技术领域
[0001] 本
发明涉及罗湖病毒检测技术领域，更具体地说，本发明涉及一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法。
背景技术
[0002] 罗非鱼是一种非常重要的食用鱼类，世界第二大
水产养殖品种。2015年世界罗非鱼养殖和捕捞产量达到640万吨，价值约98亿美元，全球贸易额达18亿美元，2016年和2017年产量持续增长，作为一种重要的动物性蛋白来源，罗非鱼具有分布范围广、适应能
力强、生长周期短、食性广泛、抗病性强等优点，被认为是全球粮食安全和营养的“支柱”之一，为包括许多小农在内的千百万人提供粮食、就业及国内和出口收入。
[0003] 近期，联合国粮农组织发布罗非鱼罗湖病毒(TiLV)特别警报，在全球六个国家发生罗湖病毒疫情，殃及南美、亚洲和中东地区，目前，尚不确定罗湖病毒是否会通
过冷冻罗非鱼产品进行传播，但粮农组织指出，罗湖病毒有可能比目前已知的分布范围更广，给全球罗非鱼养殖造成严重威胁，罗湖病毒在24-33℃均可以生长，最适
温度25℃，所以每年的5-10月份均可能导致发病，粮农组织(FAO)指出，罗非鱼生产国需要保持警惕，在开展罗非鱼贸易时应遵守世界动物卫生组织《
水生动物卫生法典》，这些国家应该实施主动监测计划，以确定是否存在罗湖病毒，其感染的地理范围，并确定有助于遏制传播的
风险因素，佛罗里达大学养殖学专家CraigWatson表示，世界动物卫生组织(OIE)将罗湖病毒列为“须报告病毒”的可能性非常大。一旦实施，水产进口国将对易感染的品种展开进口检验，如活鱼。另据阳江本市多家罗非鱼出口厂家反馈，目前出口非洲科特迪瓦等国家的罗非鱼要求出具中国官方检疫合格证书。
[0004] 鉴于罗非鱼在我国及全球巨大的经济意义，以及罗湖病毒严重的危害性，世界多国已经将其列为产品入境的检疫项目，但目前在公开发表的文献中尚无罗湖病毒检疫鉴定方法，也尚未有有效的
治疗方法，根据目前的研究现状，对于罗湖病毒的系统性研究尚不够深入，相关免疫学、分子
生物学检测方法尚未正式建立，鉴于该病毒的传播性及危害性较大，有必要开展其流行传播情况的调查研究，并需快速筛查及准确鉴定方法的技术支持，故需要一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法。
发明内容
[0005] 为了克服
现有技术的上述
缺陷，本发明的
实施例提供一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，通过建立该病毒分子生物学检验鉴定方法，可为
水产养殖加工和贸易企业提供此类病毒检测服务并出具检验报告，同时可为政府监管部
门开展疫情监测和防治提供技术服务，并且参与官方及水产企业的防疫防控工作并提供技术支持和疫情确认，另外待检测方法建立后，可以与水产养殖企业和防治药剂生产企业合作，研制罗湖病毒
预防和治疗的药剂，具有广阔的发展前景。
[0006] 为实现上述目的，本发明提供如下技术方案：一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，具体步骤如下：
[0007] S1、罗湖病毒的分离：
[0008] S1.1、可疑病例样品的处理方式：采集到的疑似样品需在配置一半以上体积
冰袋、保温效果良好的保温箱中低温运输，温度保持在0-4℃；
[0009] S1.2、病毒的分离方法：在实验室无菌条件下获取疑似病例个体的肝、肾、脾、肠、腮和脑组织，用组织
研磨机将样品匀浆成糊状，按照1：10的稀释度悬于适当的细胞培养液中，于30-37℃下孵育10-15min后放入离心机进行离心处理，离心后吸取包含细胞的上清液放入EP管中；
[0010] S2、样品中病毒RNA的提取：使用CTAB法或者商业
试剂盒提取病毒RNA；
[0011] S3、RT-PCR检测方法的建立：
[0012] S3.1、根据Genbank中登记的罗湖病毒设计上下游引物；
[0013] S3.2、对提取取得的RNA进行逆转录，合成DNA后进行核酸扩增和鉴定；
[0014] S4、实时荧光定量PCR检测方法的建立：
[0015] S4.1、根据Genbank中登记的罗湖病毒基因NC_029930特异序列设计引物和探针；
[0016] S4.2、根据DNA序列，合成单链小
片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段，合成NC_029930(Tipapia)基因(465bp)，将合成的基因片段连接至pMD19-T载体中，构建阳性质粒；取In-Fusion产物转化至E.coliCompetentCellJM109保存备用；
[0017] 对E.coliCompetentCellJM109菌落用M13-47/RV-M引物进行PCR，检测所含质粒中插入片段的长度大小；
[0018] 对E.coliCompetentCellJM109菌落进行质粒DNA提取，测序，以验证阳性质粒序列；
[0019] S4.3、在无法取得罗湖病毒阳性样本的情况下，阳性质粒可以作为检测实验的阳性对照使用；
[0020] S4.4、利用阳性质粒为模板、设计的引物和探针进行扩增，验证引物、探针、模板的正确性；
[0021] S4.5、对扩增产物进行基因测序，录入Genbank进行比对，确认为罗湖病毒特异性序列；
[0022] S4.6、经实验确认，引物、探针设计；阳性对照构建，均有效。该项检测方法可对罗湖病毒进行分子生物学鉴定；
[0023] S5、建立形态解剖学特征鉴定感病个体的方法：通过上述方法最终建立形态解剖学和分子生物学方法结合的罗湖病毒检疫鉴定方法。
[0024] 在一个优选地实施方式中，在步骤S1.2中可依据细胞培养结果考虑是否需要加入抗生素以防治污染，提高细胞成活率。
[0025] 在一个优选地实施方式中，在步骤S1.2中离心温度为0-4℃，离心机转速为8000-12000r/min，离心时间为10-15min。
[0026] 在一个优选地实施方式中，在步骤S3中使用双标记荧光探针法，在步骤S3.1中设计的引物分别为：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'，在步骤S4.1中设计的引物、探针：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'，探针：
(FAM)CCGCTCTCGTCAGCACCATA(TAMRA)。
[0027] 在一个优选地实施方式中，在步骤S3.2中也可以采用一步法，在一个反应体系内完成逆转录和扩增，根据设备及逆转录酶的特性，设计反应条件并进行优化。
[0028] 在一个优选地实施方式中，在步骤3.2中逆转录步骤为：
[0029] a、向EP管中加入DEPC水、引物以及提取的病毒RNA；
[0030] b、放入离心机中离心，然后放入100摄氏度水浴加热1min；
[0031] c、然后再加入0.5ul的dNTP、2ul的5×Buffer和1ul的AMV逆转录酶，然后放入离心机稍作离心，使用
封口膜封闭EP管口，然后42℃水浴后，在90℃下做RT；
[0032] d、100℃沸水浴3min灭活AMV。
[0033] 在一个优选地实施方式中，在步骤S3.2中使用核酸扩增仪进行核酸扩增。
[0034] 本发明的技术效果和优点：
[0035] 本发明通过建立罗湖病毒可疑样本的
采样方法、核酸提取方法和分子生物学检测系列方法，结合分子生物学检测确认结果，建立该病毒的表观及解剖学特征鉴定方法，为水产养殖加工和贸易企业提供此类病毒检测服务并出具检验报告，同时可为政府监管部门开展疫情监测和防治提供技术服务，并且参与官方及水产企业的防疫防控工作并提供技术支持和疫情确认，另外待检测方法建立后，可以与水产养殖企业和防治药剂生产企业合作，研制罗湖病毒预防和治疗的药剂，具有广阔的发展前景。
具体实施方式
[0036] 下面将结合本发明中的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述，显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0037] 实施例1：
[0038] 本发明提供了一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，具体步骤如下：
[0039] S1、罗湖病毒的分离：
[0040] S1.1、可疑病例样品的处理方式：采集到的疑似样品需在配置一半以上体积冰袋、保温效果良好的保温可依据细胞培养结果考虑是否需要加入抗生素以防治污染，提高细胞成活率，箱中低温运输，温度保持在0℃；
[0041] S1.2、病毒的分离方法：在实验室无菌条件下获取疑似病例个体的肝、肾、脾、肠、腮和脑组织，用组织研磨机将样品匀浆成糊状，按照1：10的稀释度悬于适当的细胞培养液中，离心温度为0℃，离心机转速为8000r/min，离心时间为10min，于30℃下孵育10min后放入离心机进行离心处理，离心后吸取包含细胞的上清液放入EP管中；
[0042] S2、样品中病毒RNA的提取：使用CTAB法提取病毒RNA；
[0043] S3、RT-PCR检测方法的建立：
[0044] S3.1、使用双标记荧光探针法，根据Genbank中登记的罗湖病毒设计上下游引物：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'；
[0045] S3.2、对提取取得的RNA进行逆转录，合成DNA后使用核酸扩增仪进行核酸扩增和鉴定，也可以采用一步法，在一个反应体系内完成逆转录和扩增，根据设备及逆转录酶的特性，设计反应条件并进行优化，逆转录步骤为：
[0046] a、向EP管中加入DEPC水、引物以及提取的病毒RNA；
[0047] b、放入离心机中离心，然后放入100摄氏度水浴加热1min；
[0048] c、然后再加入0.5ul的dNTP、2ul的5×Buffer和1ul的AMV逆转录酶，然后放入离心机稍作离心，使用封口膜封闭EP管口，然后42℃水浴后，在90℃下做RT；
[0049] d、100℃沸水浴3min灭活AMV；
[0050] S4、实时荧光定量PCR检测方法的建立：
[0051] S4.1、根据Genbank中登记的罗湖病毒基因NC_029930特异序列设计引物和探针：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'，探针：(FAM)CCGCTCTCGTCAGCACCATA(TAMRA)；
[0052] S4.2、根据DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段，合成NC_029930(Tipapia)基因(465bp)，将合成的基因片段连接至pMD19-T载体中，构建阳性质粒；取In-Fusion产物转化至E.coliCompetentCellJM109保存备用；
[0053] 对E.coliCompetentCellJM109菌落用M13-47/RV-M引物进行PCR，检测所含质粒中插入片段的长度大小；
[0054] 对E.coliCompetentCellJM109菌落进行质粒DNA提取，测序，以验证阳性质粒序列；
[0055] S4.3、在无法取得罗湖病毒阳性样本的情况下，阳性质粒可以作为检测实验的阳性对照使用；
[0056] S4.4、利用阳性质粒为模板、设计的引物和探针进行扩增，验证引物、探针、模板的正确性；
[0057] S4.5、对扩增产物进行基因测序，录入Genbank进行比对，确认为罗湖病毒特异性序列；
[0058] S4.6、经实验确认，引物、探针设计；阳性对照构建，均有效。该项检测方法可对罗湖病毒进行分子生物学鉴定；
[0059] S5、建立形态解剖学特征鉴定感病个体的方法：通过上述方法最终建立形态解剖学和分子生物学方法结合的罗湖病毒检疫鉴定方法。
[0060] 实施例2：
[0061] 本发明提供了一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，具体步骤如下：
[0062] S1、罗湖病毒的分离：
[0063] S1.1、可疑病例样品的处理方式：采集到的疑似样品需在配置一半以上体积冰袋、保温效果良好的保温可依据细胞培养结果考虑是否需要加入抗生素以防治污染，提高细胞成活率，箱中低温运输，温度保持在2℃；
[0064] S1.2、病毒的分离方法：在实验室无菌条件下获取疑似病例个体的肝、肾、脾、肠、腮和脑组织，用组织研磨机将样品匀浆成糊状，按照1：10的稀释度悬于适当的细胞培养液中，离心温度为2℃，离心机转速为10000r/min，离心时间为12.5min，于34℃下孵育12.5min后放入离心机进行离心处理，离心后吸取包含细胞的上清液放入EP管中；
[0065] S2、样品中病毒RNA的提取：使用CTAB法提取病毒RNA；
[0066] S3、RT-PCR检测方法的建立：
[0067] S3.1、使用双标记荧光探针法，根据Genbank中登记的罗湖病毒设计上下游引物：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'；
[0068] S3.2、对提取取得的RNA进行逆转录，合成DNA后使用核酸扩增仪进行核酸扩增和鉴定，也可以采用一步法，在一个反应体系内完成逆转录和扩增，根据设备及逆转录酶的特性，设计反应条件并进行优化，逆转录步骤为：
[0069] a、向EP管中加入DEPC水、引物以及提取的病毒RNA；
[0070] b、放入离心机中离心，然后放入100摄氏度水浴加热1min；
[0071] c、然后再加入0.5ul的dNTP、2ul的5×Buffer和1ul的AMV逆转录酶，然后放入离心机稍作离心，使用封口膜封闭EP管口，然后42℃水浴后，在90℃下做RT；
[0072] d、100℃沸水浴3min灭活AMV；
[0073] S4、实时荧光定量PCR检测方法的建立：
[0074] S4.1、根据Genbank中登记的罗湖病毒基因NC_029930特异序列设计引物和探针：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'，探针：(FAM)CCGCTCTCGTCAGCACCATA(TAMRA)；
[0075] S4.2、根据DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段，合成NC_029930(Tipapia)基因(465bp)，将合成的基因片段连接至pMD19-T载体中，构建阳性质粒；取In-Fusion产物转化至E.coliCompetentCellJM109保存备用；
[0076] 对E.coliCompetentCellJM109菌落用M13-47/RV-M引物进行PCR，检测所含质粒中插入片段的长度大小；
[0077] 对E.coliCompetentCellJM109菌落进行质粒DNA提取，测序，以验证阳性质粒序列；
[0078] S4.3、在无法取得罗湖病毒阳性样本的情况下，阳性质粒可以作为检测实验的阳性对照使用；
[0079] S4.4、利用阳性质粒为模板、设计的引物和探针进行扩增，验证引物、探针、模板的正确性；
[0080] S4.5、对扩增产物进行基因测序，录入Genbank进行比对，确认为罗湖病毒特异性序列；
[0081] S4.6、经实验确认，引物、探针设计；阳性对照构建，均有效。该项检测方法可对罗湖病毒进行分子生物学鉴定；
[0082] S5、建立形态解剖学特征鉴定感病个体的方法：通过上述方法最终建立形态解剖学和分子生物学方法结合的罗湖病毒检疫鉴定方法。
[0083] 实施例3：
[0084] 本发明提供了一种应用实时荧光RT-PCR定量检测罗湖病毒的方法，具体步骤如下：
[0085] S1、罗湖病毒的分离：
[0086] S1.1、可疑病例样品的处理方式：采集到的疑似样品需在配置一半以上体积冰袋、保温效果良好的保温可依据细胞培养结果考虑是否需要加入抗生素以防治污染，提高细胞成活率，箱中低温运输，温度保持在4℃；
[0087] S1.2、病毒的分离方法：在实验室无菌条件下获取疑似病例个体的肝、肾、脾、肠、腮和脑组织，用组织研磨机将样品匀浆成糊状，按照1：10的稀释度悬于适当的细胞培养液中，离心温度为4℃，离心机转速为12000r/min，离心时间为15min，于37℃下孵育15min后放入离心机进行离心处理，离心后吸取包含细胞的上清液放入EP管中；
[0088] S2、样品中病毒RNA的提取：使用商业试剂盒提取病毒RNA；
[0089] S3、RT-PCR检测方法的建立：
[0090] S3.1、使用双标记荧光探针法，根据Genbank中登记的罗湖病毒设计上下游引物：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'；
[0091] S3.2、对提取取得的RNA进行逆转录，合成DNA后使用核酸扩增仪进行核酸扩增和鉴定，也可以采用一步法，在一个反应体系内完成逆转录和扩增，根据设备及逆转录酶的特性，设计反应条件并进行优化，逆转录步骤为：
[0092] a、向EP管中加入DEPC水、引物以及提取的病毒RNA；
[0093] b、放入离心机中离心，然后放入100摄氏度水浴加热1min；
[0094] c、然后再加入0.5ul的dNTP、2ul的5×Buffer和1ul的AMV逆转录酶，然后放入离心机稍作离心，使用封口膜封闭EP管口，然后42℃水浴后，在90℃下做RT；
[0095] d、100℃沸水浴3min灭活AMV；
[0096] S4、实时荧光定量PCR检测方法的建立：
[0097] S4.1、根据Genbank中登记的罗湖病毒基因NC_029930特异序列设计引物和探针：上游引物：TiLV-PFSeq：5'TCACCCCACTCTATATTATC3'，下游引物：TiLV-PRSeq：5'AGTCGGAAGATCAAGAAG3'，探针：(FAM)CCGCTCTCGTCAGCACCATA(TAMRA)；
[0098] S4.2、根据DNA序列，合成单链小片段DNA，再通过PCR方法，把单链小片段DNA拼接成一条完整的双链DNA片段，合成NC_029930(Tipapia)基因(465bp)，将合成的基因片段连接至pMD19-T载体中，构建阳性质粒；取In-Fusion产物转化至E.coliCompetentCellJM109保存备用；
[0099] 对E.coliCompetentCellJM109菌落用M13-47/RV-M引物进行PCR，检测所含质粒中插入片段的长度大小；
[0100] 对E.coliCompetentCellJM109菌落进行质粒DNA提取，测序，以验证阳性质粒序列；
[0101] S4.3、在无法取得罗湖病毒阳性样本的情况下，阳性质粒可以作为检测实验的阳性对照使用；
[0102] S4.4、利用阳性质粒为模板、设计的引物和探针进行扩增，验证引物、探针、模板的正确性；
[0103] S4.5、对扩增产物进行基因测序，录入Genbank进行比对，确认为罗湖病毒特异性序列；
[0104] S4.6、经实验确认，引物、探针设计；阳性对照构建，均有效。该项检测方法可对罗湖病毒进行分子生物学鉴定；
[0105] S5、建立形态解剖学特征鉴定感病个体的方法：通过上述方法最终建立形态解剖学和分子生物学方法结合的罗湖病毒检疫鉴定方法。
[0106] 本发明的目的在于尽早建立罗湖病毒疑似病例的采样规则、样品前处理方法、病毒分离和核酸提取技术、核酸扩增和鉴定的分子生物学检测方法，对照检测结果，建立罗非鱼罗湖病毒的表观病征鉴定方法，为水产企业提供检测服务并出具检验报告；为政府监管部门开展疫情监测和防治提供技术服务；参与官方及水产企业的防疫防控工作并提供技术支持和疫情确认；待检测方法建立后，将与水产养殖企业和防治药剂生产企业合作，研制罗湖病毒预防和治疗的药剂。
[0107] 最后：以上所述仅为本发明的优选实施例而已，并不用于限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何
修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
