蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法
阅读：398发布：2020-05-13
专利汇可以提供蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于蜂房 蜜蜂 球菌检测技术领域，公开了一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan 荧光 定量PCR检测方法，根据M.pluton 16S rRNA基因序列设计了特异性引物和探针，建立蜜蜂欧洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，从标准品浓度1.0×108拷贝/μL～1.0×102拷贝/μL呈良好的线性关系，扩增效率可达0.999；与P.larvae、N.apis、A.apis等蜜蜂常见疫病病原无交叉反应；敏感性试验结果显示，可检出最低1.0×10拷贝/μL的目的基因，与普通PCR相比，灵敏度提高了1000倍；批内、批间实验表明有着较好的重复性；样品检测结果表明该方法具有广泛的适用性。，下面是蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法专利的具体信息内容。
1.一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：
步骤一，将M.pluton基因组DNA进行普通PCR扩增，获得大小为157bp的目的片段，PCR产物经回收、克隆、转化、普通PCR和测序鉴定后作同源性比对，与GenBank中登录序列同源性达到100％；将构建的pXT-16S重组质粒标准品用微量紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm＝
1.92，计算其浓度为1.0×108拷贝/μL；
步骤二，应用矩阵法对荧光定量PCR的引物、探针浓度和退火温度进行优化后的反应参数为：10×PCRbuffer 2.5μL，MgCl21.5μL，dNTPs2μL，上下游引物各1μL，特异性探针0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH2O至25μL；优化后的反应条件为：92℃3min；
92℃10s、60℃30s，40个循环，60℃时收集荧光信号。
2.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述F/R上下游引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
3.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述探针的序列为SEQ ID NO：3。
4.如权利要求1所述的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法具体包括以下步骤：
DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；
对照设置：蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；
PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCRbuffer 2.5μL，MgCl21.5μL，dNTPs 2.0μL，上下游引物各1.0μL，特异性探针0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 1.0μL，加灭菌ddH2O
15.0μL，使反应总体积为25.0μL；
PCR反应程序：92℃预变性3min；92℃变性10s、60℃退火延伸30s，共40个循环，在60℃时收集荧光信号；
结果判定：阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤36，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无Ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值≤36，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值>36的样品重复检测，重复检测结果无Ct值表示样品中无蜂房蜜蜂球菌，重复检测结果有Ct值表示样品中存在蜂房蜜蜂球菌。
蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于蜂房蜜蜂球菌检测技术领域，尤其涉及一种蜂房蜜蜂球菌 TaqMan荧光定量PCR检测方法。
背景技术
[0002] 欧洲幼虫腐臭病(European foulbrood，EFB)是由蜂房蜜蜂球菌 (Melissococcus pluton，M.pluton)引起的蜜蜂幼虫死亡的一种细菌性传染病，在蜂群迅速生长时多发，最常见的症状是蜜蜂幼虫在巢房封盖前不久死亡。M.pluton对外界不良环境的抵抗力强，能在蜂尸上存活数年，在蜂蜜里也能保持长久的毒性，在蜂群间能通过患病蜂带入传播，可引起蜂群的毁灭。但引起蜜蜂幼虫死亡也有其它疾病和原因，仅依靠临床症状诊断EFB并不可靠。目前，在实验室诊断技术方面，已有细菌涂片镜检法、扫描电子显微镜法、分离培养法、蜂巢污迹染色法、凝集试验法、酶联免疫吸附试验法和DNA杂交试验法等，上述诊断方法全部是基于病原分离培养鉴定基础之上的，由于蜂房蜜蜂球菌对培养条件要求极其苛刻，且存在与其它许多次生菌的竞争，分离培养困难，上述诊断方法很难对欧洲幼虫腐臭病做出准确诊断和推广应用。由于PCR技术在病原体检测方面的独特优势，国外许多研究者根据蜂房蜜蜂球菌16Sr RNA基因设计不同引物或探针，建立了多种PCR方法。我国虽在蜜蜂疫病防控方面开展了大量工作，但与其它家畜疫病防控相比，还存在技术落后的现状，所以国内还未见有EFB病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法的报道。
[0003] 综上所述，现有技术存在的问题是：
[0004] 1、现有的EFB实验室诊断方法全部是基于病原分离培养鉴定基础之上的，但蜂房蜜蜂球菌对培养条件要求极其苛刻，分离培养困难，对该病很难做出准确诊断，诊断方法也很难推广应用。
[0005] 2、国外在EFB的实验室诊断方面建立了多种PCR方法，但我国缺少具有自主知识产权的快速、准确、高通量、易于推广的PCR方法，不利于我国蜜蜂疫病的防控。
[0006] 3、目前，已建立的EFB普通PCR只能对终产物进行分析，无法对起始模版准确定量和对扩增反应实时监测，必须在扩增反应结束后借助电泳方法分析，流程较复杂，且在实验室内使用EB等有毒物质。而荧光定量PCR试验过程全封闭，仪器自动分析和获取试验结果，无后续试验操作，可对起始模版准确定量和扩增反应实时监测，且荧光定量PCR的特异性、灵敏度、自控化程度等均高于普通PCR。
发明内容
[0007] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。
[0008] 本发明是这样实现的，一种蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：
[0009] 步骤一，将M.pluton基因组DNA进行普通PCR扩增，获得大小为157bp的目的片段，PCR产物经回收、克隆、转化、普通PCR和测序鉴定后作同源性比对，与GenBank中登录序列同源性达到100％；将构建的pXT-16S重组质粒标准品用微量紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm＝1.92，计算其浓度为1.0×108拷贝/μL；
[0010] 步骤二，应用矩阵法对荧光定量PCR的引物、探针浓度和退火温度进行优化后的反应参数为(25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol)1.5μL， dNTPs(2.5mmol)2μL，上下游引物(10μmol)各1μL，特异性探针(10μmol) 0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH2O至 25μL；优化后的反应条件为：92℃3min；92℃10s、60℃30s，40个循环， 60℃时收集荧光信号。
[0011] 进一步，所述F/R上下游引物的序列为SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
[0012] 进一步，所述探针的序列为SEQ ID NO：3。
[0013] 进一步，所述蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法具体包括以下步骤：DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；
[0014] 对照设置：蜂房蜜蜂球菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；
[0015] PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2(25 mmol)1.5μL，dNTPs(2.5mmol)2.0μL，上下游引物(10μmol)各1.0μL，特异性探针(10μmol)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 1.0 μL，加灭菌ddH2O 15.0μL，使反应总体积为25.0μL；
[0017] 结果判定：阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct 值应≤36，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无Ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值≤36，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值>36的样品重复检测，重复检测结果无Ct值表示样品中无蜂房蜜蜂球菌，重复检测结果有Ct值表示样品中存在蜂房蜜蜂球菌。
[0018] 本发明的优点及积极效果为：建立了一种快速、灵敏的检测蜜蜂欧洲幼虫腐臭病(EFB)病原菌方法，根据蜂房蜜蜂球菌(M.pluton)16S rRNA基因序列，设计并合成特异性引物和TaqMam探针，经反应参数优化，建立了检测M.pluton TaqMan荧光定量PCR方法。本发明与其它蜜蜂常见病病原均无交叉反应；方法的灵敏度为1.0×10拷贝/μL的阳性质粒，比普通PCR灵敏1000倍；重复性试验表明该方法的批内和批间变异系数均小于1％。应用本发明的方法对 100份实验室模拟样品和150份临床样品进行了检测，与预期结果一致。本发明建立的方法可为蜂及蜂产品中M.pluton的检验检疫提供新的、有效的技术手段。附图说明
[0019] 图1是本发明实施例提供的阳性模板的扩增示意图；
[0020] 图中：M：DL2000DNA Marker；1：PCR product；2：Negative control。
[0021] 图2是本发明实施例提供的荧光定量PCR扩增曲线和标准曲线示意图；
[0022] 图中：1-7：pXT-16S recombinant plasmid diluted from 1.0×108copies/μL～ 1.0×102copies/μL；8：Negative control。
[0023] 图3是本发明实施例提供的荧光定量PCR特异性试验扩增曲线示意图；
[0024] 图中：1：M.pluton；2：P.larvae；3：N.apis；4：A.apis；5：Negative；6： Blank contrast。
[0025] 图4是本发明实施例提供的荧光定量PCR(A)与普通PCR(B)敏感性试验示意图；
[0026] 图中：1-9：1.0×108copies to 1.0×100copies；10：Negative control；M： DL2000DNA Marker。
具体实施方式
[0027] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0028] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0029] 如图1所示，本发明实施例提供的蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：
[0030] 步骤一，将M.pluton基因组DNA进行普通PCR扩增，获得大小为157bp的目的片段，PCR产物经回收、克隆、转化、普通PCR和测序鉴定后作同源性比对，与GenBank中登录序列同源性达到100％；将构建的pXT-16S重组质粒标准品用微量紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm＝1.92，计算其浓度为1.0×108拷贝/μL；
[0031] 步骤二，应用矩阵法对荧光定量PCR的引物、探针浓度和退火温度进行优化后的反应参数为(25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol)1.5μL， dNTPs(2.5mmol)2μL，上下游引物(10μmol)各1μL，特异性探针(10μmol) 0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH2O至 25μL；优化后的反应条件为：92℃3min；92℃10s、60℃30s，40个循环， 60℃时收集荧光信号。
[0032] 下面结合试验对本发明的应用原理作进一步的描述。
[0033] 1材料与方法
[0034] 1.1菌株及虫株
[0035] M.pluton购自美国典型培养物保藏中心，幼虫芽孢杆菌(P.larvae)购自北京北纳创联生物技术研究院，蜜蜂微孢子虫(N.apis)、蜜蜂子囊球菌(A.apis) 由伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心分离保存。
[0036] 1.2主要试剂
[0037] 基因组DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、 DL2000DNA Marker、pXT19-T Vector、胶回收试剂盒、质粒提取试剂盒等购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0038] 1.3引物和探针的设计与合成
[0039] 根据GenBank登录的M.pluton 16S rRNA基因保守序列(X75752)，利用Primer Primier 5和Primer Express 3.0软件设计SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：12F/R上下游引物[0040] (5'-CCATCAGAAGGGGATAACACTTG-3'/5'-ATCGTTGCCTTGGTGAGC CT-3')和探针SEQ ID NO：3
[0041] (5'-FAM-CGCATGAAGAGGAGTTAAAAGGCGC-BHQ1-3')，预期扩增目的片段长度约为157bp，由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。
[0042] 1.4细菌基因组提取及标准品制备
[0043] 采用基因组DNA抽提试剂盒提取M.pluton标准菌株DNA，应用1.3中设计与合成的特异性引物进行普通PCR扩增，将切胶纯化的PCR产物克隆至 pXT19-T Vector中，构建重组质粒pXT-16S，转化至E.coli DH5α感受态细胞中扩繁，提取质粒进行普通PCR和测序鉴定，测定质粒浓度和纯度，根据公式：拷贝数＝(质量/分子量)×6.0×1023计算其拷贝数，作为荧光定量PCR标准品。
[0044] 1.5反应体系和反应条件优化
[0045] 以pXT-16S标准品为模板，应用矩阵法对荧光定量PCR引物和探针浓度、退火、延伸温度和时间进行优化，以达到最佳反应体系和反应条件。
[0046] 1.6标准曲线的建立
[0047] 将已知浓度的pXT-16S标准品10倍梯度稀释作为模板，在最佳反应体系和条件下进行荧光定量PCR扩增，得出动力学曲线和生成标准曲线。
[0048] 1.7特异性试验
[0049] 用基因组DNA提取试剂盒提取M.pluton、P.larvae、N.apis、A.apis和健康蜜蜂幼虫的DNA为实验对象，同时设立无模板空白对照，利用优化的荧光定量 PCR方法分别进行检测，评价该方法的特异性。
[0050] 1.8敏感性试验
[0051] 分别取10倍系列稀释浓度(1.0×108拷贝/μL～1.0×100拷贝/μL)的pXT-16S 标准品作为模板，进行荧光定量PCR反应，确定最小检出量。同时进行普通PCR 反应，比较两种检测方法的敏感性。
[0052] 1.9重复性试验
[0053] 选取5个10倍系列稀释浓度梯度的pXT-16S标准品作为模板，进行荧光定量PCR反应，每个浓度做4个平行，重复3次，每次间隔4d，收集数据并进行统计分析，根据变异系数评价方法的可重复性。
[0054] 1.10样品检测
[0055] 将定量的不同稀释倍数的pXT-16S标准品掺入健康成蜂、幼虫、蜂蛹、蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉样品中制成100份实验室模拟样品；采自新疆的150份蜜蜂幼虫及蜂产品作为临床样品，利用建立的荧光定量PCR方法进行检测，同时和普通PCR方法进行比较。
[0056] 2结果
[0057] 2.1标准品的制备
[0058] 将M.pluton基因组DNA进行普通PCR扩增，获得大小约为157bp的目的片段 (图2)，PCR产物经回收、克隆、转化、普通PCR和测序鉴定后作同源性比对，与GenBank中登录序列同源性达到100％。将构建的pXT-16S重组质粒标准品用微量紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm＝1.92，计算其浓度为1.0×108拷贝/μL。
[0059] 2.2反应体系及反应条件的优化
[0060] 应用矩阵法对荧光定量PCR的引物、探针浓度和退火温度进行优化后的反应参数为(25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol)1.5μL，dNTPs(2.5 mmol)2μL，上下游引物(10μmol)各1μL，特异性探针(10μmol)0.5μL， Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH2O至25μL。优化后的反应条件为：92℃3min；92℃10s、60℃30s，40个循环，60℃时收集荧光信号。
[0061] 2.3标准曲线的建立
[0062] 将pXT-16S标准品以10倍系列梯度浓度稀释后进行荧光定量PCR反应，以已知标准品浓度的对数为横坐标，以反应循环的Ct值为纵坐标作图，得荧光定量 PCR反应标准曲线。标准品浓度1.0×108拷贝/μL～1.0×102拷贝/μL呈良好的线性关系：斜率为-3.50，截距为
38.00，扩增效率为0.999，标准曲线回归方程式： Ct＝-3.50×log CO+38.00(图3)，把待测样品的Ct值代入公式可计算出其初始拷贝数。
38.00，扩增效率为0.999，标准曲线回归方程式： Ct＝-3.50×log CO+38.00(图3)，把待测样品的Ct值代入公式可计算出其初始拷贝数。
[0063] 2.4特异性试验
[0064] 以M.pluton、P.larvae、N.apis、A.apis、健康蜜蜂幼虫DNA为模板，应用建立的荧光定量PCR进行扩增，只有M.pluton有特异性扩增曲线，其它病原、阴性对照和空白对照检测结果均为阴性(图4)，结果表明建立的方法具有良的特异性。
[0065] 2.5敏感性试验
[0066] 将pXT-16S标准品以10倍系列梯度浓度(1.0×108拷贝/μL～1.0×100拷贝/μL) 稀释后分别进行荧光定量PCR和普通PCR检测，结果显示浓度为1.0×10拷贝/μL 时荧光定量PCR依然有扩增曲线，而普通PCR最低检测浓度为1.0×104拷贝/μL，表明荧光定量PCR的敏感性比普通PCR提高约1000倍。
[0067] 2.6重复性试验
[0068] 对选取的5个浓度梯度的pXT-16S标准品进行4次批内和3次批间重复性试验，结果表明批内重复性试验CV≤0.35％，批间重复性试验CV≤0.51％(表1)，建立的方法具有较好的重复性。
[0069] 表1荧光定量PCR的重复性试验
[0070]
[0071] 2.7样本检测
[0072] 应用建立的荧光定量PCR和普通PCR方法，对100份实验室模拟样品和采自新疆的150份蜜蜂幼虫及蜂产品临床样品进行检测，结果显示实验室模拟样品荧光定量PCR和普通PCR共同检出49份阳性和30份阴性，两种检测方法的符合率为 79％，其中荧光定量PCR检测为阳性的70份(阳性率70％)样品中，仅有49份普通PCR检测为阳性(阳性率49％)，荧光定量PCR和普通PCR分别能检出加入 pXT-16S标准品浓度在1.0×10拷贝/μL和1.0×104拷贝/μL以上的实验室模拟样品，与预期结果相一致；临床样品两种方法检测结果全部为阴性，采集临床样品时虽优先选取具有临床症状的蜜蜂幼虫及该蜂群生产的蜂产品，但引起蜜蜂幼虫发病和死亡也有其它疾病和原因，仅依靠临床症状诊断EFB并不可靠。表明本发明建立的荧光定量PCR方法具有更高的敏感性，可用于多种样品的检测。
[0073] 目前，荧光定量PCR技术因具有重复性好、特异灵敏、定量准确、操作简单及对样品污染小和自动化程度高等优点，已在动物疫病诊断上已得到广泛应用和认同，但应用其检测蜜蜂疾病病原的报道还并不多见。本发明根据M.pluton 16S rRNA基因序列设计了特异性引物和探针，建立了蜜蜂欧洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，从标准品8 2
浓度1.0×10拷贝/μL～1.0×10 拷贝/μL呈良好的线性关系，扩增效率可达0.999；具有较好的特异性，与P.larvae、N.apis、A.apis等蜜蜂常见疫病病原无交叉反应；敏感性试验结果显示，可检出最低1.0×10拷贝/μL的目的基因，与普通PCR相比，灵敏度提高了1000倍；批内、批间实验表明有着较好的重复性；样品检测结果表明该方法具有广泛的适用性，检测成蜂、幼虫、蜂蛹、蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉等实验室模拟样品与预期结果一致。该方法的建立为蜂及蜂产品中M.pluton的检验检疫提供新的、有效的技术手段，对EFB防控具有重要意义。
浓度1.0×10拷贝/μL～1.0×10 拷贝/μL呈良好的线性关系，扩增效率可达0.999；具有较好的特异性，与P.larvae、N.apis、A.apis等蜜蜂常见疫病病原无交叉反应；敏感性试验结果显示，可检出最低1.0×10拷贝/μL的目的基因，与普通PCR相比，灵敏度提高了1000倍；批内、批间实验表明有着较好的重复性；样品检测结果表明该方法具有广泛的适用性，检测成蜂、幼虫、蜂蛹、蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉等实验室模拟样品与预期结果一致。该方法的建立为蜂及蜂产品中M.pluton的检验检疫提供新的、有效的技术手段，对EFB防控具有重要意义。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种中华蜂欧洲幼虫腐臭病的防治药物及其制备方法 | 2020-05-11 | 648 |
| 蜜蜂幼虫康复灵配制法 | 2020-05-21 | 827 |
| 蜜蜂欧洲幼虫腐臭病PCR快速检测方法 | 2020-05-22 | 150 |
| 一种基于箱外观察的中蜂饲养方法 | 2020-05-08 | 314 |
| 蜜蜂幼虫康复灵配制法 | 2020-05-26 | 396 |
| 预防和控制蜜蜂的病原感染的方法及相关组合物 | 2020-05-20 | 466 |
| 蜂房蜜蜂球菌TaqMan荧光定量PCR检测方法 | 2020-05-13 | 398 |
| 一种防止蜜蜂幼虫腐臭病的中草药制剂 | 2020-05-19 | 466 |
| 蜜蜂幼虫腐臭病病原双重TaqMan荧光定量PCR检测方法 | 2020-05-14 | 924 |
| 蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法 | 2020-05-17 | 736 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈