植物硝酸盐转运蛋白及其用途
阅读：1035发布：2020-07-24
专利汇可以提供植物硝酸盐转运蛋白及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了影响 植物 的产量及其它农学特性的方法和组合物。本发明还公开了通过表达NRT1.1B进行转基因调节和标记辅助育种的方法，由此提高 水 稻及其它作物的氮利用率和谷粒产量。，下面是植物硝酸盐转运蛋白及其用途专利的具体信息内容。
1.一种改善植物的农学特性的方法，所述方法包括调节以下项的表达：
(i)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与一种SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(ii)在严格杂交条件下与包含SEQ ID NO:1的多核苷酸杂交的多核苷酸；(iii)编码包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，并且其中所述多肽在SEQ ID NO:2的对应第327位氨基酸处包含氨基酸甲硫氨酸；(iv)编码与SEQ ID NO:2相比包含氨基酸的一个或多个缺失或插入或置换的多肽的多核苷酸。
2.根据权利要求1所述的方法，其中编码与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的多肽的所述多核苷酸的所述表达通过用可操作地连接至异源启动子的重组多核苷酸转化所述植物来提高。
3.根据权利要求1所述的方法，其中编码与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的多肽的内源性多核苷酸的所述表达通过上调与所述内源性多核苷酸可操作地相关联的调控元件来提高。
4.根据权利要求1所述的方法，其中所述多核苷酸的所述表达通过在异源调控元件下表达所述多核苷酸来提高。
5.根据权利要求1所述的方法，其中所述农学特性选自(i)谷粒产量增加，(ii)营养摄入增加，(iii)氮利用率增加，(iv)硝酸盐摄入增加，(v)根到苗营养物质运输增加，以及(vi)生物质增加。
6.根据权利要求1所述的方法，其中所述农学性能为生长和/或生殖阶段过程中植物生物质的增加。
7.根据权利要求1所述的方法，其中所述粒重相对于不具有表达提高的所述多核苷酸的对照植物而增加。
8.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
9.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是水稻或玉米。
10.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
11.根据权利要求1所述的方法，其中所述植物是大豆。
12.一种提高植物的产量或氮利用率的方法，所述方法包括提高编码水稻硝酸盐转运蛋白NRT1.1B的多核苷酸的所述表达。
13.根据权利要求12所述的方法，其中编码NRT1.1的所述多核苷酸获自水稻亚种籼稻。
14.根据权利要求12所述的方法，其中所述氮利用率通过增加选自以下的表型来提高：
硝酸盐含量、对氯酸盐的敏感性、每株植物的分蘖数、细胞数目、以及叶绿素含量。
15.根据权利要求13所述的方法，其中所述亚种籼稻是品种IR24。
16.一种提高水稻品种日本晴的稻粒产量的方法，所述方法包括通过用籼稻品种IR24的供体亲本育种来产生日本晴的近等基因系，并且选择包含所述供体亲本的NRT1.1等位基因的日本晴的所述等基因系，所述供体亲本的NRT1.1等位基因由编码在SEQ ID NO:2的第
327位处包含所述氨基酸甲硫氨酸的所述多肽的多核苷酸表示。
17.一种标记辅助选择产量提高的植物的方法，所述方法包括：
a.对植物进行标记辅助选择，所述植物在编码包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的基因组区域中具有一个或多个变异，其中所述多肽在对应的第
327位氨基酸处包含甲硫氨酸；以及
b.鉴定出与不包含所述甲硫氨酸的植物相比产量增加的植物。
18.一种鉴定水稻植物群体中的与增加的谷粒产量相关联的一个或多个等位基因的方法，所述方法包括：
a.在水稻植物群体中评估(i)基因组区域，所述基因组区域编码多肽，或者(ii)控制所述多肽的所述表达的调控区中的一个或多个等位基因变异，其中所述多肽包含SEQ ID NO:
2的所述氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有95％同一性的序列；
b.获得所述群体中的所述一个或多个水稻植株的增加的产量的表型值；
c.将所述基因组区域中的所述等位基因变异与所述表型相关联；以及
d.鉴定出与增加的产量相关联的所述一个或多个等位基因。
19.一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸(i)编码包含一种SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与一种SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；(ii)在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO:1的多核苷酸的片段杂交，其中所述片段包含SEQ ID NO:1的至少100个连续的核苷酸；(iii)编码与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；
(iv)编码与SEQ ID NO:1相比包含氨基酸的一个或多个缺失或插入或置换的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码参与所述氮利用的调控的多肽。
20.一种包含权利要求19所述的多核苷酸的重组表达盒，其中所述多核苷酸可操作地连接至异源调控元件，其中所述表达盒在植物细胞中是有功能的。
21.一种宿主植物细胞，所述宿主植物细胞包含权利要求20所述的表达盒。
22.一种转基因植物，所述转基因植物包含权利要求20所述的重组表达盒。
23.一种转基因植物部分，所述转基因植物部分包含可操作地调控多核苷酸的所述表达的植物调控元件，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2的所述氨基酸序列或者其变体或直系同源物的多肽，其中所述调控元件对所述多核苷酸是异源的。
24.根据权利要求19所述的多核苷酸，其中所述多肽是与SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的硝酸盐转运蛋白。
25.一种育种产量提高的水稻植物的方法，所述方法包括：
a.在第一水稻植物中检测基因组区域中的基因变异，所述基因组区域包含编码包含SEQ ID NO:2或其变体的蛋白质的多核苷酸，其中所述基因变异包含在第327位处不为苏氨酸的氨基酸；以及
b.使所述第一水稻植物与不包含所述基因变异的第二水稻植物杂交。
26.一种鉴定与玉米植物群体中的增加的产量相关联的一个或多个等位基因的方法，所述方法包括：
a.在玉米植物群体中评估(i)编码多肽的基因组区域或者(ii)控制所述多肽的所述表达的调控区中的一个或多个基因变异，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列；
b.获得所述群体中的一个或多个玉米植株的产量数据；
c.将编码所述多肽的所述基因组区域中或者控制所述多肽的所述表达的所述调控区中的所述一个或多个基因变异与产量相关联，由此鉴定出与增加的产量相关联的一个或多个等位基因。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述一个或多个基因变异处于所述多核苷酸的编码区中。
28.根据权利要求26所述的方法，其中所述调控区是启动子元件。
29.根据权利要求26所述的方法，其中所述产量是谷粒产量或种子产量。
30.一种在其基因组中包含稳定整合的多核苷酸的转基因玉米植物，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性并在SEQ ID NO:2的第327位处包含甲硫氨酸的多肽。
31.根据权利要求30所述的转基因玉米植物，其中所述多核苷酸由异源启动子驱动。
32.根据权利要求30所述的转基因玉米植物，所述转基因玉米植物与不具有所述多肽的对照玉米植物相比表现出增加的氮利用率。
植物硝酸盐转运蛋白及其用途
[0001] 交叉引用
[0002] 本实用申请要求2014年9月24日提交的中国申请201410495440.9的优先权的利益，所述申请以引用方式并入本文。
技术领域
[0005] 本公开总体上涉及分子生物学领域。
背景技术
[0006] 许多植物的驯化已与产量显著增加相关。自然群体中发生的大多数表型变异是连续的并通过多种基因影响来实现。对造成驯化植物中产量显著不同的特定基因的鉴别已成为农业研究的重要焦点。
[0007] 水稻是全世界一半以上人口的主要膳食组成。亚洲栽培稻(水稻，Oryza sativa L.)包括两个主要亚种籼稻和粳稻。同时提高水稻的产量和最终加工品质仍然是一项挑战。粳稻广泛种植于东亚地区，其在中国、日本和韩国因其更好的食用品质和低温下稳定的谷粒产量而单独占水稻耕种总面积约39％。然而，较低的氮利用率(NUE)是粳稻栽培中长期存在的问题，其意味着更高的氮(N)肥投入要求。硝酸盐和铵是水稻的主要氮源，并且灌溉的水稻中至多40％的全氮摄取作为硝酸盐吸收，因为硝化作用发生在根围。因此，通过增大NUE来提高产量是期望的。
发明内容
发明内容
[0008] 本发明公开了增强硝酸盐摄取和根到苗运输并且上调硝酸盐应答基因表达的多核苷酸、相关的多肽和新基因的所有保守性修饰变体、硝酸盐转运蛋白基因的变异、NRT1.1B/OsNPF6.5。在一个实施方案中，利用近等基因或转基因品系的田间试验确认，携带NRT1.1B-籼稻等位基因的粳稻品种具有显著提高的谷粒产量和氮利用率(NUE)。结果表明，NRT1.1B的变异有助于籼稻和粳稻之间的硝酸盐利用趋异度，并且NRT1.1B-籼稻提高了粳稻的NUE。
[0009] 一种改善植物农学特性的方法，所述方法包括调节以下项的表达：(i)编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与一种SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列的多核苷酸；(ii)在严格杂交条件下与包含SEQ ID NO:1的多核苷酸杂交的多核苷酸；(iii)编码包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的多核苷酸，并且其中所述多肽在SEQ ID NO:2的对应第327位氨基酸处包含氨基酸甲硫氨酸；(iv)编码与SEQ ID NO:2相比包含氨基酸的一个或多个缺失或插入或置换的多肽的多核苷酸。
[0010] 在一个实施方案中，编码与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的多肽的多核苷酸的表达通过用可操作地连接至异源启动子的重组多核苷酸转化植物来提高。
[0011] 在一个实施方案中，编码与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的多肽的内源性多核苷酸的表达通过上调与内源性多核苷酸可操作地相关联的调控元件来提高。
[0012] 在一个实施方案中，多核苷酸的表达通过在异源调控元件下表达多核苷酸来提高。
[0014] 在一个实施方案中，农学性能为生长和/或生殖阶段过程中植物生物质的增加。
[0015] 在一个实施方案中，粒重相对于不具有表达提高的多核苷酸的对照植物增加。
[0016] 在一个实施方案中，植物是单子叶植物。
[0017] 在一个实施方案中，植物是水稻或玉米。
[0018] 在一个实施方案中，植物是双子叶植物。
[0019] 在一个实施方案中，植物是大豆。
[0020] 一种提高植物的产量或氮利用率的方法，所述方法包括提高编码水稻硝酸盐转运蛋白NRT1.1B的多核苷酸的表达。
[0021] 在一个实施方案中，编码NRT1.1的多核苷酸获自水稻亚种籼稻。
[0022] 在一个实施方案中，氮利用率通过增加选自以下的表型来提高：硝酸盐含量、对氯酸盐的敏感性、每株植物的分蘖数、细胞数目、以及叶绿素含量。
[0023] 在一个实施方案中，亚种籼稻是品种IR24。
[0024] 一种提高水稻品种日本晴的稻粒产量的方法，所述方法包括通过用籼稻品种IR24的供体亲本育种来产生日本晴的近等基因系，并且选择包含供体亲本的NRT1.1等位基因的日本晴等基因系，所述供体亲本的NRT1.1等位基因由编码在SEQ ID NO:2的第327位处包含氨基酸甲硫氨酸的多肽的多核苷酸表示。
[0025] 一种标记辅助选择产量提高的植物的方法，所述方法包括：
[0026] a.对植物进行标记辅助选择，所述植物在编码包含与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列的多肽的基因组区域中具有一个或多个变异，其中所述多肽在对应的第327位氨基酸处包含甲硫氨酸；以及
[0027] b.鉴定出与不包含所述甲硫氨酸的植物相比产量增加的植物。
[0028] 一种鉴定水稻植物群体中的与增加的谷粒产量相关联的一个或多个等位基因的方法，所述方法包括：
[0029] a.在水稻植物群体中评估(i)基因组区域，所述基因组区域编码多肽，或者(ii)控制所述多肽表达的调控区中的一个或多个等位基因变异，其中所述多肽包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与SEQ ID NO:2具有95％同一性的序列；
[0030] b.获得所述群体中一个或多个水稻植株的增加的产量的表型值；
[0031] c.将所述基因组区域中的所述等位基因变异与所述表型相关联；以及
[0032] d.鉴定出与增加的产量相关联的一个或多个等位基因。
[0033] 一种分离的多核苷酸，所述分离的多核苷酸(i)编码包含一种SEQ ID NO:2的氨基酸序列或与一种SEQ ID NO:2具有至少95％同一性的氨基酸序列；(ii)在严格杂交条件下与选自SEQ ID NO:1的多核苷酸的片段杂交，其中所述片段包含SEQ ID NO:1的至少100个连续的核苷酸；(iii)编码与SEQ ID NO:2具有至少90％同一性的氨基酸序列；(iv)编码与SEQ ID NO:1相比包含氨基酸的一个或多个缺失或插入或置换的多肽的多核苷酸，其中所述多核苷酸编码参与氮利用的调控的多肽。
[0034] 一种重组表达盒，其中NRT1.1B多核苷酸可操作地连接至异源调控元件，其中表达盒在植物细胞中是有功能的。在一个实施方案中，植物细胞包含表达盒。一种包含重组表达盒的转基因植物。
[0035] 一种转基因植物部分，所述转基因植物部分包含可操作地调控多核苷酸表达的植物调控元件，所述多核苷酸编码包含SEQ ID NO:2的氨基酸序列或其变体或直系同源物的多肽，其中所述调控元件对所述多核苷酸是异源的。
[0036] 在一个实施方案中，多肽是与SEQ ID NO:2具有至少约70％同一性的硝酸盐转运蛋白。
[0037] 一种育种产量提高的水稻植物的方法，所述方法包括：
[0038] a.在第一水稻植物中检测基因组区域中的基因变异，所述基因组区域包括编码包含SEQ ID NO:2或其变体的蛋白质的多核苷酸，其中所述基因变异包括在第327位不为苏氨酸的氨基酸；以及
[0039] b.使所述第一水稻植物与不包含所述基因变异的第二水稻植物杂交。
[0040] 一种鉴定与玉米植物群体中增加的产量相关联的一个或多个等位基因的方法，所述方法包括：
[0041] a.在玉米植物群体中评估(i)编码多肽的基因组区域或者(ii)控制所述多肽表达的调控区中的一个或多个基因变异，其中所述多肽包含与SEQ ID NO:2具有至少80％同一性的氨基酸序列；
[0042] b.获得所述群体中一个或多个玉米植株的产量数据；
[0043] c.将所述编码多肽的基因组区域中或者所述控制多肽表达的调控区中的所述一个或基因变异与产量相关联，由此鉴定出与增加的产量相关联的一个或多个等位基因。
[0045] 转基因玉米植物在其基因组中包含稳定整合的多核苷酸，所述多核苷酸编码与SEQ ID NO:2具有至少95％同一性并在SEQ ID NO:2的第327位处包含甲硫氨酸的多肽。在一个实施方案中，多核苷酸由异源启动子驱动。在一个实施方案中，转基因玉米植物与不具有所述多肽的对照玉米植物相比表现出增加的氮利用率。
[0046] 表1序列说明
[0048] 如根据此处引用作为参考的Nucleic Acids Res.13:3021-3030(1985)和Biochemical J.219(2):345-373(1984)中描述的IUPAC-IUBMB标准所定义的，在对序列表的描述中，一个字母码表示核苷酸序列符号，三个字母码则表示氨基酸。用于核苷酸和氨基酸序列数据的符号和格式符合37C.F.R.§1.822所示的规则。
[0049]SEQ ID NO: 多核苷酸/多肽 名称 说明
SEQ ID NO:1 多核苷酸 OsNRT1.1B DNA 水稻(籼稻)
SEQ ID NO:2 多肽 OsNRT1.1B蛋白 水稻(籼稻)
SEQ ID NO:3 多核苷酸 OsNRT1.1B DNA 水稻(粳稻/日本晴)
SEQ ID NO:4 多肽 OsNRT1.1B蛋白 水稻(粳稻/日本晴)
SEQ ID NO:5 多肽 CHL1蛋白 拟南芥
SEQ ID NO:1 多核苷酸 OsNRT1.1B DNA 水稻(籼稻)
SEQ ID NO:2 多肽 OsNRT1.1B蛋白 水稻(籼稻)
SEQ ID NO:3 多核苷酸 OsNRT1.1B DNA 水稻(粳稻/日本晴)
SEQ ID NO:4 多肽 OsNRT1.1B蛋白 水稻(粳稻/日本晴)
SEQ ID NO:5 多肽 CHL1蛋白 拟南芥
[0050] 在另一个方面，本公开涉及包含所描述的核酸的重组表达盒。另外，本公开涉及含有该重组表达盒的载体。此外，含有该重组表达盒的载体可有利于该核酸在宿主细胞中的转录和翻译。本公开还涉及能够表达本公开的多核苷酸的宿主细胞。有多种宿主细胞可以使用，如但不限于微生物、哺乳动物、植物或昆虫细胞。
[0051] 在又另一个实施方案中，本公开涉及含有本公开的核酸的转基因植物或植物细胞。优选的含有本公开多核苷酸的植物包括但不限于玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、西红柿和稷。在另一个实施方案中，转基因植物为玉米植物或植物细胞。另一个实施方案是得自可操作地连接至在植物中驱动表达的启动子的本公开的转基因硝酸盐摄取相关联的多肽的转基因种子。本公开的植物与对照植物相比可具有提高的谷粒品质。附图说明
[0052] 图1示出NRT1.1B变异有助于硝酸盐利用的差异。(a)亲本植物即日本晴(Nip)、亚洲栽培水稻(Oryza sativa L.)亚种籼稻IR24水稻品种、以及CSSSL(NI10-1)的氯酸盐敏感性测试。比例尺为2cm。(b)用5mM 15N-硝酸盐标记的亲本植物和NI10-1的苗中的15N积聚测定。P值分别由日本晴与IR24、日本晴与NI10-1之间的Student t检验产生。(c)通过氯酸盐敏感性分离体的遗传连锁分析精细作图。线下方的数字指示重组体的数目。(d)NRT1.1B基因结构和日本晴与IR24之间的等位基因变异。(e)日本晴和NIL的氯酸盐敏感性测试。比例尺为2cm。(f)用5mM 15N-硝酸盐标记的日本晴和NIL的苗中的15N积聚测定。P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。(g)用5mM 15N-硝酸盐标记的NRT1.1B-日本晴(Nip-2/3/7)或NRT1.1B-IR24(IR-1/3/6)转基因植物(CaMV 35S启动子)、EV1即pCAMBIA2300-CaMV 35S空载体转基因植物的苗中的15N积聚测定。P值由NRT1.1B-日本晴转基因植物与NRT1.1B-IR24转基因植物之间的Student t检验产生。b、f和g中的值是平均±SD(n＝4)。
[0053] 图2示出NRT1.1B的功能特征和组织定位测定。(a)利用15N-硝酸盐在注入NRT1.1B-日本晴(NBnip)、NRT1.1B-IR24(NBir)、和CHL1的爪蟾卵母细胞中的硝酸盐摄入测定。CHL1用作阳性对照。类似的结果另外获自不同蛙的卵母细胞。值是平均±SD(n＝10)。P值由NRT1.1B-日本晴注射的卵母细胞与NRT1.1B-IR24注射的卵母细胞之间的Student t检验产生。(b)NRT1.1B的硝酸盐诱导测定。KCl用作阴性对照。值是平均±SD(n＝3)。(c-h)NRT1.1B启动子::GUS转基因植物的根(c-e)、叶鞘(f)、叶片(g)和秆(h)的GUS染色，在e、g和h中示出横截面。比例尺：c中为3mm，d中为0.6mm，e中为0.3mm，f-g中为1mm。i和j：用反义探针和有义探针(阴性对照)在根部段的RNA原位杂交。箭头指出邻近木质部的表皮细胞和中柱细胞。比例尺为0.4mm。
[0054] 图3展示了可影响硝酸盐摄入、硝酸盐根到苗的运输和硝酸盐应答基因的表达的NRT1.1B的变异。(a)用5mM 15N-硝酸盐标记的日本晴(Nip)和NIL的硝酸盐摄入活性测定。(b)用5mM 15N-硝酸盐标记的日本晴和NIL的硝酸盐根到苗的运输测定。(c，d)日本晴和NIL的苗和根中的OsNIA1和OsNIA2的转录物表达分析。转录物水平用定量RT-PCR测定。值是平均±SD(a和b中平行测定4次，c和d中平行测定3次)。P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。
[0055] 图4示出NRT1.1B的系统发育分析。(a)从950份各种不同的水稻种质(4种主要的水稻亚种，即籼稻、粳稻、aus、以及以不同颜色标记的中间型)产生的NRT1.1B的系统发生图示出籼稻与粳稻之间的趋异度。(b)NRT1.1B SNP1等位基因的祖先状态重建。左侧：稻属中NRT1.1B的系统发育。右侧：稻属中NRT1.1B直系同源物的基因型。示出了来自发生率为45％或更高的1,000次伪复制的具有自展值的节点。(c)籼稻、粳稻和普通野生稻(O.rufipogon)群体中的SNP1的单核苷酸多样性和代表性基因型(SEQ ID NO:99-109，分别起始于短舌野稻(O.barthii)并终止于斑点野生稻(O.punctata))。PSA为群体特异性等位基因。
[0056] 图5示出NRT1.1B-籼稻基因渗入提高NUE。(a)发芽后在具有不同硝酸盐供应(400μM、1mM和2mM)的水培溶液中生长3个月的日本晴(Nip)和NIL的宏观形态学。比例尺为20cm。(b)在低氮(LN)或高氮(HN)供应下于田间(北京)生长的日本晴和NIL的宏观形态学。比例尺为20cm。(c)在低氮或高氮供应下于田间(北京)生长的日本晴和NIL的每个植株的总谷粒。
比例尺为6cm。(d)在北京低氮供应下日本晴和NIL的每株植物的分蘖数、每株植物的谷粒产量、每块样地的实际产量和NUE。值是平均±SD(对每株植物的分蘖数和每株植物的谷粒产量平行测定30次，对每块样地的实际产量和NUE平行测定6次)。P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。将硝酸盐用作田间栽培的主要氮肥，1kg N/100m2作为低氮条件并且
2kg N/100m2作为高氮条件。
比例尺为6cm。(d)在北京低氮供应下日本晴和NIL的每株植物的分蘖数、每株植物的谷粒产量、每块样地的实际产量和NUE。值是平均±SD(对每株植物的分蘖数和每株植物的谷粒产量平行测定30次，对每块样地的实际产量和NUE平行测定6次)。P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。将硝酸盐用作田间栽培的主要氮肥，1kg N/100m2作为低氮条件并且
2kg N/100m2作为高氮条件。
[0057] 图6展示出NRT1.1B-籼稻转基因植物示出比NRT1.1B-粳稻转基因植物高的NUE。(a)在低氮供应下含有由CaMV 35S启动子控制的NRT1.1B-粳稻(Nip-3)或NRT1.1B-籼稻(IR-3)的转基因植物的农学性状(每株植物的分蘖数、每株植物的谷粒产量、每块样地的实际产量和NUE)。(b)在低氮供应下含有由其天然启动子控制的NRT1.1B-粳稻(gNip-2)或NRT1.1B-籼稻(gIR-3)的转基因植物的农学性状。值是平均±SD(对每株植物的分蘖数和每株植物的谷粒产量平行测定20次，对每块样地的实际产量和NUE平行测定6次)。P值由NRT1.1B-粳稻与NRT1.1B-籼稻转基因植物之间的Student t检验产生。EV1为pCAMBIA2300-CaMV 35S空载体转基因植物。EV2为pCAMBIA2300空载体转基因植物。硝酸盐用作田间栽培的主要氮肥，1kg N/100m2作为低氮条件。利用其它转基因植物(Nip-2和IR-1；gNip-1和gIR-4)的田间试验也获得类似结果。
[0058] 图7显示出籼稻品种示出比粳稻品种高的硝酸盐吸收和氯酸盐敏感性。(a)用5mM 15N-硝酸盐标记的34个籼稻和粳稻栽培品种的苗中的15N积聚测定。DW(干重)。(b)用2mM
15N-铵标记的34个籼稻和粳稻栽培品种的苗中的15N积聚测定。DW(干重)。(c)134个籼稻和粳稻品种之间的氯酸盐敏感性比较结果。P值由籼稻和粳稻品种之间的Student t检验产生。
15N-铵标记的34个籼稻和粳稻栽培品种的苗中的15N积聚测定。DW(干重)。(c)134个籼稻和粳稻品种之间的氯酸盐敏感性比较结果。P值由籼稻和粳稻品种之间的Student t检验产生。
[0059] 图8示出NRT1.1B-IR24等位基因是半显性的并且具有更高硝酸盐摄入活性。(a)CSSSL(NI10-1)的图形化基因型。黑条：来自日本晴的基因组区域；红条：来自IR24的基因组区域；(b)从NI10-1×日本晴产生F2代群体的示意图。(c)在氯酸盐处理下F2代群体的分离体。比例尺为2cm。(d)在氯酸盐处理下F2代植株的统计分析。(e)NIL基因型的示意图。黑条：来自日本晴的基因组区域；红条：来自IR24的基因组区域；(f)用5mM 15N-硝酸盐标记的日本晴和NIL的根中的15N积聚测定。f中的值是平均±SD(n＝4)。P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。
[0060] 图9示出转基因植物和NIL中NRT1.1B的转录物表达分析。(a)选择具有类似的NRT1.1B转录物表达水平的含有由CaMV 35S启动子控制的NRT1.1B-日本晴(Nip-2/3/7)或NRT1.1B-IR24(IR-1/3/6)的转基因植物进行进一步研究。(b)选择具有类似的NRT1.1B转录物表达水平的含有由其天然启动子控制的NRT1.1B-日本晴(gNip-1/2)或NRT1.1B-IR24(gIR-3/4)的转基因植物进行进一步研究。(c)用5mM 15N-硝酸盐标记的NRT1.1B-日本晴15
(gNip-1/2)或NRT1.1B-IR24(gIR-3/4)转基因植物的苗中的 N积聚分析。a-c中的P值由NRT1.1B-日本晴转基因植物与NRT1.1B-IR24转基因植物之间的Student t检验产生。(d)日本晴(Nip)、NIL和IR24中NRT1.1B的转录物表达测定。转录物水平由定量RT-PCR(qRT-PCR)测定。d中的P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。值是平均±SD(对qRT-PCR平行
15
测定3次，对 N测定平行测定4次)。EV1为pCAMBIA2300-CaMV 35S空载体转基因植物。EV2为pCAMBIA2300空载体转基因植物。
(gNip-1/2)或NRT1.1B-IR24(gIR-3/4)转基因植物的苗中的 N积聚分析。a-c中的P值由NRT1.1B-日本晴转基因植物与NRT1.1B-IR24转基因植物之间的Student t检验产生。(d)日本晴(Nip)、NIL和IR24中NRT1.1B的转录物表达测定。转录物水平由定量RT-PCR(qRT-PCR)测定。d中的P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。值是平均±SD(对qRT-PCR平行
15
测定3次，对 N测定平行测定4次)。EV1为pCAMBIA2300-CaMV 35S空载体转基因植物。EV2为pCAMBIA2300空载体转基因植物。
[0061] 图10示出NRT1.1B为CHL1的推定同系物。(a)基于蛋白质结构分析(http://bioinf.cs.ucl.ac.uk)的预测的NRT1.1B的跨膜形貌的示意性图。黄色圆柱体和黑色连接线分别表示跨膜区和亲水区。星号指示日本晴与IR24之间的氨基酸突变位点。(b)通过ClustalX比对示出与NRT1.1B相关性的功能性识别的植物PTR蛋白的系统发育树。(c)NRT1.1B与CHL1的比对。暗色字母指示相同/高度保守的氨基酸残基或高度相似的氨基酸残基的嵌段。
[0062] 图11示出水稻原生质体中NRT1.1B-日本晴(NBnip)和NRT1.1B-IR24(NBir)的亚细胞定位。左侧：eGFP(绿色)荧光的图像；中间：eGFP(绿色)荧光和叶绿素(红色)荧光的重叠图像；右侧：明视场图像。将p35S-eGFP用作对照。比例尺为10μm。
[0063] 图12示出nrt1.1b突变体的鉴定和功能表征。(a)在内含子中携带T-DNA插入的nrt1.1b突变体(Zhonghua11(ZH11)背景，粳稻品种)的示意图。黑白框分别表示编码区和非翻译区(UTR)。三角形表示T-DNA插入。F1和R1表示NRT1.1B的引物，并且R2表示T-DNA的引物。LB和RB分别表示T-DNA的左边界和右边界。(b)野生型ZH11和nrt1.1b突变体中NRT1.1B(F1+R1)和旁侧序列(F1+R2)的片段的PCR扩增。所用引物列出于表2中。(c)ZH11和nrt1.1b突变体中的NRT1.1B转录水平的RT-PCR分析。将水稻ACTIN1用作内参。所用引物列出于表215
中。(d)用200μM或5mM N-硝酸盐标记的ZH11和nrt1.1b突变体的苗和根中的15N积聚测定。
DW(干重)。(e)具有200μM或5mM 15N-硝酸盐的ZH11和nrt1.1b突变体的硝酸盐摄入活性测定。(f)具有200μM或5mM 15N-硝酸盐的ZH11和nrt1.1b突变体的硝酸盐根到苗运输测定。d-f中的值是平均±SD(n＝4)。P值由ZH11和nrt1.1b突变体之间的Student t检验产生。
中。(d)用200μM或5mM N-硝酸盐标记的ZH11和nrt1.1b突变体的苗和根中的15N积聚测定。
DW(干重)。(e)具有200μM或5mM 15N-硝酸盐的ZH11和nrt1.1b突变体的硝酸盐摄入活性测定。(f)具有200μM或5mM 15N-硝酸盐的ZH11和nrt1.1b突变体的硝酸盐根到苗运输测定。d-f中的值是平均±SD(n＝4)。P值由ZH11和nrt1.1b突变体之间的Student t检验产生。
[0064] 图13示出NRT1.1B参与调控硝酸盐应答基因的表达。(a)ZH11和nrt1.1b突变体中OsNIA1、OsNIA2、OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3A和OsNRT1.5A的硝酸盐诱导测定。y-轴指出硝酸盐(5mM)诱导2小时的转录物增加的倍数(b)日本晴(Nip)和NIL中OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3A和OsNRT1.5A的转录物表达分析。转录物水平由qRT-PCR测定。值是平均±SD(n＝3)。P值由ZH11与nrt1.1b突变体(a)、日本晴与NIL(b)之间的Student t检验产生。所用引物列出于表2中。
[0065] 图14示出NRT1.1B在籼稻和粳稻亚种之间分歧并且在籼稻中进行人工选择。(a)单核苷酸多样性(SND)测定显示出NRT1.1B的CDS区域中的两种群体特异性等位基因(PSA)。经由定制的PERL脚本对22kb序列集计算SND。(b)籼稻和粳稻中NRT1.1B的SNP分析。T(蓝色)或C(绿色)指出核苷酸置换，从而导致错义突变。(c)NRT1.1B基因周围的选择性扫描信号(中心位于NRT1.1B的22kb区域)。y-轴指示π值。(d)NRT1.1B的连锁不平衡(LD)分析。y-轴指示LD统计的ωmax值。水平红线代表LD统计的全基因组临界值(FDR≤0.05)。NRT1.1B的基因模型缩放为序列坐标，c和d中的白框和蓝框分别表示非翻译区和编码区，并且黑线表示内含子区域。(e)中心位于NRT1.1B的22kb区域中的核苷酸多样性(π)的多重比较结果。序列被分为3个区域。区域1为6kb下游序列，区域2为中心位于NRT1.1B的10kb序列，并且区域3为6kb上游序列，它们分别由B中X轴下方的黄色、红色和绿色条表示。后附不同字母(A和B)的每行内平均π值彼此显著不同(方法示于表中，α＝0.05)。
[0066] 图15示出日本晴(Nip)和NIL的实际样地产量(a)和NUE(b)，将尿素作为田间的氮肥。田间试验在北京于不同氮水平下进行，将尿素作为唯一的氮肥(2014)。植株之间的间距为20cm，并且出产的样地尺寸为4m2。值是平均±SD(n＝6)。P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。
[0067] 图16示出在水培下NIL的叶绿素含量(a)、光合速率(b)、以及生物质(c)相对于日本晴(Nip)增加。使用在不同硝酸盐供应水平(400μM、1mM和2mM)下于水培中生长3个月的水稻植物来研究这些性状。值是平均±SD(n＝10)。P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。
[0068] 图17示出低氮供应(LN)下日本晴(Nip)和NIL的农学性状(每株植物的分蘖数、每株植物的谷粒产量、每块样地的实际产量和NUE)的田间试验。(a)在上海低氮供应(1kg N/100m2)下田间试验中日本晴和NIL的农学性状。(b)在湖南省长沙市低氮供应(0.6kg N/
100m2)下田间试验中日本晴和NIL的农学性状。值是平均±SD(对每株植物的分蘖数和每株植物的谷粒产量平行测定30次，并且对每块样地的实际产量和NUE平行测定6次)。P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。将硝酸盐用作田间栽培的主要氮肥。
100m2)下田间试验中日本晴和NIL的农学性状。值是平均±SD(对每株植物的分蘖数和每株植物的谷粒产量平行测定30次，并且对每块样地的实际产量和NUE平行测定6次)。P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。将硝酸盐用作田间栽培的主要氮肥。
[0069] 图18示出在高氮供应(HN)下田间生长的日本晴(Nip)和NIL的农学性状。在北京(a)、上海(b)和长沙(c)，采用HN供应在田间生长的日本晴和NIL的每株植物的分蘖数、每株植物的谷粒产量、每块样地的实际产量和NUE。值是平均±SD(对每株植物的分蘖数和每株植物的谷粒产量平行测定30次，对每块样地的实际产量和NUE平行测定6次)。P值由日本晴与NIL之间的Student t检验产生。将硝酸盐用作主要氮肥，2kg N/100m2作为高氮条件。
[0070] 图19示出高氮供应下NRT1.1B-籼稻/粳稻转基因植物的农学性状(每株植物的分蘖数、每株植物的谷粒产量、每块样地的实际产量和NUE)的田间试验。(a)在高氮供应下含有由CaMV 35S启动子控制的NRT1.1B-粳稻(Nip-3)或NRT1.1B-籼稻(IR-3)的转基因植物的农学性状。(b)在高氮供应下含有由天然启动子控制的NRT1.1B-粳稻(gNip-2)或NRT1.1B-籼稻(gIR-3)的转基因植物的农学性状。值是平均±SD(对每株植物的分蘖数和每株植物的谷粒产量平行测定20次，对每块样地的实际产量和NUE平行测定6次)。P值由NRT1.1B-粳稻与NRT1.1B-籼稻转基因植物之间的Student t检验产生。EV1为pCAMBIA2300-CaMV 35S空载体转基因植物。EV2为pCAMBIA2300空载体转基因植物。将硝酸盐用作主要氮肥，2kg N/100m2作为高氮条件。
[0071] 图20示出Kongyu131和Xiushui134以及对应的CSSSL的氯酸盐敏感性和硝酸盐吸收测定。(a)Kongyu131和CSSSL-KI(NIL作为供体亲本并且Kongyu131作为轮回亲本，BC4F2)的氯酸盐敏感性测定。比例尺为2cm。(b)Xiushui134和CSSSL-XI(NIL作为供体亲本并且Xiushui134作为轮回亲本，BC4F2)的氯酸盐敏感性测定。比例尺为3cm。(c)用5mM 15N-硝酸盐标记的Kongyu131和CSSSL-KI的苗中的15N积聚测定。(d)用5mM 15N-硝酸盐标记的Xiushui134和CSSSL-XI的苗中的15N积聚测定。DW(干重)。值是平均±SD(n＝4)。P值由受体亲本和对应的CSSSL之间的Student t检验产生。
具体实施方式
[0072] 谷粒产量的增加是许多作物植物包括例如稻中期望的特征，并且自谷类食物被最初驯化以后一直处于选择之中。
[0073] 一种产生种子的方法，所述方法包括：(a)将第一植物与第二植物杂交，其中第一植物和第二植物中的至少一者包含重组DNA构建体，其中重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一种异源调控元件的多核苷酸，其中基于Clustal V或Clustal W比对方法利用相应的默认参数，多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:2相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽；以及(b)选择步骤(a)的杂交的种子，其中所述种子包含重组DNA构建体。当与不包含重组DNA构建体的对照植物相比时，从种子生长的植物可表现出选自以下的至少一种性状：增加的非生物胁迫耐受性、增加的产量、增加的氮摄入、增加的营养摄入、增加的生物质、以及改变的根构造。多肽能够在至少一种植物组织中，或者在非生物胁迫的至少一种条件期间，或者这两者中过表达。植物可选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
[0074] 一种产生植物的方法，所述植物表现出选自以下的至少一种性状的增加：增加的非生物胁迫耐受性、增加的氮摄入、增加的营养摄入、增加的产量、增加的生物质、以及改变的根构造，其中所述方法包括从包含重组DNA构建体的种子生长植物，其中重组DNA构建体包含可操作地连接至至少一种异源调控元件的多核苷酸，其中基于Clustal V或Clustal W比对方法利用相应的默认参数，该多核苷酸编码具有与SEQ ID NO:2相比具有至少70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或100％序列同一性的氨基酸序列的多肽，其中当与不包含重组DNA构建体的对照植物相比时，所述植物表现出选自以下的至少一种性状：增加的氮胁迫耐受性、增加的产量、增加的生物质、以及改变的根构造。在一个实施方案中，NRT1.1B多肽在如参考SEQ ID NO:2的对应的氨基酸位置处包含氨基酸变异，其中在SEQ ID NO:2的第327位处，氨基酸不为苏氨酸。在一个实施方案中，第327位处的苏氨酸被甲硫氨酸替代。OsNRT1.1B(籼稻)多肽可在至少一种植物组织中，或者在非生物胁迫的至少一种条件期间，或者这两者中过表达。植物可选自：玉米、大豆、向日葵、高粱、卡诺拉、小麦、苜蓿、棉花、水稻、大麦、粟、甘蔗和柳枝稷。
[0075] 除非另外指明，否则本公开的实践将采用植物学、微生物学、组织培养、分子生物学、化学、生物化学和重组DNA技术的常规技术，这些技术处于本领域技能范围内。这类技术在文献中有完整的解释。参见例如Langenheim和Thimann，(1982)Botany:Plant Biology and Its Relation to Human Affairs,John Wiley；Cell Culture and Somatic Cell Genetics of Plants，第1卷，Vasil编辑，(1984)；Stanier等人，(1986)The Microbial World，第5版，Prentice-Hall；Dhringra和Sinclair，(1985)Basic Plant Pathology Methods，CRC Press；Maniatis等人，(1982)Molecular Cloning:A Laboratory Manual；DNA Cloning，第I卷和第II卷，Glover编辑，(1985)；Oligonucleotide Synthesis，Gait编辑，(1984)；Nucleic Acid Hybridization，Hames和Higgins编辑，(1984)和丛书Methods in Enzymology，Colowick和Kaplan编辑，Academic Press,Inc.，San Diego，CA。
[0076] 所谓“扩增”意指构建核酸序列的多个拷贝或与该核酸序列互补的多个拷贝，该构建是利用所述核酸序列中的至少一者作为模板进行。扩增系统包括聚合酶链式反应(PCR)系统、连接酶链反应(LCR)系统、基于核酸序列的扩增(NASBA,Cangene,Mississauga,Ontario)、Q-β复制酶系统、基于转录的扩增系统(TAS)和链置换扩增(SDA)。参见例如Diagnostic Molecular Microbiology:Principles and Applications，Persing等人编辑，American Society for Microbiology，Washington，DC(1993)。扩增的产物称为扩增子。
[0077] 应当理解，本领域的技术人员将会知道，本公开不仅仅涵盖特定的示例性序列。在给定位点产生化学等同的氨基酸，但不影响所编码多肽的功能特性的核酸片段变化是本领域熟知的。例如，疏水氨基酸丙氨酸的密码子可被编码另一个疏水性较小的残基例如甘氨酸，或疏水性较大的残基例如缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸的密码子置换。类似地，还可预期一个带负电的残基置换为另一个，例如天冬氨酸置换为谷氨酸，或一个带正电的残基置换为另一个，例如赖氨酸置换为精氨酸的变化产生功能等同的产物。还可预期使多肽分子的N-端和C-端部分改变的核苷酸变化不会改变多肽的活性。每个所推荐的改变均在本领域的常规技术内，正如确定所编码产物的生物活性的保留。
[0078] 本文所公开的蛋白质也可以是包含这样氨基酸序列的蛋白质，所述氨基酸序列包含选自SEQ ID NO:2或其变体的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸的缺失、置换、插入和/或添加。置换可以是保守的，意指某氨基酸残基被另一个具有类似物理和化学特性的残基替代。保守置换的非限制性示例包括含脂族基团的氨基酸残基例如Ile、Val、Leu或Ala之间的替代，以及极性残基之间的替代，例如Lys-Arg、Glu-Asp或Gln-Asn替代。
[0079] 来源于氨基酸缺失、置换、插入和/或添加的蛋白质可在编码其野生型蛋白质的DNA受到例如熟知的定点诱变时制备(参见例如Nucleic Acid Research，第10卷，第20期，第6487-6500页，1982年，该文献全文据此以引用方式并入)。如本文所用，术语“一个或多个氨基酸”旨在意指可通过定点诱变缺失、置换、插入和/或添加的氨基酸的可能数量。
[0080] 定点诱变可以例如如下使用与待突变的单链噬菌体DNA互补，不同的是具有特定错配(即，所需突变)的合成寡核苷酸引物实现。也就是说，上述合成寡核苷酸用作引起互补链通过噬菌体合成的引物，然后所得的双链DNA用于转化宿主细胞。将转化细菌培养物置于琼脂上，从而允许噬菌斑从含噬菌体的单个细胞形成。因此，理论上，50％的新菌落包含突变为单链的噬菌体，而其余50％具有原始序列。在允许与具有上述所需突变的DNA完全相同的DNA杂交，但不与具有原始链的DNA杂交的温度下，允许所得的噬菌斑与通过激酶处理标记的合成探针杂交。随后，拾取与探针杂交的噬菌斑并培养以收集其DNA。
[0081] 允许生物活性肽例如酶的氨基酸序列中的一个或多个氨基酸缺失、置换、插入和/或添加，同时保持其活性的技术包括上述定点诱变，以及其它技术，例如用诱变剂处理基因的那些，以及其中基因选择性裂解以移除、置换、插入或添加所选的一个或多个核苷酸然后连接的那些。
[0082] 本文所公开的蛋白质也可以是由包含这样的核苷酸序列的核酸编码的蛋白质，该核苷酸序列包含选自编码SEQ ID NO:1的序列的核苷酸序列中的一个或多个核苷酸的缺失、置换、插入和/或添加。核苷酸缺失、置换、插入和/或添加可通过定点诱变或上述其它技术实现。
[0083] 本文所公开的蛋白质也可以是由包含这样的核苷酸序列的核酸编码的蛋白质，该核苷酸序列在严格条件下与选自编码SEQ ID NO:1的序列的核苷酸序列的互补链杂交。
[0084] 术语“在严格条件下”意指两个序列在中等或高度严格条件下杂交。更具体地讲，本领域的普通技术人员可以例如根据DNA的长度轻松地确定中等严格条件。基本条件在Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第三版，第6和7章，Cold Spring Harbor Laboratory Press，2001中示出，并且包括使用硝化纤维素滤器的预洗涤溶液5xSSC、0.5％SDS、1.0mM EDTA(pH 8.0)，约50％甲酰胺、2xSSC至6xSSC、约40-50℃的杂交条件(或其它类似杂交溶液，例如Stark溶液，约50％甲酰胺、约42℃)以及例如约40-60℃、0.5-6xSSC、0.1％SDS的洗涤条件。优选地，中等严格条件包括在约50℃和6xSSC下杂交(和洗涤)。本领域的技术人员也可以例如根据DNA的长度轻松地确定高度严格条件。
[0085] 一般来讲，此类条件包括与中等严格条件相比，在较高温度和/或较低盐浓度下杂交和/或洗涤(例如在约65℃，6xSSC至0.2xSSC，优选地6xSSC，更优选地2xSSC，最优选地0.2xSSC下杂交)。例如，高度严格条件可包括如上所定义的杂交，并且在大约65-68℃、
0.2xSSC、0.1％SDS下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可代替SSC(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后进行洗涤15分钟。
0.2xSSC、0.1％SDS下洗涤。在杂交和洗涤缓冲液中SSPE(1xSSPE为0.15M NaCl、10mM NaH2PO4和1.25mM EDTA，pH 7.4)可代替SSC(1xSSC为0.15M NaCl和15mM柠檬酸钠)；在杂交完成后进行洗涤15分钟。
[0086] 使用商购获得的杂交试剂盒也是可能的，其不使用放射性物质作为探针。具体示例包括用ECL直接标记和检测系统杂交。严格条件包括例如使用包括在试剂盒中的杂交缓冲液在42℃下杂交4小时，该缓冲液补充有5％(w/v)阻断试剂和0.5M NaCl，并且在0.4％SDS、0.5xSSC中55℃下洗涤20分钟两次，在2xSSC中室温下洗涤5分钟一次。
[0087] 就特定核酸而言，所谓“编码”意指包含翻译成特定蛋白的信息。编码蛋白质的核酸可以包含在所述核酸的翻译区内的非翻译序列(例如内含子)或可以缺少这种居间的非翻译序列(例如，如在cDNA中)。据以编码蛋白质的信息是通过使用密码子来确定的。通常，氨基酸序列由核酸利用“通用”遗传密码来编码。然而，当使用这些生物体表达核酸时，可使用如在某些植物、动物和真菌线粒体、细菌山羊支原体(Mycoplasma capricolum)(Yamao等人，(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82:2306-9)或纤毛虫大核(ciliate Macronucleus)中存在的通用密码的变体。
[0088] 当通过合成法制备或改变核酸时，可利用将在其中表达核酸的预期宿主的已知密码子偏好性。例如，尽管本公开的核酸序列在单子叶植物物种和双子叶植物物种两者中都可表达，但可对序列进行修饰以解决单子叶植物或双子叶植物的特定密码子偏好性和GC含量偏好性，因为这些偏好性已被证实不同(Murray等人，(1989)Nucleic Acids Res.17:477-98)，其以引用方式并入本文)。因而，具体氨基酸的玉米偏好密码子可由来自玉米的已知基因序列得出。关于来自玉米植物的28种基因的玉米密码子的用法在Murray等人(出处同上)的表4中列出。
[0089] 如本文所用，针对核酸的“异源”为起源于外来物种的核酸，或者，如果起源于相同物种的话，则为通过蓄意的人为干预对其天然形式在组成和/或基因座方面进行了实质性修饰的核酸。异源还可指示特定核酸与其基因组中的天然位置相比对其在基因组中的位置是外来的。例如，可操作地连接至异源结构基因的启动子是来自不同于衍生该结构基因的物种的物种，或者如果是来自相同的物种，则对一者或二者对其初始形式进行了实质性的修饰。异源蛋白质可起源于外来物种，或者，如果起源于相同物种，则通过蓄意的人为干预对其天然形式进行了实质性的修饰。
[0090] 所谓“宿主细胞”意指包含本公开的异源核酸序列、含有载体并能支持该表达载体的复制和/或表达的细胞。宿主细胞可以是原核细胞如大肠杆菌(E.coli)，或真核细胞如酵母、昆虫、植物、两栖动物或哺乳动物细胞。优选地，宿主细胞是单子叶植物细胞或双子叶植物细胞，包括但不限于玉米、高粱、向日葵、大豆、小麦、苜蓿、水稻、棉花、卡诺拉、大麦、小米和番茄。特别优选的单子叶宿主细胞是玉米宿主细胞。
[0091] 术语“杂交复合体”包括指涉由两条相互选择性杂交的单链核酸序列形成的双链核酸结构。
[0092] 在将核酸插入细胞中的语境中，术语“导入”意指“转染”或“转化”或“转导”，并包括指涉将核酸掺入真核或原核细胞中，其中该核酸可掺入细胞的基因组(例如染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化成自主复制子或瞬时表达(例如，转染的mRNA)。
[0093] 术语“分离的”指诸如核酸或蛋白之类的物质，该物质实质上或基本上不含在其天然存在的环境中发现的通常与其相伴随或与其相互作用的组分。分离的物质任选包含未发现在其天然环境中与其一起的物质。本文所定义的“分离的”核酸也称为“异源”核酸。除非另有规定，否则术语“硝酸盐摄入相关联的核酸”意指包含编码完全长度或部分长度硝酸盐摄入相关联的多肽的多核苷酸(“硝酸盐摄入相关联的多核苷酸”)的核酸。
[0094] 如本文所用，“核酸”包括指涉单链或双链形式的脱氧核糖核苷酸或核糖核苷酸聚合物，并且除非另外限制，否则涵盖在以下方面具有天然核苷酸的基本性质的已知类似物：其以与天然存在的核苷酸(例如肽核酸)相似的方式杂交至单链核酸。
[0095] 所谓“核酸文库”意指分离的DNA或RNA分子的集合，其包含且基本上代表特定生物体的基因组的整个被转录的部分。示例性核酸文库诸如基因组文库和cDNA文库的构建，在诸如以下的标准分子生物学参考文献中有教导：Berger和Kimmel，(1987)Guide To Molecular Cloning Techniques，来自丛书Methods in Enzymology，第152卷，Academic Press，Inc.，San Diego，CA；Sambrook等人，(1989)，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第2版，第1-3卷；以及Current Protocols in Molecular Biology,Ausubel等人编辑，Current Protocols,Greene Publishing Associates,Inc.和John Wiley&Sons,Inc.之间合作(1994年补编)。
[0096] 本文所用的“可操作地连接”包括指涉第一序列(诸如启动子)与第二序列之间的功能性连接，其中该启动子序列引发和介导对应于该第二序列的DNA的转录。一般来讲，可操作地连接意指被连接的核酸序列是连续的，并且如果有必要连接两个蛋白编码区的话，是连续的且在相同的阅读框内。
[0097] 如本文所用，术语“植物”包括指涉整个植物、植物器官(例如叶、茎、根等)、种子和植物细胞和它们的子代。如本文所用，植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区、愈伤组织、叶、根、苗、配子体、孢子体、花粉和小孢子。可用于本公开方法中的植物种类通常与适用于转化技术的高等植物种类一样宽泛，包括单子叶植物和双子叶植物两者，包括以下属的物种：南瓜属(Cucurbita)、蔷薇属(Rosa)、葡萄属(Vitis)、胡桃属(Juglans)、草莓属(Fragaria)、百脉根属(Lotus)、苜蓿属(Medicago)、驴食草属(Onobrychis)、三叶草属(Trifolium)、胡芦巴属(Trigonella)、豇豆属(Vigna)、柑桔属(Citrus)、亚麻属(Linum)、老鹳草属(Geranium)、木薯属(Manihot)、胡萝卜属(Daucus)、拟南芥属(Arabidopsis)、芸苔属(Brassica)、萝卜属(Raphanus)、白芥属(Sinapis)、颠茄属(Atropa)、辣椒属(Capsicum)、曼陀罗属(Datura)、天仙子属(Hyoscyamus)、番茄属(Lycopersicon)、烟草属(Nicotiana)、茄属(茄属)、碧冬茄属(Petunia)、毛地黄属(Digitalis)、马珠草属(Majorana)、菊苣属(Ciahorium)、向日葵属(Helianthus)、莴苣属(Lactuca)、雀麦属(Bromus)、天门冬属(Asparagus)、金鱼草属(Antirrhinum)、萱草属(Heterocallis)、Nemesis、天竺葵属(Pelargonium)、黍属(Panieum)、狼尾草属(Pennisetum)、毛茛属(Ranunculus)、千里光属(Senecio)、蛾蝶花属(Salpiglossis)、黄瓜属(Cucumis)、布洛华丽属(Browaalia)、大豆属(Glycine)、豌豆属(Pisum)、菜豆属(Phaseolus)、黑麦草属(Lolium)、稻属(Oryza)、燕麦属(Avena)、大麦属(Hordeum)、黑麦属(Secale)、葱属(Allium)和小麦属(Triticum)。特别优选的植物是玉米(Zea mays)。
[0098] 如本文所用，“多核苷酸”包括指涉脱氧核糖多核苷酸、核糖多核苷酸或其类似物，所述类似物在如下方面具有天然核糖核苷酸的基本性质：在严格杂交条件下其所杂交的核苷酸序列与天然存在的核苷酸所杂交的核苷酸序列实质上相同，和/或可翻译成与天然存在的核苷酸所翻译的氨基酸相同的氨基酸。多核苷酸可以是天然或异源结构基因或调控基因的全长序列或其亚序列。除非另外指明，否则该术语包括指涉特定序列及其互补序列。因而，为了稳定性或为了其它原因对主链进行了修饰的DNA或RNA是如该术语在本文所意指的“多核苷酸”。此外，包含稀有碱基(如次黄嘌呤核苷)或修饰碱基(如三苯甲基化的碱基)(仅举两个示例)的DNA或RNA是多核苷酸(如该术语在本文所用的)。应当理解，已对DNA和RNA进行了很多种修饰，这些修饰起到本领域技术人员已知的许多有用目的。本文所用的术语多核苷酸涵盖多核苷酸的这类经化学修饰、酶修饰或代谢修饰的形式，以及病毒和细胞(包括特别是简单细胞和复杂细胞)特征性的DNA和RNA的化学形式。
[0099] 术语“多肽”、“肽”和“蛋白”在本文中可互换使用，指氨基酸残基的聚合物。这些术语适用于其中一个或多个氨基酸残基为相应的天然存在的氨基酸的人工化学类似物的氨基酸聚合物，以及适用于天然存在的氨基酸聚合物。
[0100] 本文所用的“启动子”包括指涉DNA的在转录起始的上游并涉及RNA聚合酶和其它蛋白的识别和结合以起始转录的区域。“植物启动子”是能够引发在植物细胞中的转录的启动子。示例性的植物启动子包括但不限于从植物、植物病毒和包含在植物细胞中表达的基因的细菌获得的那些启动子，所述细菌诸如农杆菌(Agrobacterium)或根瘤菌(Rhizobium)。示例为优先起始在某些组织，例如叶、根、种子、纤维、木质部导管、管胞或厚壁组织中的转录的启动子。这种启动子称为“组织优选的”。“细胞类型”特异性启动子主要驱动在一种或多种器官中的某些细胞类型(例如，根或叶中的维管细胞)中的表达。“诱导型”或“调控型”启动子是处于环境控制下的启动子。可实现通过诱导型启动子进行的转录的环境条件的示例包括无氧条件或光的存在。另一类型的启动子是发育调控的启动子，例如在花粉发育过程中驱动表达的启动子。组织偏好的、细胞类型特异性的、发育调控的和诱导型的启动子构成了“非组成型”启动子类别。“组成型”启动子是在大多数环境条件下活跃的启动子。合适的组成型启动子包括例如遍在蛋白启动子、肌动蛋白启动子和GOS2启动子(de Pater等人，(1992)，The Plant Journal，2:837–844)。
[0101] 如本文所用，“重组的”包括指涉已通过导入异源核酸进行修饰的细胞或载体，或者源于经这样修饰过的细胞的细胞。因而，例如，重组细胞表达不以天然(非重组)形式的细胞内的相同形式存在的基因，或因为蓄意人为干预而表达原本异常表达、表达不足或根本不表达的天然基因，或可具有减低的或消除的天然基因表达。如本文所用，术语“重组的”不涵盖通过自然发生事件(例如自发突变、天然转化/转导/转座)进行的细胞或载体的改变，所述事件为例如在没有蓄意人为干预的情况下发生的那些。
[0102] 如本文所用，“重组表达盒”是具有一系列特定核酸元件的通过重组法或合成法产生的核酸构建体，其允许特定核酸在靶细胞中转录。重组表达盒可掺入质粒、染色体、线粒体DNA、质体DNA、病毒或核酸片段中。通常，除了别的序列以外，表达载体的重组表达盒部分还包含待转录的核酸和启动子。
[0103] 如本文所用，“转基因植物”包括指涉植物，在其基因组内包含通过转化过程获得的稳定整合的异源多核苷酸，其中整合的多核苷酸处于植物中的基因组位置处，在该处异源多核苷酸通常不以其天然状态存在。一般来讲，异源多核苷酸稳定地整合在基因组内使得该多核苷酸得以传递到连续世代。异源多核苷酸可单独整合进基因组中，或者作为重组表达盒的一部分整合进基因组中。“转基因”在本文中用来包括其基因型已因异源核酸的存在而被改变的任何细胞、细胞系、愈伤组织、组织、植物部分或植物，包括那些最初如此改变的转基因以及那些通过从最初的转基因进行有性杂交或无性繁殖而产生的转基因在内。如本文所用，术语“转基因”不涵盖通过常规植物育种方法或通过诸如随机异花受精、非重组病毒感染、非重组细菌转化、非重组转座或自发突变之类的自然发生事件导致的基因组(染色体基因组或染色体外基因组)的改变。
[0104] 如本文所用，“载体”包括指涉用于转染宿主细胞并可在其中插入多核苷酸的核酸。载体常常是复制子。表达载体容许插入其中的核酸的转录。
[0105] 以下术语用于说明两个或更多个核酸或多核苷酸或多肽之间的序列关系：(a)“参考序列”、(b)“比较窗口”、(c)“序列同一性”、(d)“序列同一性百分比”和(e)“实质同一性”。
[0107] 如本文所用，“比较窗口”意在包括指涉多核苷酸序列的连续和指定的区段，其中该多核苷酸序列可与参考序列比较，并且其中该比较窗口中的该多核苷酸序列的部分相比于参考序列(不包含添加或缺失)可包含添加或缺失(即空位)，以便两个序列的最佳比对。通常，比较窗口长度为至少20个连续的核苷酸，任选可为30、40、50、100个或更长。本领域技术人员认识到，为避免由于在多核苷酸序列中加入空位所致的与参考序列的高度相似性，通常引入空位罚分并从匹配数扣除空位罚分。
[0108] 将核苷酸和氨基酸序列进行比对以作比较的各种方法是本领域熟知的。局部同源性算法(BESTFIT)(Smith和Waterman,(1981)Adv.Appl.Math2:482)可以对用于比较的序列进行最佳比对；Needleman和Wunsch(1970)J.Mol.Biol.48:443-53的同源比对算法(GAP)；相似性搜索方法(Tfasta和Fasta)(Pearson和Lipman,(1988)Proc.Natl.Acad.Sci.USA85:
2444；这些算法的计算机化实施包括，但不限于：Intelligenetics(加州山景城(Mountain View,California))的PC/Gene程序中的CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software
第8版(可得自Genetics Computer Group( 程序(Accelrys公司(加州圣
地亚哥(San Diego,CA)))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。CLUSTAL程序由如下文献详细说明：Higginsh和Sharp，(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp，(1989)CABIOS
5:151-3；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等人，(1992)Computer Applications in the Biosciences 8:155-65以及Pearson等人，(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-31。用于多序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.,25:351-60，其类似于Higgins和Sharp，(1989)CABIOS5:
151-53描述的方法，藉此将其以引用方式并入本文)。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；以及TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见Current Protocols in Molecular Biology 19章，Ausubel等人编辑，Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1995)。
2444；这些算法的计算机化实施包括，但不限于：Intelligenetics(加州山景城(Mountain View,California))的PC/Gene程序中的CLUSTAL、Wisconsin Genetics Software
第8版(可得自Genetics Computer Group( 程序(Accelrys公司(加州圣
地亚哥(San Diego,CA)))中的GAP、BESTFIT、BLAST、FASTA和TFASTA。CLUSTAL程序由如下文献详细说明：Higginsh和Sharp，(1988)Gene 73:237-44；Higgins和Sharp，(1989)CABIOS
5:151-3；Corpet等人，(1988)Nucleic Acids Res.16:10881-90；Huang等人，(1992)Computer Applications in the Biosciences 8:155-65以及Pearson等人，(1994)Meth.Mol.Biol.24:307-31。用于多序列的最佳全局比对的优选程序是PileUp(Feng和Doolittle，(1987)J.Mol.Evol.,25:351-60，其类似于Higgins和Sharp，(1989)CABIOS5:
151-53描述的方法，藉此将其以引用方式并入本文)。可用于数据库相似性搜索的BLAST家族程序包括：BLASTN，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；BLASTX，用于核苷酸查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；BLASTP，用于蛋白查询序列针对蛋白数据库序列进行查询；TBLASTN，用于蛋白查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询；以及TBLASTX，用于核苷酸查询序列针对核苷酸数据库序列进行查询。参见Current Protocols in Molecular Biology 19章，Ausubel等人编辑，Greene Publishing and Wiley-Interscience,New York(1995)。
[0109] 如本领域普通技术人员将会理解的，BLAST搜索假定蛋白可以随机序列建模。然而，许多真实蛋白包含非随机序列区，该非随机序列可为同聚段、短周期重复或富含一种或多种氨基酸的区域。这种低复杂性区域可在不相关的蛋白质之间比对，尽管该蛋白质的其它区域完全不相似。可采用多种低复杂性过滤程序来减少这种低复杂性比对。例如，可单独使用或联合使用SEG(Wooten和Federhen，(1993)，Comput.Chem.17:149-63)和XNU(Claverie和States,(1993)Comput.Chem.17:191-201)低复杂性过滤程序。
[0110] 在两条核酸或多肽序列的情形中，如本文所用的“序列同一性”或“同一性”包括指涉当在指定的比较窗口上进行比对以获得最大对应时两个序列中相同的残基。当序列同一性百分比针对蛋白使用时，认识到不相同的残基位置往往差别在于保守氨基酸置换，其中氨基酸残基由具有相似化学性质(例如电荷或疏水性)的其它氨基酸残基置换，因此不会改变分子的功能性质。如果序列差别在于保守置换，则可上调序列同一性百分比以校正置换的保守性质。差异在于这种保守置换的序列被称为具有“序列相似性”或“相似性”。作出这个调整的手段是本领域技术人员熟知的。通常，这涉及将保守置换评定为部分错配而不是完全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，如果相同的氨基酸给予1分，非保守置换给予0分，则保守置换给予0至1之间的分数。例如，根据Meyers和Miller，(1988)，Computer Applic.Biol.Sci.4:11-17的算法计算保守置换的分数，例如如在程序PC/GENE(Intelligenetics，Mountain View，California，US)中所实现的。
[0111] 本文所用的“序列同一性百分比”意指通过在比较窗口上比较两个最佳比对的序列所确定的数值，其中多核苷酸序列在该比较窗口中的部分与参考序列(不包含添加或缺失)相比可包含添加或缺失(即，空位)，以便两个序列的最佳比对。该百分比是这样计算的：确定在两个序列中出现相同核酸碱基或氨基酸残基的位置的数目以得到匹配的位置的数目，将匹配的位置的数目除以比较窗口中的位置的总数目，然后将结果乘以100以得到序列同一性百分比。
[0112] 术语多核苷酸序列的“实质同一性”意指利用所描述的比对程序之一采用标准参数与参考序列比较时，多核苷酸包含具有50-100％之间的序列同一性，优选至少50％的序列同一性，优选至少60％的序列同一性，优选至少70％，更优选至少80％，更优选至少90％且最优选至少95％序列同一性的序列。技术人员将会认识到，可通过考虑密码子简并性、氨基酸相似性、阅读框定位等等适当调整这c些值以确定两个核苷酸序列所编码的蛋白的相应同一性。用于这些目的的氨基酸序列的实质同一性通常意指55-100％之间的序列同一性，优选至少55％，优选至少60％，更优选至少70％、80％、90％，最优选至少95％。
[0113] 直系同源物和旁系同源物
[0114] 上述同源序列可包含直系同源序列或旁系同源序列。本领域技术人员已知有若干不同方法用于鉴别和定义这些功能上同源的序列。描述了定义直系同源物和旁系同源物的三种一般性方法；可通过以下所述的一种或多种方法来鉴定直系同源物、旁系同源物或同系物。
[0115] 非编码区中的变体核苷酸序列
[0116] 硝酸盐摄入相关联的核苷酸序列用于产生变体核苷酸序列，所述变体核苷酸序列具有5’-非翻译区、3’-非翻译区或启动子区的核苷酸序列，其与相应的SEQ ID NO:1的起始核苷酸序列具有大约70％、75％、80％、85％、90％和95％同一性。这些变体然后与种质中与谷粒品质和/或谷粒产量相关的构成性状的天然变异相关联。该相关联的变体用作标记单倍型来选择所期望的性状。
[0117] OsNRT1.1B相关联的多肽的变体氨基酸序列
[0118] 产生了OsNRT1.1B相关联的多肽的变体氨基酸序列。在本实施例中，改变一个氨基酸。具体而言，观察开放阅读框以确定适当的氨基酸改变。通过参考蛋白质比对(与其它直系同源基因和来自各种物种的其它基因家族成员的比对)来选择氨基酸进行改变。选择据认为不处于高选择压力下(不是高度保守的)且相当易于用具有类似化学特性(即，类似功能性侧链)的氨基酸进行置换的氨基酸。利用蛋白比对，可对适当的氨基酸进行改变。一旦鉴定出目标氨基酸，即遵循本文所述的程序。使用这个方法产生出具有约70％、75％、80％、85％、90％和95％核酸序列同一性的变体。这些变体然后与种质中与谷粒品质和/或谷粒产量相关的构成性状的天然变异相关联。该相关联的变体用作标记单倍型来选择所期望的性状。
[0119] 用于构建核酸的合成方法
[0120] 分离的本公开的核酸也可以通过直接化学合成制备，例如用磷酸三酯方法(Narang等人，(1979)Meth.Enzymol.68:90-9；磷酸二酯方法(Brown等人，(1979)Meth.Enzymol.68:109-51；二乙基亚磷酰胺方法(Beaucage等人，(1981)Tetra.Letts.22(20):1859-62；Beaucage等人(出处同上)描述的固相亚磷酰胺三酯方法，如使用自动化合成仪，例如Needham-VanDevanter人，(1984)Nucleic Acids Res.12:6159-68中所述，以及美国专利4,458,066的固相支持体方法。化学合成通常产生单链寡核苷酸。这可通过与互补序列杂交或通过将该单链作为模板用DNA聚合酶进行聚合来转变为双链DNA。技术人员将会认识到，虽然DNA的化学合成局限于约100个碱基的序列，但可通过连接较短的序列来获得较长的序列。
[0121] UTR和密码子偏好性
[0122] 总体来说，已发现翻译效率受RNA的5'非编码或非翻译区(5'UTR)中的特定序列元件的调控。正序列模体包括翻译起始共有序列(Kozak,(1987)Nucleic Acids Res.15:8125)和57甲基GpppG RNA帽结构(Drummond等人，(1985)Nucleic Acids Res.13:
7375)。负元件包括稳定的分子内5'UTR茎-环结构(Muesing等人，(1987)，Cell，48:691)和
5'UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)、Rao等人，(1988)，Mol.and Cell.Biol.8:284)。因此，本公开提供了用于调节异源编码序列的翻译的5'和/或
3'UTR区。
7375)。负元件包括稳定的分子内5'UTR茎-环结构(Muesing等人，(1987)，Cell，48:691)和
5'UTR中的AUG序列或前面有适当AUG的短开放阅读框(Kozak(出处同上)、Rao等人，(1988)，Mol.and Cell.Biol.8:284)。因此，本公开提供了用于调节异源编码序列的翻译的5'和/或
3'UTR区。
[0123] 植物转化方法
[0124] 有多种用于将外来基因导入植物中的方法是已知的并可用来将硝酸盐摄入相关联的多核苷酸插入植物宿主中，这包括生物学和物理学的植物转化方案。参见例如Miki等人，“Procedure for Introducing Foreign DNA into Plants”，载于Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology，Glick和Thompson编辑，CRC Press,Inc.，Boca Raton，第67-88页(1993)。所选择的方法随宿主植物而变化，包括化学转染方法如磷酸钙介导的基因转移、微生物介导的基因转移如农杆菌介导的基因转移(Horsch等人，(1985)Science 227:1229-31)、电穿孔、显微注射和基因枪轰击。
[0125] 用于植物细胞或组织转化和植物再生的表达盒和载体以及体外培养方法是已知的并可获得。参见例如Gruber等人，“Vectors for Plant Transformation”，载于Methods in Plant Molecular Biology and Biotechnology(出处同上)，第89-119页。
[0126] 可通过一种或多种通常用于直接递送进细胞中的技术将分离的多核苷酸或多肽导入植物中。取决于要进行基因修饰的生物体、细胞、植物或植物细胞的类型(即单子叶植物或双子叶植物)，这种方式可不同。转化植物细胞的合适方法包括显微注射(Crossway等人，(1986)，Biotechniques，4:320-334和美国专利6,300,543)、电穿孔(Riggs等人，(1986)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83:5602-5606)，直接基因转移(Paszkowski等人，(1984)EMBO J.3:2717-2722)以及弹道粒子加速(参见例如Sanford等人，美国专利4,945,050；WO 91/10725和McCabe等人，(1988)，Biotechnology，6:923-926)。还可参见Tomes等人，“Direct DNA Transfer into Intact Plant Cells Via Microprojectile
Bombardment”，第197-213页，载于Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Fundamental Methods，Gamborg和Phillips编辑，Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，
1995；美国专利5,736,369(分生组织)；Weissinger等人，(1988)，Ann.Rev.Genet.22:421-
477；Sanford等人，(1987)，Particulate Science and Technology，5:27-37(洋葱)；
Christou等人，(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；Datta等人，(1990)，Biotechnology，8:736-740(水稻)；Klein等人，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:
4305-4309(玉米)；Klein等人，(1988)，Biotechnology，6:559-563(玉米)；WO 91/10725(玉米)；Klein等人，(1988)，Plant Physiol.，91:440-444(玉米)；Fromm等人，(1990)，Biotechnology，8:833-839)和Gordon-Kamm等人，(1990)，Plant Cell，2:603-618)(玉米)；
Hooydaas-Van Slogteren和Hooykaas，(1984)，Nature(London)，311:763-764)；Bytebierm等人，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(百合科)；De Wet等人，(1985)，载于The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，Chapman等人编辑，第197-209页；
Longman,NY(花粉)；Kaeppler等人，(1990)，Plant Cell Reports，9:415-418；以及Kaeppler等人，(1992)，Theor.Appl.Genet.84:560-566(颈须介导的转化)；美国专利5,
693,512(超声处理)；D'Halluin等人，(1992)，Plant Cell，4:1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)，Plant Cell Reports，12:250-255；以及Christou和Ford，(1995)，Annals of Botany，75:407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)，Nature Biotech.14:745-750；农杆菌介导的玉米转化(美国专利5,981,840)；碳化硅晶须方法(Frame等人，(1994)，Plant J.，6:
941-948)；激光方法(Guo等人，(1995)，Physiologia Plantarum，93:19-24)；超声处理方法(Bao等人，(1997)，Ultrasound in Medicine&Biology，23:953-959；Finer和Finer，(2000)，Lett Appl Microbiol.30:406-10；Amoah等人，(2001)，J Exp Bot，52:1135-42)；
聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)，Nature，296:72-77)；单子叶和双子叶植物细胞的原生质可以用电穿孔(Fromm等人，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:5824-5828)和显微注射(Crossway等人，(1986)，Mol.Gen.Genet.，202:179-185)进行转化；将这些文献全部以引用方式并入本文。
Bombardment”，第197-213页，载于Plant Cell,Tissue and Organ Culture,Fundamental Methods，Gamborg和Phillips编辑，Springer-Verlag Berlin Heidelberg New York，
1995；美国专利5,736,369(分生组织)；Weissinger等人，(1988)，Ann.Rev.Genet.22:421-
477；Sanford等人，(1987)，Particulate Science and Technology，5:27-37(洋葱)；
Christou等人，(1988)Plant Physiol.87:671-674(大豆)；Datta等人，(1990)，Biotechnology，8:736-740(水稻)；Klein等人，(1988)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 85:
4305-4309(玉米)；Klein等人，(1988)，Biotechnology，6:559-563(玉米)；WO 91/10725(玉米)；Klein等人，(1988)，Plant Physiol.，91:440-444(玉米)；Fromm等人，(1990)，Biotechnology，8:833-839)和Gordon-Kamm等人，(1990)，Plant Cell，2:603-618)(玉米)；
Hooydaas-Van Slogteren和Hooykaas，(1984)，Nature(London)，311:763-764)；Bytebierm等人，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 84:5345-5349(百合科)；De Wet等人，(1985)，载于The Experimental Manipulation of Ovule Tissues，Chapman等人编辑，第197-209页；
Longman,NY(花粉)；Kaeppler等人，(1990)，Plant Cell Reports，9:415-418；以及Kaeppler等人，(1992)，Theor.Appl.Genet.84:560-566(颈须介导的转化)；美国专利5,
693,512(超声处理)；D'Halluin等人，(1992)，Plant Cell，4:1495-1505(电穿孔)；Li等人，(1993)，Plant Cell Reports，12:250-255；以及Christou和Ford，(1995)，Annals of Botany，75:407-413(水稻)；Osjoda等人，(1996)，Nature Biotech.14:745-750；农杆菌介导的玉米转化(美国专利5,981,840)；碳化硅晶须方法(Frame等人，(1994)，Plant J.，6:
941-948)；激光方法(Guo等人，(1995)，Physiologia Plantarum，93:19-24)；超声处理方法(Bao等人，(1997)，Ultrasound in Medicine&Biology，23:953-959；Finer和Finer，(2000)，Lett Appl Microbiol.30:406-10；Amoah等人，(2001)，J Exp Bot，52:1135-42)；
聚乙二醇方法(Krens等人，(1982)，Nature，296:72-77)；单子叶和双子叶植物细胞的原生质可以用电穿孔(Fromm等人，(1985)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，82:5824-5828)和显微注射(Crossway等人，(1986)，Mol.Gen.Genet.，202:179-185)进行转化；将这些文献全部以引用方式并入本文。
[0127] 农杆菌介导的转化
[0128] 将表达载体导入植物中的最广泛使用的方法是基于农杆菌的天然转化系统的。根瘤农杆菌(A.tumefaciens)和毛根农杆菌(A.rhizogenes)是植物病原性土壤细菌，其能遗传转化植物细胞。根瘤农杆菌和毛根农杆菌各自的Ti和Ri质粒携带负责植物的遗传转化的基因。参见例如Kado，(1991)，Crit.Rev.Plant Sci.10:1。有关农杆菌介导的基因转移的农杆菌载体系统和方法的描述在以下文献中提供：Gruber等人(出处同上)；Miki等人，出处同上和Moloney等人，(1989)，Plant Cell Reports，8:238。
[0129] 相似地，可将基因插入源于根瘤农杆菌或毛根农杆菌各自的Ti或Ri质粒的T-DNA区中。因而，可使用这些质粒，如上构建表达盒。已知有许多控制序列，其在偶联至异源编码序列并转化进宿主生物体中时，在初始编码序列的组织/器官特异性方面显示出基因表达的保真性。参见例如Benfey和Chua，(1989)，Science，244:174-81。用于这些质粒中的特别合适的控制序列是用于基因在各种目标植物中的组成型叶特异性表达的启动子。其它可用的控制序列包括来自胭脂碱合酶基因(NOS)的启动子和终止子。NOS启动子和终止子存在于质粒pARC2中，该质粒可得自美国典型培养物保藏中心，指定的ATCC存放号为67238。如果使用这样一种系统，则来自Ti或Ri质粒的毒力(vir)基因也必须存在，或者与T-DNA部分一起，或者通过其中vir基因存在于单独载体上的双元系统。这类系统、其中所用的载体、以及转化植物细胞的方法描述在美国专利4,658,082；1993年11月16日提交的美国专利5,262,306中引用的、1986年10月1提交的美国专利申请913,914以及Simpson等人，(1986)，Plant Mol.Biol.，6:403-15(也在'306专利中引用)中，将所有上述参考文献以引用的方式全文并入本文。
[0130] 一旦转化，可将这些细胞用于再生转基因植物。例如，整个植物可通过使该植物产生伤口，然后将载体导入该伤口位点中来用这些载体进行感染。可使植物的任何部分产生伤口，包括叶、茎和根。或者，可将外植体形式的植物组织诸如子叶组织或叶圆片用这些载体接种，并在可促进植物再生的条件下培养。可将通过用毛根农杆菌或根瘤农杆菌(含有编码伏马毒素降解酶的基因)接种植物组织而转化的根或苗用作植物组织来源，以通过体细胞胚胎发生或器官发生来再生伏马毒素抗性转基因植物。用于再生植物组织的此类方法的示例公开于Shahin，(1985)，Theor.Appl.Genet.，69:235-40；美国专利4,658,082；Simpson等人(出处同上)；和均于1986年10月1日提交的美国专利申请No.913,913和913,914，如公布于1993年11月16日的美国专利No.5,262,306引用，将上述文献的全部公开内容以引用的方式并入本文。
[0131] 直接基因转移
[0132] 尽管农杆菌介导的转化的宿主范围广泛，但一些主要的谷类作物物种和裸子植物总体上对该基因转移模式而言是顽拗的，尽管最近已在水稻中获得了一定的成功(Hiei等人，(1994)，The Plant Journal，6:271-82)。已开发了几种植物转化的方法(统称为直接基因转移)作为对农杆菌介导的转化的替代方案。
[0133] 一般适用的植物转化方法是微抛射体(microprojectile)介导的转化，其中DNA携带在测得为约1-4μm的微抛射体的表面上。用基因枪装置(biolistic device)将表达载体导入植物组织中，该基因枪装置将微抛射体加速至300-600m/s的速度，该速度足以穿透植物细胞壁和膜(Sanford等人，(1987)，Part.Sci.Technol.5:27；Sanford，(1988)，Trends Biotech，6:299；Sanford，(1990)，Physiol.Plant，79:206以及Klein等人，(1992)，Biotechnology，10:268)。
[0134] 物理递送DNA至植物的另一种方法是如Zang等人，(1991)，BioTechnology，9:996中所述的对靶细胞的超声处理。或者，脂质体或原生质球融合已用于将表达载体导入植物中。参见例如Deshayes等人，(1985)，EMBO J.，4:2731和Christou等人，(1987)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，84:3962。利用CaCl2沉淀、聚乙烯醇或聚-L-鸟氨酸直接将DNA摄入原生质体中也已有报道。参见例如Hain等人，(1985)，Mol.Gen.Genet.，199:161和Draper等人，(1982)，Plant Cell Physiol.，23:451。
[0135] 原生质体和完整细胞和组织的电穿孔也已有描述。参见例如Donn等人，(1990)，Abstracts of the VIIth Int’l.Congress on Plant Cell and Tissue Culture IAPTC(《第VII届植物细胞与组织培养IAPTC会议摘要》)，A2-38，第53页)；D’Halluin等人，(1994)，Plant Cell，4:1495-505)和Spencer等人，(1992)，Plant Mol.Biol.，24:51-61。
[0136] 1.基于多核苷酸的方法：
[0137] 在本公开的一些实施方案中，用表达盒转化植物，该表达盒能够表达可抑制本公开的OsNRT1.1B的表达的多核苷酸。本文所用的术语“表达”指基因产物的生物合成，包括所述基因产物的转录和/或翻译。例如，出于本公开的目的，能够表达可抑制至少一种硝酸盐摄入相关联的多肽的表达的多核苷酸的表达盒，是能够产生可抑制本公开的至少一种硝酸盐摄入相关联的多肽的转录和/或翻译的RNA分子的表达盒。蛋白或多肽从DNA分子的“表达”或“产生”指该编码序列转录和翻译而产生该蛋白或多肽，而蛋白或多肽从RNA分子“表达”或“产生”指该RNA编码序列翻译而产生蛋白或多肽。
[0138] 可抑制OsNRT1.1B的表达的多核苷酸的示例在下面给出。
[0139] i.有义抑制/共抑制
[0140] 在本公开的一些实施方案中，OsNRT1.1B表达的抑制可通过有义抑制或共抑制获得。对于共抑制，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子以“有义”取向对应于编码OsNRT1.1B的信使RNA的全部或部分。该RNA分子的过表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用该共抑制表达盒转化的多个植株系进行筛选以鉴别那些显示出对硝酸盐摄入相关联的多肽表达的最大抑制的植株。
[0141] 用于共抑制的多核苷酸可对应于编码硝酸盐摄入相关联的多肽的序列的全部或部分、OsNRT1.1B转录物的5'和/或3'非翻译区的全部或部分、或者编码OsNRT1.1B的转录物的编码序列和非翻译区二者的全部或部分。在其中该多核苷酸包含硝酸盐摄入相关联的多肽的编码区的全部或部分的一些实施方案中，将表达盒设计为消除该多核苷酸的起始密码子，使得不会翻译出蛋白产物。
[0142] 共抑制可用来抑制植物基因的表达以产生对于由这些基因编码的蛋白而言具有不可检测的蛋白水平的植物。参见例如Broin等人，(2002)PlantCell，14:1417-1432。共抑制还可用来抑制同一植物中的多种蛋白的表达。参见例如美国专利5,942,657。使用共抑制来抑制植物中的内源性基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Flavell等人，(1994)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，91:3490-3496；Jorgensen等人，(1996)，Plant Mol.Biol.，31:957-973；Johansen和Carrington，(2001)，Plant Physiol.，126:930-938；Broin等人，(2002)，Plant Cell，14:1417-1432；Stoutjesdijk等人，(2002)，Plant Physiol.，129:1723-1731；Yu等人，(2003)，Phytochemistry，63:753-763和美国专利5,
034,323、5,283,184和5,942,657，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3'和多腺苷酸化信号的5'位置包括poly-dT区来提高。参见美国专利公布2002/0048814，将其以引用的方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与内源性基因的转录物的序列具有实质上的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见美国专利5,283,184和5,034,323，将它们以引用的方式并入本文。
034,323、5,283,184和5,942,657，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。共抑制的效率可通过在表达盒中在有义序列的3'和多腺苷酸化信号的5'位置包括poly-dT区来提高。参见美国专利公布2002/0048814，将其以引用的方式并入本文。通常，这种核苷酸序列与内源性基因的转录物的序列具有实质上的序列同一性，优选的是高于约65％的序列同一性，更优选的是高于约85％的序列同一性，最优选的是高于约95％的序列同一性。参见美国专利5,283,184和5,034,323，将它们以引用的方式并入本文。
[0143] ii.反义抑制
[0144] 在本公开的一些实施方案中，对硝酸盐摄入相关联的多肽表达的抑制可通过反义抑制获得。对于反义抑制，将表达盒设计为表达与编码该硝酸盐摄入相关联的多肽的信使RNA的全部或部分互补的RNA分子。该反义RNA分子的过表达可导致天然基因的表达减少。因此，对用该反义抑制表达盒转化的多个植株系进行筛选以鉴别那些显示出对硝酸盐摄入相关联的多肽表达的最大抑制的植株。
[0145] iii.双链RNA干扰
[0146] 在本公开的一些实施方案中，对OsNRT1.1B表达的抑制可通过双链RNA(dsRNA)干扰来获得。对于dsRNA干扰，有义RNA分子(如上文针对共抑制所描述)和与该有义RNA分子完全或部分互补的反义RNA分子在同一细胞中表达，从而导致对应的内源性信使RNA的表达的抑制。
[0147] 有义和反义分子的表达可通过将表达盒设计为同时包含有义序列和反义序列来实现。或者，可将单独的表达盒分别用于有义序列和反义序列。使用dsRNA干扰来抑制内源性植物基因的表达的方法在以下文献和专利中有描述：Waterhouse等人，(1998)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，95:13959-13964，Liu等人，(2002)，Plant Physiol.，129:1732-1743以及WO 99/49029、WO 99/53050、WO 99/61631和WO 00/49035，将这些文献和专利的每一个以引用方式并入本文。
[0148] iv.发夹RNA干扰和含内含子的发夹RNA干扰
[0149] 在本公开的一些实施方案中，对OsNRT1.1B表达的抑制可通过发夹RNA(hpRNA)干扰或含内含子的发夹RNA(ihpRNA)干扰来获得。这些方法在抑制内源性基因表达方面是高度有效的。参见，Waterhouse和Helliwell，(2003)，Nat.Rev.Genet.，4:29-38以及其中引用的参考文献。
[0150] 对于hpRNA干扰，将表达盒设计为表达这样的RNA分子，该RNA分子自身杂交而形成包括单链环区和碱基配对茎的发夹结构。该碱基配对茎区包含对应于编码要对其表达进行抑制的基因的内源性信使RNA的全部或部分的有义序列和与该有义序列完全或部分互补的反义序列。另选地，碱基配对茎区可对应于控制待抑制的基因的表达的启动子序列的一部分。因此，该分子的碱基配对茎区通常确定了RNA干扰的特异性。hpRNA分子在抑制内源性基因表达中很高效，它们诱导的RNA干扰被植物后代继承。参见例如Chuang和Meyerowitz，(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97:4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)，Plant Physiol.，129:1723-1731以及Waterhouse和Helliwell，(2003)，Nat.Rev.Genet.，4:29-38。使用hpRNA干扰来抑制或沉默基因表达的方法在例如以下文献和专利中有描述：Chuang和Meyerowitz，(2000)，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，97:4985-4990；Stoutjesdijk等人，(2002)，Plant Physiol.，129:1723-1731；Waterhouse和Helliwell，(2003)，
Nat.Rev.Genet.，4:29-38；Pandolfini等人，BMC Biotechnology，3:7；以及美国专利申请公布号2003/0175965，每个文献和专利以引用方式并入本文。hpRNA构建体沉默体内基因表达的效率的瞬时测定法已在以下文献中描述：Panstruga等人，(2003)，Mol.Biol.Rep.，30:
135-140，该文献以引用方式并入本文。
Nat.Rev.Genet.，4:29-38；Pandolfini等人，BMC Biotechnology，3:7；以及美国专利申请公布号2003/0175965，每个文献和专利以引用方式并入本文。hpRNA构建体沉默体内基因表达的效率的瞬时测定法已在以下文献中描述：Panstruga等人，(2003)，Mol.Biol.Rep.，30:
135-140，该文献以引用方式并入本文。
[0151] 对于ihpRNA，干扰分子具有与hpRNA相同的总体结构，但该RNA分子另外包含内含子，该内含子能够在表达该ihpRNA的细胞中被剪接。内含子的使用使得发夹RNA分子中的环的尺寸在剪接后最小化，这可提高干扰的效率。参见例如Smith等人，(2000)，Nature，407:319-320。事实上，Smith等人证实使用ihpRNA介导的干扰，内源性基因表达受到100％抑制。
使用ihpRNA干扰来抑制内源性植物基因的表达的方法例如在Smith等人，(2000)，Nature，
407:319-320；Wesley等人，(2001)，Plant J.，27:581-590；Wang和Waterhouse，(2001)，Curr.Opin.Plant Biol.，5:146-150；Waterhouse和Helliwell，(2003)，Nat.Rev.Genet.，
4:29-38；Helliwell和Waterhouse，(2003)，Methods，30:289-295和美国专利申请公布号
2003/0180945中有描述，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。
使用ihpRNA干扰来抑制内源性植物基因的表达的方法例如在Smith等人，(2000)，Nature，
407:319-320；Wesley等人，(2001)，Plant J.，27:581-590；Wang和Waterhouse，(2001)，Curr.Opin.Plant Biol.，5:146-150；Waterhouse和Helliwell，(2003)，Nat.Rev.Genet.，
4:29-38；Helliwell和Waterhouse，(2003)，Methods，30:289-295和美国专利申请公布号
2003/0180945中有描述，以上每个文献和专利以引用方式并入本文。
[0152] 还可对用于hpRNA干扰的表达盒进行设计，使得有义序列和反义序列不对应于内源性RNA。在这个实施方案中，该有义和反义序列在这样的环序列的旁侧，该环序列包含对应于靶基因的内源性信使RNA的全部或部分的核苷酸序列。因而，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见例如WO 02/00904；Mette等人，(2000)，EMBO J，19:5194-5201；Matzke等人，(2001)Curr.Opin.Genet.Devel.，11:221-227；Scheid等人，(2002)，Proc.Natl.Acad.Sci.,USA，99:13659-13662；Aufsaftz等人，(2002)，Proc.Nat’l.Acad.Sci.，99(4):16499-16506；Sijen等人，Curr.Biol.(2001)11:436-440)，将这些文献和专利以引用方式并入本文。
[0153] v.扩增子介导的干扰
[0154] 扩增子表达盒包含源自植物病毒的序列，该序列含有靶基因的全部或部分但通常不含有该天然病毒的基因的全部。存在于表达盒的转录产物中的病毒序列使得该转录产物能引导其自身的复制。由扩增子产生的转录物相对于靶序列(即硝酸盐摄入相关联的多肽的信使RNA)可以是有义或反义的。利用扩增子来抑制内源植物基因的表达的方法例如在如下文献中有描述：Angell和Baulcombe，(1997)，EMBO J.，16:3675-3684、Angell和Baulcombe，(1999)，Plant J.，20:357-362以及美国专利6,646,805，将这些参考文献的每一个以引用的方式并入本文。
[0155] vii.小干扰RNA或微RNA
[0156] 在本公开的一些实施方案中，OsNRT1.1B表达的抑制可通过表达编码微RNA(miRNA)的基因经RNA干扰获得。miRNA是由约22个核糖核苷酸组成的调控剂，miRNA在抑制内源性基因表达方面很高效。参见例如Javier等人，(2003)，Nature，425:257-263，将该文献以引用方式并入本文。
[0157] 对于miRNA干扰，将表达盒设计成表达模仿内源性miRNA基因的RNA分子。该miRNA基因编码可形成发夹结构的RNA，该发夹结构含有与另一内源性基因(靶序列)互补的22核苷酸序列。为抑制硝酸盐摄入相关联的表达，所述22个核苷酸序列选自硝酸盐摄入相关联的转录物序列并包含所述硝酸盐摄入相关联的序列有义方向的22个核苷酸和与所述有义序列互补的相应的反义序列的21个核苷酸。miRNA分子在抑制内源性基因的表达上很高效，并且它们诱导的RNA干扰被植物后代继承。
[0158] vi.调节生殖组织发育
[0159] 提供了用于调节生殖组织发育的方法。在一个实施方案中，提供了用于调节植物中的花发育的方法。所谓“调节花发育”意指与其中硝酸盐摄入相关联的多肽的活性或水平还未受调节的对照植物相比，植物的生殖组织的结构的任何改变。“调节花发育”还包括与其中硝酸盐摄入相关联的多肽的活性或水平未受调节的对照植物相比，植物生殖组织发育的时刻的任何改变(即花发育时刻的延迟或提前)。宏观改变可包括在环境胁迫时的如下变化：生殖器官的尺寸、形状、数目或位置，这些结构形成的发育时间段，或者维持或发展经过开花过程的能力。微观改变可包括构成生殖器官的细胞的类型或形状的改变。
[0160] 一般来讲，修改或改变宿主内源性基因组DNA的方法是可用的。这包括改变宿主天然DNA序列或预先存在的转基因序列，所述转基因序列包括调控元件、编码和非编码序列。这些方法也可用于使核酸靶向基因组中预先工程化的靶识别序列。例如，本文所述的经过遗传修饰的细胞或植物使用“定制的”或工程化核酸内切酶如大范围核酸酶生成，所述大范围核酸酶的产生用于修饰植物基因组(参见例如WO 2009/114321；Gao等人，(2010)，Plant Journal，1:176-187)。另一个定点工程化通过使用与限制性酶的限制特性结合的锌指结构域识别。参见例如Urnov等人，(2010)，Nat Rev Genet.，11(9):636-46；Shukla等人，(2009)，Nature，459(7245):437-41。类转录激活因子(TAL)效应物-DNA修饰酶(TALE或TALEN)也用于植物基因组中进行工程改变。参见例如US20110145940；Cermak等人，(2011)，Nucleic Acids Res.，39(12)；以及Boch等人，(2009)，Science，326(5959):1509-12。还可使用细菌II型CRISPR(规律成簇间隔短回文重复序列)/Cas(CRISPR-相关联的)系统进行植物基因组的位点特异性修饰。参见例如Belhaj等人，(2013)，Plant Methods，9:39；CRISPR/Cas系统允许靶向裂解由可定制的小非编码RNA引导的基因组DNA。基于NRT1.1B编码序列、直系同源物/同系物的多肽序列和基因组DNA序列的公开，可易于进行定点诱变以产生表达更高水平内源性NRT1.1B多肽或其直系同源物的植物。
[0161] 还涵盖对于本文公开的或实施方案的NRT1.1B多肽或对于其变体或片段的抗体。本公开的抗体包括多克隆和单克隆抗体以及它们的片断，所述片断保留了其与本文所公开的NRT1.1B多肽结合的能力。抗体、单克隆抗体或其片段如果能够与分子发生特异性反应从而使该分子结合于该抗体、单克隆抗体或其片段，则被认为能够结合该分子。术语“抗体”(Ab)或“单克隆抗体”(Mab)意在包括能够结合半抗原的完整分子以及其片段或结合区或域(比如，Fab和F(ab).sub.2片段)。此类片段通常由蛋白水解裂解(比如木瓜蛋白酶或胃蛋白酶)产生。或者，半抗原结合片段可通过应用重组DNA技术或通过合成化学产生。用于制备本公开抗体的方法是本领域公知的。例如参见Antibodies,A Laboratory Manual,Ed Harlow and David Lane(eds.)Cold Spring Harbor Laboratory,N.Y.(1988)(《抗体：实验室手册》，Ed Harlow和David Lane编辑，纽约冷泉港实验室，1988年)以及其中引用的参考文献。
说明免疫学一般原理的标准参考著作包括：Klein,J.Immunology:The Science of Cell-Noncell Discrimination,John Wiley&Sons,N.Y.(1982)；Dennett等人，Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Press,N.Y.(1980)以及Campbell，“Monoclonal Antibody Technology”，载于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第13卷，Burdon等人(编辑)，Elsevier，Amsterdam(1984)。还可参见美国专利4,196,265；4,609,893；4,713,325；4,714,681；4,
716,111；4,716,117和4,720,459。PtIP-50多肽或PtIP-65多肽抗体或其抗原结合部分可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，(1975)Nature
256:495的标准体细胞杂交技术。也可采用用于产生单克隆抗体的其它技术，比如B淋巴细胞的病毒转化或致癌性转化。用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。用于分离供融合用的免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。本公开的抗体和单克隆抗体可通过将本文所公开的NRT1.1B多肽用作抗原来制备。
说明免疫学一般原理的标准参考著作包括：Klein,J.Immunology:The Science of Cell-Noncell Discrimination,John Wiley&Sons,N.Y.(1982)；Dennett等人，Monoclonal Antibodies,Hybridoma:A New Dimension in Biological Analyses,Plenum Press,N.Y.(1980)以及Campbell，“Monoclonal Antibody Technology”，载于Laboratory Techniques in Biochemistry and Molecular Biology，第13卷，Burdon等人(编辑)，Elsevier，Amsterdam(1984)。还可参见美国专利4,196,265；4,609,893；4,713,325；4,714,681；4,
716,111；4,716,117和4,720,459。PtIP-50多肽或PtIP-65多肽抗体或其抗原结合部分可通过多种技术产生，包括常规的单克隆抗体方法，例如Kohler和Milstein，(1975)Nature
256:495的标准体细胞杂交技术。也可采用用于产生单克隆抗体的其它技术，比如B淋巴细胞的病毒转化或致癌性转化。用于制备杂交瘤的动物系统是鼠系统。用于分离供融合用的免疫脾细胞的免疫方案和技术是本领域已知的。融合伴侣(例如，鼠骨髓瘤细胞)和融合程序也是已知的。本公开的抗体和单克隆抗体可通过将本文所公开的NRT1.1B多肽用作抗原来制备。
[0162] 提供了用于在样品中检测本文所公开的NRT1.1B多肽的存在或检测编码本文所公开的NRT1.1B多肽的核苷酸序列的存在的试剂盒。在一个实施方案中，该试剂盒提供了基于抗体的试剂以用于检测组织样品中本文所公开的NRT1.1B多肽的存在。在另一个实施方案中，该试剂盒提供了可用于检测编码本文所公开的NRT1.1B多肽的一个或多个多核苷酸的存在的标记核酸探针。该试剂盒连同执行检测方法的适当试剂和对照以及试剂盒使用说明一起提供。
[0163] 如上面所论述的，技术人员将会认识用于调节植物中的花发育的适当启动子。用于这个实施方案的示例性启动子包括组成型启动子、诱导型启动子、苗偏好启动子和花偏好启动子。
[0164] 所关注的基因可反映涉及作物开发的那些的商业市场和利益。所关注的作物和市场在变化，随着发展中国家开放了世界市场，也将出现新的作物和技术。另外，随着我们对农学性状和特性诸如产量和杂种优势的理解逐渐深入，选择进行转化的基因会相应变化。所关注的基因的大体类别包括例如涉及信息的那些基因(如锌指)、涉及通信的那些基因(如激酶)和涉及看家的那些基因(如热休克蛋白)。转基因的更具体类别例如包括编码对农艺学、昆虫抗性、病害抗性、除草剂抗性、不育性、籽粒特性和商业产品重要的性状的基因。
一般而言，所关注的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些基因以及影响仁大小、蔗糖载量等的那些基因。
一般而言，所关注的基因包括涉及油脂、淀粉、碳水化合物或营养物质代谢的那些基因以及影响仁大小、蔗糖载量等的那些基因。
[0165] 在某些实施方案中，可将本公开的核酸序列与所关注的其它多核苷酸序列联合(“堆叠”)使用，以便产生具有所需表型的植物。
[0167] 实施例
[0168] 实施例1——NRT1.1B/OsNPF6.5的鉴定
[0169] 硝酸盐和铵吸收利用范围较大的水稻品种进行分析，包括34个籼稻和粳稻栽培品种。在15N-硝酸盐标记之后籼稻中的15N积聚显著高于粳稻(图7a)，而在15N-铵标记之后籼稻和粳稻之间15N积聚的差异在统计意义上不显著(图7b)。该分析指出，籼稻实际上具有比粳稻更高的硝酸盐吸收活性。为鉴定与该种硝酸盐使用趋异度相关的基因变异，使用氯酸盐即硝酸盐的毒性类似物来进行定位作图。在采用氯酸盐敏感性测定对134个稻品种测试之后，籼稻品种可因显著更高的氯酸盐敏感性而在显型上与粳稻品种区分开(图7c)。因此，通过使用作为供体的氯酸盐敏感性较高的籼稻品种IR24以及作为受体的氯酸盐敏感性较低的粳稻品种日本晴开发的317BC2F5品系用于氯酸盐毒性筛选。获得了氯酸盐敏感性相对较高的七个品系，表现出最高氯酸盐敏感性的其中一者被选择用于产生染色体单片段代换系(CSSSL)NI10-1，该NI10-1携带日本晴背景中的来自IR24的10号染色体上的单代换片段(图8a)。在15N-硝酸盐标记之后NI10-1具有比日本晴显著更高的氯酸盐敏感性和15N积聚(图
1a，b)。NI10-1的基因渗入片段包含先前定位的主要的氯酸盐敏感性数量性状基因座qCHR10。遗传分析显示出NI10-1的氯酸盐敏感性表型被分离为半显性性状(图8b-d)。由NI10-1与日本晴之间的杂交进行精细作图，并且候选基因缩窄到介于标记M10-21和M10-23之间的约15kb区域(图1c)。编码硝酸盐转运蛋白(称为NRT1.1B/OsNPF6.5)的基因座LOC_Os10g40600是定位至该区域的唯一基因。
1a，b)。NI10-1的基因渗入片段包含先前定位的主要的氯酸盐敏感性数量性状基因座qCHR10。遗传分析显示出NI10-1的氯酸盐敏感性表型被分离为半显性性状(图8b-d)。由NI10-1与日本晴之间的杂交进行精细作图，并且候选基因缩窄到介于标记M10-21和M10-23之间的约15kb区域(图1c)。编码硝酸盐转运蛋白(称为NRT1.1B/OsNPF6.5)的基因座LOC_Os10g40600是定位至该区域的唯一基因。
[0170] CSSSL鉴定和NIL构建。将从BC2F5群体鉴别的氯酸盐敏感性最高的品系与作为受体亲本的日本晴回交两次，以产生CSSSL。使用均匀遍布于12号染色体上的123个基于PCR的多态性插入缺失标记来鉴定和选择包含目标供体片段的候选品系。从包含来自IR24的10号染色体的单片段的BC4F4群体中鉴定出氯酸盐敏感性CSSSL NI10-1。将NI10-1×日本晴F1代杂交体与日本晴回交，以产生携带NRT1.1B-IR24的NIL(BC6F4)。NIL中基因渗入片段的尺寸在M-12与M-19之间为约400kb。用于CSSSL鉴定和NIL产生的引物列出于表2中。
[0171] NRT1.1B的精细作图。采用来源于NI10-1×日本晴的F2代群体进行精细作图。从采用氯酸盐测定鉴定的F2代群体的所关注的个体中，选择3,018个氯酸盐敏感性分离体进行遗传连锁分析。用于精细作图的引物列出于表2中。
[0172] 氯酸盐敏感性测定。首先使幼苗在发芽后于含2mM KNO3的改良Kimura B溶液中培养4天。随后用2mM氯酸盐将幼苗处理4天，并使其在改良的Kimura B溶液(2mM KNO3)中恢复2天。氯酸盐敏感性计算为氯酸盐对植株高度的抑制百分率：(对照处理高度–氯酸盐处理高度/对照处理高度)×100。
[0173] 用于测定15N积聚的15N-硝酸盐/铵标记。15N-硝酸盐标记之后的15N积聚测定利用15N标记的KNO3(98％原子15N-KNO3，Sigma-Aldrich)进行。首先将幼苗在含5mM KNO3的改良Kimura B溶液中培养10天。随后，用含5mM 15N-KNO3的改良Kimura B处理幼苗24小时(对于34个水稻栽培种，用15N-KNO3处理幼苗3小时)。第三，将幼苗转移到未标记的溶液中3分钟，0.1mM CaSO4中2分钟，以除去根表面上的15N-NO3-。收集根和苗并在70℃下干燥。最后，研磨样品并使用同位素比质谱仪利用元素分析仪(Thermo Finnigan Delta plus XP；
15
Flash EA 1112)测定 N含量。对nrt1.1b突变体和Zhonghua11野生型而言，在具有较低(200μM KNO3)或较高(5mM KNO3)硝酸盐的改良Kimura B溶液中培养幼苗10天，接着，用含200μM或5mM 15N-标记的KNO3的改良Kimura B处理幼苗24小时，然后进行分析。对15N-铵标记后的15N积聚测定而言，将幼苗首先在含1mM(NH4)2SO4(作为N源)的改良Kimura B溶液中栽培
15
10天，并且用2mM N标记的NH4Cl(98％原子15N-NH4Cl，Sigma-Aldrich)处理3小时，并且如上所述测定15N含量。
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Flash EA 1112)测定 N含量。对nrt1.1b突变体和Zhonghua11野生型而言，在具有较低(200μM KNO3)或较高(5mM KNO3)硝酸盐的改良Kimura B溶液中培养幼苗10天，接着，用含200μM或5mM 15N-标记的KNO3的改良Kimura B处理幼苗24小时，然后进行分析。对15N-铵标记后的15N积聚测定而言，将幼苗首先在含1mM(NH4)2SO4(作为N源)的改良Kimura B溶液中栽培
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10天，并且用2mM N标记的NH4Cl(98％原子15N-NH4Cl，Sigma-Aldrich)处理3小时，并且如上所述测定15N含量。
[0174] 表2该研究中使用的引物.
[0175]
[0176]
[0177]
[0178]
[0179] 实施例2——NRT1.1B SNP分析
[0180] 序列分析显示出日本晴和IR24之间的NRT1.1B的编码序列(CDS)内的两种单核苷酸多态性(SNP)。SNP1(c.980C>T)导致错义突变，日本晴中的苏氨酸(Thr)对应于IR24中的甲硫氨酸(Met)(p.Thr327Met置换)，而SNP2为同义核苷酸置换(c.1335G>C)(图1d)。还在用于qCHR10作图的亲本JX17和ZYQ8之间检测到NRT1.1B中的SNP1和SNP2(表3)，确认了NRT1.1B对应于qCHR10的先前推测。NRT1.1B-日本晴/IR24的氨基酸置换发生在中心胞质环(CCL)中，这对于运输功能至关重要。这引导我们假设，由SNP1所导致的NRT1.1B变异可能造成日本晴和IR24之间的氯酸盐敏感性和硝酸盐利用趋异度。
[0181] RNA提取、cDNA制备以及qRT-PCR.使用TRIzol试剂(Invitrogen)提取总RNA。将寡(dT)18用作引物，使用经DNase I处理的约2μg总RNA来合成第一链cDNA。将第一链cDNA的产物用作PCR的模板。就qRT-PCR而言，将SYBR Green I添加到反应混合物中，并且根据制造商的说明书在Chromo4实时PCR检测系统(Bio-Rad,CFX96)上运行。采用Opticon监控器软件(Bio-Rad)分析数据。对各个基因进行三次平行测定。在所有分析中，将水稻ACTIN1用作内参。用于qRT-PCR的引物列出于表2中。
[0182] 免疫印迹分析.将NRT1.1B粳稻/籼稻-eGFP转基因幼苗在发芽后于Kimura B溶液中栽培10天，然后用200μM CHX处理。在CHX处理之后，在0、1、2和4小时收集转基因植物的苗，并且利用2×SDS缓冲液(4％SDS、10％β-巯基乙醇、125mM Tris-HCl(pH 6.8)、20％甘油和0.002％BPB)，使用相同量的植物材料来提取总蛋白质。通过SDS/PAGE分析蛋白质样品并且用抗-GFP抗体(Abmart，M20004)进行免疫印迹。
[0183] 群体序列集.中心都位于NRT1.1B的两个群体序列集22kb和1MB获自稻HapMap3数据集22，每个序列的缺失率≤80％。总共439和422个籼稻、327和308个粳稻、以及438和439个普通野生稻品种分别保留在22kb和1Mb群体中。22kb序列集用于群体特异性等位基因(PSA)检测和核苷酸多样性分析。1MB序列集用于LD统计。另外，提取来自水稻HapMap3的中心位于NRT1.1B的12kb区域中的SNP并且用于NRT1.1B品种系统发育重建。
[0184] NRT1.1B的系统发育重建.使用PHYLIP 3.695构建水稻品种的邻接品种树。使用EvolView29使所得的树可视化并注释。从短舌野稻、非洲栽培稻(O.glaberrima)、普通野生稻、大颖野生稻(O.glumaepatula)、南方野稻(O.meridionalis)、长雄野生稻(O.longistamainata)和斑点野生稻中测序稻属中NRT1.1B的直系同源物。用于NRT1.1B测序的引物列出于表2中。另外，来自普通野生稻acc.w1943ver.2、稻属粳稻变种日本晴ver.TIGR7.0、稻属籼稻变种9311和稻属籼稻变种PA64S的NRT1.1B的直系同源物通过BLAST搜索获自引用的在线数据库。多序列比对在MEGA6.06中通过MUSCLE31获得。采用Jukes-Cantor模型使用邻近相加的方法通过MEGA 6.06重建稻属中的NRT1.1B的系统发育，对于缺失数据成对删除并且自展伪复制1,000次。在MEGA 6.06中通过比对浏览器重建SNP1等位基因的祖先状态。
[0185] NRT1.1B的CDS中群体特异性等位基因(PSA)的检测通过经由定制的PERL脚本对22kb序列集的单核苷酸多样性(SND)计算来识别PSA。将π值高于0.3的SNP归类为PSA。位于CDS区域中的PSA是NRT1.1B功能趋异度的可能候选。等位基因频率大于0.3的亚群中的基因型被称为代表性的基因型(PSA)。
[0186] 人工选择的评估人工选择通过22kb序列集的核苷酸多样性(π)来评估。核苷酸多样性(包括单核苷酸多样性，SND)通过定制的PERL脚本来计算(可根据要求得到)。22kb序列集内的上部6kb区域、中间10kb区域(在中心具有NRT1.1B)和下部6kb区域之间的平均核苷酸多样性的统计学差异在各个水稻亚群中实施。基于方差结果分析(ANOVA，P＝0.0167)，在籼稻亚群中实施Fisher的最小显著差数法(LSD)。基于ANOVA结果(分别P＝0.1807和0.4354)，在粳稻和野生水稻普通野生稻亚群上实施Ryan-Einot-Gabriel-Welsch Q(REGWQ)方法。所有ANOVA测试假设均匀性检验(Leven的测试，P>0.25)结果所示的相同方差。使用OmegaPlus-M34(-minwin 10 -maxwin 5000 -grid 2000 -impute N -binary -threads 20和-所有参数)在1MB序列集上进行ωmax参数33估计的LD统计。代表最新正向扫描的前5％ωmax截断值从未公开的研究得到。LD统计值范围是来自NRT1.1B区域的数据点的最左和最右边界范围的平均值，对于籼稻、粳稻和野生水稻普通野生稻其分别为
744.6kb、914.7kb和156.6kb。除非另有说明，否则统计学测试使用SAS9.3进行。
744.6kb、914.7kb和156.6kb。除非另有说明，否则统计学测试使用SAS9.3进行。
[0187] 实施例3——NRT1.1B等位基因的验证
[0188] 为验证假说，进一步检查近等基因系(NIL)，包括日本晴背景中的NRT1.1B-IR24等位基因(图8e)。相比于日本晴，NIL在15N-硝酸盐标记之后表现出氯酸盐敏感性(图1e)和15N积聚(图1f和图8f)的显著增加。受CaMV 35S启动子或其相应的天然启动子控制的NRT1.1B-日本晴/IR24的转基因分析显示出，在15N-硝酸盐标记后NRT1.1B-IR24转基因植物中的15N积聚高于NRT1.1B-日本晴转基因植物(图1g和图9a-c)。此外，NIL或IR24中NRT1.1B的转录物表达类似于或甚至低至日本晴(图9d)，排除了基因表达差异导致这两个NRT1.1B等位基因功能性变异的可能性。
[0189] 实施例4——NRT1.1B编码PTR(肽转运蛋白)结构域-包含蛋白质
[0190] NRT1.1B编码PTR(肽转运蛋白)结构域-包含蛋白质(图10a)。系统发育分析显示出NRT1.1B与CHL1(AtNRT1.1；图10b，c)共享最近共同祖先，双亲和性硝酸盐转运蛋白和传感蛋白。使用水稻原生质体中的NRT1.1B-eGFP融合蛋白的进一步研究显示出NRT1.1B定位至原生质膜(图11)。另外，使用爪蟾卵母细胞的15N-硝酸盐摄入测定示出，在较低(200μM)和较高(10mM)硝酸盐浓度两者下硝酸盐摄入在注射有NRT1.1B cRNA的卵母细胞中更高，并且NRT1.1B-IR24注射的卵母细胞表现出比NRT1.1B-日本晴注射的卵母细胞相对更高的硝酸盐摄入活性(图2a)。这表明在较低和较高硝酸盐浓度两者下NRT1.1B具有硝酸盐运输活性，并且NRT1.1B-IR24相对于NRT1.1B-日本晴具有更高的活性。
[0191] NRT1.1B表达基本上由硝酸盐诱导(图2b)。NRT1.1B启动子::β-葡糖苷酸酶(GUS)转基因植物的检查示出主要在根毛、表皮和维管组织中检测出GUS活性(图2c-h)。原位杂交示出，NRT1.1B转录物在邻近根中木质部的表皮细胞和中柱细胞中丰度最大(图2i，j)。这些发现提供的有力支持在于，NRT1.1B直接参与硝酸盐摄入和硝酸盐运输。附加确认采用功能丧失的突变型nrt1.1b获得，其在硝酸盐摄入和硝酸盐根到苗运输两者中具有缺陷(图12)。因此，可能NRT1.1B中天然存在的基因变异也可影响这些过程。可以预知，硝酸盐摄入活性和根到苗运输在NIL中增强(图3a，b)，这解释了在NIL中15N-硝酸盐标记后更高的15N积聚。
值得注意的是，两种编码硝酸还原酶的基因OsNIA1和OsNIA2(硝酸盐同化的关键组分)在NIL中被显著上调(图3c，d)，而硝酸盐对其的诱导在nrt1.1b突变体中受到很大的阻遏(图
13a)。这指出NRT1.1B可能在硝酸盐信号传导16-18中用作类似于CHL1的传感蛋白/转运受体，并且其变异可改变硝酸盐应答基因的表达。因此，NRT1.1B的基因变异可影响硝酸盐利用的不同步骤，包括根摄入，根到苗运输，以及同化作用。
值得注意的是，两种编码硝酸还原酶的基因OsNIA1和OsNIA2(硝酸盐同化的关键组分)在NIL中被显著上调(图3c，d)，而硝酸盐对其的诱导在nrt1.1b突变体中受到很大的阻遏(图
13a)。这指出NRT1.1B可能在硝酸盐信号传导16-18中用作类似于CHL1的传感蛋白/转运受体，并且其变异可改变硝酸盐应答基因的表达。因此，NRT1.1B的基因变异可影响硝酸盐利用的不同步骤，包括根摄入，根到苗运输，以及同化作用。
[0192] 亚细胞定位测定.经由克隆到二元载体pCAMBIA2300-CaMV 35S-eGFP中将NRT1.1B-日本晴/IR24的CDS与增强的绿荧光蛋白(eGFP)框内融合。所得的载体转化到稻原生质体中，如先前25所述。eGFP图像用共聚焦显微镜(Leica，TCS SP5)观察。所用引物列出于表2中。
[0193] 非洲蟾蜍卵母细胞中的15N-硝酸盐摄入测定将NRT1.1B-日本晴/IR24的CDS扩增并克隆到非洲蟾蜍卵母细胞表达载体pCS2+中限制性位点BamHI和EcoRI之间，然后用ApaI线性化。根据制造商规程，使用mMESSAGE mMACHINE盒(Ambion，AM1340)在体外合成带帽mRNA。在第V-VI阶段使非洲蟾蜍卵母细胞注入含46ng NRT1.1B cRNA的46nL核酸酶-游离水。在注入后，将卵母细胞在ND-96培养基中培养24小时并使用其进行15NO3-摄入测定。分别使用
200μM和10mM 15N-KNO3在卵母细胞中进行高和低亲和性摄入测定，如先前26所述。所用引物列出于表2中。
200μM和10mM 15N-KNO3在卵母细胞中进行高和低亲和性摄入测定，如先前26所述。所用引物列出于表2中。
[0194] 启动子::GUS和RNA原位杂交测定.从日本晴扩增NRT1.1B的起始密码子ATG的1.9kb上游DNA片段并克隆到pCAMBIA2391Z中以产生NRT1.1B启动子::GUS，并且将所得的载体转化到Zhonghua11中。对转基因植物的根、叶鞘、叶片和秆的组织取样以进行GUS表达的组织化学检测。根据先前描述的方法27进行RNA原位杂交。用于载体构建和探针扩增的引物列出于表2中。
[0195] 15N-硝酸盐摄入活性和根到苗运输测定利用15N-KNO3测定对硝酸盐摄入活性进行测定。在5mM 15N-KNO3摄入3小时后测定整个植株的15N含量。摄入活性计算为每单位时间每单位根重量的15N摄入量。在5mM 15N-KNO3标记3小时之后，通过苗与根之间的15N积聚(15N mM/g DW)比率测定根到苗的硝酸盐运输。就nrt1.1b突变体和Zhonghua11而言，摄入和根到苗运输测定分别使用200μM和5mM 15N-KNO3进行。
[0196] 实施例5——NRT1.1B家族的系统发育分析
[0197] 使用950份稻种质的系统发育分析示出NRT1.1B在籼稻和粳稻亚种之间明显分歧(图4a)。基于单核苷酸多样性，SNP1和SNP2仅仅被鉴定为NRT1.1B的CDS中的两种群体特异性等位基因(图14a)。134个水稻品种中NRT1.1B的重新定序进一步证实，籼稻品种具有IR24基因型，而粳稻品种具有日本晴基因型(图14b和表3)，这与观察到的籼稻品种相对于粳稻品种具有更高的硝酸盐吸收和氯酸盐敏感性相一致(图7a，c)。
[0198] 稻属中NRT1.1B直系同源物的评估显示出NRT1.1B-籼稻是后来得到的等位基因(图4b)。籼稻中的SNP1仅保留来自具有两个基因型(C/T)的其直接祖先普通野生稻-I的一个基因型(T)，而粳稻中的SNP1仅保留来自其直接祖先普通野生稻-III的基因型(C)(图4c)，这指出NRT1.1B-籼稻已经历定向选择。NRT1.1B的核苷酸多样性(π)分析示出籼稻和粳稻分别保留普通野生稻多样性的6.5％和2.5％。核苷酸多样性的减少可能是阳性选择、遗传漂变或瓶颈效应的结果。然而，NRT1.1B-籼稻的π显著高于其旁侧区域(图14c，e)，消除了遗传漂变和瓶颈效应的可能性并且指示出阳性选择。此外，粳稻亚群中任一区域的π没有显著差别，但却低于其野生相应物(图14c，e)，这可由瓶颈效应解释。籼稻中NRT1.1B周围的显著更高的连锁不平衡统计值(ωmax)进一步支持了NRT1.1B-籼稻的阳性选择的假说(图
14d)。这些结果显示出NRT1.1B可能在籼稻驯养期间经受人工选择，随后导致更高的硝酸盐利用率或NUE。
14d)。这些结果显示出NRT1.1B可能在籼稻驯养期间经受人工选择，随后导致更高的硝酸盐利用率或NUE。
[0199] 表3：用于15N-硝酸盐/铵吸收、氯酸盐敏感性测定和NRT1.1B重新定序分析的水稻品种
[0200]
[0201]
[0202]
[0203]
[0204] 用编号标记的水稻种质用于15N-硝酸盐/铵吸收测定。
[0205] 实施例6–NRT1.1表达和增大的NUE
[0206] 为测试NRT1.1B-籼稻可提高NUE的假说，进一步研究NIL的生长性能和谷粒产量。在将硝酸盐用作唯一氮源水培下，NIL特别是在相对较低的硝酸盐条件下相对于日本晴表现出显著的优点：增加的叶绿素含量、光合速率、以及生物质产量(400μM和1mM；图5a和图
16)。我们将硝酸盐用作主要氮肥在三个地点即北京(E116o，N40o)、上海(E121o，N31o)和长沙(E112o，N28o)进一步进行大规模田间试验。在低氮供应下，NIL中每株植物的分蘖数显著增加，这导致每株植物的谷粒产量增加26.1-29.4％，每块样地的实际产量增加30.3-
33.4％，而土壤23，24中由每单位可用氮的谷粒产量定义的NUE也提高约30％(图5b-d和图
7)。然而，对于每个穗的种子数目、结实率和千粒重，并没有观察到显著差异(表4)。在高氮供应(标准氮水平)下，NIL中每株植物的分蘖数、每株植物的谷粒产量以及每块样地的实际产量也分别增加8.3-11.3％、9.3-10.9％和7.0-13.2％，并且平均NUE提高约10％(图5b，c和图7)。田间试验还示出，在低氮(图6)和高氮条件(图7)两者下，NRT1.1B-籼稻转基因植物具有比NRT1.1B-粳稻转基因植物更好的生长性能(图7)和更高的NUE。另外，当将NRT1.1B-籼稻导入Kongyu131和Xiushui134中时，将两种优质的粳稻栽培品种分别广泛栽培于中国东北和长江流域，在15N-硝酸盐标记后氯酸盐敏感性和15N积聚两者也显著增加(图7)，这指示广泛范围的粳稻背景中的NRT1.1B-籼稻的应用价值。因此，这些结果展示NRT1.1B可为作物育种的NUE提高中的重要参与物质。由NRT1.1B多态性导致的NUE差异可由硝酸盐利用的多个方面的改变造成。除硝酸盐摄入和根到苗运输之外，我们的数据还表明NRT1.1B也在硝酸盐信号化中起重要作用，其可能对NUE测定具有更显著的贡献(补充的注释)。
16)。我们将硝酸盐用作主要氮肥在三个地点即北京(E116o，N40o)、上海(E121o，N31o)和长沙(E112o，N28o)进一步进行大规模田间试验。在低氮供应下，NIL中每株植物的分蘖数显著增加，这导致每株植物的谷粒产量增加26.1-29.4％，每块样地的实际产量增加30.3-
33.4％，而土壤23，24中由每单位可用氮的谷粒产量定义的NUE也提高约30％(图5b-d和图
7)。然而，对于每个穗的种子数目、结实率和千粒重，并没有观察到显著差异(表4)。在高氮供应(标准氮水平)下，NIL中每株植物的分蘖数、每株植物的谷粒产量以及每块样地的实际产量也分别增加8.3-11.3％、9.3-10.9％和7.0-13.2％，并且平均NUE提高约10％(图5b，c和图7)。田间试验还示出，在低氮(图6)和高氮条件(图7)两者下，NRT1.1B-籼稻转基因植物具有比NRT1.1B-粳稻转基因植物更好的生长性能(图7)和更高的NUE。另外，当将NRT1.1B-籼稻导入Kongyu131和Xiushui134中时，将两种优质的粳稻栽培品种分别广泛栽培于中国东北和长江流域，在15N-硝酸盐标记后氯酸盐敏感性和15N积聚两者也显著增加(图7)，这指示广泛范围的粳稻背景中的NRT1.1B-籼稻的应用价值。因此，这些结果展示NRT1.1B可为作物育种的NUE提高中的重要参与物质。由NRT1.1B多态性导致的NUE差异可由硝酸盐利用的多个方面的改变造成。除硝酸盐摄入和根到苗运输之外，我们的数据还表明NRT1.1B也在硝酸盐信号化中起重要作用，其可能对NUE测定具有更显著的贡献(补充的注释)。
[0207] 植物材料和生长条件.就短期水培而言，使水稻幼苗在生长室中生长，条件为12小时光照(30℃)/12小时黑夜(28℃)光周期，约200μM m-2s-1光子密度和70％湿度。对于生长性能测定，日本晴和NIL的长期生长水培在人工气候室中进行，条件为12小时光照(28℃)/12小时黑夜(25℃)光周期，约300μM m-2s-1光子密度和40％湿度。使用具有不同硝酸盐浓度的改良的Kimura B溶液(400μM/1mM/2mM KNO3，1mM KCl，0.36mM CaCl2，0.54mM MgSO4，
0.18mM KH2PO4，40μM Fe(II)-EDTA，18.8μM H3BO3，13.4μM MnCl2，0.32μM CuSO4，0.3μM ZnSO4，0.03μM Na2MoO4和1.6mM Na2SiO3，pH 6.0)进行水培。对于各个生长条件，进行3次平行测定。nrt1.1b突变体(Zhonghua11背景，粳稻品种)获自上海T-DNA插入群体。
0.18mM KH2PO4，40μM Fe(II)-EDTA，18.8μM H3BO3，13.4μM MnCl2，0.32μM CuSO4，0.3μM ZnSO4，0.03μM Na2MoO4和1.6mM Na2SiO3，pH 6.0)进行水培。对于各个生长条件，进行3次平行测定。nrt1.1b突变体(Zhonghua11背景，粳稻品种)获自上海T-DNA插入群体。
[0208] 分析nrt1.1b突变体、Zhonghua11(ZH11)、NRT1.1B粳稻-eGFP转基因植物(NG-Nip6，nrt1.1b背景)、以及NRT1.1B籼稻-eGFP转基因植物(NG-IR4，nrt1.1b背景)中NRT1.1B的转录物表达分析。转录物水平用qRT-PCR测定。NG-Nip6和NG-IR4示出比nrt1.1b突变体更高的氯酸盐敏感性，并且NG-IR4还表现出比NG-Nip6更高的氯酸盐敏感性，这证实了NRT1.1B粳稻-eGFP和NRT1.1B籼稻-eGFP融合蛋白的功能。对于不同时间点免疫印迹分析用CHX(200μM)处理的对应转基因植物中的NRT1.1B粳稻-eGFP和NRT1.1B籼稻-eGFP。丽春红(Ponseau S)染色指示加载的蛋白量。如由免疫印迹分析所示，并未在NRT1.1B粳稻-eGFP和NRT1.1B籼稻-eGFP之间观察到蛋白质稳定性的显著差异。
[0209] 水稻的田间栽培.在以下三个实验站点，在2013年的常规水稻栽培季节期间进行日本晴和NIL的大规模田间试验：遗传与发育生物学研究所(Institute of Genetics and Developmental Biology，北京)，上海市农业科学院(Shanghai Academy of Agricultural Sciences，上海)，以及中国国家杂交水稻工程技术研究中心(China National Hybrid Rice Research and Development Center，湖南省长沙市)。在中国大多数地区中，水稻栽培的正常氮供应为约2kg N/100m2。因此，对于低氮(80％硝酸盐与20％铵混合)条件，我们在北京和上海使用1kg N/100m2，在长沙使用0.6kg N/100m2，并且对于高N(80％硝酸盐与20％铵混合)条件在所有三个地点使用2kg N/100m2。KNO3和(NH4)2SO4分别用作硝酸盐和铵的来源。P2O5用作磷肥(0.5kg P/100m2)。植株之间的间距为20cm并且用于产量测试的样地尺寸为3.24m2，包含100个植株。六次平行测定用于样地产量测定。在以上提及的北京的相同栽培条件下，在2014年用转基因植物进行田间试验(将硝酸盐用作主要氮肥)。
[0210] 农学性状分析.根据单植株基础测量重要的农学性状，包括植株高度、每个穗的种子数目、结实率、每株植物的分蘖数、以及每株植物的谷粒产量。植株高度测定为主分蘖的高度。对于结实率测量，手工分离主穗的实粒和空粒(实粒/实粒+空粒)×100。收集单个植株的总实粒，在烘箱中于50℃干燥，以进行每个植株的谷粒产量测量。随机挑选实粒用于千粒重测量。收集单块样地中的所有谷粒并且如上所述处理以进行实际产量测量。
[0211] 过表达转基因构建体.从cDNA模板扩增NRT1.1B-日本晴/IR24(1,791bp)的CDS并克隆到二元载体pCAMBIA2300-CaMV 35S中，以产生NRT1.1B过表达载体。经由农杆菌介导的转化将所得的载体和空载体导入到粳稻品种Zhonghua11中。另外，将包含启动子和编码区的NRT1.1B-日本晴/IR24的基因组片段克隆到二元载体pCAMBIA2300中。将所得的载体和空载体转化到Zhonghua11中，以产生转基因植物以用于NRT1.1B-日本晴/IR24的功能分析。用于载体构建的引物列出于表2中。
[0212] 叶绿素含量和光合速率测定.相对叶绿素含量用Soil and Plant Analyzer Development(SPAD)叶绿素仪测定。利用LI-6400便携式光合作用系统(LICOR，USA)研究光合速率，固定的条件为1,200μM光子m-2s-1，400μM CO2M-1和25℃。
[0213] 表4：田间日本晴(Nip)和NIL的农学性状
[0214]
[0215]
[0216] 将硝酸盐用作主要氮肥。LN：低N，在北京(BJ)和上海(SH)1kg/100m2，在长沙(CS)0.6kg/100m2；HN：高N，在北京、上海和长沙2kg/100m2。值为平均±SD(对于植株高度平行测定30次，并且对于每个穗的种子数目、结实率和千粒重平行测定6次)。P值由Student t检验产生。
[0217] 实施例7：NRT1.1B的自然变异有助于籼稻与粳稻之间的硝酸盐利用趋异度[0218] 关键基因的自然变异强调了不同品种之间的发育和生理差异，并且作物中的这些基因可能在育种程序中具有很大的价值。籼稻和粳稻亚种之间的硝酸盐吸收和利用率的显著差异给出了这样的机会：从水稻中分离控制硝酸盐利用率/NUE的自然变异基因。此处，我们的工作展示出硝酸盐转运蛋白NRT1.1B的自然变异有助于该种硝酸盐利用趋异度，这主要基于两个结果：首先，NRT1.1B在CDS中具有错义核苷酸变异的籼稻与粳稻亚种之间分歧(采用950份水稻种质的系统发育分析)；第二，NRT1.1B-籼稻变异增强硝酸盐利用的不同步骤，包括根摄入，根到苗运输，以及同化作用。这还为粳稻育种的硝酸盐利用率/NUE提高提供潜在的基因座。采用NIL和转基因植物的大规模田间试验进一步确认NRT1.1B-籼稻在粳稻NUE提高中的应用价值。我们需注意，NIL中分蘖数的增加是谷粒产量提高的主要原因，而其它农学性状并未显著改变(图5d，图7，11，和表4)。虽然一些农学性状稍有改变，但与NRT1.1B-粳稻转基因植物相比，增加的分蘖数还是NRT1.1B-籼稻转基因植物的主要生长优势(图6，图7，和表5)。当比较高氮(HN)和低氮(LN)之间的农学性状时，与响应于氮可用性的谷粒产量相比，分蘖数的增加还是对于改善最有效的因素。这些结果指示，谷粒产量提高中NRT1.1B-籼稻的效应符合由增大的氮可用性所引起的那些，这进一步证实其在NUE提高中的作用。因为NRT1.1B主要参与硝酸盐利用，由此，将硝酸盐用作主要氮肥(80％硝酸盐+20％铵)进行该研究的大多数田间试验。当将尿素用作氮肥时，NIL中的NUE也显著增加(图
15)，然而，增加的水平(约15％)低于将硝酸盐用作氮肥(约30％)的水平，因为在田间仅一部分尿素可通过硝化作用转化为硝酸盐，这也支持了硝酸盐利用率测定中所提出的NRT1.1B的作用。
15)，然而，增加的水平(约15％)低于将硝酸盐用作氮肥(约30％)的水平，因为在田间仅一部分尿素可通过硝化作用转化为硝酸盐，这也支持了硝酸盐利用率测定中所提出的NRT1.1B的作用。
[0219] 实施例8——NRT1.1B的变异改变硝酸盐摄入和运输活性以及硝酸盐信号化。
[0220] 除改善硝酸盐摄入和运输活性(图3a，b)之外，硝酸还原酶基因(OsNIA1和OsNIA2)的表达也通过NRT1.1B-籼稻显著上调(图3c，d)，这指示NRT1.1B变体还影响硝酸盐应答基因的表达。几种硝酸盐转运蛋白基因(OsNRT2.1、OsNRT2.2、OsNRT2.3A和OsNRT1.5A)的表达分析示出它们也在NIL中上调(图13b)。然而，nrt1.1b突变体中的硝酸盐诱导测定显示出仅OsNIA1和OsNIA2(而非这些硝酸盐转运蛋白基因)受到显著阻遏(图13a)，指示OsNIA1和OsNIA2可能为NRT1.1B-介导的硝酸盐信号化中的下游基因。因此，NRT1.1B-籼稻的变异可能激活NRT1.1B下游基因的表达。就这些硝酸盐转运蛋白基因而言，其上调可归因于经由NIL中更高硝酸盐积聚的前馈效应。虽然这些硝酸盐转运蛋白基因的上调可部分有助于NIL中更高的硝酸盐积聚，但是NRT1.1B-籼稻的更高转运蛋白活性应当是NIL中增强的硝酸盐摄入和运输的主要原因，因为这些硝酸盐转运蛋白基因仅略微上调。基于这些结果，据推论NRT1.1B-籼稻变异不仅改善硝酸盐摄入和运输活性，还激活某些硝酸盐应答基因的表达，这很大程度上解释了硝酸盐利用率测定中NRT1.1B的重要作用。因为NRT1.1B是CHL1的近同系物，数据还指示NRT1.1B可能用作硝酸盐传感蛋白/转运受体。NRT1.1B的自然变异可影响硝酸盐感应和信号化，这有助于籼稻中更高的NUE。可能的是，除OsNIA1和OsNIA2之外，参与硝酸盐利用的某些其它未鉴定的组分还可由NRT1.1B-籼稻变异来上调。NUE测定中的NRT1.1B作用可取决于其在硝酸盐信号化中的功能。
[0221] NRT1.1B的单氨基酸置换(327T/M)发生在中心胞质环(CCL)。结构柔韧性可通过这种氨基酸置换来改变，其随后导致运输活性/信号化改变。NRT1.1B-籼稻/粳稻的晶体结构分析可确认该假说。另外，氨基酸置换还可导致蛋白质稳定性改变。对转基因植物中NRT1.1B(籼稻/粳稻)-eGFP融合蛋白的稳定性进行分析并且发现，在NRT1.1B的两个变体之间不存在显著的差异，这排除了这种可能性。
[0222] 实施例9：人工选择NRT1.1B-籼稻和栽培水稻中的硝酸盐利用趋异度
[0223] 在籼稻驯养期间，NRT1.1B可为人工选择的目标。一种可能的解释是，更好的生长性能或更高的产量可为先祖选择的主要性状。因为特别是在氮浓度相对较低的土壤下，氮极大地确定了生长性能和谷粒产量，所以可选择NUE更高的水稻以用于进一步栽培。极有可能在籼稻驯养最开始时选择硝酸盐利用活性较高的后来得到的等位基因NRT1.1B-籼稻，因为几乎所有的籼稻品种都携带NRT1.1B-籼稻基因座。而在粳稻中，此类人工选择不可能发生，因为突变的等位基因不存在于其直接祖先中。这也对籼稻和粳稻亚种之间硝酸盐利用趋异度的起因给出了适当解释。因为NRT1.1B在籼稻和粳稻之间高度分歧，表明所有的粳稻品种可通过基因渗入NRT1.1B-籼稻来改善。
[0224] 将硝酸盐用作主要氮肥。LN：低氮，1kg N/100m2；HN：高氮，2kgN/100m2。使用含有受CaMV 35S启动子控制的NRT1.1B-粳稻(Nip-3)/籼稻(IR-3)的转基因植物以及含有受其天然启动子控制的NRT1.1B-粳稻(gNip-2)/籼稻(gIR-3)的转基因植物进行农学性状研究。P值由NRT1.1B-粳稻与NRT1.1B-籼稻转基因植物之间的Student t检验产生。EV1为pCAMBIA2300-CaMV 35S空载体转基因植物。EV2为pCAMBIA2300空载体转基因植物。
[0225] 表5：田间NRT1.1B-籼稻/粳稻转基因植物的农学性状。
[0226]
[0227]
[0228] 已结合各个具体的和优选的实施方案和技术描述了本发明。然而，应当理解，在保持在本发明的实质和范围内的情况下可以作出许多变化和修改。
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