杨树PtMYB158基因及其在创制杨树新种质材料中的应用
阅读：1022发布：2020-05-24
专利汇可以提供杨树PtMYB158基因及其在创制杨树新种质材料中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了杨树PtMYB158基因及其在创制杨树新种质材料中的应用，属于 植物 育种技术领域，所述PtMYB158基因如SEQ ID NO.1所示；所述PtMYB158基因能够明显改变杨树植株的形态。PtMYB158转基因杨树主要表现为茎组织柔韧，不易直立生长。进一步的解剖学研究发现，PtMYB158过表达杨树木 纤维 和 导管 细胞壁厚度与对照植株相比显著减小。在杨树中过量表达PtMYB158基因，能够创制一种形态明显改变的新的杨树种质材料，为培育杨树新品种奠定 基础 。，下面是杨树PtMYB158基因及其在创制杨树新种质材料中的应用专利的具体信息内容。
1.杨树PtMYB158基因，所述PtMYB158基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
2.权利要求1所述的PtMYB158基因的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
3.权利要求1所述的PtMYB158基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示。
4.一种包含权利要求2所述编码序列的重组载体。
5.权利要求1所述的PtMYB158基因在杨树育种中的应用。
6.权利要求1所述的PtMYB158基因在降低杨树茎组织的柔韧度中的应用。
7.权利要求1所述的PtMYB158基因在降低杨树植株的木纤维和/或导管细胞壁的厚度中的应用。
8.根据权利要求5～7任意一项所述的应用，其特征在于，所述应用通过PtMYB158基因过量表达实现。
杨树PtMYB158基因及其在创制杨树新种质材料中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 杨树(拉丁语学名：PopμLus L.)是杨属的植物，全属有约100余种，主要分布于北半球温带，包括北美、北非及欧亚大陆。我国是世界杨树集中分布区之一，包含5大派约60种，主要分布在北方、西南及华中。
[0003] 杨树是我国主要的造林树种，不仅在生态防护中起重要作用，而且在城市绿化、园林景观设计中也有广阔的应用前景。此外，杨树也是一种重要的工业用材，为造纸、家具制造等生产活动提供原材料。创制新的杨树种质材料对培育适应我国现代化建设需求的杨树新品种具有重要作用。
[0004] 丰富的种质资源是植物育种的物质基础。传统的创制植物新种质的方法主要是通过化学诱变(EMS诱变)和物理诱变(如γ射线)等，这些方法诱发突变的方向难以掌控，而且诱发突变的效率较低，需要通过处理大量的材料，提高获得诱变个体的机会。相对于一年生的草本植物，多年生木本植物具有生长周期长，组织细胞形态结构特殊，通过传统诱变方法获取新的种质材料更是困难。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供杨树PtMYB158基因及其在创制杨树新种质材料中的应用。
[0006] 为了实现上述发明目的，本发明提供以下技术方案：
[0007] 本发明提供了杨树PtMYB158基因，所述PtMYB158基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。
[0008] 本发明还提供了上述方案所述的PtMYB158基因的编码序列，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示。
[0010] 本发明还提供了一种包含上述方案所述编码序列的重组载体。
[0011] 本发明还提供了上述方案所述的PtMYB158基因在杨树育种中的应用。
[0012] 本发明还提供了上述方案所述的PtMYB158基因在降低杨树茎组织的柔韧度中的应用。
[0014] 优选的，所述应用通过PtMYB158基因过量表达实现。
[0015] 本发明的有益效果：本发明提供了杨树PtMYB158基因，所述PtMYB158基因如SEQ ID NO.1所示；所述PtMYB158基因能够明显改变杨树植株的形态。PtMYB158转基因杨树主要表现为茎组织柔韧，不易直立生长。进一步的解剖学研究发现，PtMYB158过表达杨树木纤维和导管细胞壁厚度与对照植株相比显著减小。在杨树中过量表达PtMYB158基因，能够创制一种形态明显改变的新的杨树种质材料，为培育杨树新品种奠定基础。附图说明
[0016] 图1为重组载体的构建流程图；
[0017] 图2为实施例1中PtMYB158在杨树不同组织的表达模式；
[0018] 图3为实施例5中转基因植株PCR检测结果，其中1：DL2000 Marker；2：阴性对照(以野生型毛白杨基因组DNA为模板PCR扩增)；3-22：转基因植株(以PtMYB158转基因毛白杨基因组DNA为模板PCR扩增)；
[0019] 图4为实施例5中转基因植株RT-qPCR检测结果；
[0020] 图5为实施例6中对照植株和PtMYB158过表达植株的表型比较；
[0021] 图6为实施例6中对照植株和PtMYB158过表达植株的株高、茎直径和茎节长度的比较分析，其中图6-A为对照植株和PtMYB158过表达植株的株高的比较分析；图6-B为对照植株和PtMYB158过表达植株的茎直径的比较分析；图6-C为对照植株和PtMYB158过表达植株的茎节长度的比较分析；图6-A、图6-B和图6-C中，对照表示对照植株，转基因植株表示PtMYB158过表达植株；
[0022] 图7为实施例7中对照植株和PtMYB158过表达植株木纤维和导管细胞壁厚度的比较分析；其中图7-A为对照植株和PtMYB158过表达植株的茎木质部区域的细胞形态；图7-B为对照植株和PtMYB158过表达植株木纤维细胞壁厚度的比较；图7-C为对照植株和PtMYB158过表达植株导管细胞壁厚度的比较。图7-A、图7-B和图7-C中，对照表示对照植株，转基因植株表示PtMYB158过表达植株。
具体实施方式
[0023] 本发明提供了杨树PtMYB158基因，所述PtMYB158基因的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示，具体为：ATGGAGGAATCTTTGGCTGGAAATTCGAGTGATGATGCGAAGAGTACTGCTTGCCCTAGAGGTCACTGGAGACCAGCTGAGGACGACAAACTCAGGCAACTTGTTGAGCAATATGGTGCACAAAACTGGAATTCTATTGCAGAGAAGCTCCAAGGAAGATCAGGTAAATTATATGAAATTTTAAAATTATTTTTTGATAAACCGGGTGAATATCATTAAGATAAACACGTTAGAATCAATCTGAAATCTATGCTTAATTTAAAGATAACATATAAGGAAAAATATTGCAAAGATCATTAAACTCAAACAGTAGGCATATCTTAGTTTTATTTTATTTTGTTACATGAAACGGACTTCCAATTTCTAAAAAATTAAGATCGAGATGGATTCTTTGCTTAAGTAACTAACAGATATCAATGATACGTCTCTCTAAACGTGTGTAGGACTTCTGGATCATGCTAGATGTAATTTTACCATTTTCATTTCTTTTCTTTTTCTTTGATAGAGGTAATTTTACCAGCTTATGATTGAATTAATAATGTCTCGTATATATGCGGCCAGCTTGAGAAACTCCCGAAATTCCTATCTCGTGACATGGGAGATAAAATTCTACCAAGCATAACGATGGCTCCCTCTCTCTCTCTACACACACTTGCACACACTTAATTACTTGGTTCCTGAATTTCTCTCTCTTTGTTTTTTTTTTTTTTCCAGGGAAGAGTTGCAGATTGAGGTGGTTTAATCAACTTGATCCTAGAATCAACAGGAGACCTTTCAGTGAACAGGAAGAAGAGAGACTACTAGCAGCTCATCGGATTCATGGAAACAAATGGGCACTAATAGCCAGACTATTTCCAGGTCGAACAGATAATGCTGTGAAAAATCATTGGCATGTCATAATGGCAAGAAAGCAAAGGGAACAGTCCAAGCTATGTGGAAAGAGAAGTTATCAAGATAATCTAAGTGAATCCAATGCCACTAATAGTTCACATGCAGGGAAATCAAGAGCTCAAGATGTGTTCAATTCAAGAATTGGATTTGATGACTCTAGAGTCTTGGAATTTCGAAACCCGGGTAAAGATAGGATATTGTCAATATCTCCTTCTGGTTCTTCACCTTCTTGGAATTTCACCCCATCAACTATAGCAGCTTCAAACAATTCTTCTTCGGTGGACTTATCGAGAAGGGAAGGAAGAGATAATTACTTCAATTCAAGTTTATTTTGCACCACCGAGAGCTCCAAATTAATCTCCGATCAACCTATTTATAGATACTATATGAATTCTTCGGTGTGTGGCAGCTACCGGAGTTCAAGTATATTCGGGATTCCAAACTATAGAAGGGTTGTTCCAAGTCCTTTTGGATCATACCTTAAACTTGGAGATGATTATGAAAACCACGGAATGATCAAGAAAGAGCTGGCAAGTTGCCATAACTCATCGACATTAAAGAATTTAAGAGCGACGAGTAATCATCAAGAGAAAGGAGATCATGAATCTATCAAACCCAAGGATGTTCCTTTCATTGATTTTCTTGGAGTGGGTATATCTTCTTGA。
[0024] 本发明还提供了上述方案所述的PtMYB158基因的编码序列(PtMYB158基因的cDNA序列)，所述编码序列的核苷酸序列如SEQ ID NO.2所示，具体为：ATGGAGGAATCTTTGGCTGGAAATTCGAGTGATGATGCGAAGAGTACTGCTTGCCCTAGAGGTCACTGGAGACCAGCTGAGGACGACAAACTCAGGCAACTTGTTGAGCAATATGGTGCACAAAACTGGAATTCTATTGCAGAGAAGCTCCAAGGAAGATCAGGGAAGAGTTGCAGATTGAGGTGGTTTAATCAACTTGATCCTAGAATCAACAGGAGACCTTTCAGTGAACAGGAAGAAGAGAGACTACTAGCAGCTCATCGGATTCATGGAAACAAATGGGCACTAATAGCCAGACTATTTCCAGGTCGAACAGATAATGCTGTGAAAAATCATTGGCATGTCATAATGGCAAGAAAGCAAAGGGAACAGTCCAAGCTATGTGGAAAGAGAAGTTATCAAGATAATCTAAGTGAATCCAATGCCACTAATAGTTCACATGCAGGGAAATCAAGAGCTCAAGATGTGTTCAATTCAAGAATTGGATTTGATGACTCTAGAGTCTTGGAATTTCGAAACCCGGGTAAAGATAGGATATTGTCAATATCTCCTTCTGGTTCTTCACCTTCTTGGAATTTCACCCCATCAACTATAGCAGCTTCAAACAATTCTTCTTCGGTGGACTTATCGAGAAGGGAAGGAAGAGATAATTACTTCAATTCAAGTTTATTTTGCACCACCGAGAGCTCCAAATTAATCTCCGATCAACCTATTTATAGATACTATATGAATTCTTCGGTGTGTGGCAGCTACCGGAGTTCAAGTATATTCGGGATTCCAAACTATAGAAGGGTTGTTCCAAGTCCTTTTGGATCATACCTTAAACTTGGAGATGATTATGAAAACCACGGAATGATCAAGAAAGAGCTGGCAAGTTGCCATAACTCATCGACATTAAAGAATTTAAGAGCGACGAGTAATCATCAAGAGAAAGGAGATCATGAATCTATCAAACCCAAGGATGTTCCTTTCATTGATTTTCTTGGAGTGGGTATATCTTCTTGA。
[0025] 本发明还提供了上述方案所述的PtMYB158基因编码的蛋白质，所述蛋白质的氨基酸序列如SEQ ID NO.3所示，具体为：MEESLAGNSSDDAKSTACPRGHWRPAEDDKLRQLVEQYGAQNWNSIAEKLQGRSGKSCRLRWFNQLDPRINRRPFSEQEEERLLAAHRIHGNKWALIARLFPGRTDNAVKNHWHVIMARKQREQSKLCGKRSYQDNLSESNATNSSHAGKSRAQDVFNSRIGFDDSRVLEFRNPGKDRILSISPSGSSPSWNFTPSTIAASNNSSSVDLSRREGRDNYFNSSLFCTTESSKLISDQPIYRYYMNSSVCGSYRSSSIFGIPNYRRVVPSPFGSYLKLGDDYENHGMIKKELASCHNSSTLKNLRATSNHQEKGDHESIKPKDVPFIDFLGVGISS。
[0026] 本发明还提供了一种包含上述方案所述编码序列的重组载体；所述重组载体优选的以ΔpCAMBIA1302作为原始载体；所述ΔpCAMBIA1302是由传统的植物表达载体pCAMBIA1302改造而来的一个双元植物表达载体，ΔpCAMBIA1302载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示，具体改造过程为：将pCAMBIA1302载体中T-DNA区段含有的组成型的CaMV35S启动子(CaMV35S-P)(538bp)和报告基因GFP替换为组成型的CaMV35S启动子(CaMV35S-P)(835bp)和多克隆位点序列；所述编码序列优选的插入在ΔpCAMBIA1302上的BamHI和SalI位点之间；所述重组载体构建的流程图参见图1；本发明对构建重组载体的方法没有特殊限制，采用本领域常规方法即可。
[0027] 本发明还提供了上述方案所述的PtMYB158基因在杨树育种中的应用。
[0028] 本发明还提供了上述方案所述的PtMYB158基因在降低杨树茎组织的柔韧度中的应用。
[0029] 本发明还提供了上述方案所述的PtMYB158基因在降低杨树植株的木纤维和/或导管细胞壁的厚度中的应用。
[0030] 本发明上述方案所述应用通过PtMYB158基因过量表达实现，更优选的是通过将所述重组载体的T-DNA区段整合到杨树基因组上实现的；所述杨树优选为毛白杨。
[0031] 下面结合实施例对本发明提供的技术方案进行详细的说明，但是不能把它们理解为对本发明保护范围的限定。
[0032] 下述实例中所用到的常规实验操作：
[0033] 1、DNA提取
[0035] 2、RNA的提取
[0036] RNA提取采用RNAprep Pure PlantKit(天根，北京)，详细步骤见说明书。
[0037] 3、DNA片段的PCR扩增
[0038] 扩增体系：10×ExTaq ReactionBuffer：2.0μL
[0039] dNTP(2.5mM)：2.0μL
[0040] Forward Primer(2.0mM)：2.0μL
[0041] Reverse Primer(2.0mM)：2.0μL
[0042] 模板(基因组DNA或cDNA)：1μL
[0043] ExTaqpolymerase(5U/μL)：0.1μL；
[0044] 补充ddH2O至20μL。
[0046] 4、DNA片段的回收、连接和克隆
[0047] 使用DNA快速回收/纯化试剂盒(北京鼎国昌盛生物技术有限责任公司)回收DNA片段，详细步骤见说明书。回收的DNA片段连入pEASY-Blunt载体(全式金，北京)，连接体系及反应条件：PCR产物，4μL；pEASY-Blunt载体1μL；室温反应5min。然后将连接产物转化大肠杆菌DH10b。经过抗性筛选，选取单克隆，送美吉生物公司测序。
[0048] 5、RT-qPCR检测
[0049] 利用PrimeScriptTM RT reagent Kit(Perfect Real Time)(TakaRa)将RNA反转录为cDNA，反转录体系为：
[0050] 5×PrimeScript Buffer(forReal Time)：2μL
[0051] PrimeScript RT Enzyme Mix I：0.5μL
[0052] Oligo dTPrimer(50μM)：0.5μL
[0053] Random 6mers(100μM)：0.5μL
[0054] Total RNA：400ng
[0055] 补充Rnase Free ddH2O至10μL。
[0056] 以cDNA为模板，利用 Premix Ex TaqTMII(Tli RNaseH Plus)进行RT-qPCR检测，反应体系为：
[0057] SYBR Premix Ex Taq II(Tli RNaseH Plus)(2×)：10μL
[0058] PCR Forward Primer(10μM)：0.8μL
[0059] PCR Reverse Primer(10μM)：0.8μL
[0060] cDNA模板(<100ng)：2μL
[0061] 灭菌水：6.4μL
[0062] RT-qPCR检测采用两步法：(1)预变性：95℃，30sec；(2)PCR反应：95℃5sec，60℃30sec，40个循环；(3)溶解曲线分析：95℃5sec，60℃60sec。
[0063] 实施例1 PtMYB158的表达模式分析
[0064] 毛白杨生长3个月后，分别提取树皮、根、茎、叶、叶柄和木质部中的总RNA，采用RT-qPCR方法检测PtMYB158的组织表达模式，RT-qPCR引物见表1。RT-qPCR检测结果显示，PtMYB158在毛白杨树皮、根、茎、叶、叶柄和木质部中均有表达，其中在木质部中的表达水平最高(图2)，表明PtMYB158可能在杨树木质部的发育过程中发挥重要作用。
[0065] 表1 PtMYB158进行RT-qPCR检测的引物信息
[0066]
[0067]
[0068] 实施例2 PtMYB158编码序列的克隆
[0069] 分别提取毛白杨根、茎和叶组织的总RNA，然后将各组织的总RNA进行等量混合，反转录为cDNA。利用特异性引物5’-TGGACTTCTTTCTGGTGTATTTG-3’，如SEQ ID NO.9所示；5’-GCTACTTAATTTTCATGCCGTCA-3’，如SEQ ID NO.10所示；以上述混合cDNA作为模板，扩增PtMYB158的编码序列。扩增产物通过常规方法进行回收、克隆和测序，最终获得PtMYB158的编码序列。
[0070] 实施例3 PtMYB158过量表达载体构建
[0071] 将PtMYB158的编码序列构建入植物双元表达载体ΔpCAMBIA1302流程见图1。ΔpCAMBIA1302是由传统的植物表达载体pCAMBIA1302改造而来的一个双元植物表达载体，其核苷酸序列如SEQ ID NO.4所示。改造过程为：将pCAMBIA1302载体中T-DNA区段含有的组成型的CaMV35S启动子(CaMV35S-P)(538bp)和报告基因GFP替换为组成型的CaMV35S启动子(CaMV35S-P)(835bp)和多克隆位点序列。
[0072] 利用BamHI和SalI酶切ΔpCAMBIA1302载体。利用BamHI和SalI将PtMYB158的编码序列从克隆载体上切下，将酶切下的片段连入到酶切后的ΔpCAMBIA1302，最终获得过量表达载体PtMYB158OE。所有限制性内切酶购自NEB公司，按照使用说明书操作。DNA片段的回收、连接等操作按前述常规操作方法进行。
[0073] 实施例4杨树的遗传转化
[0074] 通过根癌农杆菌介导转化法，获得多个过量表达PtMYB158的杨树候选转基因植株。根癌农杆菌介导转化法中使用的培养基见表2，具体操作如下：
[0075] (1)将携带遗传转化载体的农杆菌单菌落接种于含有50mg/L Kan和50mg/L Rif的液体YEB培养基中，置于28℃摇床(200rpm)震荡培养至OD600＝0.8～1.0，离心收集菌体，使用WPM重悬液重悬菌体，28℃震荡培养1～2h(OD600≈0.6)，置于冰上，作为侵染液，用于转化。
[0076] (2)剪取4周之内的组培苗幼嫩叶片(从顶端向下1～4片叶)和茎节(从顶端向下1～4节)，将叶片切成0.5×0.5cm2的小块，将茎节切成0.5～1cm长的茎段，置于侵染液中悬浮10～15min。
[0077] (3)将侵染后的外植体吸去表面多余菌液，然后平铺于CM1培养基上，25℃避光培养2d。
[0078] (4)将外植体转接到CM2培养基中，25℃避光培养3～4周，期间每10-14天更换一次培养基。
[0079] (5)待外植体切口处出现白色或淡黄色的愈伤组织时，将外植体转接到CM3培养基中，放置于光下诱导出芽。
[0080] (6)待不定芽生长至1～2公分时，将其切下转接到CM4培养基中，一周左右不定根开始出现。
[0082] 表2根癌农杆菌介导的杨树遗传转化用培养基
[0083]
[0084] WPM:Lloyd&McCownWoodPlantBasalMediumwithVitamins，货号：L449。
[0085] 实施例5过量表达PtMYB158的杨树转基因植株的检测
[0086] 对候选植株进行检测，筛选转基因阳性植株。
[0087] 首先，检测携带有PtMYB158基因的T-DNA区段是否整合到杨树基因组上。提取候选转基因植株的基因组DNA，提取步骤按前述常规操作方法进行。利用引物5’-TGCTCCATACAAGCCAACC-3’，如SEQ ID NO.11所示；5’-TGTCCTGCGGGTAAATAGC-3’，SEQ ID NO.12所示；以候选转基因植株的基因组DNA为模板，PCR扩增潮霉素抗性基因hptII，hptII基因扩增片段(594bp)的核苷酸序列如SEQ ID NO.13所示，具体为：TGCTCCATACAAGCCAACCACGGCCTCCAGAAGAAGATGTTGGCGACCTCGTATTGGGAATCCCCGAACATCGCCTCGCTCCAGTCAATGACCGCTGTTATGCGGCCATTGTCCGTCAGGACATTGTTGGAGCCGAAATCCGCGTGCACGAGGTGCCGGACTTCGGGGCAGTCCTCGGCCCAAAGCATCAGCTCATCGAGAGCCTGCGCGACGGACGCACTGACGGTGTCGTCCATCACAGTTTGCCAGTGATACACATGGGGATCAGCAATCGCGCATATGAAATCACGCCATGTAGTGTATTGACCGATTCCTTGCGGTCCGAATGGGCCGAACCCGCTCGTCTGGCTAAGATCGGCCGCAGCGATCGCATCCATAGCCTCCGCGACCGGTTGTAGAACAGCGGGCAGTTCGGTTTCAGGCAGGTCTTGCAACGTGACACCCTGTGCACGGCGGGAGATGCAATAGGTCAGGCTCTCGCTAAACTCCCCAATGTCAAGCACTTCCGGAATCGGGAGCGCGGCCGATGCAAAGTGCCGATAAACATAACGATCTTTGTAGAAACCATCGGCGCAGCTATTTACCCGCAGGACA。hptII抗性基因位于T-DNA区段中，可用于检测T-DNA区段是否整合到杨树基因组中。PCR扩增hptII标记基因的结果如图3所示，其中1：DL2000 Marker；2：阴性对照(以野生型毛白杨基因组DNA为模板PCR扩增)；3-22：转基因植株(以PtMYB158转基因毛白杨基因组DNA为模板PCR扩增)，表明携带有PtMYB158基因的T-DNA区段成功整合到杨树基因组上。
[0088] 然后，检测杨树转基因植株中PtMYB158的转录水平。分别提取对照植株和转基因植株的RNA，反转录合成cDNA一链，以此为模板进行RT-qPCR检测，RT-qPCR的检测引物如表1所示。反转录和RT-qPCR操作步骤按前述常规操作方法进行。RT-qPCR检测结果表明(图4)，与对照植株相比，PtMYB158在转基因植株中的表达量显著提高。
[0089] 实施例6过量表达PtMYB158改变杨树植株形态
[0090] 在杨树中过量表达PtMYB158后，杨树不能够直立生长(图5)。比较对照植株和PtMYB158过表达植株的株高、茎直径、茎节长度，发现PtMYB158过表达植株的株高、茎直径、茎节长度显著减小(图6)。
[0091] 实施例7过量表达PtMYB158导致杨树细胞壁细胞厚度减小
[0093] (1)利用双面刀片将对照植株和PtMYB158过表达植株的第9茎节进行横切，然后将切块迅速投入预冷的固定液中，固定液含3％戊二醛和0.1M PB(pH 7.2)，在固定液中将茎块切割成0.5mm以下的薄片。
[0095] (3)利用0.1M PB(pH 7.2)充分漂洗材料3～4次，约30Min/次。
[0096] (4)利用1％锇酸固定材料2h。
[0097] (5)利用0.1M PB(pH 7.2)充分漂洗材料3～4次，约30Min/次。
[0098] (6)对材料进行乙醇系列脱水：10％乙醇，30min，冰上；30％乙醇，30min，冰上；70％乙醇，30min，冰上；80％乙醇，30min，室温；95％乙醇，30min，室温；100％乙醇，30min，室温。
[0099] (7)利用乙醇：丙酮(1:1，vol/vol)置换材料30min，然后利用纯丙酮置换材料2次，每次30min。
[0100] (8)丙酮：树脂(3:1，vol/vol)置换材料2～3h；丙酮：树脂(1:1，vol/vol)置换材料2～3h，丙酮；树脂(1:3，vol/vol)置换材料2～3h；纯树脂置换材料8h。
[0101] (9)将材料置于新鲜纯树脂中，60℃烘箱中聚合至少24h。树脂样品制备完成后，置于携带有钻石刀的切片机上进行切片。将制备完成的超薄切片置于铜网中在透射电子显微镜下观察细胞壁的厚度，观察及分析结果参见图7，其中图7-A为对照植株和PtMYB158过表达植株的茎木质部区域的细胞形态；图7-B为对照植株和PtMYB158过表达植株木纤维细胞壁厚度的比较；图7-C为对照植株和PtMYB158过表达植株导管细胞壁厚度的比较。A、B和C图中，对照表示对照植株，转基因植株表示PtMYB158过表达植株。结果显示，与对照植株相比，PtMYB158过表达植株导管和纤维细胞壁厚度显著减小。
[0102] 以上所述仅是本发明的优选实施方式，应当指出，对于本技术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明原理的前提下，还可以做出若干改进和润饰，这些改进和润饰也应视为本发明的保护范围。
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