昆虫抗菌肽(Insect antibacterial peptides)是昆虫在受到微生物感染或 意外伤害时，在血淋巴及消化道中产生的一类多肽，具有分子量小、热稳定 性强、水溶性好的特点。研究表明昆虫抗菌肽具有广谱抗菌性，对耐药菌株 有明显的杀伤作用，同时对生物体的细胞无破坏性，无免疫原性，它的生成 和释放是机体炎症反应的组成部分，是宿主防御细菌、真菌等病原微生物入 侵的重要屏障，应用前景十分广阔。
自从1972年Boman等从天蚕蛹的血淋巴分离出第一例抗菌肽以来，迄今 为止，在昆虫中发现的抗菌肽已达200多种。主要集中于鳞翅目 (Lepidoptera)、鞘翅目(Coleoptera)、双翅目(Diptera)、膜翅目 (Hymenoptera)，还有半翅目(Hemiptera)、等翅目(Isoptera)、同翅目 (Homoptera)及蜻蜒目(Odonata)。不同昆虫中存在的抗菌物质有所不同， 它们的一级结构差别很大，由13-50个氨基酸组成，分子量少于5kDa，由 于肽链中富含精氨酸或赖氨酸等带正电荷残基，故多为阳离子型。抗菌肽根 据其氨基酸组成和分子结构特点分为4类：
(1)天蚕素类(Cecropins)：天蚕素是最早发现的抗菌肽。天蚕素族抗 菌肽是大约4KD的阳离子肽，由31～40个氨基酸残基组成，分子内很少 有半胱氨酸残基，分子主要为螺旋构象，含有两个两性α螺旋位于N-端和 C-端。目前，已从鳞翅目和双翅目昆虫中分离出20多种天蚕素类似物，天 蚕素类的抗菌谱包括抗革兰氏阳性菌和革兰氏阴性菌，其中对革兰氏阴性 菌抗菌活性较强。不易被胰蛋白酶、胃蛋白酶降解。
(2)昆虫防御素(Insect defensins)：昆虫防御素含有6个Cys形成的3或4 个分子内二硫键、3个不同的结构域：一个氨基酸末端环，一个双亲性α螺 旋和一个羧基端反相平行的β折叠。分子内二硫键在维持防御素的体内活性 方面起重要的作用。目前，从双翅目、鞘翅目和半翅目几十种昆虫中均已发 现防御素，不同种类昆虫的防御素分子结构具有较高的同源性，该类抗菌肽 抗菌谱较窄，主要对金黄色葡萄球菌等革兰氏阳性菌具有较强的抗菌活性。
(3)富含脯氨酸或精氨酸的抗菌肽(Prolinerich peptides)：这类抗菌肽 在双翅目、膜翅目、半翅目、鞘翅目昆虫中分离得到，他们具有很高的相似 性，含有15～39个氨基酸残基，分子中脯氨酸含量大于25％，它对革兰氏阴 性菌具有很强的活性，而对革兰阳性菌不起作用。
(4)富含甘氨酸的抗菌肽(Glycine-rich peptides)：这类抗菌肽从天蝇、 麻蝇中发现，其共同特点是一级结构中富含甘氨酸，分子量较大，为 8-30kDa。该类抗菌肽Cys含量少或不含Cys，不形成分子内二硫键，氨基酸 残基上也不具有修饰基团。目前，在鳞翅目、双翅目、半翅目、鞘翅目和膜 翅目昆虫中都发现了此类抗菌肽，此类抗菌肽中含量很高的Gly对提高肽链 的弹性及广谱抗菌等可能起重要作用。
有关抗菌肽的作用机制，不同的抗菌肽存在不同的作用模式，但其只有 接近或结合细胞膜时才形成其发挥功能的高级结构，而在水溶液中并没有稳 定的构象，这可能是其对热稳定的原因。目前对昆虫抗菌肽的作用机理有几 种主要的学说
(1)离子通道学说：构成抗菌肽分子的氨基酸大多数带正电荷，分子通 过正电荷与细菌胞浆磷脂分子上的负电荷形成静电吸附而结合在脂质膜上， 然后分子中的疏水端借助分子链的柔性插入到质膜中，进而牵引整个分子进 人质膜，扰乱质膜上蛋白质和脂质原有排列秩序，再通过抗菌肽分子间的相 互位移而聚合形成跨膜离子通道，使细胞内离子大量流失，最终细胞不能保 持其正常渗透压而死亡。
(2)细胞呼吸作用抑制学说：昆虫防御素类thanatin是通过抑制细胞呼 吸作用来杀菌。
(3)抑制细胞外膜蛋白的合成，从而导致细胞膜的通透性增加，细菌的 生长受到抑制。
(4)抑制细胞壁的形成，使细菌不能维持正常的细胞形态而生长受阻， 但对已经形成的细胞壁无作用。
昆虫抗菌肽具有分子量小、材料来源丰富和抗菌谱广的特点，在医药工 业上有着广阔的应用前景。随着传统抗生素的广泛及长期的应用，许多病源 菌对它们产生了耐药性，而具有广谱抗菌且有独特的抗菌机制的抗菌肽显然 在这方面的应用研究中具明显优势。国际上，抗菌肽已经用于脑脊髓膜炎、 幽门螺旋杆菌感染及抗真菌感染等的临床治疗。昆虫抗菌肽的药用价值在我 国中医药中很早就有记载，家蝇幼虫洗净晒干后与其他中药配制成为具有治 疗感染性疾病的药剂。
昆虫抗菌肽不仅能抑杀多种细菌和真菌，而且还可以杀死某些寄生虫(如 疟原虫)，对多种癌细胞及动物实体瘤也有明显的杀伤作用，甚至对含包膜 的病毒(如艾滋病病毒、疱疹病毒)也有作用，而对正常细胞无损害，这与它 们的细胞膜中膜脂的组成有关。细菌细胞膜膜脂由大量的带阴离子电荷的磷 脂基团组成，且细菌细胞壁有带负电的肽聚糖或脂多糖，而真核细胞膜富含 胆固醇，且真核细胞膜多由不带电的膜脂组成，一些带负电荷的磷脂基团朝 向细胞质。此外，高等动物存在高度发达的细胞骨架系统，也具有抵抗抗菌 肽的作用，癌细胞的细胞骨架系统与正常细胞相比不发达，这是抗菌肽对其 产生抑制作用的原因之一。
抗菌肽作为添加剂，在饲料加工业、食品添加剂和水产养殖业也有着广 阔的应用前景，被认为是最有发展前景的绿色饲料添加剂。通常，抗生素添 加剂的使用严重破坏了动物肠道的微生物平衡，并易在动物体内残留，严重 影响了畜产品的品质和人类的健康。研究表明抗菌肽具广谱抗菌作用，同时 对畜、禽具有促进生长、保健和治疗疾病的功能，属无毒副作用、无残留、 无致细菌耐药性的一类环保型制剂
此外，抗菌肽已经成功的应用于转基因动植物的研究。通过基因工程的 方法，将抗菌肽基因转入植物中获得抗病品种，已经成为一种新型的基因工 程育种策略。Jaynes等已将Shiva-1基因转入烟草和马铃薯。其中转基因烟草 青枯病发病明显延迟，病情指数低下，植株死亡率降低。仔猪腹泻、奶牛乳 房炎及各种病毒性疾病如猪瘟、鸡新城疫等一直是棘手的疾病，不利于畜牧 业的发展，把特异的抗菌肽基因转入畜禽特定细胞让其表达，从而产生抗病 新品种，不失为一条发展畜牧生产的新思路。
由于天然抗菌肽的来源十分有限，化学合成抗菌肽价格昂贵，因此通过 基因工程技术来获得抗菌肽成为首选方法。由于抗菌肽本身具有抗菌活性， 对宿主菌有杀伤作用，其直接表达较困难。目前，对抗菌肽在原核中的表达 常采用融合表达方式进行。Xie等根据家蚕抗菌肽CMIV的氨基酸序列，利用 E.coli偏爱的密码子设计并合成其突变体DNA，克隆到融合表达载体 pEZZ318，在E.coli中得到ZZ-CMIV融合表达的蛋白，融合蛋白经亲和层析 后，用CNBr裂解，得到具有抗菌活性的突变体抗菌肽CMIV，但产率不高(Xie W，et al.，Biochem Mol Biol Int，1996，39：487-492.)。为提高产率，李秀兰 等最大限度地利用了大肠杆菌偏爱的密码子，设计并合成了新的抗菌肽基因 CMIV片段，重组到测序载体，再将此片段重组到带有His纯化标签的高效 融合表达载体pET28，融合蛋白经镍金属离子胶亲和层析后，用CNBr裂解， 最终产物具有与天然抗菌肽相同的生物活性，且产率提高一倍(李秀兰等， 中国生物化学与分子生物学报，1999，15：387～391)。
虽然原核表达系统操作简便，但由于抗菌肽基因为真核基因，部分抗菌 肽类基因在原核系统中表达出来的蛋白不能有效、正确地折叠且缺乏信号肽 切除和翻译后修饰。因此，用真核细胞表达抗菌肽成为研究热点。陈海旭等 用化学合成法合成了以酵母偏爱密码子编码的抗菌肽magainin基因片断，采 用Pichia pastoris系统成功地表达了magainin(陈海旭等，中国生物化学与 分子生物学报，2002，18：461-464)。但酵母表达系统不仅培养密度低，抗菌 肽的表达量有限，而且抗菌肽表达酰胺化不完全，影响其杀菌活性。Hellers 等将编码天蚕素肽原前体的片段克隆到苜蓿斜纹蛾多角病毒启动子的下游， 构建了昆虫病毒表达系统(Hellers Metal，Biochem J，1991，199：435-439.)。 徐建华等构建了抗菌肽Cecropin基因真核表达载体，其带有可提供高效表达 的CMV启动子，能在各种哺乳动物细胞稳定高效表达(徐建华等，生物技术， 2005，15：3～6.)。关于家蚕抗菌肽(CecropinD)，目前国内外还未见有在 真核和原核表达系统克隆和表达的报道。

本发明的目的在于提供一种基因工程家蚕抗菌肽Cecropin D，该多肽具有 广谱的抑菌作用，对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌均具有抑菌活性，能够作 为抗生素的取代品广泛的应用于新型医药、兽药、水产养殖用药的研制。
本发明的另外一个目的在于提供一种基因工程昆虫抗菌肽CecropinD的 制备方法，该方法是以E.coli作为宿主。
本发明还涉及基因工程家蚕(昆虫)抗菌肽CecropinD在制备治疗或预防 抗家蚕病毒病(BmNPV)感染的药物中的应用。
本发明还涉及基因工程家蚕抗菌肽在制备治疗或预防革兰氏阳性革兰氏 阴性细菌性(包括在医药、兽药及农药)的药物中的应用。
本发明还涉及基因工程家蚕抗菌肽在制备治疗或预防家蚕养殖的药物中 的应用。
本发明的技术要点之一在于提供一种用E.coli表达系统表达具有生物活 性的昆虫抗菌肽CecropinD基因的方法。
家蚕抗菌肽Cecropion D(以下简称CD)是最早从家蚕免疫血淋巴中分离 得到的高效抗菌肽，由62个氨基酸组成，经过翻译后修饰，去掉信号部分和 C末端酰胺后，成为具有生物活性的成熟肽(36aa)。由于大肠杆菌表达系统 缺乏C末端酰胺转移酶，因此用肠杆菌表达系统表达的基因工程抗菌肽很多 不具有活性。在本发明的一个实施例中，提供了一种表达具有抗菌肽活性的 基因工程抗菌肽的方法，该方法通过PCR的方法在成熟肽基因的末端添加了 一个天冬酰胺，以保证表达后蛋白末端的酰胺化。
本发明的技术要点之二在于提供一种用E.coli表达系统表达可溶性的昆 虫抗菌肽CecropinD基因的方法。
人们已经发展了多种原核、真核表达系统生产外源重组蛋白，迄今为止， 大肠杆菌以其易于操作、遗传背景清楚、发酵成本低等优点依然是重组蛋白 生产的首选体系。但大肠杆菌表达蛋白时重组蛋白有时不能正确折叠，而且 常形成无活性的包涵体，而且由于表达系统本身缺乏一些翻译后的修饰作 用，所表达的蛋白有些没有活性。研究发现，如果将目的蛋合融合在某些易 于高效表达和纯化的“融合头”(fusion partner)的C端，融合表达往往可以获 得外源基因的高效表达，而且可以减少蛋白酶的降解，并提供特异、简单的 纯化方法。通过人工设计的蛋白酶切割位点或化学试剂断裂位点，可以在体 外去除融合蛋白N端的“融合头”，获得与天然蛋白完全一致的重组蛋白。 更为重要的是，这种融合表达的蛋白通常具有较好的可溶性，不容易形成包 涵体，具有更好的生物学功能。比如，Genetics公司发展了硫氧还蛋白TrxA 融合表达系统，将细胞因子与TrxA融合后，经诱导均可获得高效表达，且大 多以可溶形式存在。
在本发明的一个实施例中提供了一种表达可溶性昆虫抗菌肽CecropinD 基因的方法，该方法是利用硫氧还蛋白TrxA融合表达系统，融合蛋白表达量 高且均为可溶性，利于今后的工业化生产。
本发明的技术要点之三在于提供一种用Ecoli表达系统表达不同用途的 功能性昆虫抗菌肽Cec ropinD基因的方法。
由于抗菌肽本身对于宿主细胞的毒性，不能直接表达。可以通过融合表 达的策略，将抗菌肽基因与其它基因融合表达，然后通过化学的或物理的方 法，释放昆虫抗菌肽成熟肽片段，然后进行分离纯化得到与天然蛋白完全相 同的抗菌肽蛋白。在本发明的一个实施例中，提供了一种融合表达昆虫抗菌 肽CecropinD基因的方法，该方法是将抗菌肽的成熟肽基因上游加入肠激酶 切割位点，然后将融合基因克隆到pET32a表达载体(Invitrogen公司产品)并转 化到大肠杆菌BL21(DE3)(Invitrogen公司产品)中，然后通过IPTG诱导实现 了抗菌肽融合蛋白的高效表达。该融合蛋白主要用于医药、兽药和水产口服 或外用药。融合蛋白通过肠激酶切割释放出抗菌肽CecropinD成熟肽，该成 熟肽主要用于医药和兽药注射用药。一种基因工程家蚕抗菌肽的分离，其序 列为SEQ ID NO：1所示的核苷酸序列和SEQ ID NO：2所示的氨基酸序列。
为实现上述目的，本发明采用的技术方案如下：
一种制备基因工程菌株的步骤是：
A、家蚕脂肪体总RNA的提取：
取5-10条经大肠杆菌JM109诱导24h后的家蚕，用DEPC水(0.1％焦碳酸二 乙酯的水溶液)清洗干净后，切开腹腔，将脂肪提挤出收集后，在液氮中研 磨成粉末状，按照RNeasyR Kit的操作说明书提取脂肪体总RNA。提取的总 RNA经紫外分光光度计检测，其OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间，说明 总RNA无蛋白质污染。将提取出的总RNA溶于含0.5％SDS的经DEPC处理的 水中，取20ul进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，可见28S rRNA和18S rRNA的 清晰条带，表明RNA完整，无降解。
B、家蚕抗菌肽CecropinD全长基因的克隆：
按照Reverse Transcription System试剂盒说明书，以Oligo(dT)20为引物合 成cDNA第一链。将反应后的产物储存于-20℃以作为目的基因克隆的模板。
CD全长基因的扩增：
依据GenBank中已发表的家蚕抗菌肽CecropinD cDNA序列，综合分析后 设计PCR引物。上游引物P1：ATGAAATTCTCGAAAA TTTTCGTT，下游引物 P2：TCCTTGTCCGAGAGCTTTTGC。以cDNA第一链为模板，应用降落式PCR 的形式进行反应，其反应参数为：95℃预变性4min，94℃变性30sec，60-50 ℃退火30min，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性30sec，50℃退火30sec， .2℃延伸1 min，1O个循环，72℃再延伸1O min。分别取10 1PCR产物进行1 ％琼脂糖凝胶电泳，可见到一条190 bp左右的条带，与预期片段的大小相符， 回收PCR产物，并将其克隆到载体pUCm-T中，重组载体pUCm-T-CD转化 E.coli JMl09。
C、pET32a重组表达质粒的构建，转化E.coli BL21筛选阳性克隆子：
根据pET32a表达载体上的多克隆酶切位点和CD成熟肽基因序列设计合 成了三条PCR引物：
P3：GGCAACTTCTTCAAGGATCTT-3’(下 划线为EcoRI方框内为肠激酶切割位点)；
P4：5’-CTCGAGCTAGTTTTGTCCGAGAGTTG-3’(下划线为XhoI，黑体为 突变的碱基，编码为Asn天冬酰胺)；
P5：5’-CTCGAGCTAGTTTTGTCCGAGAGTTG-3’(下划线为XhoI)。
P3和P4用于构建成熟肽基因末端突变的重组质粒pET32a-CDm，P3和P5用于 构建成熟肽基因末端没有突变的重组质粒pET32a-CD。
以含CD全长基因的重组质粒pUCm-T-CD为模板，分别用引物P1+P2和 P1+P3进行PCR反应，得到两条大小约为120bp的单一特异条带，与预期大小 相符。PCR产物用PCR回收试剂盒纯化回收后分别与pGEM-T载体连接，连接 产物转化E.coliJMl09感受态细胞，经PCR和限制性酶切反应鉴定阳性重组子 后，20ul碱裂解法提取得到pGEM-T-CD和pGEM-T-CDm重组质粒。按照设计 好的酶切位点分别对pGEM-T-CD，pGEM-T-CDm和pET32a进行EcoRI和Xho I 双酶切。用胶回收试剂盒分别纯化回收相应的目的片断。将酶切得到CD和 CDm片断和载体连接，获得重组表达质粒pET32a-CD和pET32a-CDm，然后 转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，用EcoR I和xho 1分别双酶切鉴定阳性克 隆。然后得到工程菌株Ecoli BL21(pET32a-CDm)，该菌株已保藏，保藏单位：中 国典型培养物保藏中心，地址：中国．武汉．武汉大学，邮编：430072，保藏 日期：2006年11月21日，保藏编号：CCTCC No.M206129，分类命名： Escherichia.coliBL21/pET32a-CDm)。
在本发明的一个实施例中提供了一种通过提取家蚕脂肪体总RNA，然后 进行RT-PCR克隆家蚕抗菌肽CecropinD全长基因的方法，获得家蚕抗菌肽 CecropinD全长基因的方法包括但不仅限于：(1)亚克隆：以本发明所涉及 的基因片段为模板，或者以含有本发明所涉及的基因片段的重组质粒 pET32a-cDm为模板，或者以含有本发明所涉及的基因片段的基因工程菌株 E.coliBL21(pET32a-CDm)DNA为模板，通过常规分子生物学操作方法(如PCR)， 亚克隆得到相应基因片段CDm，这些片段可以包括全部的或者部分的本发明 所涉及基因序列，这些片段可在细菌、酵母、动植物细胞或其它真核、原核 生物中表达，得到蛋白质或多肽片段，这些蛋白质或多肽片段与本发明所涉 及的蛋白质有相同的生物学功能；(2)人工合成：根据本发明所涉及的氨 基酸或者核苷酸序列，可以通过化学合成的方法合成DNA片段，这些片段可 以包括全部的或者部分的本发明所涉及基因序列，可以克隆到相应的载体中 进行表达，表达的蛋白质或多肽与本发明所涉及的蛋白质有相同的生物学功 能。
本发明所涉及的基因片段可以进行修饰，比如突变基因的某些核苷酸序 列，但并不影响其编码的蛋白质氨基酸序列；可以增加、缺失本发明所涉及 的氨基酸或者核苷酸序列，这些修饰不会影响蛋白质的生物化学特性、高级 结构和蛋白质的生物学功能，比如：可以在蛋白质或多肽N-端或C-端加上分 泌信号肽，还可以加上适当的接头(如6个组氨酸)便于蛋白质提取、纯化。
家蚕抗菌肽CecropinD的基因工程表达、纯化
本发明所涉及的基因与载体连接后可以克隆到相应的宿主中，以便于基 因的保存、扩增和表达。应用于本发明的克隆载体包括但不仅限于下列载体： pBR322、pBR325、pACYC177、pUC8、pUC9、pUC18、pUC19、pLG339、 pR290、pKC37、pKC101、SV40、pBluescript II SK+/-、pQE、pGEM-T、 pET系列载体。载体特征及克隆方法可参见冷泉港实验室编写的《分子克隆 实验手册》。应用于本发明的宿主-载体系统包括但不仅限于下列系统：细 菌-噬菌体系统，细菌-质粒载体系统，酵母-酵母载体系统，哺乳动物- 病毒系统(牛痘病毒、腺病毒等)，昆虫细胞-杆状病毒系统。
在本发明的一个实施例中提供了一种利用pET32a表达载体在大肠杆菌 BL21(DE3)中高效表达家蚕抗菌肽CecropinD基因的方法。利用该载体表达的 基因工程蛋白为融合蛋白，含有家蚕抗菌肽CecropinD氨基酸序列、肠激酶 识别位点以及6个连续的His标签，得到的融合蛋白通过Ni2+柱亲和层析法纯 化，然后用肠激酶进行酶切获得具有生物活性的抗菌肽CecropinD成熟肽。 该融合蛋白可以通过Ni2+柱亲和层析法纯化，然后用肠激酶进行酶切，可以 获得与天然蛋白序列完全一致的抗菌肽CecropinD成熟肽。大肠杆菌表达系 统缺乏C末端酰胺转移酶，而抗菌肽必须经过C末端酰胺化修饰才具有活性， 在本发明的一个实施例中，提供了一种通过PCR的方法进行修饰，在家蚕抗 菌肽CecropinD成熟肽基因的末端添加了一个天冬酰胺，以保证表达后蛋白 末端的酰胺化并具有生物功能。
可用于基因工程抗菌肽CecropinD分离、纯化的方法包括但不仅限于下列 方法：Ni柱层析法、离子交换层析法、亲和层析法、凝胶过滤层析法、电泳 回收法、超滤法、硫酸铵沉淀法等。
在本发明的实施例中提供一种分离、纯化基因工程抗菌肽CecropinD蛋白 的方法。首先是Ni柱层析纯化，基因工程抗菌肽CecropinD蛋白有6个连续的 组氨酸残基，它们能与Ni2+结合使基因工程蛋白结合在固定的金属离子柱 上，而其它杂蛋白不能与金属离子柱结合被直接洗脱下来，最后用适当的洗 脱液将目的蛋白质洗脱下来从而达到蛋白纯化的目的。Ni柱层析纯化产物加 入高度纯化的牛内肠激酶或重组的内肠激酶，进行降解反应，可切去融合蛋 白中的非天然氨基酸残基，得到与天然蛋白氨基酸组成完全相同的基因工程 蛋白。
基因工程家蚕抗菌肽融合蛋白TrxA-CDm的生物活性测定
将经过透析处理的纯化TrxA-CDm作为待测液，以大肠杆菌JM 109和金黄 色葡萄球菌作为实验菌种，测定TrxA-CDm的抗菌活性。分别挑取大肠杆菌 和金黄色葡萄球菌单菌落接种于20ml LB液体培养基中，37℃，250rpm过夜 培养。次日将培养的菌液稀释1000倍后，以1ml/200ml比例均匀涂布于LB琼 脂平板上，待稍微干燥后贴上无菌药敏纸片，将待测样品TrxA-CDm(15μl)、 10mM PBS(15μl)和氨苄青霉素Amp(20mg/ml，5μl)分别加到纸片上。 37℃孵育12h后观察抑菌圈(附图5)。
基因工程家蚕抗菌肽CecropinD的生物活性测定
(1)抑菌圈形成实验：
将金黄葡萄球菌(Staphylococcus aureus)，枯草芽孢杆菌(Bacillussubtilis) 及大肠杆菌(E.coli)JM109分别均匀涂布于LB琼脂平板上，将灭菌过的纸 垫片贴在琼脂平板上。取纯化的等摩尔量(0.2nmol)的融合蛋白TrxA-CD，重 组成熟肽CD及末端突变的CDm，分别以elution buffer溶液和含等摩尔量氨苄 青霉溶液为阴性和阳性对照，做抑菌圈实验。分别加样于各个纸垫片，标记 后放入37℃培养箱培养16h后，观测平板生长情况，以确定蛋白是否具有抑 菌活性。
(2)重组成熟肽CDm最小抑菌浓度MIC的测定
通过CFU(菌落形成单位)法测定最小抑菌浓度，取已定量的浓缩重组蛋 白(约300μg/ml)的溶液，分别取原浓度和2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀释 样各20μl，无菌水为阴性对照，与定量的菌体(105CFU/ml)LB培养基等体 积混合，室温(20-25℃)下作用12h后，将混合液均匀涂LB琼脂培养平板， 培养12h后观察菌落形成单位数，不形成菌落的平板即说明蛋白浓度已经达 到抑制浓度，多次重复确定其最小抑制浓度。
在本发明的一个实施例中，还提供了一种证明基因工程家蚕抗菌肽 CeeropinD对家蚕病毒感染的拮抗作用。
本发明与现有技术相比，具有以下优点和效果：本发明所涉及的基因工 程蛋白在新型医药、兽药、水产养殖的研发领域中具有广泛的用途，可用作 为一种抗生素的替代品，具有广阔的市场前景。此外，该蛋白还可以用于家 蚕病毒病的生物防治。
下面结合附图及实施例子对本发明作进一步说明，但并不作为对本发明 权利范围的限制。

图1为一种pET32a-CDm PCR和酶切鉴定图
泳道1     Maker III
泳道2     pET32a-CDm/EcoR I+XhoI
泳道3     末端突变的成熟肽CD的PCR扩增
泳道4     CD全长肽的PCR扩增
泳道5     Marker DL2000
图2为一种抗菌肽融合蛋白Trx-CDm表达的SDS-PAGE检测图
泳道1  经IPTG诱导4h后的阳性菌破碎后的沉淀；
泳道2  经IPTG诱导4h后的阳性菌破碎后的上清；
泳道3  pET32a-CDm未诱导；
泳道4  pET32a-CDm经IPTG诱导4hours；
泳道5  pET32a空载体经IPTG诱导4hours；
泳道6  protein marker
图3为一种抗菌肽融合蛋白TrxA-CDm的镍柱纯化结果图
泳道1        蛋白marker
泳道2-6      Ni柱纯化分步洗脱收集到的样品
图4为一种重组成熟肽CDm酶切及分离纯化的SDS-PA GE检测图
泳道1      纯化的融合蛋白TrxA-CDm
泳道2T     rxA-CDm酶切图
泳道3      纯化的成熟肽C Dm
泳道4      蛋白marker
图5为一种TrxA-CDm的抑菌圈测活结果图
A TrxA-CDm对于金黄色葡萄球菌的抑菌圈测活结果
1：TrxA-CDm
2：氨苄青霉溶液
B TrxA-CDm对于大肠杆菌的抑菌圈测活结果
1：TrxA-CDm
2：PBS
3：氨苄青霉溶液
图6为一种成熟肽CDm的抑菌圈测活结果图
A 成熟肽CDm对于大肠杆菌JM109的抑菌圈测活结果
2，CDm
3，氨苄青霉溶液
4，elution buffer溶液
B 成熟肽CDm对于金黄葡萄球菌的抑菌圈测活结果
1，氨苄青霉溶液
2，elution buffer溶液
3，CDm
C 成熟肽CDm对于枯草芽孢杆菌的抑菌圈测活结果
1，CDm
2，elution buffer溶液
3，氨苄青霉溶液
图7为一种感染BmNPV后各组家蚕的累计死亡率曲线图
1，组I，   直接投喂病毒；
2，组II，  Trx-CDm和病毒混合作用后再投喂；
3，组III， 为成熟肽CDm和病毒混合作用后投喂；
4，组IV，  先投喂病毒后12h后再投喂成熟肽CDm.

所有实施例中的培养基及分子生物学操作方法为该领域技术人员所熟 悉，可以参考Sambrook等“分子克隆“(实验室手册，冷泉港，1989)及“精 编分子生物学实验指南”(美/F.奥斯伯等著，颜子颖等译，北京，科学出版 社，1998)。
实施例1：家蚕抗菌肽CecropinD全长基因的克隆
(1)家蚕脂肪体总RNA的提取：
取5-10条经大肠杆菌J M109诱导24h后的家蚕，用DEPC水(0.1％焦碳酸二 乙酯的水溶液)清洗干净后，切开腹腔，将脂肪提挤出收集后，在液氮中研 磨成粉末状，按照RNeasyR Kit的操作说明书提取脂肪体总RNA。提取的总 RNA经紫外分光光度计检测，其OD260/OD280的比值在1.8-2.0之间，说明 总RNA无蛋白质污染。将提取出的总RNA溶于含0.5％SDS的经DEPC处理的 水中，取20ul进行甲醛变性琼脂糖凝胶电泳，可见28S rRNA和18S rRNA的 清晰条带，表明RNA完整，无降解。
(2)合成CecropinD cDNA的第一条链：
按照Reverse Transc ription System试剂盒说明书，以Oligo(dT)20为引物合 成cDNA第一链。将反应后的产物储存于-20℃以作为目的基因克隆的模板。
(3)CD全长基因的扩增：
依据GenBank中已发表的家蚕抗菌肽CecropinD cDNA序列，综合分析后 设计PCR引物。上游引物P 1：A TGAAATTCTCGAAAATTTTCGTT，下游引物 P2：TCCTTGTCCGAGAGCTTTTGC。以cDNA第一链为模板，应用降落式PCR 的形式进行反应，其反应参数为：95℃预变性4min，94℃变性30sec，60-50 ℃退火30mi n，72℃延伸1min，20个循环；94℃变性30sec，50℃退火30sec， 72℃延伸1min，10个循环，72℃再延伸10min。分别取10μl PCR产物进行1 ％琼脂糖凝胶电泳，可见到一条190bp左右的条带，与预期片段的大小相符， 同收PC R产物，并将其克隆到载体pUCm-T中，重组载体pUCm-T-CD转化 E.coli JM109，便于基因的保藏和扩增。
(4)家蚕抗茵肽cDNA的序列分析：
将扩增获得的家蚕抗茵肽cDNA进行序列测定，将测得到的序列在 Genbank上利用相关工具Blast等进行序列分析。结果表明，所克隆的基因与 Genbank上登录的家蚕抗菌肽CecropinD(ACCESSION：Ab010825)完全一 致，编码片断长度为186bp，共编码62个氨基酸。这说明不同种属家蚕间的 抗菌肽基因在进化过程中保守性很高。
实施例2：家蚕抗菌肽CecropinD成熟肽基因在E.coli中的表达、纯化
(1)重组表达质粒的构建
根据pET32a表达载体上的多克隆酶切位点和CD成熟肽基因序列设计合 成了三条PCR引物：P3：GAATTCIGACGACGACGACAAAAC TTCTTCAAGGATCTT(含有EcoRI位点和肠激酶切割位点)；P4： CTCGAGCTAGTTTTGTCCGAGAGCTTTTG(部分碱基突变，增加一个天冬 酰胺密码子)；P5：CTCGAGCTAGTTTTGTCCGAGAGGGCTTG(含有XhoI位 点)。P1和P2用于构建成熟肽基因末端突变的重组质粒pET32a-CDm，P1和P3 用于构建成熟肽基因末端没有突变的重组质粒pET32a-CD。
以含CD全长基因的重组质粒pUCm-T-CD为模板，分别用引物P1+P2和 P1+P3进行PCR反应，得到两条大小约为120bp的单一特异条带，与预期大小 相符。PCR产物用PCR回收试剂盒纯化同收后分别与pGEM-T载体连接，连接 产物转化E.coli JM109感受态细胞，经PCR和限制性酶切反应鉴定阳性重组子 后，小量碱裂解法提取得到pGEM-T-CD和pGEM-T-CDm重组质粒。按照设计 好的酶切位点分别对pGEM-T-CD，pGEM-T-CDm和pET32a进行EcoRI和Xho I 双酶切。用胶回收试剂盒分别纯化回收相应的目的片断。将酶切得到CD和 CDm片断和载体连接，获得重组表达质粒pET32a-CD和pET32a-CDm，然后 转化E.coli BL21(DE3)感受态细胞，用EcoR I和Xho 1分别双酶切鉴定阳性克 隆.其结果如附图1所示。
(2)抗菌肽融合蛋白的表达、粗提取：
将鉴定出的阳性重组子接入20ml LB培养基(Amp+)中，37℃下培养过夜， 第二天转接500μl至另一个20ml 2×YT培养基(每升含16g蛋白胨、10g酵母 粉、5g NaCl)(Amp+)中，培养至0D600大约为0.6时加入IPTG至终浓度为0.6 mM，诱导目的蛋白的表达。培养4h后离心收集菌体，向收集的菌体中加入 PBS重悬，反复冻融2次后，再用超声波破碎菌体(将待处理样品置于冰水混 合物中，连续处理3次，每次6×30sec)，待菌液变清亮，则表明绝大部分菌 体破裂。4000rpm，4℃离心菌液15-20min。离心后分别收集得到菌体残渣 和上清液，12000rpm，4℃继续离心上清液15min。收集两次离心所得上清 和沉淀，分别取20μl加入2×SDS-PAGE加样缓冲液，经沸水浴10min后，用 SDS-PAGE进行电泳检测，SDS-PAGE电泳分析结果表明目标蛋白以可溶形 式高效表达，大小约23kDa，与预期目标大小相符，如附图2所示。经过电脑 软件bandscan分析电泳图谱，测定表达量约占细胞总蛋白的30％。
实施例3：Ni2+柱亲和层析法纯化可溶性抗菌肽融合蛋白TrxA-CD和 TrxA-CDm
(1)样品的制备
重组菌pET32a-CD/BL21(DE3)和pET32a-CDm/BL21(DE3)在1L 2× YT培养基中按上述方法诱导表达TrxA-CD和TrxA-CDm后，以4000g，4℃离 心30min收集菌体，用100ml的Binding buffer(8×Binding Buffer：40mM 咪唑，4M NaCl，160mM Tris-HCl)重悬菌体。样品反复冻溶后置于冰上， 超声波破碎细菌细胞(10×30sec)后，以12,000g，4℃离心15min分别收集 上清和沉淀。上清用0.45μm滤膜过滤，作为非变性状态下的Ni2+柱亲和层 析的样品。
(2)层析过程
1)用10倍柱床体积(CV)的无菌水清洗装有His-bind填料的玻璃柱柱床后， 再用10CV的1×Charge Buffer(8×Charge Buffer：400mM NiSO4)使填料 与Ni2+充分结合，再用10CV的1×Binding Buffer平衡填料，准备层析待纯化 的样品。
2)待纯化样品借助蠕动泵以一定的流速(1ml/5min)缓慢流过平衡好的 亲和层析柱中，使带有His6标签的样品充分与填料上的Ni2+结合，连续两次 流过柱床后，收集与Ni2+反应后的样品(即穿漏液)。
3)用20CV的1×Binding Buffer冲洗柱床，以冲洗留在层析柱内的少量未 与填料上Ni2+的结合的蛋白。
4)用含有10mM咪唑的washing buffe r继续冲洗柱床，以洗脱与填料上的 Ni2+非特异性结合且结合能力弱的蛋白(洗脱液体积与浓度视总蛋白含量及 非目的蛋白与填料上Ni2+的结合能力灵活变化)。
5)用1×Elution Buffer(4×Elution Buffer：4M咪唑，2M NaCl，80mM Tris-HCl)洗脱结合在填料上的目的蛋白，以1ml为单位分部收集洗脱液。
6)用分离胶浓度为12％SDS-PAGE电泳分析分部收集的每一管洗脱液，以 确融合蛋白在洗脱液中的分布。
7)继续用1×Elution Buffer冲洗柱床，以洗掉柱床中的全部剩余蛋白，然 后再用1×Strip Buffer(4×Strip Buffer：400mM EDTA，2M NaCl，80mM Tris-HCl)洗去柱子中与填料结合的Ni2+离子。
融合蛋白在非变性状态下的Ni柱亲和层析后，洗脱样品用SDS-PAGE电 泳分析，其结果均如附图3所示，显示有一条约为23kDa的条带，其大小与理 论值相符，表明利用亲和层析可以使目的蛋白得到有效的纯化。
(3)融合蛋白的酶切与重组抗菌肽的纯化
融合蛋白经肠激酶16℃切割16h后释放为TrxA(18kDa)和CD(5kDa)。酶切 后的反应液经以下步骤分离得到重组抗菌肽的成熟肽纯品(5kDa)：
a)反应液转移至超滤管(孔径为10kDa)，离心(4000g，4℃，10min)， 收集离心管透过液。
b)将(a)中收集的液体转移到另外的超滤管(孔径为3kDa)，离心(4000g， 4℃，10min)，弃透过液。用PB S(pH7.4)重新洗脱超滤管(孔径为3kDa) 膜，轻轻用移液器吹悬，收集悬液。
c)2次重复以上(a)(b)步骤后，将悬液用超滤管(孔径为3kDa)再次离 心(4000g，4℃，10min)，以提高目标蛋白浓度
d)18％SDS-PAGE检测显示5kDa有单一特异性蛋白条带，表明重组成熟 肽CDm得到有效的纯化，如附图4所示。
实施例4：基因工程家蚕抗菌肽融合蛋白TrxA-CDm的生物活性测定
实验菌种包括：大肠杆菌(Escherichiacoli)JM 109株、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcusaureus)ATCC 25923株。
将经过透析处理的纯化TrxA-CDm作为待测液，以大肠杆菌JM109和金黄 色葡萄球菌作为实验菌种，测定TrxA-CDm的抗菌活性。分别挑取大肠杆菌 和金黄色葡萄球菌单菌落接种于20ml LB液体培养基中，37℃，250rpm过夜 培养。次日将培养的菌液稀释1000倍后，以1ml/200ml比例均匀涂布于LB琼 脂平板上，待稍微干燥后贴上无菌药敏纸片，将待测样品TrxA-CDm(15μl)、 10mM PBS(15μl)和氨苄青霉素Amp(20mg/ml，5μl)分别加到纸片上。 37℃孵育12h后观察抑菌圈，试验结果见附图5。结果显示，家蚕抗菌肽 TrxA-CDm对大肠杆菌和对Amp不敏感的金黄色葡萄球菌均有明显的抗菌活 性。
实施例5：基因工程家蚕抗菌肽CeeropinD的生物活性测定
(1)抑菌圈形成实验
实验菌种包括：大肠杆菌(Escherichia coli)JM109株、金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus)ATCC 25923株、枯草芽孢杆菌(Bacillus megaterium) ATCC6633株。
将金黄葡萄球菌，枯草芽孢杆菌及大肠杆菌JM109分别均匀涂布于LB琼 脂平板上，将灭菌过的纸垫片贴在琼脂平板上。取纯化的等摩尔量(0.2nmol) 的融合蛋白TrxA-CD，重组成熟肽CD及末端突变的CDm，分别以elution buffer溶液和含等摩尔量氨苄青霉溶液为阴性和阳性对照，做抑菌圈实验。 分别加样于各个纸垫片，标记后放入37℃培养箱培养16h后，观测平板生长 情况，以确定蛋白是否具有抑菌活性。实验结果见表1和附图6)表明，重组 成熟肽CDm对于革兰氏阳性菌金黄葡萄球菌和枯草芽孢杆菌及革兰氏阴性 菌大肠杆菌都有明显的抑制作用。
表1抑菌圈形成实验结果

+表示形成抑菌圈   -表示没有形成抑菌圈
以上实验结果皆为重复三次所得。
(2)重组成熟肽CDm最小抑菌浓度MIC的测定
通过CFU(菌落形成单位)法测定最小抑菌浓度，取已定量的浓缩重组蛋 白(约300μg/ml)的溶液，分别取原浓度和2倍、4倍、8倍、16倍、32倍稀释 样各20μl，无菌水为阴性对照，与定量的菌体(105CFU/ml)LB培养基等体 积混合，室温下作用12h后，将混合液均匀涂LB琼脂培养平板，培养12h后 观察菌落形成单位数，不形成菌落的平板即说明蛋白浓度已经达到抑制浓 度，经3次重复确定其最小抑制浓度。实验结果表明(表2)，重组蛋白(CDm) 对革兰氏阴性和革兰氏阳性细菌都有抑菌活性。
表2重组成熟肽CDm最小抑菌浓度MIC值
  Minimal inhibitory   concentration(μg/m l)   Gram-negative bacterial   E.coilJM109   65   Gram-negative bacterial   Staphylococcus aureus   70   Bacillus subtilis   80
实施例6：基因工程家蚕抗菌肽CeeropinD成熟肽对BmNPV感染家蚕的 抑制作用
如附图7所示，在25℃室温条件下养殖结果显示：组I，直接投喂病毒15d 后累积死亡率为98％。组II，Trx-CDm和病毒混合作用后投喂15d后的累积死 亡率为96％，与阳性对照没有明显的区别。组III，成熟肽CDm和病毒混合作 用后投喂15d累积死亡率为48％，有明显的降低病毒感染作用。组IV，先投 喂病毒后12h后再投喂成熟肽CDm 15d后累积死亡率为92％，无显著的降低 病毒感染作用。
序列表(SEQUENCE LISTING)
<110>武汉大学
<120>基因工程家蚕抗菌肽及制备方法和应用
<130>家蚕抗菌肽Cecropion D核苷酸序列
<160>2
<170>PatentIn version 3.1
<210>1
<211>108
<212>DNA
<213>Bombyx mori
<220>
<221>CDS
<222>(1)..(108)
<223>
<400>1
ggc aac ttc ttc aag gat ctt gaa aaa atg ggt cag agg gtt cga gac    48
Gly Asn Phe Phe Lys Asp Leu Glu Lys Met Gly Gln Arg Val Arg Asp
1               5                   10                  15
gcc gtc atc agc gcg gct cca gca gtc gac acc ctg gca aaa gca aaa    96
Ala Val Ile Ser Ala Ala Pro Ala Val Asp Thr Leu Ala Lys Ala Lys
            20                   25                  30
gct ctc gga caa                                                    108
Ala Leu Gly Gln
        35
<210> 2
<211> 36
<212> PRT
<213> Bombyx mori
<400> 2
Gly Asn Phe Phe Lys Asp Leu Glu Lys Met Gly Gln Arg Val Arg Asp
1               5                   10                  15
Ala Val Ile Ser Ala Ala Pro Ala Val Asp Thr Leu Ala Lys Ala Lys
            20                  25                   30
Ala Leu Gly Gln
         35