专利汇可以提供Production of monoclonal antibody专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且PURPOSE:To provide the subject method for producing a monoclonal antibody capable of effectively producing the monoclonal antibody corresponding to a marker molecule peculiar to a disease even when the marker itself or its bioactivity is unknown. CONSTITUTION:A patient-derived biological component and a normal person- derived biological component corresponding it to are partly purified respectively by using one or more kinds of the same methods so as to obtain a patient- derived fraction containing a substance existing in the patient-derived biological component but not in the normal person-derived biological component and a normal person-derived fraction corresponding to it. An animal is then immunized with the above patient-derived fraction as an immunogen so as to obtain a hybridoma capable of producing a monoclonal antibody against the immunogen. The monoclonal antibody produced by the hybridoma is treated with the above normal person-derived fraction and a hybridoma capable of a monoclonal antibody exhibiting a specific affinity to the above patient-derived fraction is subsequently selected. From the selected hybridoma, the objective monoclonal antibody is recovered. This method for producing the monoclonal antibody includes the above processes.,下面是Production of monoclonal antibody专利的具体信息内容。
【0001】
【産業上の利用分野】本発明は、各種疾病の診断に有用なモノクローナル抗体を製造する方法に関する。
【0002】
【従来の技術】従来、疾患の診断に用いられるモノクローナル抗体は、その疾患に特有のマーカー分子に注目し、そのマーカー分子の持つ生理活性を指標にして精製し、単離した標品を用いて作製している。 あるいは、未知の物質を標的にする場合には、多数の抗体を実際に作製し、それぞれの抗体の抗原を解析するという手法が採られている。
【0003】しかしながら、前者の方法を行なうためには、(1) そのマーカー分子の特定の生理活性が測定できること、(2) そのマーカー分子が比較的安定であること、及び(3) そのマーカー分子が比較的多量に存在すること等が必要である。 また、後者の方法は、手間が大きく、スクリーニングの方法も確立されていない。
【0004】
【発明が解決しようとする課題】本発明の目的は、マーカー分子自体又はその生理活性が未知の場合であっても、疾患に特有なマーカー分子に対するモノクローナル抗体を効率的に生産することができるモノクローナル抗体の製造方法を提供することである。
【0005】
【課題を解決するための手段】本願発明者らは、鋭意研究の結果、患者由来の生体成分と正常人由来の成分を同一の方法で部分精製し、患者由来の生体成分中には存在するが正常人由来の生体成分中には存在しない物質を含有する、患者由来の画分及びそれに対応する正常人由来の画分を得、患者由来の前記画分を免疫原として動物に免疫して該免疫原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、該ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を上記正常人由来の画分で処理した後上記患者由来の画分と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択することにより、
患者由来の生体成分には存在するが正常人由来の生体成分には存在しない物質、すなわち、当該疾患のマーカー分子に対するモノクローナル抗体を効率的に生産することができることを見出し本発明を完成した。
【0006】
【課題を解決するための手段】すなわち、本発明は、特定疾患患者由来の生体成分と、それに対応する正常人由来の生体成分をそれぞれ少なくとも1種の同一の手段で部分精製し、患者由来の生体成分中には存在するが正常人由来の生体成分中には存在しない物質を含有する、患者由来の画分及びそれに対応する正常人由来の画分を得、患者由来の前記画分を免疫原として動物に免疫して該免疫原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを得、さらに、ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を前記正常人由来の画分で処理した後前記患者由来の画分と特異的に結合するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを選択し、該ハイブリドーマからモノクローナル抗体を回収することを含むモノクローナル抗体の製造方法を提供する。
【0007】本発明の方法の第1の工程では、診断しようとする疾患を有する患者由来の生体成分と、それに対応する正常人由来の生体成分をそれぞれ少なくとも1種の同一の手段で部分精製し、患者由来の生体成分中には存在するが正常人由来の生体成分中には存在しない物質を含有する、患者由来の画分及びそれに対応する正常人由来の画分を得る。 ここで、生体成分としてはいかなるものでもよく、例えば、血液、血清及びその成分、尿、
大便、リンパ液、髄液、唾液、羊水並びに各種分泌液等を挙げることができる。 このような生体成分を部分精製するための手段としては、従来から生体物質の分離、精製等に用いられているあらゆる手段及びその組合せを採用することができる。 例えば、塩析、透析、各種ゲルろ過クロマトグラフィー、各種イオン交換クロマトグラフィー、各種アフィニティークロマトグラフィー及び各種電気泳動等を挙げることができる。 この部分精製は、患者由来の生体成分中には存在するが正常人由来の生体成分中には存在しない物質を含有する画分が得られるまで行なわれる。 例えばカラムクロマトグラフィーにより部分精製を行なう場合には、常法により、吸光度等のピークを調べ、患者由来の成分中には存在するが正常人由来の成分中には存在しないピークが存在すれば、そのピークを含む患者由来の画分及びそれに対応する正常人由来の画分(上記ピークが存在しない)が求めるべき画分である。 部分精製は、このような画分が得られるまで行なう。 どのような部分精製手段を用いればこのような画分を得られるかは未知であり、試行錯誤を行なうしかないが、多くの場合、このような画分を得ることは困難なことではない。 このような画分は、その疾患のマーカー分子が未知の場合やその生理活性が未知又は測定不能の場合にも得ることができ、このことは本発明の大きな利点である。 このような画分が得られた後も、該画分がアルブミンやイムノグロブリン等の抗原性を有する物質を含む場合には、目的とするモノクローナル抗体が生産される確率を高めるため、このような抗原性物質を常法により除去することもできる(もっとも、この処理によって患者由来成分に固有の物質が除かれてはならない)。 なお、この明細書において、「画分」とは複数の物質を含む場合のみならず、単一の物質のみからなる場合をも包含して用いている。 従って、例えば、部分精製手段として電気泳動を採用した場合、患者由来の生体成分には存在するが正常人由来の成分には存在しないバンドが存在すれば、そのバンドを構成する物質が単一の物質であっても、それはこの明細書で言う「画分」に相当する。
【0008】次いで、このようにして得られた患者由来の生体成分由来の画分(以下、「患者由来画分」ということがある)を抗原として用いて動物を免疫し、常法に基づき、該抗原に対するモノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを作製する。 動物の免疫方法はこの分野において周知であり、また、ハイブリドーマの作製も周知のケーラーとミルシュタインの方法により行なうことができる。
【0009】1つの物質は通常多数のエピトープを有しており、上記患者由来画分にのみ含まれる物質(すなわちマーカー分子)もその構造の大部分は正常人のものと同一であることが普通であるから、マーカー分子に対する抗体といえどもその大部分は正常人由来の物質とも反応するのが通常である。 さらに、上記患者由来画分はマーカー分子以外の多数の物質を含むのが通常であるから、上記方法により得られたハイブリドーマも、通常、
そのほとんどは患者由来成分と正常人由来成分の両方に反応するものである。 しかしながら、求めるべきものは患者由来成分とは特異的に反応するが正常人由来成分とは反応しないモノクローナル抗体である。 これを得るために、まず、上記ハイブリドーマが産生するモノクローナル抗体を正常人由来画分で処理し、正常人由来画分と反応しないモノクローナル抗体のみを選択する(以下、
これを「ネガティブ選択」と言うことがある)。 これは、例えば、患者由来画分を固相に固定しておき、モノクローナル抗体を正常人由来画分と混合して抗原抗体反応が可能な状態においた後、この混合液を固相に固定された患者由来画分と反応させ、固相を洗浄後、固相に結合したモノクローナル抗体を常法により検出することによって行なうことができる。 あるいは、固相に患者由来画分を固定し、その上に正常人由来画分を液相として加え、これにモノクローナル抗体を添加して抗原抗体反応させてもよい(この場合でもモノクローナル抗体は固相と接触する前に液相と接触するので、液相と固相の両方に反応するモノクローナル抗体は固相と反応する前に液相に吸収されてしまう)。 なお、免疫原に対するモノクローナル抗体を生産しているハイブリドーマを上記したネガティブ選択工程に先立ち選択し(以下、これを「ポジティブ選択」ということがある)、選択されたハイブリドーマが生産するモノクローナル抗体のみを上記ネガティブ選択工程に付してもよい。 これによって選択工程の効率を高めることができる。 また、上記ネガティブ選択の後、免疫原として用いた画分に対応する画分以外の正常人由来の生体成分と交差反応性を有するモノクローナル抗体を避けるため、正常人由来の全生体成分を液相に用いたネガティブ選択をさらに行なうことが好ましい。 これにより、正常人由来成分とは交差反応性を有さない、患者由来成分に対してのみ特異的なモノクローナル抗体を得ることができる。
【0010】上記方法において、正常人由来画分で処理した後、患者由来画分と反応したモノクローナル抗体(及び好ましくは、さらに正常人由来の全生体成分と交差反応しないモノクローナル抗体)が求めるモノクローナル抗体である。 このモノクローナル抗体は、該モノクローナル抗体を産生するハイブリドーマを培養し、その培養上清から回収することもできるし、該ハイブリドーマをマウス等の腹腔に移植し、腹水から回収することもできる。
【0011】本発明の方法により製造されたモノクローナル抗体は、当該疾患に固有なマーカー分子とのみ特異的に反応するので、当該疾患の診断薬として用いることができる。
【0012】
【発明の効果】本発明の方法は、疾患に固有なマーカー分子の生理活性に基づく分離、精製又は検出を必要としない。 従って、本発明により、診断しようとする疾患に固有なマーカー分子が未知の場合又はマーカー分子の生理活性が未知若しくは測定不能の場合であっても、その疾患に固有なマーカー分子と特異的に反応するモノクローナル抗体の製造方法が提供された。 従って、本発明は各種疾患の診断の分野において大いに貢献するものと考えられる。
【0013】
【実施例】以下、本発明を実施例によりさらに具体的に説明する。 もっとも、本発明は下記実施例に限定されるものではない。
【0014】(1) 硫酸アンモニウムによる塩析 リウマチ患者(以下、リウマチ患者由来のものを示す場合「R」の表示を使用することがある)及び正常人(以下、正常人由来のものを示す場合「N」の表示を使用することがある)からそれぞれ100mlずつ血清を採取した。 各血清を1N水酸化ナトリウムでpHを7.0に調整し、それぞれ飽和硫酸アンモニウム(pH7.0)
を最終濃度で10%、20%、30%、40%、50%
となるように段階的に加え、それぞれの段階での沈殿物を回収、洗浄し、10mMリン酸バッファー(pH7.
5)に対して透析した。 硫酸アンモニウム濃度ごとの画分をそれぞれN−10、N−20、N−30、N−4
0、N−50(以上正常人由来)及びR−10、R−2
0、R−30、R−40、R−50(以上リウマチ患者由来)と呼ぶ。
【0015】(2) ゲルろ過クロマトグラフィーによる分画 (1) で得た各画分をFPLCシステム(ファルマシア社製)のSuperose-6を用いて分子サイズによる分画を行ない、各画分を大きなピークごとに分画した。 N、Rとも、−10、−20、−50の各画分は4つの画分に分画され(高分子側の画分からI、II、III 、IVと示す)、−30、−40の各画分は6つの画分に分画された(高分子側の画分からI、II、III 、IV、V、VIと示す)。
【0016】(3) 陰イオンカラムクロマトグラフィーによる分画 (2) で得たN、R、それぞれ24の画分をFPLCシステムのMonoQ カラムによってNaCl濃度0〜300m
Mの濃度勾配によって溶出、分画した。 波長260nm
における吸光度を測定してN、Rの各画分の溶出パターンを比較したところ、N−20−III にはなくR−20
−III には存在するNaCl濃度約150mM付近で溶出されるピークを検出した。
【0017】(4) Blueセファロースカラムクロマトグラフィーによるアルブミンの除去 (3) で検出したピークを分画し(N−20−III-150 、
R−20−III-150)、アルブミンの混入を除くため、Blu
eセファロースカラム(ファルマシア社製)に素通りする画分を回収した。
【0018】(5) 抗イムノグロブリン抗体カラムによるイムノグロブリンの除去 (4) と同様の目的で、抗イムノグロブリン抗体カラムを用いて、(4) で得た画分よりイムノグロブリンを除去した。 この段階で得た各部分生成物をN−P、R−Pとした。
【0019】(6) 免疫及びハイブリドーマの作製 部分精製の結果、リウマチ患者に特徴的であると思われるR−P画分を、Balb/cマウスに免疫した。 3回の免疫後、脾臓細胞を取り出し、常法に従ってマウスミエローマ細胞との融合を行なった。
【0020】(7) スクリーニング HAT培地による選択により生存したハイブリドーマから、目的物質に対するモノクローナル抗体を産生しているもののスクリーニングは以下の方法を用いた。 すなわち、まず、ポジティブ選択として、免疫原として用いたR−Pをマイクロタイタープレートのウェルに固定し(PBS、4℃、一昼夜)、1% BSA/PBSでブロッキングを行なった後、各ハイブリドーマの培養上清を加えて反応させた。 洗浄後、HRP標識した抗マウスイムノグロブリン抗体を反応させ、o−フェニレンジアミンを基質として発色させ、硫酸で停止後、492nm
の吸光度を測定することにより、固相に結合したモノクローナル抗体を選択した。 次いで、ポジティブ選択されたモノクローナル抗体についてネガティブ選択を行なった。 すなわち、R−Pをマイクロタイタープレートのウェルに固定し、ブロッキング処理を行なった後、N−P
をウェルに加え、ポジティブ選択されたハイブリドーマの培養上清をウェルに加え、固相に結合したモノクローナル抗体を上記と同様な酵素免疫分析の手法により選択した。 さらに同様にして、正常人の全血清を液相として用いたネガティブ選択を行ない、他の血清成分との交差反応性を有するモノクローナル抗体をも除いた。 最終的に、R−Pに特徴的に存在するタンパク質にのみ特異的に反応する2種のモノクローナル抗体を得た(RP−0
1、RP−02)。
【0021】(8) 血清診断 マイクロタイタープレートにRP−01を10μg/m
lの濃度で固定し(PBS、4℃、一昼夜)、1% B
SA/PBSでブロッキング処理を行なった後、リウマチ患者の血清32例と正常人の血清64例を反応させた。 洗浄後、HRP標識したRP−02を反応させ、洗浄後、o−フェニレンジアミンを基質として発色させ、
硫酸による停止後、492nmの吸光度を測定した。 正常人血清の平均値の+2SD(SDは標準偏差)をcu
t off値としたところ、リウマチ患者の血清では1
9/32例(59%)が陽性率を示し、また、正常人血清ではわずかに1例(2%)がcut off値以上であった。
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