预测软枣猕猴桃果肉光响应着色效果的分子标记及其应用和
试剂盒
技术领域
[0001] 本
发明属于软枣猕猴桃人工培育及分子标记技术领域，具体涉及一种
预测软枣猕猴桃果肉光响应着色效果的分子标记及其应用和试剂盒。
背景技术
[0002] 猕猴桃隶属猕猴桃科(Actinidiaceae)猕猴桃属(Actinidia Lindl.)，为多年生雌雄异株
植物，共54个种，21个变种，绝大多数种原产于中国。猕猴桃以其独特的
风味，富含维生素C、膳食
纤维和多种微量
营养元素，以及良好的清肠健胃等功效而受到人们的广泛关注，现已成为重要的
水果种类之一。
[0003] 当前种植业中猕猴桃的栽培品种主要来源于大果类型的中华猕猴桃原变种(Actinidia.chinensis Planch.var.chinensis)和美味猕猴桃变种(A.chinensis Planch.var.deliciosa A.Chev.)以及小果类型的软枣猕猴桃(A.arguta(Siebold&Zucc.)Planch.ex Miq.)。猕猴桃果肉
颜色主要分为三类：绿色、黄色和红色，其中全红型软枣猕猴桃作为新兴的高端水果产品，近年来发展迅速。
[0004] 众所周知，果实色泽可以反映出果实的成熟度和风味，从而直接决定其商业价值，同时也是评价果实品质优劣的重要指标之一。研究表明，猕猴桃果实红色的显现是由于花色苷的合成和积累。花色苷属于类黄
酮物质，广泛存在于植物体内，具有抗
氧化、清除自由基、抗菌、消炎和抗病毒等功效。花色苷的合成受到内源基因(结构基因和调节基因)和外部因子的调控。结构基因通过编码花色苷合成过程中的相关酶类直接影响花色苷的合成，参与猕猴桃果实花色苷合成的结构基因AcF3H、AcDFR、AcCHS、AcLDOX、AaLDOX、AcF3GT1和AcF3GGT1等均已克隆和鉴定。调节基因通过编码转录因子蛋白影响结构基因的表达从而间接调节花色苷的合成，MYBs、bHLHs和WD40s三大类转录因子通过形成MBW
复合体调控花色苷的合成。如“红阳”猕猴桃果实AcMYB123和AcbHLH42的共同表达能够调节其内
果皮花色苷合成，而AcMYB75、AcMYB110和AcMYBF110均能够调控猕猴桃果实花色苷的合成与积累。
[0005] 除了内源基因之外，花色苷的合成还受到外界环境因子如光照、
温度、水分等的影响，其中光照被认为是影响果实色泽形成的关键因素。光影响花色苷合成主要通过对相关基因的直接或间接调控来完成，例如，光照能够促进葡萄、苹果等果实中相关结构基因的表达从而影响花色苷的合成，而这些结构基因的表达受到MYBs转录因子的调控。如果能够对猕猴桃果实中与果肉花色苷合成相关的关键光响应调节基因进行有效的遗传分析，不仅有助于解析光照对猕猴桃红肉性状形成的影响机制，而且可以为预测猕猴桃果肉光响应着色效果、筛选优质果品、提高产品品质和商业价值、进行种质创新和品种改良提供有
力的技术手段。
[0006] 然而，由于猕猴桃种间杂交现象明显，
染色体倍性复杂，采用常规的方法进行遗传学研究效率不高，DNA分子标记的发展为猕猴桃研究提供了有效的途径。DNA分子标记以个体间核苷酸序列变异为
基础，是
生物个体遗传变异的直接反映，利用其可以检测出生物个体之间核苷酸序列上的差异。目前，分子标记技术已应用于猕猴桃种质资源遗传多样性评价、遗传图谱构建、雌雄性别鉴定以及猕猴桃相关性状
定位等领域。然而，与猕猴桃果肉光响应着色效果相关以用于预测红肉猕猴桃果肉
色度的分子标记尚未见报道。
发明内容
[0007] 本发明的目的旨在提供一种新的且行之有效的用于预测软枣猕猴桃果肉光响应着色效果的分子标记，该分子标记为全红型软枣猕猴桃中包含的转录因子基因AaMYB1，其基因ID为c122899-g2，具体序列如SEQ ID NO:1所示，所述分子标记的上游引物序列为：5'-CTATCCCTCACCGAGTTCGC-3'(SEQ ID NO:2)，下游引物序列为：5'-TCCGATCGACAGGTCCAGAT-3'(SEQ ID NO:3)。
[0008] 进一步地，本发明还提供了上述分子标记的筛选方法，包括以下步骤：
[0009] (1)软枣猕猴桃材料处理：选取生长状态良好的树体，在盛花期后第30天对部分果实进行套袋处理，未处理果实作为对照，分别在盛花期后第30、50、70、80、90、100、110和120天在树体东、西、南、北四个方向采集受光良好的果实，迅速分离切取果肉样品并经液氮速冻后置于-80℃
冰箱中保存，备用；
[0010] (2)果肉色泽比、色度
角的测定：使用色差计测定果实横切面的
亮度值、红绿色差值和黄蓝色差值，计算综合色差指标色泽比和色度角，其中色泽比＝红绿色差值/黄蓝色差值，色度角＝arc[tan(黄蓝色差值/红绿色差值)]；色泽比在绿果期为负数，负值越小，绿色越深，红果期为正数，正值越大，红色越深；色度角区间为0-180°，0°代表紫红色，90°代表黄色，180°代表绿色，当色度角＞100°时，值越大越绿，当色度角＜50°时，值越小越红；
[0011] (3)总花色苷的提取及测定：利用植物花色苷含量检测试剂盒提取总花色苷；采用超高效液相色谱
串联质谱法测定花色苷组分含量；
[0012] 液相色谱条件设置如下：液相色谱柱，3.0mm×150mm×1.8μm的ZORBAX Eclipse Plus C18柱；柱温，40℃；流动相A为含0.5％
甲酸水溶液，B为乙腈；梯度洗脱程序，0-1.5min，10％B；1.5-3min，10-30％B；3-5min，30-40％B；5-7min，40-90％B；7-8min，90％B；
8-10min，10％B；流速，0.3mL·min-1；进样量，5μL；
[0013] 质谱条件设置如下：电喷雾离子源；扫描模式，正负离子模式；检测方式，多反应监测；干燥气温度，350℃；干燥气流速，8L·min-1；鞘流气温度，350℃，鞘流气流速，12L·min-1；毛细管
电压，4000V；
[0014] 花色苷组分标准品如下：矢车菊素、飞燕草素、矢车菊色素-3-O-半乳糖苷、飞燕草色素-3-O-半乳糖苷、矢车菊色素-3-O-木糖-半乳糖苷；
[0015] (4)总RNA提取、反转录和
荧光定量PCR：利用植物RNA提取试剂盒提取总RNA，1％琼脂糖凝胶
电泳检测RNA
质量和纯度，微量紫外分光光度计测定RNA浓度；利用反转录试剂盒对总RNA进行反转录；以与花色苷合成相关的转录因子基因为对象，设计扩增引物，以猕猴桃β-actin作为内参基因进行荧光定量PCR，反应体系和程序设置如下：10μL反应体系为5μL 2*SYBR qPCR Mix，3.5μL ddH2O，0.5μL上游引物，0.5μL下游引物，0.5μL cDNA；反应程序为PCR循环三步法：95℃预变性2min，40个循环：95℃变性15s、60℃
退火30s、72℃延伸30s，在
40个循环后进行熔解曲线分析以确保靶
片段的适当扩增，每次试验均进行三次生物学重复；
[0016] (5)数据统计与分析：利用SPSS对试验数据进行相关性分析；用邓肯检测法进行显著性分析。
[0017] 此外，本发明还涉及上述分子标记在预测软枣猕猴桃果肉光响应着色效果中的应用。
[0018] 以及，上述分子标记在软枣猕猴桃品种选育中的应用。
[0019] 另一方面，本发明还提供了一种预测软枣猕猴桃果肉光响应着色效果的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含针对上述分子标记的检测试剂。
[0020] 更具体地，本发明提供了一种预测软枣猕猴桃果肉光响应着色效果的检测试剂盒，所述检测试剂盒中包含用于检测上述分子标记的上游引物和下游引物，其序列分别为上游引物：5'-CTATCCCTCACCGAGTTCGC-3'，下游引物：5'-TCCGATCGACAGGTCCAGAT-3'。
[0021] 进一步地，上述检测试剂盒中还包含下述组分：猕猴桃β-actin基因、2*SYBR qPCR Mix试剂、ddH2O、cDNA、花色苷标准品。
[0022] 进一步地，上述检测试剂盒中的花色苷标准品包含下述组分：矢车菊素、飞燕草素、矢车菊色素-3-O-半乳糖苷、飞燕草色素-3-O-半乳糖苷、矢车菊色素-3-O-木糖-半乳糖苷。
[0023] 此外，本发明还提供了一种预测软枣猕猴桃果肉光响应着色效果的方法，所述方法中包含对上述分子标记进行检测的步骤。
[0024] 综上，本发明提供了一种与软枣猕猴桃果肉光响应着色效果相关、可用于预测红肉软枣猕猴桃果肉色度的分子标记及其试剂盒，利用本发明分子标记和试剂盒可准确预测猕猴桃果肉光响应着色效果，进而为筛选优质果品、提高产品品质和商业价值、进行种质创新和品种改良提供有力的技术手段。
附图说明
[0025] 为了更清楚地说明本发明
实施例或
现有技术中的技术方案，下面将对实施例或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0026] 图1为不同生长期试验组和对照组“天源红”全红型软枣猕猴桃果肉颜色的表型变化图。
[0027] 图2为不同生长期试验组和对照组“天源红”全红型软枣猕猴桃果肉色差指标(色泽比和色度角)的变化情况图。
[0028] 图3为不同生长期试验组和对照组“天源红”全红型软枣猕猴桃果肉中5种花色苷组分和总花色苷含量的变化情况图。
[0029] 图4为果实发育期间14个转录因子基因的表达分析图。
[0030] 图5为光响应转录因子AaMYB1参与调控软枣猕猴桃果实花色苷合成的模型图。
具体实施方式
[0031] 以下通过特定的具体实例说明本发明的实施方式，本领域技术人员可由本
说明书所揭露的内容轻易地了解本发明的其他优点与功效。本发明还可以通过另外不同的具体实施方式加以实施或应用，本说明书中的各项细节也可以基于不同观点与应用，在没有背离本发明的精神下进行各种修饰或改变。
[0032] 在进一步描述本发明具体实施方式之前，应理解，本发明的保护范围不局限于下述特定的具体实施方案；还应当理解，本发明实施例中使用的术语是为了描述特定的具体实施方案，而不是为了限制本发明的保护范围。
[0033] 除非另外定义，本发明中使用的所有技术和科学术语与本技术领域技术人员通常理解的意义相同。除实施例中使用的具体方法、设备、材料外，根据
本技术领域的技术人员对现有技术的掌握及本发明的记载，还可以使用与本发明实施例中所述的方法、设备、材料相似或等同的现有技术的任何方法、设备和材料来实现本发明。
[0034] 在本发明中，若无特别说明，所有的仪器和原料均可从商业途径得到或是本行业常用的。下述实施例中的方法，如无特别说明，均为本领域的常规方法。
[0035] 实施例1：一种用于预测软枣猕猴桃果肉光响应着色效果的分子标记的筛选方法包括以下步骤：
[0036] 1、软枣猕猴桃材料处理
[0037] 试验材料取自河南省洛阳市栾川县全红型软枣猕猴桃“天源红”种植基地，单主干、双主蔓水平大棚架管理，树龄8年。选取12株生长状态良好、树势均匀一致的树体，在盛花期后第30天对部分果实进行套袋处理(纸袋采用中国农业科学院郑州果树研究所生产的内黑外黄双层不透光纸袋)，未处理果实作为对照，每2株为一个小区，3次重复，对所选的果树按常规进行
修剪、疏花、疏果及肥水管理。分别在盛花期后第30(套袋处理当天)、50、70、80、90、100、110和120天在树体双主蔓两侧架面下东、西、南、北四个方向采集受光良好的果实，各取5个共计20个，迅速分离切取果肉样品并经液氮速冻后置于-80℃冰箱中保存，备用。
[0038] 2、果肉色泽比、色度角的测定
[0039] 使用日本柯尼卡美能达可携式CR-400型色差计测定果实横切面的亮度值(L值)、红绿色差值(a值)和黄蓝色差值(b值)，每个时期测定5个果实，3次重复。计算综合色差指标色泽比(h)和色度角(h*)，其中色泽比＝红绿色差值/黄蓝色差值(h＝a/b)，色度角＝arc[tan(黄蓝色差值/红绿色差值)](h*＝arc[tan(b/a)])；色泽比在绿果期为负数，负值越小，绿色越深，红果期为正数，正值越大，红色越深；色度角均为正值，区间为0-180°，0°代表紫红色，90°代表黄色，180°代表绿色，当色度角＞100°时，值越大越绿，当色度角＜50°时，值越小越红。
[0040] 3、总花色苷的提取及测定
[0041] 利用植物花色苷含量检测试剂盒(BC1385，北京索莱宝公司)提取总花色苷；采用超高效液相色谱串联质谱法(1290-6460高效液相色谱-三重四级杆串联质谱仪，美国Agilient公司)测定花色苷组分含量；
[0042] 液相色谱条件设置如下：
[0043] 液相色谱柱：3.0mm×150mm×1.8μm的ZORBAX Eclipse Plus C18柱；
[0044] 柱温：40℃；
[0045] 流动相：A为含0.5％甲酸水溶液，B为乙腈；
[0046] 梯度洗脱程序：0-1.5min，10％B；
[0047] 1.5-3min，10-30％B；
[0048] 3-5min，30-40％B；
[0049] 5-7min，40-90％B；
[0050] 7-8min，90％B；
[0051] 8-10min，10％B；
[0052] 流速：0.3mL·min-1；
[0053] 进样量：5μL。
[0054] 质谱条件设置如下：
[0055] 电喷雾离子源(ESI)；
[0056] 扫描模式：正负离子模式；
[0057] 检测方式：多反应监测(MRM)；
[0058] 干燥气温度：350℃；干燥气流速：8L·min-1；
[0059] 鞘流气温度：350℃，鞘流气流速：12L·min-1；
[0060] 毛细管电压，4000V。
[0061] 花色苷组分标准品如下：矢车菊素(CAS：528-58-5)、飞燕草素(CAS：528-53-0)、矢车菊色素-3-O-半乳糖苷(CAS：27661-36-5)、飞燕草色素-3-O-半乳糖苷(CAS：28500-00-7)、矢车菊色素-3-O-木糖-半乳糖苷(CAS：31073-32-2)。
[0062] 4、总RNA提取、反转录和荧光定量PCR
[0063] 利用多糖多酚植物RNA提取试剂盒(Quick RNA isolation Kit，北京华越洋生物科技有限公司)提取总RNA，1％琼脂糖凝胶电泳检测RNA质量和纯度，微量紫外分光光度计(Thermo Scientific,NANO,DROP2000)测定RNA浓度；称取1g RNA，利用反转录试剂盒(东洋纺FSQ-101反转录试剂盒)对总RNA进行反转录。依据本课题组前期对“天源红”不同发育时期果实转录组测序结果，筛选得到14个与花色苷合成相关的转录因子基因(表1)，并根据其在KEGG和GO中的注释信息对其进行命名。以上述14个与花色苷合成相关的转录因子基因为对象，设计扩增引物，以猕猴桃β-actin作为内参基因进行荧光定量PCR，荧光定量PCR反应体系和程序设置如下：
[0064] 反应体系(10μL)：
[0065] 2*SYBR qPCR Mix(5μL)(
艾德莱，北京艾德莱生物科技有限公司)，
[0066] ddH2O(3.5μL)，
[0067] 上游引物(0.5μL)，
[0068] 下游引物(0.5μL)，
[0069] cDNA(0.5μL)。
[0070] 反应程序为PCR循环三步法：
[0071] 95℃预变性2min，
[0072] 40个循环：95℃变性15s、60℃退火30s、72℃延伸30s，
[0073] 在40个循环后进行熔解曲线分析以确保靶片段的适当扩增；
[0074] 每次试验均进行三次生物学重复。
[0075] 表1 14个与花色苷合成相关的转录因子基因及荧光定量引物
[0076]
[0077] 5、数据统计与分析
[0078] 采用Office 2007进行基础数据的
整理；利用SPSS 22.0对试验数据进行相关性分析；用邓肯检测法(Duncan test)进行显著性分析。
[0079] 6、试验结果与结论
[0080] (1)果肉颜色的动态变化
[0081] 盛花期后8个采集时间点“天源红”果肉颜色的动态变化如(图1)所示。随着果实生长发育，果肉颜色由绿变红，呈现红色的时期为果实发育的后两个时期，即盛花期后110天和120天，两种处理着色程度存在差异。果实发育8个时期果肉样品色泽比和色度角的测定结果，两种处理色泽比(图2A)和色度角(图2B)在发育前期变化规律基本一致，且无显著性差异；但在盛花期后120天，未套袋处理的果肉色泽比较高、色度角较低，二者均与套袋处理果肉达到极显著水平差异，即未套袋果肉在果实发育后期能够正常着色，而套袋果肉着色受到一定程度的影响。
[0082] (2)果肉花色苷组分的定性、定量分析及总花色苷含量的测定
[0083] 对两种处理、8个发育时期果肉样品的5种花色苷组分进行定性、定量分析，结果表明：矢车菊素和飞燕草素在盛花期后30天的含量显著高于其他各个时期(图3A,B)；飞燕草素-3-O-半乳糖苷含量在整个果实发育过程中无明显的变化规律，且含量均维持在较低水平(图3D)；矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷在果实发育前期含量低，随着果实的生长发育，含量逐渐升高，至盛花期后120天达到最大(图3C,E)。
[0084] 总花色苷含量测定结果显示：只有在果肉颜色变红的盛花期后110天和120天能够检测到总花色苷，且盛花期后120天总花色苷含量较其他时期显著高。总花色苷含量与5种花色苷组分含量的相关性分析结果显示，矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷与总花色苷呈现极显著相关(表2)。另外，盛花期后120天，未套袋果肉总花色苷含量、矢车菊素-3-O-半乳糖苷含量显著高于套袋果肉，而矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷含量二者无显著性差异，表明套袋处理能够抑制果肉总花色苷和矢车菊素-3-O-半乳糖苷的合成与积累。
[0085] 表2试验组和对照组果肉中5种花色苷组分和总花色苷含量的相关性分析[0086]
[0087]
[0088] 注：‘**’代表在0.01水平上具有显著性差异
[0089] (3)花色苷合成相关转录因子基因在果肉中的表达规律
[0090] 14个转录因子基因在8个时期果肉中均有表达，但规律不尽一致(图4)。随着果实生长发育，MYB1和MYB110的表达水平逐渐升高，至盛花期后120天最高；MYB5、MYC2、HD-ZIP2、HD-ZIP3、HD-ZIP4和HD-ZIP5在果实发育前期高表达，后期表达水平逐渐降低；MYB14在整个发育过程中均呈现高水平表达；MYB123、MYC1、MYC3、bHLH、HD-ZIP1的表达并无明显规律。在两种处理着色差异最显著的盛花期后120天，未套袋果实MYB1和MYB110高表达，而套袋果实该两种基因均低表达(图5A,C)。
[0091] 对14个转录因子基因与矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷含量进行相关性分析结果显示(表3)：在未套袋果实中，MYB1和MYB110与矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷含量均呈显著正相关；在套袋果实中，MYB110与矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷含量呈显著正相关，而MYB1与该两种花色苷组分含量无相关，表明MYB1能够响应套袋处理，即MYB1可能响应光照，所以本研究推测在猕猴桃中MYB1可能作为光响应因子参与调节猕猴桃花色苷的合成与积累。
[0092] 表3 14个转录因子基因与试验组和对照组果肉中矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖酸苷的相关性分析
[0093]
[0094]
[0095] 注：‘*’代表在0.05水平上具有显著性差异；
[0096] ‘**’代表在0.01水平上具有显著性差异。
[0097] (4)AaMYB1响应光照条件下参与调控花色苷合成的模式图的构建
[0098] 根据上述研究结果，本研究构建了AaMYB1响应光照条件下参与调节全红型软枣猕猴桃花色苷合成的模式图(图5)，即在未套袋处理果实中，果实能够正常接收光照，AaMYB1可以正常高表达，编码AaMYB1转录因子，其通过与另外两类转录因子bHLHs和WD40s结合形成MBW蛋白复合体，从而激活下游结构基因的表达，催化花色苷的合成与积累，从而使果实呈现红色；而在套袋处理条件下，果实不能正常接收光照，AaMYB1表达受到抑制，不能正常合成AaMYB1转录因子，MBW复合体不能正常形成，下游结构基因不能够被激活，花色苷合成受阻，影响果实正常着色。
[0099] 综上，我们可以获知以下结论：随着软枣猕猴桃果实生长发育，果肉颜色逐渐由绿变红，在盛花期后120天红色最深，未套袋果肉红色明显深于套袋果肉，色泽比和色度角的测定结果与表型鉴定结果一致。软枣猕猴桃果肉主要呈色物质是矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷，二者与总花色苷含量呈极显著相关；盛花期后120天，矢车菊素-3-O-半乳糖苷和总花色苷含量在套袋与不套袋果肉中差异显著。实时荧光定量PCR结果显示，MYB1在盛花期后120天未套袋果肉中的表达水平显著高于套袋果肉，并且与未套袋果肉矢车菊素-3-O-半乳糖苷和矢车菊素-3-O-木糖-半乳糖苷含量呈显著正相关，与套袋处理果肉不相关。因此可以确认，AaMYB1是软枣猕猴桃花色苷形成响应光照的关键转录因子，套袋处理可能通过抑制AaMYB1的表达进而抑制花色苷(主要是矢车菊素-3-O-半乳糖苷)的合成与积累，从而阻碍果实正常着色。
[0100] 实施例2：一种预测软枣猕猴桃果肉光响应着色效果的检测试剂盒本试剂盒包含下述组分：
[0101] (1)分子标记引物：上游引物：5'-CTATCCCTCACCGAGTTCGC-3'，
[0102] 下游引物：5'-TCCGATCGACAGGTCCAGAT-3'；
[0103] (2)内参基因：猕猴桃β-actin基因；
[0104] (3)荧光定量PCR反应试剂：2*SYBR qPCR Mix试剂、ddH2O、cDNA；
[0105] (4)花色苷标准品：矢车菊素、飞燕草素、矢车菊色素-3-O-半乳糖苷、飞燕草色素-3-O-半乳糖苷、矢车菊色素-3-O-木糖-半乳糖苷。
[0106] 以上对本发明优选的具体实施方式和实施例作了详细说明，但是本发明并不限于上述实施方式和实施例，在本领域技术人员所具备的知识范围内，还可以在不脱离本发明构思的前提下作出各种变化。
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