蜜蜂(蜜蜂属(Apis))，特别是意大利蜜蜂(Apis mellifera)和中华蜜蜂(Apis cerana)，长期以来被人们用作蜂 蜜的来源。意大利蜜蜂和中华蜜蜂储存有大量可利用的蜂蜜，而且可 以被诱导在可移动的容器(或“蜂房”)内筑巢。因此，这些种类的 蜜蜂在全球范围内已被开发利用了几千年，而且现在形成了大规模复 杂养蜂业的基础。在此处所用术语蜜蜂(或蜂)指的是真正蜜蜂属 (Apis)的蜜蜂，尤其是意大利蜜蜂和中华蜜蜂。
养蜂(养蜂业)因蜜蜂易患多种疾病这一事实而复杂化。这些疾 病包括那些由病毒、细菌、真菌、小孢子、原生动物、寄生螨虫、其 它昆虫和线虫引起的疾病。有两种细菌性疾病是全球性的，并引起养 蜂者和农业管理者的广泛关注：  它们是美洲蜜蜂幼虫腐臭病 (American foulbrood)和欧洲蜜蜂幼虫腐臭病(European foulbrood)(一般称作蜜蜂幼虫腐臭病)。
美洲蜜蜂幼虫腐臭病(AFB)是一种侵袭蜜蜂幼虫的疾病，几乎 总是在前蛹阶段杀死它们；幼虫变成褐色、腐烂，发出讨厌的鱼胶样 臭味。AFB是由产孢子的革兰氏阳性细菌幼虫类芽孢杆菌larvae亚种 (Paenibacillus larvae subsp.larvae)引起的。孢子可以在不 用的污染养蜂设备中休眠数十年，但一旦这些设备再次被利用或是被 来自于感染群体的访问蜂利用时则可引起疾病。细菌经口感染一窝幼 虫，并在孢子形成时释放出稳定的蛋白水解酶，导致幼虫死亡并最终 溶解成粘着胶体。
欧洲蜜蜂幼虫腐臭病(EFB)是由非产孢子的革兰氏阳性细菌冥 王星蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)引起的。该细菌导致EFB的 散在爆发，致使成窝幼虫死亡而不形成胶样胶体。
目前有几种处理AFB和EFB的方法可以利用，尽管每种方法都有其 内在的缺点。尽管激进但可能最为有效的处理方法是控制性地焚烧蜜 蜂群体和有关的设备。如果有其它方法可供选择的话，由于明显的经 济原因这种破坏性措施并非一个优选的处理方法。
把成年蜜蜂从感染疾病的群体中抖到新的蜂房上也经常被尝试， 但此方法既不可靠又费力。
另一种处理方法包括利用灭菌性化学物质例如福尔马林、氯和氧 化乙烯进行蜂房和其内容物的消毒。但是，这些化学物质的使用可能 导致蜂房内的蜂蜜和花粉对蜜蜂的持久毒性，或引起蜂房变脆。另 外，利用这些化学物质治疗AFB和EFB的效果是不稳定的。
另一种可供选择的治疗形式涉及使用抗生素治疗患病群体。引起 AFB的细菌可以通过氧四环素，商品名通常为土霉素的抗生素来控 制。但是在英国(UK)，根据1982年的《蜜蜂疾病规定》，确证的 AFB爆发必须通过焚烧处理，这一政策实施几十年来确保了英国的AFB 低发生率，但是在一些国家，例如美国和澳大利亚，广泛使用土霉素 进行预防性治疗与造成抗生素依赖性的该疾病的亚临床扩散有关，并 可能引起对四环素具有抗性的幼虫类芽孢杆菌larvae亚种的出现(这 将招致蜜蜂群体的灾难性崩溃)。另外，抗生素对感染蜂房和设备的 孢子无效，它的使用可能导致感染在群体间扩散，并因此提高对抗生 素规律施用的依赖性。
在英国，轻度EFB事件可用四环素进行处理，但是严重和重复爆 发则通过焚烧进行控制。由于存在出现抗性的危险和EFB的抑制可能 掩盖出现的低水平AFB感染以及因此产生的四环素依赖性这一可能 性，利用四环素进行预防和处理急性EFB事件是不可取的。
与使用四环素治疗AFB和EFB有关的另一个主要问题是结果在蜂蜜 中出现不想要的四环素残余物，这些残余物的出现违背了蜂蜜提倡者 试图给出的有利健康和卫生的形象。
因此，迫切需要开发一种针对普遍性蜜蜂疾病，尤其是美洲和欧 洲蜜蜂幼虫腐臭病的处理方法，该方法不仅避免了四环素使用的相关 问题而且避免了焚烧所伴随的破坏性经济浪费。
发明概述
现在已发现，某些微生物可以防止蜜蜂病原体感染，并根除患病 蜂群中已形成的感染。这些微生物可以产生一种或多种抗生素，或者 可以与蜜蜂病原体竞争，由此防止或根除感染。这类微生物中的一些 可以天然地在蜂房和蜜蜂中找到。
因此，第一次认识到蜜蜂疾病可以被方便、安全有效地进行生物 学控制，而避免了使用抗生素制品所带来的相关问题以及焚烧带来的 破坏性经济浪费。
因此，根据本发明，提供了一种用于治疗性处理或预防蜜蜂疾病 的组合物，该组合物包括接种物和养蜂业递送载体，该养蜂业递送载 体用于将该接种物传递到蜂房以便在其中建立一个治疗性和/或保护 性微生物区系。
另一方面，本发明涉及用于治疗性处理或预防蜜蜂疾病的方法， 包括给蜂房接种以在其中建立一个治疗性和/或保护性微生物区系。
术语接种物在本文中按其通常意义使用，以定义一种含有接种后 能建立微生物区系的微生物的制剂。因此，在本发明中，接种物包含 一种或多种活微生物，这些微生物具有足够的数量，并且处于一种代 谢/生理状态，以致于当它们被递送到蜂房或蜜蜂群体中后，能建立 一个微生物区系。
本文所用术语抗生素包括能够抑制一种或多种蜜蜂病原体(例如 通过抑制它们的生长)的致病活性的任何物质(例如细菌素或次级代 谢物)。
术语蜂房在本文中用以定义养蜂者用来盛放和处理蜜蜂群体和其 所产蜜的所有各种容器。因此，该术语在本文中尤其用来指盖子、盒 子、架子、蜂巢(蜜蜂在架子中建造的有序蜡基质)或任何其它蜂房 成分，包括单个的或集合的。
蜂房可以含有或不含蜜蜂群，例如，在本发明用于预防目的的情 况下，可能将接种物投入空的蜂房。在这样的实施方案中，接种物可 以处于休眠状态，直到通过定居蜜蜂的作用将其分散开来并促进其生 长：这样，保护性微生物区系与蜂群一起产生。或者，可以在无蜜蜂 定居的情况下，通过以任何适当技术(例如，提供适宜的营养和/或 基质)促进蜂房中接种微生物的生长来(至少部分地)形成该微生物 区系。因此，治疗性和/或保护性微生物区系在有或无定居蜜蜂群体 作用的情况下都可以建立。
任何适宜的养蜂用递送载体都可用于本发明，只要它适宜于将接 种物送至蜂房，以致(在有或无定居蜜蜂群体作用的情况下)最终能 在其中建立一个治疗性和/或保护性微生物区系。优选地，该递送载 体与巢居蜂群的觅食和摄食行为一起发挥作用，当(由递送介质携带 的)接种物被蜜蜂摄取，并接着通过随后的分泌(例如在幼虫的喂食 过程中通过下咽腺体)、排泄或释放扩散至整个蜂房和/或群体时， 接种物即获得传递。
接种物可以以单一剂量或间隔施用的几个较小剂量递送。依据递 送载体的不同，可以将接种物投入蜂房的任何成分中(例如，未使用 的蜂巢)或蜂群本身(例如：取一勺量蜜蜂，在远离蜂房处用接种物 喷洒它们，并随后将其放回蜂房)。
接种物的大小、合适的给药方案和递送载体的类型将尤其随着蜜 蜂群体的营养状况、待递送的微生物、处理方式(预防性或治疗性/ 治疗用)、蜜蜂群体的年龄、蜂房的大小和结构、地理、气候和季节 情况、待治疗或预防的疾病的性质和感染的严重程度而变化。本领域 技术人员能够容易地通过常规尝试法确定最佳参数。
已知有各种不同的在饲养越冬蜜蜂中用于递送已知抗生素的蜜蜂 养殖递送载体。根据本发明，优选养蜂用小糖块(patty)、糖浆、 浸液(drench)、撒粉(dusting)或糊状物(paste)。
术语养蜂用小糖块是一个本领域术语，用以定义各种主要由固态 糖构成的固态小块或饼状物。尤其优选用于本发明的是蔗糖小糖块或 含有蔗糖和脂肪(例如植物脂肪)混合物的混合小糖块。
用于本发明的糖浆优选由蔗糖和水构成。尤其优选50％W/V的蔗 糖溶液。
优选地，撒粉由糖粉构成。既可以将其直接施用于蜂巢，也可以 更为通常地将其施用(例如用风箱)于蜂房的所有内表面或直接应用 于蜂群。    
用于本发明的糊状物可以是花粉替代物。术语花粉替代物是一个 本领域术语，用以定义大量功能上和/或化学上模拟花粉的制剂中的 任一种(其被蜜蜂用作主要蛋白来源)。
本发明递送载体中使用的糖优选是蔗糖，但是也可以使用任何功 能上和/或化学上模拟花蜜(其被蜜蜂用作非蛋白类食物的主要来 源)的制剂。
本发明中使用的接种物包括一种或多种微生物。该微生物可以防 止蜜蜂病原体的感染，并根除患病蜂群中已形成的感染(例如：通过 产生一种或多种抗生素或通过与蜜蜂病原体竞争，来预防或根除感 染)。一些这种微生物可以天然地在蜂房或/和蜜蜂中找到。
在所述微生物产生针对一种或多种蜜蜂病原体的一种或多种抗生 素的情况中，优选地该抗生素具有抗冥王星蜜蜂球菌和/或幼虫类芽 孢杆菌larvae亚种的活性。优选抗生素具有对抗冥王星蜜蜂球菌和幼 虫类芽孢杆菌larvae亚种两者的活性。该抗生素可以是抑菌的或溶菌 的，但优选溶菌的。
尤其优选包括一种或多种微生物的接种物，其中所述微生物产生 在幼虫类芽孢杆菌pulvifaciens亚种(Paenibacillus larvae subsp.pulvifaciens)中发现的抗冥王星蜜蜂球菌和抗幼虫类芽孢 杆菌larvae亚种的抗生素，或其同系物。
本文所用术语同系物(应用于抗生素时)定义功能上或/和化学 上与幼虫类芽孢杆菌pulvifaciens亚种产生的参考抗生素相似，但 由不同来源的生物产生的抗生素。这些同系物(和产生它们的微生 物)可以通过参考抗生素的结构分析，或/和基于检测抗冥王星蜜蜂 球菌和/或幼虫类芽孢杆菌larvae亚种的活性的筛选程序来鉴定。
由本发明所用微生物产生的抗生素可以用包括尤其是抗如下微生 物的活性的活性谱来表征：大肠杆菌(Escherichia coli)，鼠伤寒 沙门氏菌(Salmonella typhimurium)，恶臭假单胞菌(Pseudomonas putida)，铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugenasa)，藤黄微球菌 (Micrococcus luteus)，蜡状芽孢杆菌(Bacillus cereus)，枯草芽 孢杆菌(Bacillus subtilis)，蜂房类芽孢杆菌(Paenibacillus alvei)，幼虫类芽孢杆菌larvae亚种，Paenibacillus apiarius，单 核细胞增生利斯特氏菌(Listeria monocytogenes)，金黄色葡萄球 菌(Staphylococcus aureus)，小肠结肠炎耶尔森氏菌(Yersinia enterocolinca)和冥王星蜜蜂球菌。
在优选的实施方案中，微生物包含细菌，尤其优选产生内生孢子 的产孢子细菌，在此情况下接种物优选包含细菌内生孢子(选择性地 联合营养细胞)。
当把细菌内生孢子用做接种物时，其优选的提供方式是洗涤的和 /或浓缩的孢子制剂。这种制剂可以通过大量已知微生物技术中的任 何一种来制备。典型的方法包括在液体培养基中使营养细胞生长至静 止期(以诱导孢子形成)，之后通过离心从耗尽的培养基中将其分离 出来。该实施方案利用了细菌内生孢子的高度抗性性质，这样产生的 组合物极为稳定，生产便宜并易于储存。
该细菌接种物优选包含类芽孢杆菌属(Paenibacillus)的种或其 亚种(见Heyndrickx等(1996)，Int.J.Syst.Bacteriol.46 (4)，988-1003)。
尤其优选幼虫类芽孢杆菌的亚种，例如，幼虫类芽孢杆菌 pulvifaciens亚种，或幼虫类芽孢杆菌larvae亚种的减毒或无毒菌 株。其它合适的细菌可以通过从自然分离物中筛选至今未分类的表现 出必需抗生素活性(但不具有致病性的)的类芽孢杆菌属分离物。
幼虫类芽孢杆菌pulvifaciens亚种产生有抗致病性细菌幼虫类 芽孢杆菌larvae亚种、蜂房类芽孢杆菌和冥王星蜜蜂球菌活性的抗生 素，因此该亚种(或其衍生物)可以用作预防和/或治疗性处理欧洲 和美洲蜜蜂蜜蜂幼虫腐臭病的组合物的基础。
幼虫类芽孢杆菌larvae亚种的减毒或无毒菌株产生有抗冥王星蜜 蜂球菌和蜂房类芽孢杆菌活性的抗生素，因此这些菌株(或其衍生 物)可以用作预防和/或治疗性处理尤其是欧洲蜜蜂幼虫腐臭病和蜂 房类芽孢杆菌介导疾病的组合物的基础。
或者，可以遗传工程改造其它微生物(尤其是细菌)成为表达以 上定义的抗生素的宿主。
本发明所用细菌可以带有一或多个改变毒性或/和抗生素生产能 力的突变，和/或由减毒或无毒菌株构成。在接种物是幼虫类芽孢杆 菌pulvifaciens亚种的实施方案中这是尤其优选的，因为该细菌的 一些株引起一种称作粉状鳞片病(powdery scale)的轻微疾病。
减毒或无毒菌株可以容易地通过在实验室培养基上重复传代培 养、诱变/筛选技术或毒性决定因素的定向诱变来产生。
本发明所治疗或预防的蜜蜂疾病典型地是由细菌感染介导的疾病 (例如：由幼虫类芽孢杆菌larvae亚种，幼虫类芽孢杆菌 pulvifaciens亚种，蜂房类芽孢杆菌，或冥王星蜜蜂球菌介导的疾 病)。
在尤其优选的实施方案中，该蜜蜂疾病为蜜蜂幼虫腐臭病(即美 洲和欧洲蜜蜂幼虫腐臭病)。作为替代，或此外，该疾病可以是粉状 鳞片病。
另一方面，本发明涉及一种类芽孢杆菌属(例如幼虫类芽孢杆 菌)的减毒或无毒菌株。尤其优选幼虫类芽孢杆菌pulvifaciens亚 种、幼虫类芽孢杆菌larvae亚种或蜂房类芽孢杆菌的减毒或无毒菌 株。
上述本发明减毒或无毒菌株可以用来治疗性处理或预防蜜蜂感 染。这些细菌株在上文所述的本发明方法和组合物中作为接种物有特 殊用途。
在又一方面，本发明涉及接种物在制备用于治疗或预防蜜蜂感染 的药物中的应用。在本发明的这个方面中，该药物优选是根据本发明 的组合物(例如上文定义的组合物)。
本发明还涉及本质上从上文描述的微生物中分离的抗生素，以及 这些抗生素在治疗或预防以上讨论的蜜蜂疾病中的应用。这些抗生素 制剂可以按与现有抗生素相同的方式(见上文)来施用。
现在通过参考以下非限制性实施例来阐明本发明。 实施例1 幼虫类芽孢杆菌抗生素敏感性(透明区)
我们进行了生物学试验以阐明幼虫类芽孢杆菌pulvifaciens变 种(Paenibacillus larvae var.pulvifaciens)对各种微生物种 的抗生素活性。根据标准技术在含有接种了测试微生物的生长培养基 的培养皿中进行试验。将一个带有幼虫类芽孢杆菌pulvifaciens变 种(PLP)的圆盘置于培养皿的中央，然后测量测试微生物的生长程 度。下表1中记录了圆盘周围透明区的相对大小。
表1 物种 PLP 大肠杆菌E61883/0(020H-，尿液) ++ 大肠杆菌C600 ++ 鼠伤寒沙门氏菌ATCC 1131 ++ 小肠结肠炎耶尔森氏菌NCTC 11176 + 铜绿假单胞菌ATCC 9027 + 恶臭假单孢菌NCTC 109367 ++ 恶臭假单孢菌UWCC1 ++ 蜡状芽孢杆菌F462690 +++ 枯草芽孢杆菌168 +++ 蜂房类芽孢杆菌 +++ 幼虫类芽孢杆菌larvae变种 +++ 幼虫类芽孢杆菌pulvifaciens变种 - 单核细胞增生利斯特氏菌ScottA +++ 金黄色葡萄球菌CRA410 +++ 藤黄微球菌 + 酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae) -
表中所示结果说明幼虫类芽孢杆菌pulvifaciens变种对于杀灭 与AFB有关的致病株幼虫类芽孢杆菌larvae变种(PLL)，以及在感 染蜜蜂幼虫腐臭病的蜂房内还发现的蜂房类芽孢杆菌是有效的。这些 结果也显示它具有抗一定范围内的其它细菌的抗生素活性，而且抗革 兰氏阳性细菌的活性强于抗革兰氏阴性细菌的活性。
检测了PLP的3个株，发现每个菌株都可以杀死大范围的来自不同 地理来源如英国、斯洛文尼亚、澳大利亚和新西兰的PLL株。没有发 现PLL株影响PLP。
这3种与蜜蜂有关的致病性类芽孢杆菌属细菌都产生抗体，这在 一定程度上解释了它们在蜜蜂中的行为。因此，AFB感染的物质经常 表现为单一培养物。对于EFB，冥王星蜜蜂球菌是第一个出现在蜜蜂 幼虫肠内巨大细胞团中的生物体。幼虫死后，条件明显有利于蜂房类 芽孢杆菌，其占据主要地位并抑制冥王星蜜蜂球菌，以致于可能显微 镜下很难在死的幼虫中发现冥王星蜜蜂球菌，尽管在疾病早期冥王星 蜜蜂球菌已形成浓密的优势培养物。用抗生素术语来说，实施的试验 证实蜂房类芽孢杆菌可以杀死广谱细菌，包括冥王星蜜蜂球菌但不包 括幼虫类芽孢杆菌(PLP和PLL)。PLL可以杀死蜂房类芽孢杆菌、冥 王星蜜蜂球菌以及所有的其它测试菌株，但不影响PLP。PLP可以杀死 (蜜蜂相关范围内的)所有微生物，尽管对于所有这三种菌株，酵母 (酿酒酵母)和藤黄微球菌相对具有抗性。 实施例2 竞争试验
为了给PLP对PLL杀伤作用的机制提供更多的信息，通过在丰富 培养基上并排接种PLL和PLP，设立并排(side by side)竞争试 验。测试的两个菌株呈斑块状生长，几天后，PLL在紧邻PLP的一边开 始后退。又几天后，仅在离PLP的最远端留有一个模糊的生长边缘。 对后退边缘细胞的显微镜观察显示空胞、原生质体，否则就是受损细 胞；来自PLL斑溶解部分的样品显示仅是碎片。因此，这些实验表明 PLP产生的抗生素是溶细胞性的而不是抑菌性的。 实施例3 PLP杀伤PLL和其它致病性类芽孢杆菌属细菌的机制
我们发现PLP对PLL(美洲蜜蜂幼虫腐臭病细菌)的作用是由于细 菌素引起的，该细菌素在生长的早期产生，并在整个生长期持续产 生。该细菌素对PLL具有相当的特异性和溶菌作用。表1所列的大部分 细菌对这种细菌素是不敏感的，尽管偶尔一些种类如枯草芽孢杆菌似 乎是敏感的。我们已鉴定该细菌素具有热敏感性(100℃ 2分钟即可 将其破坏)和蛋白激酶K敏感性。
广谱抗菌活性出现在孢子形成开始的时候。在上面描述的同等条 件下该活性是热不敏感的。不希望受任何理论的束缚，可以认为该活 性是由抗生素化合物的存在导致的。经热处理的抗生素提取物不能抑 制PLL，因此可以认为混合物中仅有该细菌素负责此抑制活性。 实施例4 组合物A 养蜂用组合物
把PLP孢子接种物分散在含50％蔗糖水溶液的糖浆中形成液体组合 物。这一组合物用作蜜蜂的食物添加成分，可以布置在蜂房内或蜂房 附近的适合位置。 组合物B 小糖块组合物
将其中散布有PLP接种物的糖压缩制成固体小块或饼状物(养蜂 业中称作小糖块)。 组合物C 撒粉组合物
把糖研磨成细粉末，然后在粉末中混入PLP接种物，制成撒粉组 合物。该撒粉可直接施用于蜂房内的蜂巢或是蜂房的内表面，或是直 接施用于蜜蜂群体。 组合物D 喷雾组合物
把PLP接种物分散到水中制成液体喷雾组合物。这种组合物可以 用于喷洒蜂房内部或蜂巢，或是直接喷洒蜂群。
以上实施例仅仅为了举例说明，而不是意图从任何方面限制本发 明。