一种结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法
阅读：369发布：2020-05-11
专利汇可以提供一种结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒 化学发光 检测 试剂 盒 及其制备方法，属于化学发光检测试剂盒技术领域。解决了 现有技术 中结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒检测耗时长，重复性差， 稳定性 差，灵敏度差，准确度差等技术问题。本发明的化学发光检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；R1试剂为含有链霉亲和素磁微粒的缓冲液；R2试剂为含有化学发 光标 记物标记的γ干扰素单克隆 抗体 的缓冲液；R3试剂为含有 生物 素标记的γ干扰素单克隆抗体的缓冲液。该化学发光检测试剂盒测试速度快，测试结果重复性好，试剂性能稳定，灵敏度高，测试结果准确。，下面是一种结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法专利的具体信息内容。
1.结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；
所述R1试剂为含有链霉亲和素磁微粒的缓冲液；
所述R2试剂为含有化学发光标记物标记的γ干扰素单克隆抗体的缓冲液；
所述R3试剂为含有生物素标记的γ干扰素单克隆抗体的缓冲液。
2.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R1试剂中，链霉亲和素磁微粒的浓度≥0.03％。
3.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R2试剂中，化学发光标记物标记的γ干扰素单克隆抗体的浓度≥0.1μg/mL。
4.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述R3试剂中，生物素标记的γ干扰素单克隆抗体的浓度≥0.1μg/mL。
5.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述链霉亲和素磁微粒的粒径为1～3μm。
6.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述化学发光标记物标记的γ干扰素单克隆抗体中，化学发光标记物为吖啶酯或吖啶酯衍生物，化学发光标记物与单克隆抗体的摩尔比为(1～10):1。
7.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，所述生物素标记的γ干扰素单克隆抗体中，生物素与γ干扰素单克隆抗体的摩尔比为(1～10):1。
8.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，R1试剂、R2试剂和R3试剂中，缓冲液均为由50mM的吗啉乙磺酸、0.05％的吐温和0.05％的ProClin300组成，pH为6.5的缓冲液。
9.根据权利要求1所述的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，其特征在于，该试剂盒中还包括校准品、质控品、测试培养管、阴性对照培养管、阳性对照培养管中的一种或多种；
所述校准品由多个含有不同浓度γ干扰素的缓冲液组成，γ干扰素的浓度范围为5～
50pg/mL；
所述质控品由多个含有不同浓度γ干扰素的缓冲液组成，γ干扰素的浓度范围为5～
50pg/mL；
所述测试培养管中置有0.1～0.5μg的结核分枝杆菌特异性抗原；
所述阴性对照培养管中置有含1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液；
所述阳性对照培养管置有0.1～0.5μg的植物血凝素。
10.权利要求1～8任何一项所述的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，其特征在于，包括以下步骤：
步骤一、制备R1试剂
将链霉亲和素磁颗粒溶液加入TBST溶液中，充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液清洗磁颗粒后，再用缓冲液配成固相试剂，即为R1试剂；
步骤二、制备R2试剂
先将γ干扰素单克隆抗体放入离心管中，保证γ干扰素单克隆抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲液，充分混匀后，加入化学发光标记物的N,N-二甲基甲酰胺溶液，用离心机室温条件下离心；
然后将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，加入赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀，封闭0.5～1h；
再将封闭好的γ干扰素单克隆抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用磷酸缓冲液洗脱，分别收集；
最后将收集好的γ干扰素单克隆抗体溶液用缓冲液稀释，即为R2试剂；
步骤三、制备R3试剂
取γ干扰素单克隆抗体，用pH为6.0～6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素，2～8℃反应1～2h，再转入室温继续反应30～40min，最后加入赖氨酸反应30～
40min，反应液脱盐柱纯化，加入缓冲液稀释，即为R3试剂。
一种结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测
试剂盒及其制备方法
技术领域
[0001] 本发明属于化学发光检测试剂盒技术领域，具体涉及一种结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法。
背景技术
[0002] 在过去的一百多年里，结核菌素皮肤试验(TST)是主要的用于辅助结核诊断的手段，但由于其使用的纯化蛋白衍生物(PPD)会与卡介苗(BCG)接种及环境中的其他非结核分支杆菌等存在交叉反应，在卡介苗高接种地区，如中国，会造成较多假阳性结果，使用价值有限。
[0003] γ干扰素释放试验(IGRA)是近年来研发并用于临床的一种新型结核免疫诊断方法，其主要原理为利用结核分枝杆菌特有的一段基因序列-RD1编码产生的早期分泌抗原靶分子6(ESAT-6)和培养滤液蛋白10(CFP-10)作为抗原，体外刺激机体特异性T淋巴细胞，产生细胞因子γ干扰素(IFN-γ)，通过检测所释放的γ干扰素来进行结核分枝杆菌感染的诊断。由于RD1序列只存在于结核分枝杆菌中，而不存在于卡介苗和环境中大部分其他分枝杆菌的基因中，减少了假阳性结果的可能性，因此与TST相比具有更高的特异性。
[0004] IFN-γ是一种能抗病毒、抗细菌、对靶细胞有免疫调节作用的二聚体蛋白。人类的IFN-γ基因位于12号染色体长臂1区4带(12q14)，全长6kb，含有4个外显子和3个内含子。IFN-γ在SDS-PAGE上表现的分子量为20～25kD，成熟的单体含有127～143个氨基酸。IFN-γ没有二硫键，仅依靠范德华力相互作用，活性形式是二聚体(如图1所示)或四聚体(如图2中a和b所示)，单体没有活性。IFN-γ有2个可能的糖基化位点(25，97)，IFN-γ有2个碱性氨基酸区(aa.86～90，aa.128～132)，与其酸不稳定性有关。IFN-γ没有β-片层结构，每个单体有10个α-螺旋。
[0005] 现有技术中，结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒普遍为酶联免疫吸附测定试剂盒，包括：酶标板，酶标板包括固相载体和包被层，固相载体上设置多个微孔，包被层附着在固相载体的微孔表面，包被层是由抗γ干扰素单克隆抗体和牛血清白蛋白依次涂布在固相载体的微孔表面形成的复合层，通常采用3，3'，5，5'-四甲基联苯胺(TMB)为显色底物。反应过程中，待测物与生物素化的抗γ干扰素单克隆抗体结合在酶标板上，再通过亲和素化辣根过氧化物酶(HRP)放大信息，以TMB及硫酸分别作为底物及终止液，完成检测。这种方法的缺点是：(1)以酶标板作为固相载体时，由于载体表面的检测物与样品中的待测物无法充分接触，导致反应效率较低，反应时间较长，通常在1h以上，有些甚至达到3h以上；(2)由于酶的生物活性会随着环境条件(温度、pH等)发生变化，导致同样数量的酶在不同条件下产生的光量有明显的区别，无法得到稳定的结果。
发明内容
[0006] 本发明为解决现有技术中结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应检测试剂盒检测耗时长，重复性差，稳定性差，灵敏度差，准确度差等技术问题，提供一种结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒及其制备方法。
[0007] 本发明解决上述技术问题采取的技术方案如下。
[0008] 本发明的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂；
[0009] 所述R1试剂为含有链霉亲和素磁微粒的缓冲液；
[0010] 所述R2试剂为含有化学发光标记物标记的γ干扰素单克隆抗体的缓冲液；
[0011] 所述R3试剂为含有生物素标记的γ干扰素单克隆抗体的缓冲液。
[0012] 优选的是，所述R1试剂中，链霉亲和素磁微粒的浓度≥0.03％。
[0013] 优选的是，所述R2试剂中，化学发光标记物标记的γ干扰素单克隆抗体的浓度≥0.1μg/mL。
[0014] 优选的是，所述R3试剂中，生物素标记的γ干扰素单克隆抗体的浓度≥0.1μg/mL。
[0015] 优选的是，所述链霉亲和素磁微粒的粒径为1～3μm。
[0016] 优选的是，所述化学发光标记物标记的γ干扰素单克隆抗体中，化学发光标记物为吖啶酯，化学发光标记物与单克隆抗体的摩尔比为(1～10):1。
[0017] 优选的是，所述生物素标记的γ干扰素单克隆抗体中，生物素与γ干扰素单克隆抗体的摩尔比为(1～10):1。
[0018] 优选的是，R1试剂、R2试剂和R3试剂中，缓冲液均为由50mM的吗啉乙磺酸、0.05％的吐温和0.05％的ProClin300组成，pH为6.5。
[0019] 优选的是，该试剂盒中还包括校准品、质控品、测试培养管、阴性对照培养管、阳性对照培养管中的一种或多种；
[0020] 所述校准品由多个含有不同浓度γ干扰素的缓冲液组成，γ干扰素的浓度范围为5～50pg/mL；
[0021] 所述质控品由多个含有不同浓度γ干扰素的缓冲液组成，γ干扰素的浓度范围为5～50pg/mL；
[0022] 所述测试培养管中置有0.1～0.5μg的结核分枝杆菌特异性抗原；
[0023] 所述阴性对照培养管中置有含1％牛血清白蛋白的PBS缓冲液；
[0024] 所述阳性对照培养管置有0.1～0.5μg的植物血凝素。
[0025] 本发明还提供上述结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤：
[0026] 步骤一、制备R1试剂
[0027] 将链霉亲和素磁颗粒溶液加入TBST溶液中，充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液清洗磁颗粒后，再用缓冲液配成固相试剂，即为R1试剂；
[0028] 步骤二、制备R2试剂
[0029] 先将γ干扰素单克隆抗体放入离心管中，保证γ干扰素单克隆抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲液，充分混匀后，加入化学发光标记物的N,N-二甲基甲酰胺(DMF)溶液，用离心机室温条件下离心；
[0031] 再将封闭好的γ干扰素单克隆抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用磷酸缓冲液洗脱，分别收集；
[0032] 最后将收集好的γ干扰素单克隆抗体溶液用缓冲液稀释，即为R2试剂；
[0033] 步骤三、制备R3试剂
[0034] 取γ干扰素单克隆抗体，用pH为6.0～6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素，2～8℃反应1～2h，再转入室温继续反应30～40min，最后加入赖氨酸反应30～40min，反应液脱盐柱纯化，加入缓冲液稀释，即为R3试剂。
[0035] 与现有技术相比，本发明的有益效果为：
[0036] 本发明的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒使用生物素-亲和素体系，生物素-亲和素体系是通过链霉亲和素-生物素之间特异性相互作用，将生物素标记的抗体连接到磁微粒上，测试前，链霉亲和素包被的磁珠和生物素标记的抗体是分开存放的，避免了抗体直接包被磁珠导致的磁珠凝集，故试剂性能稳定测试，结果重复性好。
[0037] 本发明的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒测试结果准确
[0038] 本发明的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒采用吖啶酯直接发光，提高了检测灵敏度。经过实验，这种结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒检测灵敏度＜2pg/mL，检测精度较高。附图说明
[0039] 图1为现有技术中的IFN-γ二聚体的晶体衍射图；
[0040] 图2为现有技术中的IFN-γ四聚体的晶体衍射图，其中，a为俯视图，b为侧视图；
[0041] 图3为采用本发明的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒检测校准品绘制的校准曲线。
具体实施方式
[0042] 为使本发明的上述目的、特征和优点能够更加明显易懂，下面通过具体实例对本发明的具体实施方式做详细的说明。在下面的描述中描述了很多具体细节以便于充分理解本发明。但是本发明能够以很多不同于在此描述的其它方式来实施，本领域技术人员可以在不违背本发明内涵的情况下做类似改进，因此本发明不受下面公开的具体实施的限制。
[0043] 本发明的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，包括R1试剂、R2试剂和R3试剂，还可以包括校准品、质控品、测试培养管、阴性对照培养管、阳性对照培养管中的一种或多种。
[0044] 其中，R1试剂为含有链霉亲和素磁微粒的缓冲液；R1试剂中，链霉亲和素磁微粒浓度≥0.03％；链霉亲和素磁微粒的粒径为1～3μm；缓冲液为由50mM的吗啉乙磺酸、0.05％的吐温和0.05％的ProClin300组成，pH为6.5的缓冲液。
[0045] R2试剂为含有化学发光标记物标记的γ干扰素单克隆抗体，R3试剂中，化学发光标记物标记的γ干扰素单克隆抗体浓度≥0.1μg/mL；化学发光标记物标记的γ干扰素单克隆抗体中，化学发光标记物为吖啶酯，化学发光标记物与单克隆抗体的摩尔比为1:(1～10)；缓冲液为由50mM的吗啉乙磺酸、0.05％的吐温和0.05％的ProClin300组成，pH为6.5的缓冲液。
[0046] R3试剂为含有生物素标记的γ干扰素单克隆抗体的缓冲液；R2试剂中，生物素标记的γ干扰素单克隆抗体浓度≥0.1μg/mL；生物素标记的γ干扰素单克隆抗体中，生物素与γ干扰素单克隆抗体的摩尔比为1:(1～10)；缓冲液为由50mM的吗啉乙磺酸、0.05％的吐温和0.05％的ProClin300组成，pH为6.5的缓冲液。
[0047] 校准品由多个含有不同浓度γ干扰素的缓冲液组成，γ干扰素的浓度范围为5～50pg/mL，每个浓度的γ干扰素缓冲液常用体积为1mL，缓冲液为PBS缓冲液。
[0048] 质控品由多个含有不同浓度γ干扰素的缓冲液组成，γ干扰素的浓度范围为5～50pg/mL，每个浓度的γ干扰素缓冲液常用体积为1mL，缓冲液为PBS缓冲液。
[0049] 测试培养管中置有0.1～0.5μg的结核分枝杆菌特异性抗原，结核分枝杆菌特异性抗原能够通过商购获得；
[0050] 阴性对照培养管中置有含1％的牛血清白蛋白的PBS缓冲液；
[0051] 阳性对照培养管置有0.1～0.5μg的植物血凝素，植物血凝素能够通过商购获得。
[0052] 本发明还提供上述结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒的制备方法，包括以下步骤；
[0053] 将链霉亲和素磁颗粒溶液加入TBST溶液中，充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液清洗磁颗粒后，再用缓冲液配成所需浓度的固相试剂，即为R1试剂；
[0054] 其中，链霉亲和素磁颗粒溶液(商购，选自Thermol)的浓度优选为50～100mg/ml；一般清洗需重复清洗三次；R1试剂需在2～8℃保存。
[0055] 步骤二、制备R2试剂
[0056] 先将γ干扰素单克隆抗体放入离心管中，保证γ干扰素单克隆抗体位于离心管底部位置后加入碳酸缓冲液，充分混匀，混匀后加入化学发光标记物的DMF溶液，用离心机室温条件下离心0.5min；
[0057] 然后将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，将暗盒放入气浴恒温振荡器中混匀，加入赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器中混匀，封闭0.5～1h；
[0058] 再将封闭好的γ干扰素单克隆抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用磷酸缓冲液洗脱，分别收集；
[0059] 最后将收集好的γ干扰素单克隆抗体溶液用缓冲液稀释至所需浓度，即为R2试剂；
[0060] 其中，保证γ干扰素单克隆抗体位于离心管底部采取的技术手段一般是使离心机室温离心20s；γ干扰素单克隆抗体与化学发光标记物的标记摩尔比优选为1:(1～10)；气浴恒温振荡器的温度优选为25℃，气浴恒温振荡器中混匀一般需要4h，速度一般采用中速；赖氨酸封闭液的浓度为20％，其加入量与γ干扰素单克隆抗体的配比为：1mL:500μg；R2试剂需在2～8℃保存。
[0061] 步骤三、制备R3试剂
[0062] 取γ干扰素单克隆抗体，用pH为6.0～6.5的TRIS缓冲液透析纯化后加入已活化的长链磺化生物素，2～8℃反应1～2h，再转入室温继续反应30～40min，最后加入赖氨酸反应30～40min，反应液脱盐柱纯化，加入缓冲液稀释至所需浓度，即为R3试剂；
[0063] 其中，γ干扰素单克隆抗体与偶联标记物的标记摩尔比优选为1:(1～10)。
[0064] 步骤四、将R1试剂、R2试剂和R3试剂分别灌封于不同的试剂瓶，得到结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒。
[0065] 本发明的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒用于γ-干扰素检测时，检测方法如下：首先采用静脉穿刺术，使用不含内毒素的肝素锂真空采血管进行全血采集，且样本量不低于4mL，得到全血样本；然后将全血样本在采血管中轻柔地颠倒混匀5次，于2h内分别分装到“阴性对照培养管”、“测试培养管”、“阳性对照培养管”，1mL/管；再将三个培养管轻柔地颠倒混匀5次后快速放到37℃恒温培养箱中培养22±2h，注意保持培养管的直立状态；全血培养结束后，使用离心机3000r/min，离心10min，吸取离心后的上层血浆样本进行γ干扰素检测(注意吸取上清的过程中不可吸到中间细胞层，以防溶血)。利用全自动化学发光免疫分析仪对γ-干扰素主校准品进行检测，绘制主校准曲线，内置于射频卡；接着测试两点校准，对主校准曲线进行校准；接着测试质控品，质控品测试结果落在靶值范围内认为校准合格。采用全自动化学发光免疫分析仪测试实际样本，根据样本相对光单位(RLU)计算样本浓度。
[0066] 以下结合实施例进一步说明本发明。
[0067] 实施例1
[0068] 结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒的制备：
[0069] R1试剂制备：取浓度是100mg/mL的链霉亲和素磁颗粒(粒径1μm)溶液0.5mL(50mg)加入1mL TBST溶液中，充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液清洗三次，清洗后，再用缓冲液配成磁颗粒浓度为0.05％的固相试剂，即为R1试剂，2℃～8℃保存；
[0070] R2试剂制备：将500μgγ干扰素单克隆抗体放入离心管中，保证γ干扰素单克隆抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入1mL碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入5μL 2mg/mL吖啶酯的DMF溶液，用离心机室温条件下离心30s；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)中，混匀4h；加入1mL 20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为1h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用PB缓冲液洗脱，分别收集；将收集好的抗体溶液用缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/mL，即为R2试剂，2℃～8℃保存。
[0071] R3试剂制备：取0.5μg/mL的γ干扰素单克隆抗体，采用pH为6.5的Tris缓冲液透析纯化后，按照γ干扰素单克隆抗体与已活化的水溶生物素交联剂(Sulfo-NHS-LC-Biotin)的摩尔比为10:1加入γ干扰素单克隆抗体，2℃～8℃反应2h，再转入室温继续反应30min，最后加入摩尔量为γ干扰素单克隆抗体的100倍的赖氨酸反应30min，反应液用脱盐柱纯化，加入缓冲液稀释至终浓度为0.1μg/mL。
[0072] R1试剂、R2试剂和R3试剂中，缓冲液均为由50mM的吗啉乙磺酸、0.05％的吐温和0.05％的ProClin300组成，pH为6.5的缓冲液。
[0073] 实施例2
[0074] R1试剂制备：取浓度是100mg/mL的链霉亲和素磁颗粒(粒径3μm)溶液0.5mL(50mg)加入1mL TBST溶液中，充分混匀后，放置于磁分离器上，直至上清无混浊，弃上清，留取磁颗粒，使用缓冲液清洗三次，清洗后，再用缓冲液配成磁颗粒浓度为1％的固相试剂，即为R1试剂，2℃～8℃保存；
[0075] R2试剂制备：将500μgγ干扰素单克隆抗体放入离心管中，保证γ干扰素单克隆抗体位于离心管底部位置(离心机室温离心20s)后加入1mL碳酸缓冲溶液，充分混匀，混匀后加入5μL 2mg/mL吖啶酯的DMF溶液，用离心机室温条件下离心30s；将离心管用封口膜密封后放入避光暗盒中，之后将暗盒放入气浴恒温振荡器(25℃)中，混匀2h；加入1mL 20％赖氨酸封闭液，放入气浴恒温振荡器(25℃)，中速混匀，封闭时间为1h。将封闭好的抗体上葡聚糖凝胶G250柱纯化，用PB缓冲液洗脱，分别收集；将收集好的抗体溶液用缓冲液稀释至终浓度为0.5μg/mL，即为R2试剂，2℃～8℃保存。
[0076] R3试剂制备：取1.5μg/mLγ干扰素单克隆抗体，采用pH为6.0的Tris缓冲液透析纯化后，按照γ干扰素单克隆抗体与已活化的水溶生物素交联剂(Sulfo-NHS-LC-Biotin)的摩尔比为1:1加入γ干扰素单克隆抗体，2℃～8℃反应2h，再转入室温继续反应30min，最后加入100倍摩尔比的赖氨酸反应30min，反应液用脱盐柱纯化，加入缓冲液稀释至终浓度为0.5μg/ml，即为R3试剂。
[0077] R1试剂、R2试剂和R3试剂中，缓冲液均为由100mM MES、0.05％吐温和0.05％Proclin300组成，pH为6.0的缓冲液。
[0078] 对实施例1～2的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒的性能进行评价，该结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒的检测步骤如具体实施方式中所述。
[0079] 本发明采用国际标准物质给主校准品赋值，再用主校准品给本发明试剂盒的校准品赋值，校准品曲线如图3所示。
[0080]
[0081] 1、灵敏度的检测：主校准品A为零浓度校准品，主校准品B为相邻校准品；测试主校准品A，重复20次；测试主校准品B，重复3次，检测结果如表1与表2所示。
[0082] 表1实施例1的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒灵敏度检测结果
[0083]
[0084]
[0085]
[0086] 表2实施例2的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒灵敏度检测结果
[0087]
[0088]
[0089] 从表1～2可以看出，本发明的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒，检测灵敏度小于2.0pg/mL。
[0090] 2、线性检测
[0091] 利用实施例1～2的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒进行线性检测：即将浓度为0pg/mL、2.00pg/mL、10.00pg/mL、50.00pg/mL、100.00pg/mL、200.00pg/mL、400.00pg/mL的7个国际标准物质样本进行检测，检测结果如表3～4所示。
[0092] 表3实施例1的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒线性检测
[0093]
[0094] 表4实施例2的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒线性检测
[0095]
[0096] 利用表3～4中数据作标准曲线，得到线性相关系数r＝0.9990，线性范围为2～400pg/mL。
[0097] 3、精密度测定
[0098] 取浓度为20pg/mL的低浓度γ干扰素样品和200pg/mL高浓度γ干扰素样品的两个样本，每个样本各做3次平行测试，分别用3批实施例1和实施例2的试剂盒进行检测，计算试剂盒批内及批间差，结果表明该试剂盒批内及批间差均＜5％。
[0099] 4、干扰性实验
[0100] 对实施例1～2的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒进行抗干扰特异性实验，取混合血清分别添加干扰物，包括：胆红素、血红蛋白、甘油三酯、人白蛋白，其中胆红素浓度为30mg/dL，血红蛋白浓度为500mg/dL，甘油三酯浓度为3000mg/dL，人白蛋白浓度为12g/L，分别测定添加干扰物质的血清和未添加干扰物质的血清，计算测试偏差，检测结果如表5～6所示。
[0101] 表5实施例1的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒的抗干扰特异性实验
[0102]
[0103] 表6实施例2的结核分枝杆菌特异性细胞免疫反应磁微粒化学发光检测试剂盒的抗干扰特异性实验
[0104]
[0105] 从表5～6可以看出，偏差＜±10％，干扰性均达到NCCLS的文件标准，在胆红素30mg/dL、血红蛋白500mg/dL、甘油三酯3000mg/dL、人血清白蛋白12g/L中的样本，不会显著影响γ干扰素的测定，可用于临床实验室γ干扰素状况的准确评估。
[0106] 对所公开的实施例的上述说明，使本领域专业技术人员能够实现或使用本发明。对这些实施例的多种修改对本领域的专业技术人员来说将是显而易见的，本文中所定义的一般原理可以在不脱离本发明的精神或范围的情况下，在其它实施例中实现。因此，本发明将不会被限制于本文所示的这些实施例，而是要符合与本文所公开的原理和新颖特点相一致的最宽的范围。
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