蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法
专利汇可以提供蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及蜂房 蜜蜂 球菌 荧光 定量PCR检测 试剂 盒 及其检测方法，专用于蜂房蜜蜂球菌的检测。该试剂盒包括：（1）阳性标准品；（2）阴性对照；（3）PCR反应液；（4）ExTaq酶；（5）无菌 水 。本发明具有以下优点：（1）良好的 稳定性 和特异性：对蜂房蜜蜂球菌的检测具有高度特异性，与其它蜜蜂病原菌无交叉反应，且重复性好；（2）灵敏度高：灵敏度能达到50拷贝/μL；（3）操作简便、快速：整个反应可在2小时内完成。本发明试剂盒可用于蜜蜂欧洲幼虫腐臭病的诊断及其蜂房蜜蜂球菌的检测，对该病的早期 预防 和及时 治疗 具有重要意义。，下面是蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法专利的具体信息内容。
1.一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：包括正向引物F、反向引物R及TaqMan探针P，各引物核苷酸序列如下：
正向引物F：5’-AACGCTTCTTCTGAT TAAG-3’，
反向引物R：5’-GCCTTTTAACTCCTCTTC-3’；
TaqMan探针P：5’-ACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAAT-3’，
探针的 5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和BHQ1进行修饰。
2.根据权利要求1所述的一种蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒，其特征在于：该试剂盒由下列试剂组成：
（1）阳性标准品：100 μL浓度为1×103拷贝/μL的阳性标准品1支，采用含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性标准品，-20℃保存；
（2）阴性对照：100 μL浓度为100 ng/μL的阴性对照1支，采用未感染蜂房蜜蜂球菌的健康蜜蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；
（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR 缓冲液625μL，浓度为
10 μmol/L的正向引物F和反向引物R各25 μL，浓度为5 μmol/L的TaqMan探针P 50 μL，浓度为10 mmol/L的dNTP 25μL，浓度为25 mmol/L的MgCl2 100μL，共计850 μL；-20 ℃保存；
（4）ExTaq酶：25 μL浓度为5 U/μL ExTaq酶1支，-20 ℃保存；
（5）无菌水：2 mL无菌水2支。
3.利用权利要求1或2所述的蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括以下步骤：
（1）PCR反应体系配置：在PCR管中加入PCR反应液17.0 μL，5 U/μL ExTaq酶0.5 μL，待测样品DNA 2.0 μL，然后加入灭菌水5.5μL，使反应总体积为25.0μL；
（2）PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；然后95 ℃变性5 s、59 ℃退火延伸30 s，共40个循环，在59 ℃进行单点荧光检测；
（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效；在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含蜂房蜜蜂球菌；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜂房蜜蜂球菌。
蜂房蜜蜂球菌荧光定量PCR检测试剂盒及其检测方法
技术领域
背景技术
发明内容
正向引物F：5’-AACGCTTCTTCTGAT TAAG-3’，
反向引物R：5’-GCCTTTTAACTCCTCTTC-3’；
TaqMan探针P：5’-ACGGTATTAGCACCTGTTTCCAAAT-3’，
探针的 5’端和3’端分别采用荧光基团FAM和BHQ1进行修饰。
（2）阴性对照：100 μL浓度为100 ng/μL的阴性对照1支，采用未感染蜂房蜜蜂球菌的健康蜜蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；
（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR 缓冲液625μL，浓度为
10 μmol/L的正向引物F和反向引物R各25 μL，浓度为5 μmol/L的TaqMan探针P 50 μL，浓度为10 mmol/L的dNTP 25μL，浓度为25 mmol/L的MgCl2 100μL，共计850 μL；-20 ℃保存；
（4）ExTaq酶：25 μL浓度为5 U/μL ExTaq酶1支，-20 ℃保存；
（5）无菌水：2 mL无菌水2支。
（2）PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；然后95 ℃变性5 s、59 ℃退火延伸30 s，共40个循环，在59 ℃进行单点荧光检测；
（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效；在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含蜂房蜜蜂球菌；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜂房蜜蜂球菌。
附图说明
具体实施方式
3’。该试剂盒包括下列试剂（50个反应体系）：
（1）阳性标准品：利用F和R引物扩增蜂房蜜蜂球菌基因组DNA，将产物克隆至pMD-18T载体，转化DH5α大肠杆菌，利用碱裂解法提取阳性克隆质粒，计算质粒纯度和浓度后，10倍梯度稀释至1000拷贝/μL作为阳性标准品，100 μL /支，-20 ℃保存；
（2）阴性对照：100 μL浓度为100 ng/μL的阴性对照1支，采用未感染蜂房蜜蜂球菌的健康蜜蜂组织提取的总DNA为阴性对照样品，-20℃保存；
（3）PCR反应液：50个反应体系的PCR反应液组成成分为：2×PCR 缓冲液625μL，浓度为
10 μmol/L的正向引物F和反向引物R各25 μL，浓度为5 μmol/L的TaqMan探针P 50 μL，浓度为10 mmol/L的dNTP 25μL，浓度为25 mmol/L的MgCl2 100μL，共计850 μL；-20 ℃保存；
（4）ExTaq酶：25 μL浓度为5 U/μL ExTaq酶1支，-20 ℃保存；
（5）无菌水：2 mL无菌水2支。
（1）PCR反应体系配置：在PCR管中加入PCR反应液17.0 μL，5 U/μL ExTaq酶0.5 μL，待测样品DNA 2.0 μL，然后加入灭菌水5.5μL，使反应总体积为25.0μL；
（2）PCR反应程序：95 ℃预变性3 min；然后95 ℃变性5 s、59 ℃退火延伸30 s，共40个循环，在59 ℃进行单点荧光检测；
（3）结果判定：阴性对照无Ct值且无扩增曲线，同时阳性对照Ct值≤35，并且出现典型的扩增曲线，说明实验为有效实验，否则实验无效。在实验有效的情况下，待测样品无Ct值且无扩增曲线，表示样品中不含蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值≤35，且出现典型的扩增曲线，表示样品中含有蜂房蜜蜂球菌；待测样品Ct值＞35，则对该样品重复检测：重复检测结果无Ct值则该样品不含蜂房蜜蜂球菌；重复检测结果有Ct值则该样品中含有蜂房蜜蜂球菌。
（1）标准品DNA稀释：将含有目的片段的阳性克隆质粒用无菌水10倍递增稀释成5×108拷贝/μL 5×101拷贝/μL的一系列DNA标准品。
~
线方程为Y= -3.309x+39.873，决定系数R为0.993，扩增效率为99.607%，检测灵敏度可达到50拷贝/μL，满足荧光PCR正常的标准曲线要求。
分别以蜂房蜜蜂球菌、蜜蜂幼虫芽孢杆菌、蜜蜂球囊菌、蜜蜂副伤寒杆菌和黄曲霉菌等
5种常见的蜜蜂病原菌为样品，按常规方法提取DNA后以实施例2的方法进行PCR反应和结果判定，由图4可知，仅蜂房蜜蜂球菌有产生典型的扩增曲线（Ct值为14.07），其他样品均无扩增曲线，说明本试剂盒具有较强的特异性。
利用本试剂盒对临床分离的7份感染蜂房蜜蜂球菌的蜜蜂阳性样品进行检测，按照CTAB方法提取各个样品总DNA后根据实施例2的方法进行检测。结果如图5所示，7份样品均为阳性，Ct值分别为21.89、23.91、27.52、27.71、28.15、28.31和28.45，阳性对照为15.97，阴性对照无Ct值，与预期结果相一致。
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