技术领域
[0001] 本
发明涉及种质鉴定方法，特别是一种仿刺参种质鉴定方法。
背景技术
[0002] 海参为海产棘皮动物
门海参纲动物的总称，全世界有900多种，可供食用的约40多 种，而我国有101种，可供食用的有21种。根据海参背面是否有圆锥肉刺状的疣足分为"有刺 参"和"光皮参"两大类。其中"有刺参"主要是"刺参科"的种类，"光皮参"主要是"海参科" "瓜参科"和"芋参科"的种类。通常见到的市售海参主要是海参科、刺参科、瓜参科、和芋海 参科的一些海参种类。
[0003] 在海参家族中，仿刺参(Apostichopus japonicus)是我国经济价值最高的一种海 参。仿刺参隶属于楣手目、刺参科、仿刺参属。体呈圆筒状，长度一般在20cm左右，直径在4cm 左右。刺身的背部均匀分布着许多大小不等的肉刺，腹面平坦，受外界刺激后会蜷缩身体并 使身体变得僵硬。国内仿刺参一般在辽宁，河北，山东，江苏等地的沿海地区很常见。国外北 太平洋区列如俄罗斯的萨哈林，海参崴；日本的北海道，横滨，九州;朝鲜半岛沿岸等地区以 及其他地区均有刺参的分布。仿刺参之所以是一种名贵的海产品，是在于它本身具有很高 的营养价值，而且还可以入药，在医学上也有很大的贡献。随着对仿刺参养殖的深入研究以 及技术的不断改良，导致仿刺参养殖业开始迅速的发展，苗种的生产能
力在不断地提高，养 殖面积也在进一步的扩大，产量也在急速增长，养殖收益愈发可观，成为我国沿海渔业经济 中的重要支柱，是继海带、对虾、扇贝、
海水鱼4次养殖浪潮后第5次
海水养殖浪潮的主体。
[0004] 由于仿刺参具有极高的营养价值，市场售价也较高，一些不法商贩常用一些低价 的海参来充斥仿刺参市场，特别是经过加工后的海参制品更是难以鉴定其来源。因此，开发 一种仿刺参特有的鉴定方法，对于仿刺参种质鉴定、食源性检测鉴定具有十分重要的作用。 当前，人们在鉴定仿刺参的方法上仍依赖传统的经验，以形态学鉴定
生物种，但仿刺参经过 加工成半成品或食品原料时，或保健品时，其原有的形态则灭失，无法从外观上加以鉴定。 而且，与仿刺参外观相似的刺参种类也较多，需经非常专业的分类专家才可以鉴定，对生产 实际造成了很大的障碍。因此，开发一种相对简单、一般检测人员就可以鉴定的技术方案具 有很强的实用性和应用价值。
发明内容
[0005] 本发明所要解决的技术问题是针对
现有技术的不足，提供一种新的、快捷方便的 仿刺参种质鉴定方法，该方法可以克服现有经验性鉴定和利用刺参分类专家才可鉴定的缺 陷。
[0006] 本发明所要解决的技术问题是通过以下的技术方案来实现的。本发明是一种仿刺 参种质鉴定方法，其特点是，所述的鉴定方法步骤如下：
[0007] (1)样本提取：将疑似仿刺参样本，随机取样5g，加液氮在研砵中研成粉末，取 〇. 〇5g分装到2mL EP管中，取样至少3支;在不能即时提取DNA时，则-20°C保存备用；按常规 的酚氯仿法提取DNA，或者用深加工食品DNA提取
试剂盒按操作指南提取DNA;
[0008] (2)PCR 鉴定：
[0009] 反应条件： 15pl体系： 模板 0.2]!]
[0010] 2'^Tdq PCR MastcrMix 7.5pl 引物 上下游引物均为2.5)irnol/L ddTLO 6.1 pi _] PCR反应程序： 94°C 5min 94°C 40s % 57°C 40s p 72°C 40s J 94°C 40s s 55°C 40s ilOx
[0012] 72°C 40s J 94°C 40s i 50°C 40s l25x 72。。40s J 72°C 8min 保存
[0013]弓丨物序列：
[0015] ⑶鉴定标准：产物8%聚丙烯酰胺凝胶
电泳2.5h，
银染显色后
扫描仪成像；引物 △」_ &2-111的结果为111&口的一条带；引物4」&13-144的结果为14仙口的一条带 ；引物4」&15-185的结果为185bp和384bp的2条带；
[0016] (4)结果判定：用步骤(2)所述的3对引物扩增出如步骤(3)所述的条带时，判定样 本是仿刺参。
[0017] 本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述 的仿刺参种质鉴定方法，其特点是，步骤(2)中：所述引物的设计合成方法如下：
[0018] (1)将测序得到的引物序列用Seqman程序，进行对比拼接，去除冗余，再将得到的 每一个DNA序列输入到SSR
软件中，找出每DNA序列的重复序列以及其重复次数;运用Primer Premiers软件对所有微卫星序列进行引物设计，设计出上游引物和下游引物共23对，将所 得到的引物序列进行合成;所设计的引物序列如下表：
[0022] (2)仿刺参合成引物的鉴定
[0023] PCR 扩增：
[0024] 建立一个15yl的扩增体系： f上游引物 l.pi 下游引物 l:lil
[0025] ^ 模板 3pi Mix 7.5pl L ddJHbO 2.5pl
[0026] 上下游引物是根据引物合成单上的ODs值与nmoles per 0D中的n值向合成引物干 粉中添加 TE buffer制成引物原液，再将引物原液与TE以1:39的比例稀释40倍后用于扩增 体系，浓度为2.5wiiol/L，；而模板是4地理群体(采自辽宁大连，河北北戴河，山东东营，江苏 连
云港的天然水域)24个较好的仿刺参组DNA经过灭菌双蒸水稀释5倍后的稀释液，浓度约 为lOng/yl;将这它们用移液枪按要求量移入管中，用过离心将它们混合在一起然后放入 PCR扩增仪中进行扩增；
[0027] PCR扩增程序
[0028]
盖顶温度:99°C 94°C 8min 94°C 35s > 58°C 35s L 2x 72°C 35s J 94°C 35s 56°C： 35s Ex 72°C 35s J 94°C 35s 54°C 35s I 6x
[0029] f 72°C 35s 94°C 35s 52°C 35s I l〇x 72°C： 35s J 94°C 35s 50°C 35s 1 25x 72°C 35s J 72 °C 10m in 12°C保存
[0030] PCR产物的检测
[0031]扩增出来的PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测:将
混合液扩增产物进行检 测，配制好的1.0%的琼脂糖胶液倒入插好梳子的电泳槽中
凝固成型，然后拔掉梳子，加入 电泳液，没过胶板0.5-lcm，然后用移液枪将5yl的PCR产物和2yl的溴酚蓝指示剂混合均匀 后点入琼脂糖凝胶的点样孔中；按下
开关后，将
电压设置成120V，
电流60m然后电泳约 30min;电泳结束后营造一个较暗的环境，用手提式紫外线照射仪查看条带电泳情况，是否 跑出条带，条带
亮度大小;观察之后再将胶板拿到紫外线凝胶呈像系统观察，并拍照记录； 将电泳条带较亮的引物筛选出来，作为下一步实验用引物;23对引物中，12对引物的条带亮 度较好，较为清晰;最终
选定以上技术方案中所述的3对扩增稳定的引物。
[0032] 本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述 的一种仿刺参种质鉴定方法，其特点是，步骤(3)中：聚丙烯酰胺凝胶电泳步骤如下：
[0033] (1)待聚丙烯酰胺凝胶凝固之后，将梳子轻轻拔出，夹子和胶条取下，将胶板
耳板 向里固定在电泳槽中，两边各用两个夹子夹紧；
[0034] (2)向电泳槽中加入IX TBE，下面加到槽壁的2/3处，上面加到没过耳板lcm左右的 地方；
[0035] (3)接通电源，电泳槽上为负极，下为正极；以250V电压，70mA电流，预电泳30min;[OO36] (4)预电泳结束后，关掉电源；用移液枪向第一个点样孔中加入一个2yl的MarkerD 作为参照物，然后依次往后加入1的PCR产物;M i x没有
颜色的话PCR产物还要与溴酸蓝指 示剂混合后再点入点样孔；
[0037] (5)点好样后，接通电源，250V，70mA正式电泳约2小时；意观察条带跑到距离底部 约1 cm处停止电泳。
[0038]本发明所要解决的技术问题还可以通过以下的技术方案来进一步实现。以上所述 的一种仿刺参种质鉴定方法，其特点是，步骤(3)中：聚丙烯酰胺凝胶电泳后胶板的银染显 色方法如下：电泳结束后，将胶板取下，用小刀沿胶板的一
角轻轻撬开，然后用去离子水轻 轻的冲洗胶面，冲洗好后将胶板胶面朝上放入配好的银染液当中，避光
染色;染色过程中每 隔两三分钟要轻轻的晃动银染液，使银染液与胶体充分
接触，染色均匀；染色10 - 15min后 取出胶板;用去离子水再次将染色后的胶体冲洗干净，然后放入染色液中轻轻晃动进行染 色；当出现清晰的条带后立即取出胶板，用去离子水轻轻冲洗一下胶板，再用卫生纸把胶板 背面擦拭干净，拿到扫描仪中扫描并拍照。
[0039]与现有技术相比，本发明方法设计合理，操作方便快捷，准确度高，有效地克服现 有经验性鉴定和利用刺参分类专家才可鉴定的
缺陷。
附图说明
[0040] 图1为引物Aja2-lll在仿刺参扩增的电泳图；图1中:M:marker，l-23为23个随机仿 刺参个体；[0041 ] 图2为引物Ajal3-144在仿刺参扩增的电泳图；图2中:M:marker，l-8，12-24为21个 随机仿刺参个体；
[0042] 图3为引物Ajal5-185在仿刺参扩增的电泳图；图3中：M:marker，l-24为24个随机 仿刺参个体；
[0043]图4为仿刺参其中5个个体DNA提取电泳图。
具体实施方式
[0044] 以下参照附图，进一步描述发明的具体技术方案，以便于本领域的技术人员进一 步地理解本发明，而不构成对其权利的限制。
[0045]
实施例1，一种仿刺参种质鉴定方法，所述的鉴定方法步骤如下：
[0046] (1)样本提取：将疑似仿刺参样本，随机取样5g，加液氮在研砵中研成粉末，取 〇. 〇5g分装到2mL EP管中，取样至少3支;在不能即时提取DNA时，则-20°C保存备用；按常规 的酚氯仿法提取DNA，或者用深加工食品DNA提取试剂盒按操作指南提取DNA;
[0047] (2)PCR 鉴定：
[0048] 反应条件： 15…体系： 模板 0 2P1
[0049] 2y-Taq PCR MasterMix (Li|] Mix，上下；Cl丨d; 7.5pl 引物 l,2pl，上下游引物均为2.5pmol/L ddH.O 6. Ip!
[0050] PCR反应程序： 94°C 5min 94°C 40 s 、
[0051] 57°C 40s p 72°C 40s 94°C 40s ' 55°C 40s Ll〇x 72°C 40s J
[0052] 94°C 40s >> 50CC： 40s L 25x 72°C 40s J 72°C 8min 4T保存 [0053]引物序列：
[0055] (3)鉴定标准:产物经常规的8%聚丙烯酰胺凝胶电泳2.5h，银染显色后扫描仪成 像；引物Aja2-lll的结果为lllbp的一条带；引物Ajal3-144的结果为144bp的一条带；引物 Ajal5-185的结果为185bp和384bp的2条带；
[0056] (4)结果判定：用步骤(2)所述的3对引物扩增出如步骤(3)所述的条带时，判定样 本是仿刺参。
[0057]实施例2,实施例1所述的仿刺参种质鉴定方法，步骤(2)中:所述引 [0058]物的设计合成方法如下：
[0059] (1)将测序得到的引物序列用Seqman程序，进行对比拼接，去除冗余，再将得到的 每一个DNA序列输入到SSR软件中，找出每DNA序列的重复序列以及其重复次数;运用Primer Premiers软件对所有微卫星序列进行引物设计，设计出上游引物和下游引物共23对，将所 得到的引物序列进行合成;所设计的引物序列如下表1:
[0060] 表1仿刺参微卫星引物设计信息表
[0064]
[0065] (2)仿刺参合成引物的鉴定
[0066] PCR 扩增：
[0067] 建立一个15yl的扩增体系： 卩上游引物 1叫 下游引物 l]il
[0068] ^模板 3叫 Mix 7.5pl ^ ddH20 2.5pl
[0069] 上下游引物是根据引物合成单上的ods值与nmoles per 0D中的n值向合成引物干 粉中添加 TE制成引物原液，再将引物原液与TE以1:39的比例稀释40倍后用于扩增体系；而 模板是4地理群体24个较好的仿刺参组DNA经过灭菌双蒸水稀释5后的稀释液;将这它们用 移液枪按要求量移入管中，用过离心将它们混合在一起然后放入PCR扩增仪中进行扩增；
[0070] PCR扩增程序 盖顶温度:99°C 94°C 8min 94°C 35s i 58°C 35s . 2x 72°C 35s .
[0071] 94°C 35s . 56°C 35s 2x 72°C 35s , 94°C 35s ^ 54°C 35s L 6x 72°C 35s . 94°C 35s T 52°C 35s llQx 72°C 35s J 94°C 35s >
[0072] 50°C 35s 卜25乂 72CC： 35s . 72°C lOmin 1:20C保存：
[0073] PCR产物的检测
[0074] 扩增出来的PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测:将混合液扩增产物进行检 测，配制好的1.0%的琼脂糖胶液倒入插好梳子的电泳槽中凝固成型，然后拔掉梳子，加入 电泳液，没过胶板0.5-lcm，然后用移液枪将5yl的PCR产物和2yl的溴酚蓝指示剂混合均匀 后点入琼脂糖凝胶的点样孔中；按下开关后，将电压设置成120V，电流60m然后电泳约 30min;电泳结束后营造一个较暗的环境，用手提式紫外线照射仪查看条带电泳情况，是否 跑出条带，条带亮度大小;观察之后再将胶板拿到紫外线凝胶呈像系统观察，并拍照记录； 将电泳条带较亮的引物筛选出来，作为下一步实验用引物;23对引物中，12对引物的条带亮 度较好，较为清晰;最终选定实施例1所述的3对扩增稳定的引物。
[0075] 实施例3,实施例1或2所述的仿刺参种质鉴定方法的步骤(3)中：聚丙烯酰胺凝胶 电泳步骤如下：
[0076] (1)待聚丙烯酰胺凝胶凝固之后，将梳子轻轻拔出，夹子和胶条取下，将胶板耳板 向里固定在电泳槽中，两边各用两个夹子夹紧；
[0077] (2)向电泳槽中加入IX TBE，下面加到槽壁的2/3处，上面加到没过耳板lcm左右的 地方；
[0078] (3)接通电源，电泳槽上为负极，下为正极；以250V电压，70mA电流，预电泳30min;
[0079] (4)预电泳结束后，关掉电源。用移液枪向第一个点样孔中加入一个2yl的MarkerD 作为参照物，然后依次往后加入1的PCR产物;M i x没有颜色的话PCR产物还要与溴酸蓝指 示剂混合后再点入点样孔；
[0080] (5)点好样后，接通电源，250V，70mA正式电泳约2小时；意观察条带跑到距离底部 约1 cm处停止电泳。
[0081] 实施例4,实施例1或2或3所述的仿刺参种质鉴定方法的步骤(3)中：聚丙烯酰胺凝 胶电泳后胶板的银染显色方法如下：电泳结束后，将胶板取下，用小刀沿胶板的一角轻轻撬 开，然后用去离子水轻轻的冲洗胶面，冲洗好后将胶板胶面朝上放入配好的银染液当中，避 光染色;染色过程中每隔两三分钟要轻轻的晃动银染液，使银染液与胶体充分接触，染色均 匀;染色10 - 15min后取出胶板;用去离子水再次将染色后的胶体冲洗干净，然后放入染色 液中轻轻晃动进行染色；当出现清晰的条带后立即取出胶板，用去离子水轻轻冲洗一下胶 板，再用卫生纸把胶板背面擦拭干净，拿到扫描仪中扫描并拍照。
[0082] 实施例5，仿刺参种质鉴定方法实验：
[0083]实验用仿刺参采集于辽宁大连、山东东营、江苏连云港、河北北戴河这四个主产区 海域，每个地区10只以上，个体大小在20克左右，采集到的仿刺参活体运回实验室，速提 DNA〇
[0084] (l)DNA 提取
[0085] 取组织约50mg，先用蒸馏水将组织中的
乙醇清洗干净，然后按照常规的酚一氯仿 法提取DNA。每个地区10只个体。
[0086]使用琼脂糖凝胶电泳对所提取的DNA模板进行检测，筛选出亮度大、较清晰的高质 量模板，为下一步实验做准备。电泳效果图4。
[0087]从图4中可以看到，仿刺参所提DNA大小合适，亮度较好，电泳结果很好，说明DNA模 板
质量较好，有利于下一步的实验。
[0089]磁珠富集文库的构建主要的流程依次为:基因组DNA的酶切、酶切
片段和Mse I接头 的连接、连接混合液的预扩增、预扩增产物与生物素探针的杂交、目的洗脱片断的精制和扩 增、磁珠杂交和洗脱、PCR产物的纯化、富集片断的T载体连接、阳性克隆的培养和采选。构建 磁珠富集文库的做法参见文献方法:《彩虹明樱蛤遗传多样性分析的微卫星标记开发及其 特征》，《保护遗传资源》（2013)5:59_61(Li X Y，Zhiguo Dong，Meizhen Wang，Manman Zhao,Yumei Chang,Hanchun Chen.Development and characterization of microsatellite markers for genetic analysis of Moerella iridescens Benson, 1842[J] .Conservation Genet Resour(2013)5:59_61)，复合探针分别为CA/GA 1:1混合。
[0090] (3)引物的设计合成
[0091] 引物的设计合成
[0092] 将测序回来的引物序列用Seqman程序，进行对比拼接，去除冗余，再将得到的每一 个DNA序列输入到SSR软件中，找出每DNA序列的重复序列以及其重复次数。运用Primer Premiers软件对所有微卫星序列进行引物设计，设计出上游引物和下游引物，将所得到的 弓丨物序列送到生物公司进行合成。所设计的引物序列如实施例2中的表1。
[0093] (4)仿刺参合成引物的鉴定
[0094] 4.1PCR 扩增 [0095] 建立一个15yl的扩增体系： f上游引物
[0096] 乂 下游引物 M ^ ^ 模板 3|il
[0097] Mix 7.5[i\ ddH20 2.5[i\
[0098] 上下游引物是根据引物合成单上的ods值与nmoles per 0D中的n值向合成引物干 粉中添加 TE制成引物原液，再将引物原液与TE以1:39的比例稀释40倍后用于扩增体系。而 模板是4地理群体24个较好的仿刺参组DNA经过灭菌双蒸水稀释5后的稀释液。将这它们用 移液枪按要求量移入管中，用过离心将它们混合在一起然后放入PCR扩增仪中进行扩增。
[0099] PCR扩增程序 盖顶温度:9§°C 94°C 8min 94°C 35s >j 58°C： 35s L 2x 72。。 35s J 94°C 35s . 56°C 35s 72°C 35s , 94°C 35s
[0100] 54°C 35s l ex 72。。35s J 94°C 35s ' 52°C 35s ll〇x 72°C 35s 一 94°C 35s 50。。35s l-25x 72°C 35s J 72 °C 10m in 12°C保存
[0101] PCR产物的检测
[0102] 扩增出来的PCR产物使用1%琼脂糖凝胶电泳进行检测:将混合液扩增产物进行检 测，配制好的1.0%的琼脂糖胶液倒入插好梳子的电泳槽中凝固成型，然后拔掉梳子，加入 电泳液，没过胶板0.5-lcm，然后用移液枪将5yl的PCR产物和2yl的溴酚蓝指示剂混合均匀 后点入琼脂糖凝胶的点样孔中。按下开关后，将电压设置成120V，电流60m然后电泳约 30min。电泳结束后把窗帘拉上，营造一个较暗的环境，用手提式紫外线照射仪查看条带电 泳情况，是否跑出条带，条带亮度大小。观察之后再将胶板拿到紫外线凝胶呈像系统观察， 并拍照记录。将电泳条带较亮的引物筛选出来，作为下一步实验用引物。23个引物中，12个 引物的条带亮度较好，较为清晰。最终选择三个扩增稳定的引物进行种质鉴定(表2)。
[0103] 表2筛选出的理想引物
[0105] (5)聚丙烯酰胺胶凝胶电泳
[0106] 8%聚丙烯酰胺胶液的制备：（30ml约一
块板的量） 30%丙烯酰胺溶液 8:ral 5xTBE 6ml ddH2Q 16ml
[0107] 2.6.2.3
[0108] (1)待聚丙烯酰胺凝胶凝固之后，将梳子轻轻拔出，夹子和胶条取下，将胶板耳板 向里固定在电泳槽中，两边各用两个夹子夹紧。
[0109] (2)向电泳槽中加入IX TBE，下面加到槽壁的2/3处，上面加到没过耳板lcm左右的 地方。
[0110] (3)接通电源，电泳槽上为负极，下为正极。以250V电压，70mA电流，预电泳30min。
[0111] (4)预电泳结束后，关掉电源。用移液枪向第一个点样孔中加入一个2yl的MarkerD 作为参照物，然后依次往后加入1的PCR产物。M i x没有颜色的话PCR产物还要与溴酸蓝指 示剂混合后再点入点样孔。
[0112] (5)点好样后，接通电源，250V，70mA正式电泳约2小时。注意观察条带跑到距离底 部约lcm处停止电泳。
[0113] 2.6.2.3胶板的银染与显色
[0114] 电泳结束后，将胶板取下，用小刀沿胶板的一角轻轻撬开，然后用去离子水轻轻的 冲洗胶面，冲洗好后将胶板胶面朝上放入配好的银染液当中，避光染色。染色过程中每隔两 三分钟要轻轻的晃动银染液，使银染液与胶体充分接触，染色均匀。染色l〇min后取出胶板。
[0115] 用去离子水再次将染色后的胶体冲洗干净，然后放入染色液中轻轻晃动进行染 色。当出现清晰的条带后立即取出胶板(约8min)，用去离子水轻轻冲洗一下胶板，再用卫生 纸把胶板背面擦拭干净，拿到EPSON扫描仪中扫描并拍照。
[0116] 产物经常规的8 %聚丙烯酰胺凝胶电泳2.5h，银染显色后扫描仪成像。使用 GELPR045软件对扫描得到的软件进行分析处理，标出每一条泳道和位点，Marker D的六个 位点的大小分别为:200(^口、100(^口、75(^口、50(^口、25(^口、10(^口。引物4」32-111的结果 ：结 果为lllbp的一条带，如图1。引物Ajal3-144的结果：结果为144bp的一条带，如图2。引物 Ajal5-185的结果:结果为185bp和384的2条带，如图3。
