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WRKY转录因子多肽基因应用的载体和方法

阅读：491发布：2020-05-08

专利汇可以提供WRKY转录因子多肽基因应用的载体和方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明揭示了分离的多聚核苷酸和多肽，用于提高植物耐旱性的重组DNA载体，含有这些重组DNA载体的植物或种子，以及利用这些重组DNA载体的方法。重组DNA载体含有植物中有功能的启动子和与之连接的多聚核苷酸，其中，所述的多聚核苷酸编码转录因子WRKY多肽。，下面是WRKY转录因子多肽基因应用的载体和方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种分离的多聚核苷酸，其特征为增加所述多聚核苷酸的表达提高植物的耐旱性，所述多聚核苷酸由以下组成：(a)序列表中SEQ ID NO：3所示的序列，(b)序列表中SEQ ID NO：4所示的序列，(c)编码如序列表中SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列多肽的核酸序列，或(d)上述核酸序列(a)、(b)或(c)全长互补的核酸序列。
2.根据权利要求1，所述多肽的氨基酸序列由序列表中SEQ ID NO：5组成。
3.根据权利要求1，所述核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：3组成。
4.根据权利要求1，所述核苷酸序列由序列表中SEQ ID NO：4组成。
5.一种重组DNA载体，所述重组DNA载体包括权利要求1中分离的核酸序列和至少一个调控序列。
6.一种获得耐旱性提高的植物方法，包括获得转基因植物，所述获得的植物的基因组中含有重组DNA载体，其中，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸；所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；与对照植物相比，所述获得的植物显示增强的耐旱性。
7.根据权利要求6所述的一种获得耐旱性提高的植物方法，与对照植物相比，所述获得的植物显示增加的籽粒产量、生物量或两者。
8.根据权利要求6或7所述的方法，与所述对照植物相比，在水分限制条件下，所述获得的植物显示所述增加的籽粒产量、生物量或两者。
9.根据权利要求6或7所述的方法，所述获得的植物收获的种子的基因组中含有重组DNA载体，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连多聚核苷酸；所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；与对照植物相比，由所述种子长出的植物显示至少一个增加的性状，所述性状选自耐旱性、籽粒产量和生物量。
10.提高植物耐旱性的方法，其包括(a)将重组DNA载体转入植物再生细胞，其中，重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；(b)由步骤(a)的植物再生细胞再生转基因植物，其中转基因植物的基因组中含有重组DNA载体；(c)获得步骤(b)转基因植物的子代植物，其中所述子代植物的基因组中含有重组DNA载体，与对照植物相比，所述子代植物显示增强的耐旱性。
11.改善植物耐旱性的方法，其包括(1)将权利要求6或7所获得的任意植物与另一个植物进行杂交，产生的子代种子；(b)收获和种植子代种子以获得至少一个子代植株；(c)将子代植物与另一个植物品种杂交，产生至少一个回交子代种子；可选的，(d)多次重复步骤(b)和(c)，产生比所选植物品种具有更高耐旱性植物。
12.评价植物耐旱性的方法，其包括(a)获得转基因植物，其中，转基因植物的基因组中含有重组DNA载体，所述的重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；(b)获得转基因植物的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有重组DNA载体；(c)以不含有所述重组DNA载体的植物为对照，评价子代植物的耐旱性；与对照植物相比，转基因子代植物的耐旱性增加了。
13.确定植物籽粒产量、生物量或两者变化的方法，其包括(a)获得转基因植物，其中，转基因植物的基因组中含有重组DNA载体，所述重组DNA载体包括至少一个调控元件，和与之相连的多聚核苷酸，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列为SEQ ID NO：5；(b)获得转基因植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因组中含有重组DNA载体；(c)测定子代植物的籽粒产量和/或生物量，并将所述测定与对照植物的籽粒产量和/或生物量进行比较；
与对照植物相比，转基因子代植物的所述籽粒产量和/或生物量增加了。
14.根据权利要求13的方法，转基因子代植物和对照植物的籽粒产量和/或生物量是在水分限制条件下测定的。
15.根据权利要求6、7和10-14的任一方法，所述植物选自水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
16.提高田间种植水稻耐旱性的方法，其包括(a)在水稻中表达编码水稻WRKY66转录因子的重组核酸；(b)在作物的生长季节，田间种植水稻，其中，并使水稻置于干旱条件下；和(c)提高水稻的耐旱性，其中所述水稻WRKY66转录因子编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
17.提高田间种植水稻的产量的方法，其包括(a)在水稻中表达编码WRKY66转录因子的重组核酸；(b)在作物生长季节，田间种植水稻，其中水稻植株遭受干旱胁迫；和(c)提高水稻的籽粒产量，其中所述水稻WRKY66转录因子编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。
18.获得耐旱性提高的水稻植株的方法，包括获得转基因水稻植株，其与对照水稻相比，具有增加的OsWRKY66基因表达水平；并使转基因水稻植株在干旱条件下生长，其中所述OsWRKY66基因编码的氨基酸序列如SEQ ID NO：5所示。

说明书全文

WRKY转录因子多肽基因应用的载体和方法

技术领域

[0001] 本发明涉及植物育种和遗传学，特别是，涉及用于提高植物耐旱性能的重组DNA载体。

[0002] 发明背景

[0003] 非生物胁迫是世界范围内引起作物减产的主要原因，每年会造成主要作物减产50％以上(Boyer，J.S.(1982)Science218：443-448；Bray，E.A.等(2000)In Biochemistry and Molecular Biology of Plants，edited by Buchannan，B.B.等，Amer.Soc.Plant Biol.，pp.1158-1249)。干旱是所有非生物胁迫中影响作物产量最主要的因素，在植物生长发育阶段，干旱会激活植物各种不同生理和发育变化。近年来，尽管对非生物胁迫响应的分子机制和植物耐旱性的遗传调控网络进行了广泛的研究(Valliyodan，B.和Nguyen，H.T.(2006)Curr.Opin.Plant Biol.9：189-195；Wang，W.等(2003)Planta218：1-14；Vinocur，B.和Altman，A.(2005)Curr.Opin.Biotechnol.16：123-132；Chaves，M.M.和Oliveira，M.M.(2004)J.Exp.Bot.55：2365-2384；Shinozaki，K.等(2003)Curr.Opin.Plant Biol.6：410-
417；Yamaguchi-Shinozaki，K.和Shinozaki，K.(2005)Trends Plant Sci.10：88-94)，但是植物如何感受、传导干旱胁迫信号和其耐旱性的生物化学和分子机制仍然是生物学研究中面临的一个主要挑战。

[0004] 早期非生物胁迫响应分子方面的研究主要借助差异和/或加减法分析(Bray，E.A.(1993)PlantPhysiol.103：1035-1040；Shinozaki，K.和Yamaguchi-Shinozaki，K.(1997)PlantPhysiol.115：327-334；Zhu，J.-K.等(1997)Crit.Rev.Plant Sci.16：253-277；Thomashow，M.F.(1999)Annu.Rev.Plant Physiol.Plant Mol.Biol.50：571-599)；和其它的方法，如分离候选基因，分析胁迫条件下该基因的表达或活性产物，或进行特定胁迫条件下功能互补分析(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)Physiologia Plantarum112：152-166)。另外，用于鉴定和分离调控基因突变体的正向和反向遗传学研究为胁迫条件下基因表达的变化提供了证据(Xiong，L.和Zhu，J.-K.(2001)Physiologia Plantarum112：152-166)。

[0005] 激活标签可以用于鉴定影响植物性状的基因，这一方法已经用于模式植物拟南芥的研究中(Weigel，D.等(2000)PlantPhysiol.122：1003-1013)。转录增强子序列的插入主要激活和/或提高邻近内源基因的表达，因此该方法可以用于分离具有重要农艺性状表型的基因，包括提高非生物胁迫如耐旱性的基因。

[0006] WRKY转录因子是植物中发现的N-端含有WRKYGQK高度保守氨基酸序列的转录调控因子，它能够与(T)(T)TGAC(C/T)序列(W-box)发生特异性作用，调节启动子中含W-box元件的调节基因和/或功能基因的表达，从而参与植物的各种防卫反应，调节植物的生长发育。作为WRKY转录因子家族中的一员，水稻WRKY转录因子66(OsWRKY66)也含有保守的WRKYGQR氨基酸序列。

[0007] 发明概述

[0008] 本发明包括以下具体实施例：

[0009] 1.分离的多聚核苷酸包括(a)编码一个多肽的核酸序列，其中，该多肽的氨基酸序列与SEQ ID NO：5所示的氨基酸序列一致性至少为90％；(b)序列表中SEQ ID NO：3所示的序列；(c)序列表中SEQ ID NO：4所示的序列；(d)与核酸序列(a)、(b)或(c)的全长核苷酸一致性大于等于85％的核酸序列；(e)上述核酸序列(a)、(b)、(c)或(d)的全长互补核酸序列，其中全长互补序列与核酸序列含有相同的核苷酸数目，并100％的互补；多肽包括序列表中的SEQ ID NO：5的氨基酸序列，核酸序列包括序列表中的SEQ ID NO：3和4的核苷酸序列。

[0010] 2.重组DNA载体包括实例1中分离的多聚核苷酸，其与至少一个可操作的调控序列连接。

[0011] 3.基因组中含有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体的植物，其中，所述多聚核苷酸编码WRKY66转录因子(WRKY66)多肽，通过本发明中所述的GAP参数测定，可知上述WRKY66多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列的一致性至少为85％；所述植物与对照植物相比具有较高的耐旱性。

[0012] 4.基因组中整合有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体的植物，其中，所述多聚核苷酸编码一个多肽，通过本发明中所述的GAP参数测定，可知其氨基酸序列与序列表中SEQ IDNO：5的氨基酸序列的一致性至少为85％；与对照植物相比，所述植物显示至少一个农艺性状的变化；可选的，在水分限制条件下，与对照植物相比，所述植物显示所述至少一个农艺性状的变化；所述农艺性状可以是籽粒产量或者生物量；所述的变化可以是增加。

[0013] 5.上述实例3和4中所述的植物，可以是水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

[0014] 6.上述实例3、4或5的植物种子，所述植物种子的基因组中整合有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，其中，所述的多聚核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与序列表SEQ ID NO：5的氨基酸序列的一致性至少为85％；所述种子长出的植物与对照植物相比，具有较高的耐旱性，或至少一个农艺性状的变化，或两者；所述至少一个农艺性状可以是籽粒产量、生物量或其组合；所述的变化可以是增加。

[0015] 7.提高植物耐旱性的方法包括(a)使用与至少一个调控序列连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体转化植物再生细胞，其中，所述多聚核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5氨基酸序列的一致性至少为85％；(b)由步骤(a)的植物再生细胞再生基因组中含有构建的重组DNA载体的转基因植物；(c)获得由步骤(b)获得的再生植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因组中含有构建的重组DNA载体，且与野生型植物相比，所述子代植物具有较高的耐旱性。

[0016] 8.提高植物耐旱性的方法还包括(a)将实例3、4或5的植物与另一植物杂交，生产子代种子；(b)收获并种植子代种子，生产下一个子代的植物；(c)将子代植物与该另一植物杂交，获得至少一个回交的子代种子；可选的，(d)多次重复步骤(b)和(c)，获得比该另一植物具有较高耐旱性的植物。

[0017] 9.评价植物耐旱性的方法包括(a)获得转基因植物，其中，转基因植物的基因组中整合有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，所述多聚核苷酸编码一个多肽，其氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列的一致性至少为85％；(b)获得转基因植株的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有构建的重组DNA载体；(c)与对照植物相比，评价子代植物的耐旱性。

[0018] 10.确定植物中至少一个农艺性状变化的方法：(a)获得转基因植物，其基因组中含有与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，其中，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列的一致性至少为85％；(b)获得转基因植物的子代植物，其中，子代植物基因组中含有构建的重组DNA载体：(c)与对照植物对比，确定子代植物是否具有所述的至少一个农艺性状的变化；可选的，步骤(c)包括在水分限制条件下确定转基因植物是否具有至少一个农艺性状的变化；所述的至少一个农艺性状可以是籽粒产量、生物量或者其组合；所述的变化可以是增加。

[0019] 11.上述7-11所述的任一方法，其中，植物可以是水稻、玉米、大豆、向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。

[0020] 12.含有能够增强内源多聚核苷酸表达的重组转录激活子元件的水稻植株，其中，多聚核苷酸编码的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列一致性为90％。

[0021] 13.提高田间种植水稻耐旱性的方法包括(a)在水稻中表达编码水稻WRKY转录因子的重组核酸；(b)在作物的生长季节，田间种植水稻，且水稻置于干旱条件下；和(c)提高水稻的耐旱性。

[0022] 14.提高田间种植水稻的产量的方法包括(a)在水稻中表达编码WRKY转录因子的重组核酸；(b)在作物生长季节，田间种植水稻，且水稻植株遭受干旱胁迫；和(c)提高水稻的籽粒产量。

[0023] 15.鉴定增加OsWRKY66多肽表达或活性的OsWRKY66等位基因的方法包括(a)进行T-DNA插入水稻突变体库的筛选；(b)鉴定一个或多个突变体，其显示增强的OsWRKY66多肽或者其同族体的表达或者活性；和(c)从突变体中鉴定OsWRKY66等位基因或者其同族体。

[0024] 16.筛选OsWRKY66等位基因的方法包括(a)使用OsWRKY66的寡核苷酸引物序列测定从一个或者多个突变体中分离的一个或多个基因组DNA片段序列；(b)分析OsWRKY66基因的调控区或者编码区DNA序列的不同；和(c)确定OsWRKY66等位基因与植物耐旱性或籽粒产量提高的关系。

[0025] 17.基因组中含有提高OsWRKY66多肽表达的重组载体的水稻，其中，多肽序列包括序列表中SEQ ID NO：5的序列。

[0026] 在其他具体实施例中，本发明主要揭示了与至少一个调控序列连接的本发明中分离的多聚核苷酸构建的重组DNA载体，和含有该重组DNA载体的细胞、植物或种子；所述细胞可以是酵母、昆虫或植物细胞等真核细胞，也可以是细菌细胞等原核细胞。

[0027] 附图和序列表的简要说明

[0028] 下面的详细说明、附图和序列表有助于全面了解本发明。

[0029] 图1.转基因水稻叶片中OsWRKY66基因表达水平的real-time PCR分析。因未检测到OsWRKY66基因在对照水稻(DP0005)中表达，故设DP0010.13水稻叶片中OsWRKY66基因表达水平为1.00，其他转基因事件中的OsWRKY66基因表达水平如图数字所示。

[0030] 图2.海南省干旱试验期间实验地中水稻不同发育期的土壤含水量。

[0031] 图3.过表达水稻OsWRKY66基因提高了拟南芥(AtDP0010-6、AtDP0010-10和DP0010-13)的耐旱性。A.拟南芥中OsWRKY66基因的半定量PCR分析；B.复水第三天时拟南芥的存活率；C.复水第三天时拟南芥的生长状况。WT代表野生型Columbia，VC代表DP0009转化株。

[0032] 表1.序列表中核苷酸序列和氨基酸序列编号

[0033] 表2.AH01460水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析

[0034] 表3.T0代CaMV35S Pro：OsWRKY66水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析

[0035] 表4.T2代CaMV35S Pro：OsWRKY66水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析

[0036] 表5.T2代CaMV35S Pro：OsWRKY66水稻株系在田间干旱胁迫后籽粒产量分析

[0037] 表1.序列表中核苷酸序列和氨基酸序列编号

[0038]

[0039] 序列表包含单字母的核苷酸序列和三字母的氨基酸序列，遵照Nucleic Acids Res.13：3021-3030(1985)和BiochemicalJ.219(No.2)：345-373(1984)描述的IUPAC-IUBMB标准。核苷酸序列和氨基酸序列数据使用的符号和格式遵照37C.F.R.§1.822的规章。

[0040] 发明详述

[0041] 本发明提到的文献均作为参考。

[0042] “WRKY转录因子66多肽”是一种WRKY转录因子。

[0043] 本发明中的单子叶植物包括禾本科的植物；双子叶植物包括十字花科、豆科和茄科的植物。

[0044] “全长互补序列”是指给定核苷酸序列的互补序列，其中，互补序列和给定核苷酸序列含有相同的核苷酸数，并且100％的互补。

[0045] “表达序列标签”(EST)是从cDNA文库中获得的DNA序列，代表已经转录的序列。EST是从随机选择的cDNA克隆进行5′端和3′端单一次测序获得短的cDNA部分序列。一个完整cDNA插入序列被称为“全插入序列”(“FIS”)。一个“叠连群”是由两个或更多从EST、FIS和PCR序列中挑选的序列组合而成。“完全基因序列”(“CGS”)指能够编码完整或功能蛋白的序列，源自于FIS或叠连群。

[0046] “性状”包括植物或特定植物材料或细胞的生理的、形态的、生化的或物理的特征。在一些实施例中，这些特征可以是肉眼可见的，比如种子、植株的大小等，可用生物化学技术测定的指标，如种子或叶片中蛋白、淀粉或油份的含量等；可观察的代谢或生理过程，如测定对水分胁迫、盐、糖或氮浓度的耐性，可检测的基因表达水平，或可观察渗透胁迫的耐性或产量等农艺性状。

[0047] 可测量的“农艺性状”包括但不限于叶片绿色、籽粒产量、生长速率、总生物量或积累速率、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物组织氮含量、植物总自由氨基酸含量、果实自由氨基酸含量、种子自由氨基酸含量、植物组织自由氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物组织蛋白质含量、耐旱性、氮的吸收、根的倒伏、收获指数、茎的倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序的大小、早期苗的活力和低温胁迫下的出苗状况。

[0048] 在评价转基因植物的性能时，可以以对照植物为对照，测定转基因植物增加的生物量，如增加的株高、植株的总叶面面积、植物鲜重、植物干重或植物种子产量。

[0049] 同时，转基因植物能够增加生物量或大小的能力具有多种重要的可商业化的应用，如作物栽培品种可以产生较高叶片部分的产量，用于食物、饲料、纤维和/或生物燃料。

[0050] 人们对叶片大小的增加特别有兴趣。增加的叶片的生物量可用于增加植物源药或工业产品的生产，分蘖数的增加可以增加产量，增加植物叶片面积可提高植物总的光合作用，增加的光合合成能力可以用于增加特定植物组织包括叶片、根、果实或种子的产量，并使植物在低光强或高光强下生长。

[0051] 其它组织如根的生物量的改变有利于提高植物在严酷条件下生长的能力抵御干旱、营养贫瘠等胁迫，因为大量的根系可以更好地吸收水分和营养。

[0052] 对于观赏植物，能够提供较大的品种的能力是人们所期望的，许多植物包括果树，用于木材生产的树，作为视图或风帘的乔木或灌木，可以通过增加其大小以获得较大的产量或增加屏障。

[0053] “转基因的”细胞、细胞系、愈伤、组织、植物部分或植物指不同核酸(如重组DNA载体)的转入改变了它们的基因组，其包括那些起始的转基因株系和杂交或无性繁殖产生的后代植物。本发明中使用的“转基因的”不适用于传统植物育种而导致的染色体的或染色体外的基因组改变，或随机异花授粉、非重组病毒转染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变而自然引起的事件。

[0054] “对照植物”或“对照植物细胞”为测定受测试植物或植物细胞的表型变化提供参考，由于转化，受测植物或植物细胞的基因组改变影响到目的基因，测试的植物或植物细胞可以是转基因植物或转基因植物细胞的子代。

[0055] 对照植物或对照植物细胞包括(a)用于基因改变产生受测植物或细胞的野生型植物或细胞；(b)具有相同基因组作为起始材料但是转入空载体(如带有标记基因的并对目标的性状没有影响的载体)的植物或植物细胞；(c)转基因植物或植物细胞性状分离，获得的非转基因的子代植物或植物细胞；(d)没有暴露于可以诱导基因表达的条件或刺激下的，与转基因植物或植物细胞基因组相同的植物或植物细胞；(e)特定的目标基因不表达情况下的，转基因植物或者植物细胞本身。

[0056] “基因组”包括细胞核中的染色体DNA，和线粒体、质体等亚细胞器中的细胞器DNA。

[0057] “植物”包括整株植物、植物器官、植物组织、种子和植物细胞、及它们的子代，植物细胞包括但不限于种子细胞、悬浮培养物、胚胎、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、嫩枝、配子体、孢子体、花粉和小孢子。

[0058] “子代”指一植物的后代。

[0059] “转基因植物”包括基因组中含有不同来源的多聚核苷酸的植物，如不同的多核苷酸稳定地整合在基因组中，而且多聚核苷酸能够传递到后代中。不同的多聚核苷酸可能单独整合在基因组中，也可以作为重组DNA载体的一部分。T0代植株直接从转化和再生过程获得，T0代植物的子代被称为T1(第一个子代)，T2(第二个子代)等。

[0060] “异源的”序列表示一个序列来源于不同物种，或即使是同一个物种，序列被人为修饰以后与原来的组成和/或基因组位点不同。

[0061] “多聚核苷酸”、“核酸序列”、“核苷酸序列和“核酸片段”都是指单链或双链RNA或DNA的聚合物；可选的，包含合成、非天然或者改变的核苷酸碱基。核苷酸(通常5′端是一磷酸盐形式)包括“A”腺苷酸或脱氧腺苷酸，“C”胞嘧啶核苷酸或脱氧胞嘧啶核苷酸，“G”鸟嘌呤核苷酸或脱氧鸟嘌呤核苷酸，“U”表示尿嘧啶核苷酸，和“T”脱氧胸苷酸。“R”代表嘌呤(A或G)，“Y”代表嘧啶(C或T)，“K”代表G或T，“H”代表A、C或T，“I”代表次黄嘌呤苷，和“N”代表任意核苷酸。

[0062] “多肽”、“肽”、“氨基酸序列”和“蛋白质”在这里互用并指氨基酸聚合物。这些概念也适用于天然发生的氨基酸聚合物和含有一个或多个人工修饰氨基酸的氨基酸聚合物。这些概念同样适用于糖基化，脂化，硫基化，谷氨酸羧基化，羟基化，和ADP核糖苷化等的氨基酸聚合物。

[0063] “信使RNA(mRNA)”是指没有内含子，能翻译成蛋白质的RNA。

[0064] “cDNA”是指以mRNA为模板反转录扩增获得的，并与mRNA互补的DNA，cDNA可以是单链DNA，也可以是通过DNA聚合酶I的Klenow片段催化合成的双链DNA。

[0065] “成熟的”蛋白质是指经过翻译后加工的多肽，也就是说已经去除初始翻译产物中前体肽(pre-或pro-peptide)。

[0066] “前体”蛋白质指mRNA翻译的初始产物，也就是说仍有前体肽(pre-或pro-peptide)存在，前体肽可以是但不局限于胞内定位信号肽。

[0067] “分离的”核酸分子和/或蛋白本身是游离的或者相反是从其它组分分离的。分离的多聚核苷酸可以是从宿主细胞纯化，本领域的技术人员熟悉的传统的核酸提取方法用于分离多聚核苷酸，分离仍然包括重组多聚核苷酸和化学合成多聚核苷酸。

[0068] “重组子”指两个相互分离的序列片段的人工结合物，如化学合成或通过基因工程技术操作将分离的核酸片段连接在一起的结合物。“重组子”也包括通过转入不同的核酸而修饰的细胞或载体，或来源于修饰细胞的细胞。但是，重组子不包括自然发生的细胞或载体的改变(如自发突变、自然转化/转导/转座)，如非人为的干扰。

[0069] “重组DNA载体”指自然条件下不会出现的核酸片段的组合，相应的，一个重组DNA载体可能包括不同来源的调控序列和编码序列，或相同来源的调控序列和编码序列，但是排列方式与自然界中存在的不同。

[0070] “进入克隆”和“进入载体”在这里互用。

[0071] “调控序列”指位于编码序列上游(5′端非编码序列)、内部、或下游(3′端非编码区)的，并影响转录、RNA加工或稳定性，或相连编码序列翻译的核苷酸序列。调控序列包括但不限于启动子、翻译引导序列、内含子和polyA识别序列。本文中“调控序列”和“调控元件”可以互用。

[0072] “启动子”指能够控制另一个核酸片段转录的核酸片段。

[0073] “在植物中有功能的启动子”指可以在植物细胞中控制基因转录的启动子，与其是否来源于植物细胞无关。

[0074] “组织特异性启动子”和“组织偏爱性启动子”都指主要在但不必仅在某一组织或器官起作用的启动子，也可能在一个特定的细胞或细胞类型中表达。

[0075] “发育调控性的启动子”指受发育阶段调控的启动子。

[0076] “可操作的连接”指将核苷酸片段连接在一起，因此其中一个核酸片段的功能可以被另一个核酸片段调控。例如一个启动子与一个核酸片段可操作的连接，那么它可以调控核酸片段的转录。

[0077] “表达”指产生功能性的产物，如核酸片段的表达是指核酸片段的转录(产生mRNA或功能性RNA)和/或mRNA的翻译合成前体或成熟蛋白质。

[0078] “表型”指一个细胞或组织可检测的特征。

[0079] “引入”指将构建的重组DNA等核酸片段插入细胞中，意为“转染”、“转化”或“转导”，包括将核酸片段插入真核或原核细胞，核酸片段可以插入细胞染色体、质粒、质体或线粒体DNA等基因组，转变为自主复制子或瞬时表达(如转染mRNA)。

[0080] “转化细胞”指引入构建的重组DNA载体等核酸片段的细胞。

[0081] “转化”包括稳定转化和瞬时转化。“稳定转化”指将核酸片段转化入宿主的基因组中导致遗传学上的稳定遗传。一旦被稳定转化，核酸片段将稳定地整合在宿主植物和其子代植物的基因组；“瞬时转化”指核酸片段转入宿主植物的细胞核或含有DNA的细胞器中，产生瞬时表达而并不稳定遗传。

[0082] “等位基因”指占据染色体同一位点的突变的基因。当一对同源色体上的等位基因是相同的时，这个双倍体植物在这个位点上是纯合的。相反，如果一对同源色体上的等位基因不同时，这个双倍体植物在这个位点上是杂合的。如果转化的基因只存在于一对同源色体的一条上时，这个双倍体植物在这个位点上是杂合的。

[0083] “叶绿体转移肽”指一段氨基酸序列与某一蛋白质一同翻译，并指引蛋白质转移到同一细胞的叶绿体或其他质体中；“叶绿体转移序列”指编码叶绿体转移肽的核酸序列；“信号肽”指与某一蛋白质一同翻译的氨基酸序列，并指引该蛋白质转运到分泌系统中(Chrispeels.(1991)Ann.Rev.Plant Phys.Plant Mol.Biol.42：21-53)；如果某一蛋白质是定位在液泡中的，那么该蛋白质前体会连接液泡目标信号(supra)；如果某一蛋白是定位在内质网中，那么内质网保留信号(supra)会与转运到内质网的蛋白质连接；转运到细胞核的蛋白质会与核定位信号相连(Raikhel.(1992)Plant Phys.100：1627-1632)；“线粒体信号肽”指一段氨基酸序列指引前体蛋白质转运到线粒体(Zhang和Glaser.(2002)
TrendsPlant Sci7：14-21)。

[0084] 目前已知有多种可以用来研究各种多聚核苷酸和多肽序列之间关系的方法。本发明中，“参考序列”作为解释序列而充当序列比对的基础。参考序列可以是一条完整的特定序列，也可以只是其中的一个子集，例如全长cDNA/基因的序列片段，抑或完整的cDNA/基因序列。此处用到的“比对窗口”，是将共有的或者特定的多聚核苷酸或多肽序列片段作为参考，然而比较窗口的序列可能会包含添加或删除(换言之既间隙)，与参考序列(参考序列没有添加或者删除)相比，前者可以实现两条序列的最优化联配。通常比对窗口中至少包含20个连续的碱基或氨基酸，还可以选择30、40、50、100甚至更长。本领域的技术人员为了避免因引入序列间隙而导致的与参考序列的高相似性，引入空位罚分，并减去相应的匹配数目。

[0085] 使用数学算法可以计算任意两条序列的序列一致性(百分比)。序列比对算法的例子包括Myers和Miller运算法则(CABIOS4：11-17，1988)；局部联配算法(smith等，Adv.Appl.Math.2：482，1981)；全局联配算法(Needleman和Wunsch，J. Mol.Biol.48：443-453，1970)；局部搜索联配算法(Pearson和Lipman，Proc.Natl.Acad.Sci.85：2444-2448，
1988)；和Karlin和Altschul运算法则(Proc.Natl.Acad.Sci.USA872264(1990)，Karlin和Altschul于1993年修订Proc.Natl.Acad.Sci.USA90：5873-5877)。

[0086] 计算机可以利用这些算法来确定序列的一致性，这些应用包括但不限于CLUSTAL in the PC/Gene Program(Intelligenetics，Mountain View，美国加州)；ALIGN(Ver2.0)和GCG Wisconsin遗传学软件包(Ver10)(Accelrys Inc.，9685美国加州圣地亚哥斯克兰顿路)中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA；和 bioinformatics computmg suite( Inc.，Madison，WI)的

[0087] 使用缺省参数就可以通过上述程序开展序列联配工作。Higgins等(Gene73：237-244，1988)，Higgins等(CABIOS5：151-153，1989)，Corpet等(NucleicAcidsRes.16：10881-
10890，1988)，Huang等(CABIOS8：155-165，1992)和Pearson等(Meth.Mo l.Biol.24：307-
331，1994)对CLUSTAL进行了详细的描述；ALIGN程序则以Myers和Miller提出的supra算法(1988)为基础。进行氨基酸序列比对时，当使用PAM120残基重量表，且空位罚分为12和空位罚分为4时，可以与ALIGN程序相结合对氨基酸序列进行比较。BLAST程序(Altschul等，J. Mol.Biol.215：403，1990)以Karlin和Altschul的supra算法(1990)为基础，可以使用BLASTN对核苷酸序列进行检索，score＝100，wordlength＝12，以获得本发明所涉及蛋白质对应编码核苷酸序列的同源序列；可以使用BLASTX，score＝50，wordlength＝3，以获得本发明所涉及蛋白质或多肽的同源氨基酸序列。Gapped BLAST(BLAST2.0)(Altschul等Nuc leic AcidsRes.25：3389，1997)可以用于Gap比对。作为一种选择，PSI-BLAST(BLAST2.0)可以开展交互式搜索，从而检测到亲缘关系较远的两个分子(Altschul等(1997)supra)。当使用BLAST时，Gapped BLAST、PSI-BLAST和相应程序的缺省参数(例如用于核甘酸序列的BLASTN，用于蛋白质的BLASTX)也可以一并使用(美国政府国立卫生研究院国立医学图书馆国家生物技术信息中心)。序列联配也可以用于人工检索。

[0088] 通过使用GAP(Ver10)和以下参数可以得到配对序列一致性/相似性值：使用GAP Weight50、Length Weight3以及nwsgapdna.cmp得分矩阵来计算核酸序列的一致性(％)和相似性(％)；使用GAP Weight8、Length Weight2以及BLOSUM62得分矩阵可以计算氨基酸序列的一致性(％)和相似性(％)；或者任何等同程序。任何序列比较程序都可以被看作“等同程序”，因为任意两条序列进行比较，都会产生一个联配结果，包含一致的核苷酸或氨基酸碱基配对。当与GAP Ver10所产生序列联配结果进行比较时，还会产生序列一致性百分比。

[0089] GAP利用Needleman和Wunsch算法(J.Mol.Biol.48：443-453，1970)，以发现两个全长序列联配的最大匹配数和最小间隙数。GAP考虑所有可能的联配和gap位点，并创造联配位点数目最大且gap数目结果，它允许匹配碱基单元中存在间隙创造罚分和间隙延展罚分，GAP必须利用每个插入间隙的间隙创造罚分匹配数，另外，如果选择间隙延展罚分大于0，GAP必须利用每个插入间隙的长度间隙次数，间隙延展罚分。GCG Wisconsin遗传学软件包Ver10中，缺省间隙创造罚分值和间隙延展罚分值分别为8和2，核苷酸序列中，缺省间隙创造罚分是50，缺省间隙延展罚分为3，间隙创造和间隙延展罚分可以是0-200中的整数，因此间隙创造和间隙延展罚分可以是0、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65或更大。

[0090] GAP作为最好的序列比对工具之一，而且在序列比对质量上表现最为优异。GAP主要表现四个比对的性能指数：质量、比率、一致性和相似性，质量指度量化为比对序列，比率指质量除以较短的片段中碱基数，一致性百分数指匹配符号的百分数，相似性百分数指类似符号的百分数。符号对面的差距被忽略，当配对符号得分矩阵值大于或等于0.50(相似性阈值)，需要计算相似度。GCG Wisconsin遗传学软件程序包(Ver10)使用的得分矩阵是BLOSUM62(Henikoff和Henikoff. Proc.Natl.Acad.Sci.USA89：10915，1989)。

[0091] 除非特别说明，本发明中的多序列比对采用Clustal V比对方法(Higgins和Sharp.(1989)CABIOS.5：151-153)和缺省参数(间隙罚分＝10，间隙长度罚分＝10)，两个比对的缺省参数和计算氨基酸序列一致性百分数使用Clustal V方法：KTUPLE＝1，间隙罚分＝3，窗口＝5和对角线拯救＝5；用于核酸序列的参数KTUPLE＝2，间隙罚分＝5，窗口＝4和对角线拯救＝4。序列比对后应用Clustal V程序，通过观察“序列距离”表，可以得到“一致性百分比”和“散度”值，除非特别说明，一致性百分比和散度值以相同的方式获得。

[0092] 本文中，当在特定比对窗口中最大一致性比对时，两个多聚核苷酸或多肽序列的“序列一致性”或“一致性”指参考两序列中残基相同，当序列一致性百分数用于提及的蛋白质，被认为不同残基位置与保守氨基酸替代不同，氨基酸残基被具有相似化学性质的其它氨基酸残基(如电荷或疏水性)替代，而不改变分子的功能特性，当序列在保守区替代不同，序列一致性百分数可以上调以更正替代的保守性，保守替代不同的序列被认为具有“序列相似性”或“相似性”。本领域的技术人员熟悉进行调整的方法，包括计算作为部分的而不是全长错配的保守替代，因而增加序列一致性百分数，因此，相同氨基酸给与1分，不保守的替代给与0分，保守替代给与0-1分，计算保守替代的得分，如在PC/GENE执行(Intelligenetics，Mountain View，加州)。

[0093] 本文中“序列一致性百分数”的计算包括确定两个序列中相同核苷酸碱基或氨基酸残基的位置数目，获得匹配位置数，然后将匹配的位置数除以比对窗口中位置总数再乘以100。

[0094] 本发明中使用的标准重组DNA和分子克隆技术为本领域技术人员熟知，在分子克隆-实验室手册(Sambrook，J.，Fritsch，E.F.和Maniatis，T.冷泉港实验室出版，冷泉港，下文中Sambrook)中详细描述。

[0095] 具体实施例包括分离的多聚核苷酸和多肽，构建用于提高作物耐旱性能的重组DNA载体；转化获得含有这些重组DNA载体的植物或种子等构成部分；和使用这些重组DNA载体的方法。

[0096] 分离的多聚核苷酸和多肽

[0097] 本发明揭示了以下分离的多聚核苷酸和多肽：

[0098] 分离的多聚核苷酸包括(i)根据Clustal V比对方法，编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的核酸序列；(ii)核酸序列(i)的全长互补序列，其中全长互补序列和核酸序列(i)含有相同的核苷酸数目，并且100％的互补；任意在前所述的分离的多聚核苷酸可以用于构建本发明的重组DNA载体(包括抑制DNA载体)。过表达编码的多肽可更好的增加植物的耐旱能力。

[0099] 根据Clustal V比对方法，分离的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5的序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％，多肽优选为OsWRKY66多肽，过表达该多肽可以更好地提高植物的耐旱能力。

[0100] 分离的多聚核苷酸包括：(i)根据Clustal V比对方法，与序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的核酸序列；(ii)根据Clustal V比对方法，与序列表中SEQ ID NO：4的核苷酸一致性至少为50％、51％、52％、
53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、
68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、
83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或者100％的核酸序列；(iii)核酸序列(i)或(ii)的全长互补序列。上述多聚核苷酸可用于本发明的构建重组DNA载体(包括抑制DNA载体)；分离的多聚核苷酸优选为可编码OsWRKY66多肽；过表达OsWRKY66多肽可提高植物的耐旱性能。

[0101] 重组DNA载体和抑制DNA栽体：

[0102] 一方面，本发明包括重组DNA载体(包括抑制DNA载体)

[0103] 在一个具体实施例中，构建的重组DNA包括在植物中有功能的启动子等至少一个调控序列和与其相连的一个多聚核苷酸，其中所述多聚核苷酸包括(i)根据Clustal V比对方法，编码的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或者100％的核酸序列；(ii)核酸序列(i)的全长互补序列。

[0104] 另一个具体实施例中，构建的重组DNA载体包括植物中有功能的启动子等至少一个调控序列，和与其相连的多聚核苷酸，其中所述的多聚核苷酸包括(i)根据Clustal V比对方法，与序列表中SEQ ID NO：3的核苷酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的核酸序列；(ii)根据Clustal V比对方法，与序列表中SEQ ID NO：4的核苷酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、
63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、
78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、
93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的核酸序列；(iii)核酸序列(i)或(ii)的全长互补序列。

[0105] 另一个具体实施例中，构建的重组DNA载体包括植物中有功能的启动子等至少一个调控序列，和与其相连的多聚核苷酸，其中，所述的多聚核苷酸编码WRKY66多肽。WRKY66多肽优选的可以提高植物的耐旱性能。WRKY66多肽可以来源于水稻(Oryzasativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、澎湖大豆(Glycine tabacina)、野生大豆(Glycine soja)、短绒野大豆(Glycine tomentella)等。

[0106] 另一方面，本发明还揭示了抑制DNA载体。

[0107] 一个构建的抑制DNA载体可能包括植物中有功能的启动子等至少一个调控序列，和与其相连的下述核酸序列：a)核酸序列(i)或(ii)的全部或部分，其中，(i)根据Clustal V比对方法，编码多肽氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5氨基酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或者100％的核酸序列，(ii)核酸序列(a)(i)的全长互补序列；(b)来源于目标基因正义链或反义链全部或一部分核酸片段，其中，根据Clustal V比对方法，所述核酸片段序列与获得该片段的正义链或者反义链的全部或一部分的序列一致性至少为
50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或者100％，所述目标基因编码WRKY66多肽；或(c)全部或部分(i)或(ii)或(iii)，其中，(i)是与序列表中SEQ ID NO：3核苷酸序列一致性至少为50％、
51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或者100％的核酸序列，或(ii)是与序列表中SEQ ID NO：4核苷酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、
62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、
77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、
92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％的核酸序列，(iii)核酸序列(c)(i)或(c)(ii)的全长互补序列。抑制DNA载体可能包括共抑制载体、反义载体、病毒抑制载体、发夹抑制载体、茎-环抑制载体、双链RNA生成载体、RNAi载体、小RNA载体(如siRNA载体或miRNA载体)。

[0108] 本领域技术人员意识到，本发明不仅包括发明中列举的示范序列，核酸片段的改变后在特定的位点产生化学性质相当的氨基酸，这种变化不影响编码多肽的功能。如果将编码疏水氨基酸丙氨酸的密码子替代为另一个稍不输水残基如甘氨酸，或更输水的氨基酸如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子，并不影响蛋白质的功能。同样的核酸序列的改变引起负电荷氨基酸残基之间的取代如天冬氨酸取代谷氨酸，或正电荷氨基酸残基之间的取代，如赖氨酸取代精氨酸，可以产生功能相似的蛋白质。5′或3′端核苷酸的改变引起的N-端或C-端的变化也可能不影响多肽的功能。

[0109] “抑制DNA载体”是一种重组DNA载体，当转化或稳定整合在植物基因组中后，会“沉默”植物中目标基因，目标基因可以是植物内源基因，也可以是通过基因工程手段转化的基因；本发明中的“沉默”主要针对目标基因，通常指抑制目标基因，降低mRNA或蛋白质/酶的水平，和/或酶活性或蛋白质的功能性。“沉默”或“基因沉默”不仅指分子机制，还包括反义、共抑制、病毒抑制、发夹抑制、茎-环抑制、RNAi途径和小RNA途径等多种方式。

[0110] 构建的抑制DNA载体包括来源于目标基因的片段，也可能包括目标基因正义链或反义链核酸序列的全部或部分，根据使用的方式，所选择的核酸片段与目标基因的正义链或者反义链的全部或部分序列一致性可能为100％，也可能低于100％(至少50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、
67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、
82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％或者99％)。

[0111] 构建抑制DNA载体是本领域的技术人员熟知的，一旦选定了目的基因就可以构建载体。抑制DNA载体包括共抑制载体、翻译载体、病毒抑制载体、发夹抑制载体、茎环抑制载体、双链RNA产生载体、RNA干扰(RNAi)载体、和小RNA载体如短干扰RNA(siRNA)和miRNA(microRNA)载体等。

[0112] “反义抑制”涉及产生反义RNA转录物可以抑制目标基因或mRNA的表达；“反义RNA”指可以与目的初始转录物或mRNA全部或部分互补的RNA转录物，可以阻碍目标核酸片段表达(美国专利号5,107,065)。反义RNA的互补性可以针对某一特定基因转录物的5′非编码区、3′非编码区、内含子、编码区等任一部分。

[0113] “共抑制”指产生正义RNA转录物可以抑制目的基因或基因产物的表达；“正义”RNA涉及RNA转录物，包括在细胞内或者生物体外翻译成蛋白质的mRNA，过去，植物中的共抑制载体用于在正义方向过表达与天然mRNA同源的核酸序列，因此减少所有与过表达序列同源的所有RNA(Vaucheret等(1998)Plant J.16：651-659；和Gura.(2000)Nature404：804-808)。

[0114] 申请号为WO98/36083的PCT申请(1998年8月20日公布)描述了另一种情况，使用植物病毒序列引导抑制最接近mRNA编码序列。

[0115] RNA干扰(RNAi)涉及动物细胞中短干扰RNAs(siRNA)(Fire等(1998)Nature391：806)介导的序列特异性转录后基因沉默(PTGS)过程，植物中的相应过程通常指PTGS或RNA沉默，真菌中相应过程指抑制。PTGS过程被认为是进化保守的细胞防御机制，用于防止外源基因的表达，并在不同的植物和动物中存在(Fire等(1999)Trends Genet.15：358)。

[0116] 小RNA在控制基因表达中发挥着重要的作用，如小RNA调控包括开花等多个发育过程，目前可以通过使用在植物中产生小RNA的转基因载体改变植物基因表达。

[0117] 小RNA通过碱基配对与互补的RNA或DNA目标序列结合发挥作用，当与RNA结合后，小RNA引发RNA切割或阻止目标基因的翻译，当与目标DNA序列结合后，小RNA介导目标序列的DNA甲基化，最终结果阻止基因的表达。

[0118] MicroRNAs(miRNAs)是动物和植物中都存在的非编码RNAs，大约19-24个核苷酸(nt)((Lagos-Quintana等(2001)Science294：853-858，Lagos-Quintana等(2002)Curr.Biol.12：735-739；Lau等(2001)Science294：858-862；Lee和Ambros.(2001)Science294：862-864；Llave等(2002)Plant Cell14：1605-1619；Mourelatos等(2002)Genes Dev.16：720-728；Park等(2002)Curr.Biol.12：1484-1495；Reinhart等(2002)Genes.Dev.16：1616-1626)，它们是由长度大约为70-200nt的前体转录物加工而来，这些前体转录物能够形成稳定的发夹结构。

[0119] miRNA通过与目标基因转录物中的互补序列的结合调控目标基因，miRNA可以有至少两条途径调控目标基因(1)翻译阻止，(2)RNA切割。进入RNA切割途径的miRNAs类似于动物RNAi和植物PTGS中产生的21-25nt的siRNAs，是RNA诱导的沉默复合体(RISC)的一部分。

[0120] 调控序列：

[0121] 本发明中构建的重组DNA载体(包括抑制DNA载体)包括至少一个调控序列。

[0122] 这个调控序列可以是启动子。

[0123] 许多启动子可以用于本发明构建的重组DNA载体中，可以根据期望的结果选择启动子。启动子可以是组成型的、组织特异性的、诱导型的或其它宿主植物中表达的启动子。

[0124] “组成型的启动子”通常可以使基因在大部分的细胞类型中在大部分时间表达。

[0125] 尽管评估了组成型启动子驱动下候选基因的效力，35S或UBI启动子调控的候选基因的高水平、组成型的表达具有多种效应。使用组织特异性的或胁迫诱导型启动子可以消除不希望产生的效应，同时保留提高耐旱性的能力。拟南芥中也观察到了这种效应(Kasuga等(1999)Nature Biotechnol.17：287-91)。

[0126] 植物宿主细胞中适宜的组成型启动子包括Rsyn7启动子的核心启动子，申请号为WO99/43838和美国专利号为6,072,050的专利中揭示的其它其它组成型启动子；CaMV35S核心启动子(Odell等(1985)Nature313：810-812)；水稻肌动蛋白(McElroy等(1990)Plant Cell2：163-171)；泛素(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)；pEMU(Last等(1991)Theor.Appl.Genet.81：581-588)；MAS(Velten等(1984)EMBOJ.3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。其它的组成型启动子包括美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,
785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611中讨论的启动子。

[0127] 本发明中的启动子，优选组织特异性的或发育调控性的启动子。

[0128] 组织特异性的或发育调控性的启动子是一段DNA序列选择性的调控植物细胞/组织中另一DNA序列的表达，如穗发育、种子形成等关键的细胞/组织，通常限制DNA序列在目标发育阶段表达(穗发育或种子成熟)。可鉴定的能够引起期望时空表达的启动子可用于本发明的方法中。

[0129] 本领域中有许多叶片优选的启动子已在下述文章中描述：Yamamoto等(1997)Plant J.12(2)：255-265；Kwon等(1994)Plant Physiol.105：357-367；Yamamoto等(1994)Plant Cell Physiol.35(5)：773-778；Gotor等(1993)Plant J.3：509-518；Orozco等(1993)Plant Mol.Biol.23(6)：1129-1138；和Matsuoka等(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA90(20)：9586-9590。

[0130] 本发明中使用的种子或胚胎特异性的启动子包括大豆Kunitz型胰蛋白酶抑制剂(Kti3，Jofuku和Goldberg.(1989)Plant Cell1：1079-1093)，豌豆子叶中的convicilin、豌豆球蛋白和豆球蛋白(Rerie，W.G.等(1991)Mol.Gen.Genet.259：149-157；Newbigin，E.J.等(1990)Planta180：461-470；Higgins，T.J.V.等(1988)Plant.Mol.Biol.11：683-695)，玉米胚乳中的玉米蛋白(Schemthaner，J.P.等(1988)EMBOJ.7：1249-1255)，菜豆子叶中的菜豆蛋白(Segupta-Gopalan，C.等(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.82：3320-3324)，菜豆子叶中的植物血球凝集素(Voelker，T.等(1987)EMBO J.6：3571-3577)，豌豆子叶中的B-大豆伴球蛋白和大豆球蛋白(Chen，Z-L等(1988)EMBO J.7：297-302)，水稻胚乳谷蛋白，大麦胚乳淳溶蛋白(Marris，C.等(1988)Plant Mol.Biol.10：359-366)，小麦胚乳麦谷蛋白和麸朊(Colot，V.等(1987)EMBO J.6：3559-3564)。嵌合基因构建体中种子特异性启动子与不同的编码区连接可以保持编码基因在转基因植物中的时空表达模式。这样的例子包括拟南芥2S种子储存蛋白基因的启动子调控脑啡肽多肽在拟南芥和芸苔种子中表达(Vanderkerckhove等(1989)Bio/Technology7：L929-932)，菜豆血凝素和菜豆β-菜豆蛋白启动子调控荧光素酶的表达(Riggs等(1989)Plant Sci.63：47-57)，小麦麦谷蛋白启动子调控氯霉素乙酰转移酶的表达(Colot等(1987)EMBO J6：3559-3564)。

[0131] 诱导型的启动子选择性的调控与之连接的DNA片段响应内部或外部刺激而表达，如响应化学诱导剂等化学物质、环境、激素、化学和/或发育信号等。诱导型或调控型的启动子包括光、热、胁迫、涝或干旱、植物激素、损伤、或化学制剂(乙醇、茉莉酸酯、水杨酸或者安全剂)等调控的启动子。

[0132] 一些具体实施例中使用的启动子包括(1)胁迫响应的启动子RD29A(Kasuga等(1999)Nature Biotechnol.17：287-291)，(2)胁迫诱导型启动子Rab17(Vilardel等(1991)Plant Mol.Bio.17：985-993；Kamp Busk等(1997)Plant J11(6)：1285-1295)；(3)调控玉米谷粒发育过程中花梗特异基因表达的大麦B22E启动子(“Primary Structure of a Novel Barley Gene Differentially Expressed in Immature Aleurone Layers”.Klemsdal，S.S等(1991)Mol.Gen.Genet.228(1/2)：9-16)；(4)玉米Zag2启动子(“Identification and molecular characterization of ZAG1，the maize homolog of the Arabidopsis floral homeotic gene AGAMOUS”，Schmidt，R.J.等(1993)Plant Cell5(7)：729-737；
“Structural characterization，chromosomal localization and phylogenetic evaluation of two pairs of AGAMOUS-like MADS-box genes from maize”，Theissen等(1995)Gene156(2)：155-166；NCBI GenBank登录号为X80206)，Zag2转录产物可以在授粉前
5天至授粉后7-8天检测到，并指引发育的雌性花蕊心皮部分的基因表达，Cim1是发育玉米谷粒核特异的启动子，可以在授粉前4-5天至授粉后6-8天检测到Cim1转录物。其它的启动子包括来源于雌性花发育的雌性相关基因的启动子。

[0133] 对于在发育种子组织中表达的多聚核苷酸，特殊的启动子包括种子首选的启动子，尤其是早期籽粒/胚胎启动子和晚期籽粒/胚乳启动子，授粉后籽粒的发育大致可以分为三个基本阶段，籽粒生长的停滞期起始于授粉后0天到10-12天，在此期间，籽粒不再明显的生长，但是决定籽粒活力的重要事件将在此期间发生(如细胞建成数目)。线性籽粒灌浆期起始于授粉后的10-12天并延续到授粉后的40天左右。在籽粒发育期间，籽粒达到最终的质量，并产生多种储藏物质如淀粉、蛋白质和油等；最终的成熟期起始于授粉后大约40天到收获，籽粒发育的这一过程中，籽粒开始休眠，变干。本发明中的“早期籽粒/胚乳启动子”指主要在种子发育的停滞期(也就是授粉第0天到授粉后第12天期间)驱动基因表达的启动子；“后期籽粒/胚乳启动子”主要驱动基因在授粉后12天到成熟过程中的种子中表达；表达窗口可能会有一些重叠，将根据使用的ABA偶联的序列和期望的表型选择启动子。

[0134] 早期籽粒/胚胎启动子包括，Cim1，授粉后第5天活跃在特定组织中(WO00/11177)；其它的早期籽粒/胚胎启动子包括种子偏爱启动子end1，在授粉后7-10天表达，和end2，授粉后9-14天在整个籽粒中表达，在授粉后10天在胚乳和果皮中表达(WO00/12733)。本发明中的特定方法使用的其它早期籽粒/胚乳启动子包括种子偏爱启动子ltp2(美国专利号5,
525,716)；玉米Zm40启动子(美国专利号6,403,862)；玉米nuclc(美国专利号6,407,315)；
玉米ckx1-2启动子(美国专利号6,921,815和美国专利申请公开号2006/0037103)；玉米lec1启动子(美国专利号7,122,658)；玉米ESR启动子(美国专利号7,276,596)；玉米ZAP启动子(美国专利申请公开号20040025206和20070136891)；玉米启动子eep1(美国专利申请公开号20070169226)；和玉米启动子ADF4(美国专利申请号60/963,878，2007年8月7日申请)。

[0135] 本发明中调控核酸序列在植物中表达的其它启动子是茎特异启动子，包括苜蓿S2A启动子(GenBank登录号EF030816；Abrahams等(1995)Plant Mol.Biol.27：513-528)和S2B启动子(GenBank登录号EF030817)和类似的启动子。

[0136] 启动子可以来源于一个完整的天然基因，也可以是由自然界中不同启动子的不同元件组成，甚至可以包括合成的DNA片段。

[0137] 本发明中特定的具体实施例使用的启动子包括RIP2、mLIP15、ZmCOR1、Rab17、CaMV35S、RD29A、B22E、Zag2、SAM合成酶、ubiquitin、CaMV19S、nos、Adh、蔗糖合成酶、R-等位基因、微管组织偏爱启动子S2A(Genbank登录号EF030816)and S2B(Genbank登录号EF030817)，和玉米(Zea mays)组成型启动子GOS2；根偏爱启动子，如玉米NAS2启动子，玉米Cyclo启动子(美国专利申请号2006/0156439，公布于2006年7月13日)，玉米ROOTMET2启动子(WO05063998，公布于2005年7月14日)，CR1BIO启动子(WO06055487，公布于2006年5月26日)，CRWAQ81(WO05035770公布于2005年4月21日)，和玉米ZRP2.47(NCBI登录号U38790；GI No.1063664)。

[0138] 本发明中构建的重组DNA载体可能还包括其他的调控序列，如翻译前导序列、内含子、polyA识别序列等。在特定的实施例中，重组DNA载体可能还包括增强子或沉默子。

[0139] 内含子可以添加在5′非翻译区、蛋白质编码区，或3′非翻译区以增加细胞质中成熟信使RNA的表达量。研究表明，动物细胞和植物细胞的表达载体中在转录单元中含有可拼接的内含子，可以使基因表达在mRNA和蛋白质的水平提高1,000倍(Buchman和Berg.(1988)Mol.Cell Biol.8：4395-4405；Callis等(1987)Genes Dev.1：1183-1200)。

[0140] 本发明中可以用来鉴定调控序列，其WRKY66多肽可用来构建重组DNA载体的植物可以是任意的植物。用于分离基因和调控序列的适宜目标植物包括，但不限于苜蓿、苹果、杏树、拟南芥、朝鲜蓟、芝麻菜、芦笋、鳄梨树、香蕉、大麦、菜豆、甜菜、黑莓、蓝莓、椰菜、芽甘蓝、甘蓝、加拿大油菜、罗马甜瓜、胡萝卜、木薯、蓖麻子、花椰菜、芹菜、樱桃、菊苣、芫荽叶、柑橘、克莱门式小柑橘、三叶草、椰子、咖啡、玉米、棉花、酸果蔓、黄瓜、花旗松、茄子、茅菜、桉树、茴香、无花果、大蒜、葫芦、葡萄树、柚子树、蜜露、豆薯、奇异果、莴苣、韭、柠檬、酸橙、火炬松、亚麻子、芒果、瓜、蘑菇、油桃、坚果、燕麦、油椰子、芸苔、黄秋葵、橄榄、洋葱、桔子、观赏植物、棕榈、番木瓜树、欧芹、欧洲防风草、豌豆、桃树、花生、梨树、胡椒、柿子、松树、凤梨、车前草、李子、石榴、白杨、马铃薯、南瓜、温柏树、辐射松、萝卜、油菜籽、悬钩子、水稻、黑麦、高粱、南方松、大豆、菠菜、南瓜、草莓、糖用甜菜、甘蔗、向日葵、甘薯、香枫、柳枝稷、橘子、茶树、烟草、番茄、黑小麦、草、芜菁、葡萄树、西瓜、小麦、山药、和美洲南瓜。

[0141] 构成部分

[0142] 本发明揭示了一种植物，该植物的基因组中整合了前面叙述的重组DNA载体(包括抑制DNA载体)，还揭示了植物后代，以及由植物或植物后代获得的种子，其中，植物后代或其种子的基因组中也有重组DNA载体(或抑制DNA载体)，通过自交或远交获得子代植物，子代植物包括杂交种和自交系。

[0143] 杂交种子长出的作物中，成熟的转基因植物可以通过自花授粉产生纯合自交植物，自交系植物生产的种子含有重组DNA载体(抑制DNA载体)，由上述种子长出的植物显示改变的农艺性状(如水分限制条件下具有增强的农艺性状)，或上述种子用于育种产生杂交种子，所述杂交种子长出的植株显示上述变化的农艺性状特性，所述种子可以是玉米种子也可以是水稻种子。

[0144] 植物可以是单子叶植物，也可以是双子叶植物，例如水稻、玉米、大豆，玉米杂交植物、玉米自交植物，也可以是向日葵、高粱、油莱、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、甘蔗或柳枝稷等。

[0145] 构建的重组DNA可以稳定整合到植物基因组中。

[0146] 具体实施例包括但不限于以下内容：

[0147] 1.基因组中含有构建的重组DNA载体的水稻、玉米、大豆等植物，其中，重组DNA载体包括至少一个调控序列和与其连接的多聚核苷酸序列；根据Clustal V比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5氨基酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、
66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、
81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、
96％、97％、98％、99％或者100％；与对照植物相比，所述的植物显示增强的耐旱性能，也可能进一步显示至少一个农艺性状的变化。

[0148] 2.基因组中含有构建的重组DNA载体的水稻、玉米、大豆等植物，其中，所述重组DNA载体含有至少一个调控序列和与其连接的多聚核苷酸；所述多聚核苷酸编码WRKY66多肽；与对照植物相比，所述植物显示增强的耐旱性能，或进一步显示至少一个农艺性状的变化。

[0149] 3.基因组中含有构建的重组DNA载体的水稻、玉米、大豆等植物，其中，所述重组DNA载体含有至少一个调控序列和与其可操作性连接的多聚核苷酸；所述多聚核苷酸编码WRKY66多肽；与对照植物相比，所述植物显示至少一个农艺性状的变化。

[0150] 4.基因组中含有构建的重组DNA载体的水稻、玉米、大豆等植物，其中，所述重组DNA载体包括与至少一个调控元件连接的多聚核苷酸序列；根据Clustal V比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5氨基酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、
65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或者100％；与对照植物相比，所述植物显示至少一个农艺性状的变化。

[0151] 5.基因组中含有构建的抑制DNA载体的水稻、玉米、大豆等植物，其中，抑制DNA载体包括至少一个调控元件，和与其连接的来源于的目标基因的正义链或反义链的全部或一部分的DNA片段；根据Clustal V比对方法，所述DNA片段的核酸序列与其来源(目标基因的正义链或反义链的全部或部分)的核苷酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％；所述目标基因编码WRKY66多肽；与对照植物相比，所述植物显示至少一个农艺性状的变化。

[0152] 6.基因组中含有构建的抑制DNA载体的水稻、玉米、大豆等植物，其中构建的抑制DNA载体含有至少一个调控元件，和与其连接的核酸序列，该核酸序列为下述核酸序列的全部或部分，(a)根据Clustal V比对方法，核酸序列编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列的一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或者100％；或(b)核酸序列(a)的全长互补序列；与对照植物相比，上述植物表现至少一个农艺性状的变化。

[0153] 7.上述1-6中植物的子代植物、种子、种子的后代和来源于上述1-6所述植物或其子代的细胞。

[0154] 前述1-7或其它的具体实施例中，WRKY66多肽可以是来源于水稻(Oryzasativa)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、玉米(Zea mays)、大豆(Glycine max)、澎湖大豆(Glycine tabacina)、野生大豆(Glycine soja)或短绒野大豆(Glycine tomentella)。

[0155] 前述1-7或其它的具体实施例中，构建的重组DNA载体(抑制DNA载体)可以包括至少一个植物中有功能的启动子作为调控序列。

[0156] 前述1-7或其它的具体实施例中，至少一个农艺性状的变化可以是增加也可以是降低。

[0157] 前述1-7或其它的具体实施例中，至少一个农艺性状可以是叶片绿色、籽粒产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、种子产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物组织氮含量、植物总自由氨基酸含量、果实自由氨基酸含量、种子自由氨基酸含量、植物组织自由氨基酸含量、植物总蛋白含量、果实蛋白含量、种子蛋白含量、植物组织蛋白含量、耐旱性、氮吸收能力、根倒伏、收获指数、茎倒伏、株高、穗高、穗长、耐盐性、分蘖数、圆锥花序大小、幼苗活力和低温胁迫下的出苗情况。例如，至少一个农艺性状的改变可以是籽粒产量、叶绿素含量或生物量的增加。

[0158] 前述1-7或其它的具体实施例中，在水分限制条件下，与对照植物相比，上述植物可以表现至少一个农艺性状的变化。

[0159] “干旱”指植物可用水分的减少，特别是较长时间的缺水或者在植物重要的生长阶段发生，会造成植物损伤，或阻止植物的生长(限制植物的生长，降低籽粒的产量)。

[0160] “耐旱性”指干旱胁迫下能够存活并且没有实质性的生理或物理改变的能力，和/或一段时间干旱后复水能够恢复的能力。

[0161] 多肽的“耐旱活力”表示和对照相比，过表达该多肽可以提高转基因植物的耐旱性能。

[0162] 植物“增强的耐旱性”是指与参照或对照植物相比，反映了植物在干旱胁迫下存活的能力，并且与参照或对照相比，具有较小的生理或物理损伤，或者干旱胁迫后复水时，恢复较快的能力。

[0163] 本领域技术人员熟悉模拟干旱胁迫和评估模拟或自然条件下植物耐旱性的方案。例如，可以在一段时间内，通过给予少于需要量的水或不给水来模拟干旱，通过观察和测定活力、总生长、叶片的颜色、叶或根等组织的大小和生长速率等不同的生理和/或物理状况评估植物的耐旱性。其它用于评估耐旱性的技术包括测定叶绿素荧光、光合速率和气体交换速率。

[0164] 干旱胁迫实验可能包括缓慢长时间干旱胁迫和/或可能包括两阶段的突然断水的急性胁迫，后者被1或2天的恢复隔断，长时间胁迫可能持续8-20天，急性胁迫可能持续3-15天，测定干旱胁迫和正常给水时转基因植物和相关对照植物的下述的变量：

[0165] 变量“％area chg_start chronic-acute2”指远可见光谱成像仪测定的慢性应激第1天和第二阶段急性应激之间总面积变化的百分比。

[0166] 变量“％area chg_start chronic-end chronic”指远可见光谱成像仪测定的慢性应激第1天和最后一天之间总面积变化的百分比。

[0167] 变量“％area chg_start chronic harvest”指远可见光谱成像仪测定的慢性应激第1天和收获日之间总面积变化的百分比。

[0168] 变量“％area chg_start chronic-recovery24h”指远可见光谱成像仪测定的慢性应激第1天和恢复24h(急性应激24h)之间总面积变化的百分比。

[0169] 变量“psii_急性1(psii_acute1)”指第一个急性应激阶段结束时测定的光系统II(PSII)的效率，反映了PSII天线吸收光的能力，直接与叶片二氧化碳同化相关。

[0170] 变量“psii_急性2(psii_acute2)”指第二急性应激阶段结束时的光系统II(PSII)的效率，反映了PSII天线吸收光的能力，直接与叶片二氧化碳同化相关。

[0171] 变量“fv/fm_急性1(fv/fm_acute1)”指第一急性应激结束时最大量子效率(Fv/Fm)(最大荧光与最小荧光的差值/最大荧光)。

[0172] 变量“fv/fm_急性2(fv/fm_acute2)”指第二急性应激结束时最大量子效率(Fv/Fm)(最大荧光与最小荧光的差值/最大荧光)。

[0173] 变量“叶片卷曲_收获(leaf rolling_harvest)”指收获当天叶片顶面与侧面的比率。变量“叶片卷曲_恢复24h(leaf rolling_recovery24h)”指恢复24h后叶片顶面与侧面的比率。

[0174] 变量“比生长速率(specific growth rate(SGR))”表示由LemnaTec植物仪器测定的植物总表面积每天的变化(Y(t)＝Y0*er*t)。其中Y(t)＝Y0*er*t等同于Y/Δt的变化百分数(％)，其中，Y(t)是t时刻的总表面积，Y0是估计的初始总表面积，r是指比生长速率的-1方，t指种植后的天数。

[0175] 变量“茎干重(shoot dry weight)”指104℃烘干96h后茎的重量。

[0176] 变量“茎鲜重(shoot fresh weight)”从植物上割下后立即测定的茎重量。

[0177] 以下例子描述了模拟干旱条件和/或评价耐旱性的具有代表性的方案和技术。

[0178] 可以通过测定植物在模拟或者自然干旱条件下(如与非干旱条件相比，干旱条件下测定的实质相等收益率，或与对照或者参照植物相比，干旱条件下较少的产量损失)，田间测试时保持足够产量(至少75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％产量)的能力评估植物的耐旱性。

[0179] 本发明还测定基因表达水平、水分利用效率、编码蛋白的水平和活性等参数，“对照”、“对照植物”和“对照植物细胞”为测定目标基因的转基因植物或细胞的表型变化提供参照点，受测植物或植物细胞可以是转基因植物或细胞的子代。本领域的技术人员能够选择合适的对照或参照植物，用于测定转基因植物的农艺性状或表型变化。例如，

[0180] 1.根据孟德尔定律，含重组DNA载体(抑制DNA载体)半合子的转基因植物后代，会出现性状分离，产生含有和不含重组DNA载体(抑制DNA载体)的子代：可以以不含重组DNA载体(抑制DNA载体)的子代为对照或参考植物，测定含有重组DNA载体(抑制DNA载体)的子代的性状变化。

[0181] 2.重组DNA载体(抑制DNA载体)渗入近交系，如水稻和玉米或其它的品种如大豆，以自交母本或其它品种为对照或参考植物，测定基因渗入株系的性状变化。

[0182] 3.两个杂交株系，其中第一个杂交株系由两个父母本自交株系杂交产生，第二个杂交株系由相同的父母本自交系自交产生，其中一个父母本自交系含有重组DNA载体(抑制DNA载体)：以第一个杂交系为参照或对照植物，测定第二个杂交系的性状变化。

[0183] 4.含有构建的重组DNA载体(抑制DNA载体)的植物：以不含有重组DNA载体(抑制DNA载体)的植物为对照，测定受测物的指标，其中，对照植物与被测植物具有相似的遗传背景，(如与含有重组DNA载体(抑制DNA载体)的植物相比，具有50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、
70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、
85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或
100％核苷酸序列一致性)，目前许多实验室技术用于分析、比较和描述植物的遗传背景，如同工酶电泳、限制性片段长度多态性(RFLPs)、随机扩增多态性DNAs(RAPDs)、随机引物聚合酶链式反应(AP-PCR)、DNA扩增指纹识别(DAF)、序列特征性扩增区域(SCARs)和简单序列重复(SSRs)(微卫星)。

[0184] 对照植物或对照植物细胞可能包括(a)野生型(WT)植物或细胞，也就是说相同基因型作为遗传改变起始材料产生转基因植物或细胞的植物或细胞；(b)与起始材料相同基因型，且转化空载体(带有标记基因的载体，但不影响重要基因的性状)的植物或植物细胞；(c)转基因植物或细胞分离产生的非转化的植物或细胞；(d)与转基因植物或细胞遗传一致的植物或细胞，但是没有暴露于刺激条件下诱导目标基因的表达；(e)目标基因不表达的情况，转基因植物或植物细胞本身，。对照植物可能包括多个代表一个或几个类的单体，例如非转基因分离体的集体通常指无义。

[0185] 方法：

[0186] 方法包括但不限于，增强植物耐旱性的方法、评估植物耐旱性的方法、改变植物农艺性状的方法、确定植物农艺性状变化的方法、提高植物氮素利用效率的方法、和生产种子的方法。植物可以是单子叶植物或双子叶植物，如水稻、玉米或大豆，也可以是向日葵、高粱、油菜、小麦、苜蓿、棉花、大麦、粟、或甘蔗。种子可以是玉米或大豆种子，如玉米杂交种子或玉米自交种子。

[0187] 方法包括但不限于以下的方法：

[0188] 转化细胞的方法包括使用本发明的多聚核苷酸转化细胞，其中，在特定的实施例中，细胞可以是酵母、昆虫或植物细胞等真核细胞，也可以是细菌细胞等原核细胞。

[0189] 产生转基因植物的方法包括使用本发明分离的多聚核苷酸或构建的重组DNA载体(抑制DNA载体)转化植物细胞，由转化的植物细胞再生转基因植物，其中，该方法获得的转基因植物和转基因种子可以在本发明的其它方法中使用。

[0190] 从细胞或细胞培养物中分离本发明多聚核苷酸的方法，其中细胞含有构建的重组DNA载体，其含有本发明的多聚核苷酸和至少一个调控序列，转化的细胞在适合重组DNA载体表达的条件下生长。

[0191] 改变本发明的多肽在植物细胞中表达水平的方法包括：(a)使用本发明构建的重组DNA载体转化植物细胞；和(b)使转化细胞在适合构建的重组DNA表达条件下生长，其中，重组DNA载体的表达导致本发明中的多肽在转化植物细胞中表达水平的改变。

[0192] 提高植物耐旱性的方法包括(a)使用本发明构建的重组DNA载体转化再生细胞，其中，重组DNA载体包括多聚核苷酸和至少一个调控序列(如植物中有功能的启动子)，根据Clustal V比对方法，多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5的氨基酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、
76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、
91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；(b)由步骤(a)的再生植物细胞再生转基因植物，其中，转基因植物的基因组中有重组DNA载体，与对照植物相比，显示增强的耐旱性；(c)获得转基因植物的子代植物，其中，所述子代植物的基因组中含有重组DNA载体，并与对照植物相比，显示提高的耐旱性。

[0193] 评估植物耐旱性的方法包括(a)获得转基因植物，其中，转基因植物的基因组中有抑制DNA载体，抑制DNA载体含有至少一个植物中有功能的启动子等的调控序列，和部分或全长的(i)序列，根据ClustalV比对方法，(i)核酸序列编码的多肽的氨基酸序列与序列表中序列SEQ ID NO：5的氨基酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、
72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、
87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或(ii)核酸序列(a)(i)全长互补序列；(b)获得所述转基因植物的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有抑制DNA载体；(c)与对照植物比较，评价子代植物的耐旱性。

[0194] 评价植物耐旱性的方法包括(a)获得转基因植物，其中转基因植物的基因组中含有抑制DNA载体，抑制DNA载体包括至少一个植物中有功能的启动子等调控序列和来源于目标基因的正义链或反义链的部分或全部的DNA片段；根据Clustal V比对方法，所述DNA片段的核酸序列与该片段的来源-目标基因的正义链或反义链的全部或部分的序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、
80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、
95％、96％、97％、98％、99％或100％，所述目标基因编码OsWRKY66多肽；(b)获得转基因植物的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有抑制DNA载体；和(c)与对照植物相比，评估子代植物的耐旱性。

[0195] 确定植物农艺性状变化的方法包括(a)获得基因组中含有重组DNA载体的转基因植物，重组DNA载体包括多聚核苷酸和与之相连的至少一个植物中有功能的启动子等调控序列，其中，根据Clustal V比对方法，所述多聚核苷酸编码的多肽的氨基酸序列与序列表中序列SEQ ID NO：5的序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、
73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、
88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％；(b)获得所述转基因植物的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有重组DNA载体；和(c)在水分限制条件下，与对照植物相比，确定子代植物的是否显示至少一个农艺性状的变化。

[0196] 确定植物农艺性状变化的方法包括(a)获得基因组中含有抑制DNA载体的转基因植物，抑制DNA载体包括植物中有功能的启动子等至少一个调控序列和核酸序列(i)或(ii)的全部或部分，根据Clustal V比对方法，核酸序列(i)编码的多肽的氨基酸序列与序列表中SEQ ID NO：5的序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、69％、70％、71％、72％、73％、
74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、84％、85％、86％、87％、88％、
89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％，或(ii)核酸序列(i)的全长互补序列；(b)获得所述转基因植物的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有抑制DNA载体；和(c)与对照植物相比，确定水分限制条件下，子代植物至少一个农艺性状的变化。

[0197] 确定植物农艺性状变化的方法包括(a)获得基因组中含有抑制DNA载体的转基因植物，抑制DNA载体包括植物中有功能的启动子等至少一个调控元件，和与之相连的源于目标基因的正义链或反义链的DNA片段，根据Clustal V比对方法，所述DNA片段与其来源-目标基因的正义链或反义链的全部或部分的核酸序列一致性至少为50％、51％、52％、53％、54％、55％、56％、57％、58％、59％、60％、61％、62％、63％、64％、65％、66％、67％、68％、
69％、70％、71％、72％、73％、74％、75％、76％、77％、78％、79％、80％、81％、82％、83％、
84％、85％、86％、87％、88％、89％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、
99％或100％，所述目标基因编码WRKY66多肽；(b)获得所述转基因植物的子代植物，其中，子代植物的基因组中含有抑制DNA载体；和(c)与对照植物相比，确定水分限制条件下，子代植物的至少一个农艺性状的变化。

[0198] 生产可以作为耐旱性产品销售等用途的种子的方法包括前述任一方法，更进一步的包括由所述子代植物获得种子，其中，所述种子的基因组中含有重组DNA载体(或抑制DNA载体)。

[0199] 前述任意方法或本发明的其它方法中，所述的引入步骤中，所述的再生植物细胞可以是愈伤细胞、胚性愈伤细胞、配子细胞、分生细胞或未成熟胚胎细胞，再生细胞可以来源于杂交玉米株系。

[0200] 前述任意方法或本发明的其它方法中，所述的再生步骤可能包括(i)在含有胚性促进激素的培养基上培养转化细胞直至形成愈伤组织；(ii)将步骤(i)获得的转化植物细胞转移到含有组织形成促进激素的培养基上；(iii)将步骤(ii)获得的转化植物细胞接种到继代培养基上，长出抗性芽和/或根。

[0201] 前述任意方法或本发明的其它方法中，至少一个农艺性状可能包括叶片绿色、籽粒的产量、生长速率、生物量、成熟时的鲜重、成熟时的干重、果实产量、籽粒产量、植物总氮含量、果实氮含量、种子氮含量、植物组织氮含量、植物总自由氨基酸含量、果实自由氨基酸含量、种子自由氨基酸含量、植物组织自由氨基酸含量、植物总蛋白质含量、果实蛋白质含量、种子蛋白质含量、植物组织蛋白质含量、耐旱性、氮吸收能力、根倒伏、收获指数、茎倒伏、株高、穗高、穗长、分蘖数、圆锥花序大小、耐盐性、幼苗活力和低温胁迫下出苗情况。至少一个农艺性状的变化可以是种子产量、叶片绿色或生物量的增加。

[0202] 前述任意方法或本发明的其它方法中，与对照植物相比，在水分限制条件下，植物显示至少一个农艺性状的变化。

[0203] 前述任意方法或本发明的其它方法中，将重组DNA载体转入再生植物细胞的供选方案包括将多聚核苷酸与至少一个调控序列连接，例如可以将调控序列(一个或多个增强子，可选的，作为转座元件的部分)转入植物再生细胞，筛选调控元件与编码多肽的内源基因连接的转基因植物。

[0204] 可以使用任意合适的技术将本发明的重组DNA载体转入植物中，包括但不限于，DNA直接吸收、化学处理、电穿孔、显微注射、细胞融合、转染、载体介导的DNA转移、颗粒轰击或农杆菌介导的转化。植物转化和再生技术已在国际专利申请WO2009/006276中描述。

[0205] 另外，也有修饰或改变宿主内源基因组DNA的方法，包括改变宿主天然DNA序列或调控元件、编码或非编码序列等前体转基因序列。这些方法用于将核酸瞄准(targeting)基因组中改造的目标识别序列。本发明中的转基因植物或细胞使用传统的核酸酶产生改变的植物基因组(WO2009/114321；Gao等(2010)Plant Journal1：176-187)，位置指导的工程通过使用锌指区识别偶联的限制性酶的限制性特性修饰内源基因组(例如Urnov等(2010)Nat Rev Genet.11(9)：636-46；Shukla等(2009)Nature459(7245)：437-41)。

[0206] 本领域的技术人员熟悉将编码期望多肽的基因转化植物和培育再生植物的方法。我们可以使再生植物自花授粉产生纯合子转基因植物，或者将再生植物的花粉与种子长出的农艺重要的植物杂交，或者农艺重要的植物的花粉与再生的转基因植物杂交，以产生农艺性状优良的植物。
实施例

[0207] 本发明的具体实施进一步在下列实例中示明。在这些实例中，除非特别说明，采用摄氏/公制。在这些实例中，仅用举例说明具体的实施过程。通过上述讨论和具体事例，本领域的专业人员可以查明本发明的基本特征，经过各种改变和修改将本发明应用于各种用途和条件，并不偏离本发明主体和范围。因此，除了本专利表述和讨论的各种修改外，本领域内的专业人员所做的不偏离本发明主题的修改也将落入本专利的权力要求范围内。

[0208] 实施例1.水稻激活标签突变体库的构建

[0209] 本研究使用含有4X CaMV35S增强子的T-DNA插入双元载体，采用农杆菌介导法转化中花11水稻(Oryza sativa L.)，构建水稻激活标签突变体库。中花11水稻是中国农业科学院作物研究所水稻花培组用京风五号同特特普的杂种后代与福锦杂交后培育的。我们从北京未名凯拓农业生物技术公司获得第一批种子。使用T-DNA插入双元载体转化中花11水稻胚，获得转基因的愈伤组织，长出转基因苗，收获的转基因种子构成突变体库。

[0210] 实施例2.水稻幼苗耐旱性的温室筛选实验

[0211] 水稻幼苗的耐旱性筛选试验在温室中进行。温室中设置比例为1∶1的钠灯和金属卤化物灯作为光源，光照/黑暗时间为16h/8h，光源设置在苗床上部大约1.5m处，晴天时，高于苗床30cm处的光强度为10,000-20,000lx，阴天时为6,000-10,000lx；温室相对湿度为30％-90％，温度为20-35℃。

[0212] 对于T-DNA插入突变体，T1代种子用于第一次的筛选实验。每株系选择16株生长一致的激活标记的水稻幼苗和16株组织培养获得中花11幼苗用于干旱筛选，并种植在装有有机质，蛭石和沙子(V∶V∶V＝3∶3∶2)的托盘中。当水稻生长到三叶期时，停止浇水，并将托盘放在干燥的位置，直至叶片卷曲(大约9-15天，根据不同季节)；然后再将托盘放在水槽中使水稻苗复水5-7天，并计算恢复程度(一个绿茎＝1，一个绿叶＝1，半个绿茎或绿叶＝0.5，三分之一绿叶＝0.2，零绿叶或绿茎＝0)。恢复度是绿色组织得分的总和，数据利用SAS软件进行统计分析。与野生型和其它突变体表现明显不同的株系被认为是最初的阳性株系。

[0213] 通过第一次筛选的阳性株系进入第二次筛选，选择在绿色荧光下呈红色的T2代种子用于第二轮筛选。采用上述方法培养和处理每个株系60株水稻苗和50株组织培养获得的中花11野生型水稻，数据利用SAS软件进行统计分析，显著水平为0.05。存活率也是干旱筛选的一个指标，是指干旱处理后存活的水稻株数占处理前种植水稻株数的百分数。

[0214] 通过两次筛选的水稻株系种植在温室或者田间的土壤中用于获得植物材料，进行分子克隆获得T-DNA侧翼序列和候选基因。一般而言，从同一株系生长一致的30株的水稻苗获得20-30g鲜叶材料，液氮速冻，并保存在-80℃冰箱中。

[0215] 实施例3.AH01460水稻株系的筛选结果

[0216] 温室干旱筛选试验表明，与野生型中花11水稻相比，AH01460水稻株系一直表现为具有增强的耐旱能力。

[0217] 如表2所示，16株T1代AH01460突变体幼苗中，有6株苗(37.5％)在温室干旱胁迫后存活，而组织培养获得的野生型植株(ZH11-TC)均死亡，这个结果表明AH01460水稻株系与野生型相比，具有较强的耐旱能力。

[0218] 我们使用T2代AH01460种子继续进行了第二次的筛选试验，此次筛选中，AH01460水稻只与野生型中花11进行比较，由表2可知，AH01460水稻的存活率和恢复度均均优于野生型水稻(ZH11-TC)。

[0219] 在上述两次筛选中，AH01460水稻的存活率和恢复度高于对照水稻，这些结果表明AH01460水稻幼苗具有较高的耐旱能力。

[0220] 表2.AH01460水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析

[0221]

[0222] 鉴于上述结果，进一步鉴定因T-DNA插入而影响的AH01460水稻的相关基因。

[0223] 实施例4.激活标签基因的鉴定

[0224] 本研究使用如下标准程序鉴定耐旱性AH01460水稻株系中T-DNA插入位点侧翼基因，(1)质粒拯救法(Friedrich J.Behringer和June I.Medford(1992)，Plant Molecular Biology Reporter Vol.10，2：190-198)和(2)反向PCR法(M.J.McPherson和Philip Quirke.(1991)PCR：a practicalapproach，137-146)。如果质粒拯救和反向PCR不能鉴定多聚T-DNA插入位点附近的候选基因，这种情况下，可以采用其它的程序如TAIL PCR(Liu等(1995)，Plant J.8：457-463)鉴定T-DNA插入位点附近的候选基因。

[0225] 鉴定激活标签候选基因时，能够获得含有一个T-DNA边缘序列和侧翼基因序列的DNA片段是最好的测序结果，而且当获得一个位于T-DNA插入位点的侧翼基因序列标签时，可以通过与公布的水稻基因组序列比对，鉴定候选基因。尤其是，邻近CaMV35S增强子元件/T-DNA RB和LB的注释基因可能是激活的候选基因。

[0226] 为了证实鉴定的基因确实是邻近T-DNA，并排除DNA片段是嵌合克隆的可能性，需要以T-DNA中oligo片段和基因组DNA特异的oligo片段为引物对基因组DNA进行诊断PCR分析。可以扩增产生PCR产物的基因组样品被认为有T-DNA的插入。这个分析也可以确认同一个株系中含有不止一个T-DNA插入位点的状况。如果多个不同的基因组片段可以在质粒拯救或者反向PCR中产生，表明他们含有多个插入位点。

[0227] 本研究采用CTAB法(Murray，M.G.和W.F.Thompson.(1980)Nucleic Acids Res.8：4321-4326)提取AH01460水稻株系叶片的基因组DNA。

[0228] 使用2μL的限制性内切酶XhoI(NEB)消化酶切10μg AH01460水稻基因组DNA，核酸片段自连后，采用电转化法转化大肠杆菌感受态DH5α，氨苄青霉素培养基上生长的菌落使用如下的引物进行菌落PCR验证：

[0229] P2up-5389：5′-ACCCCAGGCTTTACACTTTATGCTTCC-3′(SEQ ID NO：6)

[0230] P2down-3534：5′-AACCCACTCGTGCACCCAACTGATC-3′(SEQ ID NO：7)

[0231] PCR反应体系和程序：

[0232]

[0233] PCR循环：

[0234]

[0235] 分析结果表明，5个菌落均能扩增出约4kb的条带，挑取PCR验证阳性的菌落，测定4kb DNA片段的序列，获得AH01460水稻T-DNA插入位点的RB-侧翼序列，如序列表中SEQ ID NO：1所示。根据美国国立卫生研究院国立医学图书馆的国家生物技术信息中心(NCBI)(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)，和密歇根州立大学(Michigan State University)(http://rice.plantbiology.msu.edu)网站的水稻基因组注释，我们设计如下引物，进一步确定T-DNA插入的准确位置，并获得了T-DNA右边界侧翼序列，如序列表SEQ ID NO：2所示。引物序列如下：

[0236] AP004778-F1：5′-CGTGGCCTATCGATCCTTTAGACCTTC-3′(SEQ ID NO：8)

[0237] RB out down：5′-TGAAAGCGACGTTGGATGTTCATTCG-3′(SEQ ID NO：9)

[0238] T-DNA插入AH01460株系水稻基因组的2号染色体上，且只有一个T-DNA插入位点。OsWRKY66基因位于T-DNA左边界的下游。

[0239] 因为OsWRKY66基因临近T-DNA插入位点，且AH01460株系水稻具有提高的耐旱性，因此OsWRKY66基因被克隆，并用于验证其耐旱性能和对其他农艺性状的影响。

[0240] 实施例5.OsWRKY66基因的克隆和过表达载体的构建

[0241] 根据基因号LOC_Os02g47060.1的序列信息，设计了如下的引物，并以中花11基因组DNA为模板，使用KOD-FX PCR混合液，进行PCR扩增，获得OsWRKY66基因序列。

[0242] KXF-F：58：5′-GAAGATCTATGTGTGATTACTTCTTGCAAC-3′(SEQ ID NO：10)，[0243] KXF-R：34：5′-TCATAAACCTCCCTCCCC-3′(SEQ ID NO：11).

[0244] 引物KXF-F中含有BglII酶切位点(下划线标记)，将扩增获得的约4kb的DNA片段纯化回收，并使用BglII进行酶切。因为在OsWRKY66基因序列的从ATG开始的694bp处有BglII酶切位点，因此PCR产物被BglII酶切成两个片段，大小分别为约700bp和3300bp，因此采用两步克隆法将该基因与过表达载体连接构建该基因的过表达载体。两步法克隆得步骤包括使用BglII和NruI酶切DP0005，并将其与约3300bp的大片段连接，然后再将约700bp的小片段与新的载体连接。酶切图谱和DNA测序结果表明，已经获得正确的过表达载体(DP0010)。OsWRKY66基因的基因组序列和CDS区的序列和其编码的蛋白质序列如序列表中SEQ ID NO：
3和4的核苷酸序列和SEQ ID NO：5的氨基酸序列所示。

[0245] 实施例6.DP0005和DP0009载体的构建

[0246] 以pCAMBIA1300(Cambia，Brisbane，Australia)为骨架构建DP0005载体，以pCAMBIA1300为模板使用引物35sF和35sR扩增获得CaMV35S启动子序列，HindIII和PstI的限制性酶切位点添加在CaMV35S启动子序列的35sF和35sR引物序列中

[0247] 35sF：5′-AAGCTTAGAGCAGCTTGGCAACATGGTGGAGCAC-3′(SEQ ID NO：12)

[0248] 35sR：5′-CTGCAGAGAGATAGATTTGTAGAGAGAG-3′(SEQ ID NO：13)

[0249] 使用限制性内切酶HindIII和PstI酶切扩增获得的CaMV35S启动子，回收和纯化DNA片段，与HindIII和PstI酶切的pCAMBIA1300连接获得pCAMBIA1300-35s。

[0250] 以pCAMBIA1303为模板，使用引物TnosF和TnosR扩增终止子NOS polyA，限制性内切酶位点PstI+BglII+KpnI+NcoI+salI和BamHI分别添加在终止子NOS polyA5′端和3′端引物中。

[0251] TnosF：5′-CTGCAGAGATCTGGTACCGGTCGCCACCATGGAAGTC GACGTTTCTTGTTTCTTAAGATTGAATCCTGTTG-3′(SEQ ID NO：14)

[0252] TnosR：5′-GGATCCTCTAGTCCCGATCTAGTAACATAG-3′(SEQ ID NO：15)

[0253] 使用PstI和BamHI酶切终止子NOS polyA片段，然后与PstI和BamHI酶切的pCAMBIA1300-35s连接获得pCAMBIA1300-35s-Tnos。

[0254] AsRED基因从pAsRED2(Clontech Laboratories Inc.)上分离，插入pCAMBIA1300-35s-Tnos载体中，构建获得pCAMBIA1300-35s-AsRED-Tnos载体。

[0255] 为了便于构建基因表达载体，在新的终止子NOS polyA片段5′端添加BamHI+NruI+SalI酶切位点和3′端添加EcoRI酶切位点，引物序列如下：

[0256] TnosF2：5′-CCGGGATCCTCGCGAGTCGACCTCCAAGCTGGGCCA CAACTGAAG-3′(SEQ ID NO：16)

[0257] TnosR2：5′-CGAGAATTCTCTAGTCCCGATCTAGTAACATAG-3′(SEQ ID NO：17)

[0258] 以pCAMBIA1300-35s-AsRED-Tnos质粒为模板扩增获得新的终止子NOS polyA片段，回收终止子NOS polyA片段，进行BamHI和EcoRI双酶切，再与BamHI和EcoRI双酶切的pCAMBIA1300-35s-AsRED-Tnos载体连接，获得基因过表达的DP0005载体，可以用作候选基因OsWRKY66基因构建载体的骨架。使用BglII和BamHI双酶切DP0005，自连后去除AsRED基因，产生DP0009载体。

[0259] 实施例7.转基因水稻中OsWRKY66基因的分析

[0260] 采用农杆菌介导法将对照载体(DP0005)和过表达载体(DP0010)转入中花11水稻，每个载体获得60多个各不同的转基因植株(事件)。在T0和T2代，对植株进行耐旱性功能分析。

[0261] T0代植株在温室中培养至四叶期，选择生长一致的健康植株进行干旱筛选分析。对于获得的T2代种子，首先进行潮霉素抗性筛选，将1-2cm高的幼苗在75mg/L的潮霉素溶液中培养3-5天，只有存活的植株用于耐旱性分析(实施例2)。

[0262] 为了检测DP0010不同转基因事件中OsWRKY66基因表达水平，本研究提取转基因水稻叶片中的RNA，采用real time PCR程序比如：的反转录试剂盒和Takara的Real Time-PCR(SYBRRPremix Ex TaqTM)进行检测。EF-1基因用做内标表明突变体株系和野生型水稻扩增和上样量基本一致，优化每个基因的分析条件。

[0263] 取四叶期DP0010水稻株系叶片50mg，根据说明书，使用RNAiso Plus试剂盒(Takara)提取总RNA，以500ng总RNA为模板，使用RevertAidTM第一条链cDNA合成试剂盒(Fermentas)反转录cDNA，根据手册使用7,500Fast real time PCR仪进行real-time-PCR分析(SYBRRPremix Ex TaqTM，TaKaRa)，OsWRKY66的引物序列如下：

[0264] DP10-F：5′-CCCAACATGCTCGTCATCACC-3′(SEQ ID NO：18)

[0265] DP10-R：5′-ATCGTTGGGTTCCGCCTTGAC-3′(SEQ ID NO：19)

[0266] 如图1所示，OsWRKY66基因在转基因水稻DP0010的不同转基因事件中过量表达，而在组织培养获得中花11水稻(DP0005)中未检测到表达。

[0267] 实施例8.过表达OsWRKY66基因提高了转基因水稻的耐旱性能

[0268] T0和T2代DP0010转基因幼苗用于温室验证试验，且按照实施例2的方法进行处理。

[0269] 如表3和4所示，组成型过表达OsWRKY66基因明显提高温室种植的DP0010转基因水稻的耐旱性能。

[0270] T0代时，组织培养获得转基因DP0010幼苗用于温室干旱筛选，组织培养获得转DP0005空载体的幼苗用作对照。干旱处理后的结果表明，转基因水稻DP0010的存活率和恢复度都显著高于对照(DP0005)(表3)，表明过表达OsWRKY66提高了转基因水稻的耐旱性。

[0271] 进一步在T2代评估转基因水稻的性能。DP0010.07和DP0010.09水稻以DP0005为对照，在其他的干旱处理中，以T2代分离的阴性作为对照。干旱处理结果如表4所示，5个过表达OsWRKY66基因的不同转基因事件均显示增加的耐旱性。这些结果表明过表达OsWRKY66基因(图1)提高了转基因水稻DP0010的耐旱性。

[0272] 表3.T0代CaMV35S Pro：OsWRKY66水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析

[0273]

[0274] 表4.T2代CaMV35S Pro：OsWRKY66水稻株系在温室条件下的耐旱性能分析

[0275]

[0276] 为了进一步验证过表达OsWRKY66基因是否能够提高转基因水稻的田间耐旱性，我们使用T2代种子在海南省进行了干旱验证试验，T2代分离的阴性种子作为对照。

[0277] 对于过表达OsWRKY66基因的每一个转基因事件，选取100粒种子，室温浸种16h，然后在培养箱中35-37℃萌发36h，然后种在田间苗床。当水稻生长到三叶期时，将水稻幼苗移栽到试验地中，每个株系种植10棵苗，四次重复。这四次重复种在同一块地中。组织培养获得的转化空载体(DP0005)野生型中花11水稻在统计分析时用作对照。

[0278] 水稻苗期正常管理，并使用相应的杀虫剂和化肥，孕穗期停止浇水，因此开花期时产生干旱胁迫，干旱时间长短取决于温度和湿度等天气条件。为了避免干旱过于严重而导致植物的死亡，并保持合理的产量，一般会在干旱期间浇水一到两次，在干旱期间，使用TDR30(Spectrum Technologies，Inc.)在每块地的10个位点每三天测定土壤相对含水量。

[0279] 收获时，每个株系在每行中间挑选约20株具有代表性的植株，并称量每株水稻籽粒的重量。利用ASReml软件对籽粒重量进行统计分析，并且考虑了空间效应。

[0280] 图2是2012年海南省试验田内土壤含水量变化，由图2可知，在水稻抽穗和成熟期，土壤含水量由28％降到10％，田间种植的水稻在抽穗期和成熟期遭受了干旱胁迫，这必然会影响种子的产量。表5表明3个转基因事件单株籽粒产量均高于阴性对照。这些结果表明过表达OsWRKY66基因提高了转基因水稻的田间耐旱性，且DP0010.12在温室干旱验证试验(表4)和田间干旱验证(表5)中均表现出增强的耐旱性。

[0281] 表5.T2代CaMV35S Pro：OsWRKY66水稻株系在田间干旱处理后下籽粒产量的分析[0282]

[0283] 实施例9.水稻OsWRKY66基因转化玉米并评价在玉米中的功能

[0284] 将水稻OsWRKY66基因或者玉米、拟南芥或其它物种中的相应的同源基因转化玉米植株，以组成型的启动子如玉米泛素启动子(Christensen等(1989)Plant Mol.Biol.12：619-632和Christensen等(1992)Plant Mol.Biol.18：675-689)或其它的启动子如胁迫响应启动子调控基因的表达，可以使用微粒轰击法(国际专利公布WO2009/006276)将构建的重组DNA载体转化玉米，也可以以采用农杆菌介导法(Zhao等，Meth.Mol.Biol.318：315-323(2006)和Zhao等，Mol.Breed.8：323-333(2001)和美国专利号5,981,840，1999年11月9日公布)转化玉米。农杆菌介导转化的过程包括细菌的接种、共培养、静止、筛选和植株的再生。

[0285] 再生植株的子代如T1代植株可以种在土壤中进行干旱胁迫，采用图像分析，测量多个时期和干旱胁迫期间的植株面积、体积、生长速率和叶片颜色。与对照相比，明显延迟胁迫期间植株的萎蔫，叶面积的减小，黄色素积累的减少，和/或促进生长速率的增加被认为WRKY66基因提高玉米的耐旱性能。

[0286] 实施例10.水稻OsWRKY66基因转化玉米衍生的Gaspe Flint Lines并评价其在玉米中的功能

[0287] 如实施例9所述，可以转化玉米使其过表达水稻的OsWRKY66基因或者其它物种的同源基因。在某些情况下，具有短生活周期(快速循环)、小株型和高转化潜力的玉米(Tomes等，美国专利7,928,287)也可以成为植物受体细胞。

[0288] 以玉米胚作为受体，转化获得的转基因玉米，然后将转基因玉米按照优化的随机分组设计种植在条件可控的温室中减小或消除环境误差，比如每个重复30株包括24株转化获得植株和6株对照植株种植在盆中排成一排摆放在温室中的苗床上，每个对照或试验植株随机摆在不同设计的位置，一个实验的多个重复组种植在同一温室中，根据最小化空间需求量和环境效应来确定温室中重复组的排列，这样的排列可以被认为是压缩的温室排列。

[0289] 在研究过程中，转基因库中每一个植株都会被鉴定和追踪调查，植物上采集的数据自动与植株相连，因此采集的数据可以与转化基因植株相联系，比如每一个植物容器有可机读的标签(如通用产品码(UPC)条形码)包括植物身份信息，并与温室的位置相互联系，因此采集的数据自动与植物相联系。

[0290] 本研究中可以利用高效率，可机读植物鉴定系统如二维矩阵码或射频识别标签(RFID)收到的数据，并用射频接收器/数据处理器(美国专利7,403,855和7,702,462)分析。

[0291] 对照和T0代温室植株用于感兴趣农艺性状的分析，每个植株农艺数据会被记录或以一定的方式保存，并与植物的鉴定相联系。T1代植株被用于相同的实验设计确认植株的表型。

[0292] 实施例11.转水稻OsWRKY66基因玉米的产量分析

[0293] 如实施例9所述，转基因玉米植株使其过表达水稻OsWRKY66基因，或其它物种中相应的同源基因，近交和杂交获得转基因植株可用于进行正常浇水和干旱条件下的田间试验，研究其产量增加和/或稳定性，尤其是开花和/或灌浆期，应对干旱的能力。与对照相比，产量性状的提高反映转基因植物耐旱性的提高。

[0294] 这个方法可用来筛选水分限制条件下和/或正常灌溉条件下提高产量的转基因植物。

[0295] 实施例12.水稻OsWRKY66转化大豆或拟南芥

[0296] 根据同源性搜索，可以鉴定大豆、高粱和拟南芥中与水稻OsWRKY66同源的基因，将这些基因与CaMV35S启动子构建表达载体，转化拟南芥和/或大豆，研究这些基因在双子叶植物中提高耐旱性的能力。载体的构建，植物的转化和表型的分析类似于前面实施例中描述的方法。

[0297] 为了研究水稻OsWRKY66基因能否提高双子叶植物的耐旱性能或其它特征，本研究将水稻OsWRKY66基因(载体DP0010)载体DP0009采用农杆菌浸花法转化拟南芥(Clough，S.T.和Bent，A.F.(1998)The Plant Journal16，735743；Zhang，X等(2006)Nature Protocols1：641-646)。

[0298] 转基因的子代植株的鉴定包括：将拟南芥的种子种在含有抗生素的MS筛选培养基上；然后将平板放置在培养箱中，长日照条件生长；7-10天以后，MS筛选培养基上，生长健康，具有绿色子叶、真叶和根的拟南芥被认为是转基因阳性植株；将阳性植株移栽到土壤中，培养收获的转基因拟南芥种子；并采用PCR分析进一步验证转基因植株。

[0299] 本实验采用半定量PCR分析转基因拟南芥中OsWRKY66基因的表达量，按照实施例7的方法获得转基因拟南芥的总RNA，并获得cDNA，使用引物DP10-F和DP10-R扩增OsWRKY66基因，actin基因作为内标，使用的引物序列如下：

[0300] actin-F：5′-AGGCACCTCTTAACCCTAAAGC-3′(SEQ ID NO：20)

[0301] actin-R：5′-GGACAACGGAATCTCTCAGC-3′(SEQ ID NO：21)

[0302] PCR反应体系和程序：

[0303]

[0304] PCR循环：

[0305]

[0306] 如图3A所示，半定量PCR表明，OsWRKY66基因在转基因拟南芥AtDP0010-6、AtDP0010-10和AtDP0010-13中表达，而在野生型拟南芥(WT)和转化空载体的拟南芥(VC)中不表达.

[0307] 为了研究CaMV35S Pro：：OsWRKY66(DP0010)转基因拟南芥在干旱胁迫下的表型变化，将野生型(Columbia)、空载体的转基因对照(DP0009)和三个DP0o10转基因株系种植在种植土中，正常浇水生长四周；干旱处理前，将拟南芥的种植土浇水至饱和，在接下来的12天内不再对拟南芥浇水。当土壤相对含水量降到3％时，恢复浇水，并计算拟南芥的存活率。三次重复，每次重复12棵植株。干旱处理期间，野生型和转空载体的对照拟南芥的萎蔫程度明显高于转DP0010载体的转基因拟南芥(图3C)，恢复浇水后，50％以上的转基因拟南芥存活，而野生型和对照拟南芥的存活率低于13％。

[0308] 这些结果表明过表达水稻OsWRKY66基因提高了双子叶植物拟南芥的耐旱性能，另外，这些结果也表明单子叶植物的基因(OsWRKY66)同样也可以在双子叶植物(如拟南芥)中发挥作用。

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