预防和控制蜜蜂的病原感染的方法及相关组合物
阅读：466发布：2020-05-20
专利汇可以提供预防和控制蜜蜂的病原感染的方法及相关组合物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及用于保护 蜜蜂 健康的 益生菌 混合物，更具体的涉及用于保护免受 微 生物 病状，例如由美国幼虫腐臭病(AFD)的病原——幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)导致的病变。，下面是预防和控制蜜蜂的病原感染的方法及相关组合物专利的具体信息内容。
1.用于预防和控制蜜蜂中的细菌疾病的组合物，包含蜜蜂(Apismellifera)或其它传粉昆虫中分离的共生细菌。
2.权利要求1所述的组合物，其中共生细菌包括一种或两种彼此组合的产孢子细菌，和/或可能但不必需的，与一种或多种乙酸细菌组合。
3.权利要求2所述的组合物，其中产孢子细菌选自苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)和侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus)，而乙酸细菌是Saccharibacter sp.。
4.权利要求1所述的组合物，其中疾病是蜜蜂的细菌疾病。
5.权利要求4所述的组合物，其中蜜蜂的细菌疾病是由幼虫类芽孢杆菌(Paenibacillus larvae)或蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)导致的。
6.权利要求1-4所述的组合物，其形式为在用于水中稀释的粉末形式、浆、糖浆、实心棒或饼中的干细菌生物质。
7.用于控制和预防蜜蜂的疾病的方法，包括将蜜蜂/幼虫、蜂巢或蜂箱与有效量的组合物接触，所述组合物包含两种产孢子细菌，所述细菌可能但不必需的组合乙酸细菌。
8.权利要求7所述的方法，其中蜜蜂疾病是细菌疾病。
9.权利要求8所述的方法，其中细菌蜜蜂疾病是由幼虫类芽孢杆菌或蜂房蜜蜂球菌引起的。
10.权利要求7所述的方法，其中产孢子细菌选自苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌，而乙酸细菌是Saccharibacter sp.。
11.权利要求7所述的方法，其中使用的组合物形式为在用于水中稀释的粉末形式、浆、糖浆、实心棒或饼中的干细菌生物质。
预防和控制蜜蜂的病原感染的方法及相关组合物
发明领域
[0001] 本发明涉及用于预防和控制在蜜蜂(Apis mellifera)中发生的病原感染的方法。技术背景
[0002] 在过去20年间，养蜂地区在世界范围内极其一致的记录了蜜蜂数量和生产力的丢失。这些事实对农业-食品领域的更大规模也具有不利的影响。仅在2007年，与该灾难同时发生的若干要素就导致整个意大利和欧洲养蜂资产损失30-50％，在USA的一些地区损失峰值达60-70％。其破坏并不局限于昆虫死亡或生物多样性的丢失。由于传粉不足对季节性收获的负面影响，整个农业-食品领域都受到该问题的困扰。在经济上，与之对应的损失约为10亿欧元/年，分布如下：美国2千万，中国7千万，欧洲5亿，世界其余地区4亿。意大利仅在2007年就有20万个蜂箱遭到破坏，导致约2.5亿欧元的、与缺少传粉相关的经济损失(等于1240欧元/蜂箱)(根据APAT——环境保护和技术服务部(Agency for the environmentalprotection and technical services)于2008年1月29日发出的通告)。导致这一高死亡率的可能原因是蜂箱的卫生条件、天气变化、饲料和水的可利用度和质量、电磁污染和植物药物产品(新烟碱类(neonicotinoid))有关的污染。这些胁迫因子作用于减少蜜蜂免疫防御力，因而使其对于微生物和病毒感染更加虚弱。
[0003] 对微生物和病毒疾病的控制是艰巨的难题，因为目前尚无用于该目的的专门的注册药物。唯一的解决手段是预防，例如阻止病毒或细菌的负荷达到导致诱导感染的水平。这可以通过采用所谓的Good Apiary Practice来实现，即，在蜂箱内避免材料交换、消毒设备和保持良好的通风。然而，该Good Practice仍不充分，传染事件的数量仍然持续攀升。其中，美国幼虫腐臭病(AFD)——蜜蜂幼虫最危险的疾病——受到最多关注，因其目前尚无解决方案(Genersch E.，2009.American Foulbrood in honeybeesand its causative agent，Paenibacillus larvae.J Invertebr Pathol.103Suppl1：S10-9)。AFD的病原是产孢子细菌——幼虫类芽孢杆菌(Paenibacilluslarvae)(Genersch等人，2006.Reclassification of Paenibacillus larvaesubsp.pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsp larvae as Paenibacilluslarvae without subspecies differentiation.Int J Syst Evol Microbiol56：501-511)。有四个亚类属于幼虫类芽孢杆菌：ERIC I、ERIC II、ERICIII、ERIC IV，每个亚类都具有特定的表型特征(Raugh等人，2009.Negative correlation between individual-insect level virulence andcolony-level virulence of Paenibacillus larvae，the etiological agent ofAmerican foulbrood of honeybees.Appl Environ Microbiol75：3344-3347)。ERIC I和ERIC II是最普及的。该微生物优先感染幼小的幼虫。通过仍然保持健康的成虫进食进行传递。在欧洲，禁止使用抗生素控制AFD传播，因为这可能导致出现抗生素抗性病原体以及出于食品安全的原因(Miyagi T.，Peng C.Y.S.，Chuang R.Y.，Mussen E.C.，Spivak M.S.，Doi R.H.，2000.Verification of oxytetracycline-resistant Americanfoulbrood pathogen Paenibacillus larvae in the United States.Journal ofInvertebrate Pathology 75：
95-96)。与此同时，根据意大利法律，向当局报告出现在任何蜂箱中的AFD是强制性的。此外，根据Veterinary Police规定(D.P.R.8/2/54，n.320，art.154-158)，由于缺少任何特异性的治疗，唯一可接受的解决方案是毁坏受污染的蜂箱。该严厉手段的目的是避免存在任何可能复发的感染病灶集中点(focuses)。
95-96)。与此同时，根据意大利法律，向当局报告出现在任何蜂箱中的AFD是强制性的。此外，根据Veterinary Police规定(D.P.R.8/2/54，n.320，art.154-158)，由于缺少任何特异性的治疗，唯一可接受的解决方案是毁坏受污染的蜂箱。该严厉手段的目的是避免存在任何可能复发的感染病灶集中点(focuses)。
[0004] 如上所述，在绝大多数情况下，使用Good Apiary Practice不足以避免感染病灶集中点的存在。
[0005] 领域现状
[0006] 想要作为预防蜜蜂的微生物病状的潜在手段的市场上唯一可获得的产品是ApiGo(Chemicals LAIF)。这是一种蜜蜂的饲料添加剂，用麦芽糖糊精、酵母提取物和维生素制备而成。它被认为是重新平衡蜜蜂成虫和幼虫的胃肠道微生物群(microbiota)的益生元。然而，对意大利3个地区(即，Piemonte、Lombardia和Emilia Romagna)的养峰人进行的调查表明，该饲料添加剂不足以有效限制微生物病状在蜂箱之间扩散传播。
[0007] R&D目前关注于鉴别以蜜蜂保护、养峰业产品的健康和终端用户(消费者)安全性为目的的、环境友好的解决方案。
[0008] US2009/0104288A1公开了蛇麻草(hop)提取物限制蜜蜂的病原体扩散的用途。
[0009] US2002/0034529A1公开了使用尘埃幼虫类芽孢杆菌(Paenibacilluslarvae pulvifacens)的菌株作为幼虫类芽孢杆菌larvae种(Paenibacilluslarvae larvae)的拮抗剂。然而，尘埃幼虫类芽孢杆菌是一种病原体，即使它毒力低。
[0010] Evans 和 Lopez(Evans J.D.，Lopez D.L.，2004.Bacterial probioticsinduce an immune response in the honey bee(Hymenoptera：Apidae).J.Econ.Entomol.97：752-756)显示，设计用于人类消费的益生菌混合物可以增加两种具有抗微生物活性的肽(abaecin和防卫素)在蜜蜂中的生产。工作最后提示使用这些细菌作为蜜蜂的益生菌。
[0011] Evans和Armstrong通过metagenomic方法鉴别了至少4种可以在体外抑制幼虫类芽孢杆菌生长的微生物(嗜麦芽糖寡养单胞菌(Stenotrophomonas maltophilia)、不动杆菌属物种(Acinetobacter sp.)、Brevibacillus formosus和梭状芽孢杆菌(Bacillus fusiformis))。抑制作用涉及细菌素(bacteriocines)的生产(Evans J.D.，Armstrong T.N.，2006.Antagonistic interactions between honey bee bacterial symbionts andimplications for disease.BMC Ecol.6，4)。Yoshiyama和Kimura提供了关于生产针对其他菌株的细菌素的相同证据(Yoshiyama M.，Kimura K.，2009.Bacteria in the gut of Japanese honeybee，Apis cerana japonica，andtheir antagonistic effect against Paenibacillus larvae，the causal agent ofAmerican foulbrood.J.Invertebr.Pathol.102：91-96)。
[0012] Forsgren等人(Forsgren E.，Olofsson T.C.，Va′squez A.，Fries I.，2010.Novel lactic acid bacteria inhibiting Paenibacillus larvae in honey beelarvae.Apidologie 41：99-108)提出使用从蜜蜂肠道分离的乙酸乳酸菌(acetic lactic bacteria)对抗幼虫类芽孢杆菌感染。显示了该方法在体外和体内的效果。提出了两种可能的作用机制：i)由于产生有机酸导致pH减少；ii)产生细菌素。Sabaté等人(SabatéD.C.，Carrillo L.，Audisio M.C.，2009.Inhibition of Paenibacillus larvae and Ascophaera apis by Bacillus subtilisisolated from honeybee gut and honey samples.Res.Microbiol.160：193-199)还提出使用从蜜蜂的内脏器官和蜂蜜中分离的细菌(即，枯草芽孢杆菌(Bacillus subtiluis))来控制幼虫类芽孢杆菌和蜜蜂球囊菌(Ascosphaera apis)。
[0013] 最 后，Alippi e Reynaldi(Alippi A.M.，Reynaldi F.J.，2006.Inhibition ofthe growth of Paenibacillus larvae，the causal agent of American foulbroodof honeybees，by selected strains of aerobic spore-forming bacteria isolatedfrom apiarian sources.J.Invertebr.Pathol.91：141-146)研究了一些分离物抑制幼虫类芽孢杆菌的能力。在生物化学水平进一步探讨了10个最令人感兴趣的菌株，以鉴别可能参与抑制幼虫类芽孢杆菌的那些因素。
[0014] 发明定义
[0015] 目前发现蜜蜂的一些微生物共生生物可以对成虫和幼虫都具有益生效果，并可以具有免疫刺激效果。因此，预防和控制病原体感染对其特别感兴趣。
[0016] 更具体而言，本发明涉及菌株的混合物，所述菌株具有益生菌活性，并能够预防由AFD的病原——幼虫类芽孢杆菌和由蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)(欧洲幼虫腐臭病(European Foulbrood Disease))导致的细菌感染。
[0017] 本 发 明 包 括 一 种 或 多 种 产 孢 子 细 菌( 即 苏 云 金 芽 孢 杆 菌(Bacillusthuringensis)和侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus))，可能但不必需的联合一种或多种从蜜蜂或其它传粉者中分离的乳酸细菌(例如，Saccharibacter sp.)的用途。上述三种微生物物种的应用被认为产生了强化免疫系统的益生元效果，从而导致预防一些蜜蜂病原体的感染。
[0018] 本发明的方法包括用本发明混合物对蜜蜂、幼虫、蜂箱和所有其它组分的预防性处理。
[0019] 针对观察益生菌混合物抗幼虫类芽孢杆菌的效果所进行的具体实验显示：通过多种作用机制，所述混合物在保护蜜蜂的成虫和幼虫中具有升高的潜力。处理导致抗外部胁迫的更高的保护作用，以及蜜蜂一般健康的实质性改善。
[0020] 比较性实验显示了混合物比单一菌株在预防感染中更有效，在所述实验中蜜蜂的幼虫在经过或未经过本发明的微生物菌株预处理的条件下，暴露于幼虫类芽孢杆菌下。
[0021] 显示了本发明的特定微生物混合物能够产生针对病原体的直接拮抗作用，同时能够刺激蜜蜂的免疫系统。该刺激作用在大范围内以若干协同机制发生。这降低了出现针对本发明作用的抗性的可能性。这是极大的优势，因为出现抗性菌株是仍然允许使用抗生素的那些国家中的主要问题(Lodesani M.，Costa C.，2005.Limits of chemotherapy in beekeeping：development of resistance and the problem of residues，Bee World86：102-109)。此外，作用的广谱性(wide spectrum)可以导致还有效针对其它病毒或微生物疾病。
[0022] 更具体而言，对蜜蜂的体内研究显示本发明特异性的细菌混合物能够：
[0023] -修饰胃肠道的pH，因此产生对于病原体不利的环境；
[0024] -在蜜蜂的胃肠道中建群，诱导竞争性排除病原体的机制；
[0026] -产生AFD病原体拮抗性的细菌素。
[0027] 总而言之，本发明特定的益生菌混合物是蜜蜂collapsing疾病问题的生物学的、因而也是环境友好型的解决方案，它利用作为蜜蜂的共生生物的、从昆虫自身分离的细菌。
[0030] 散布细菌混合物的剂型和手段
[0031] 散布本发明的细菌混合物的制剂和相关手段的例子是(但不限于)：
[0032] 1.蒸发或喷雾预先稀释在净水中的细菌生物质的的粉末。该制剂可以直接散布在蜜蜂成虫、幼虫和能与昆虫接触的任何养蜂设备上。建议剂量是每个蜂箱200mL细菌悬浮3 9 5 7
液，终浓度范围从1x10 至1x10cfu/mL，更具体是从1x10 至1x10。
液，终浓度范围从1x10 至1x10cfu/mL，更具体是从1x10 至1x10。
[0033] 2.施用在浆内的干燥生物质。浆是基于糖的产品，通常被散布在每个蜂箱的给食袋(feeding pocket)中。建议剂量是每个蜂箱700mL细菌悬浮液，悬浮液终浓度范围从3 9 5 7
1x10 至1x10cfu/mL，更具体是从1x10 至1x10。
1x10 至1x10cfu/mL，更具体是从1x10 至1x10。
[0034] 3.施用实心棒或饼。将细菌生物质溶解在基于糖的液体中，然后将其硬化并导3
入蜂箱顶盖下。建议剂量是每个蜂箱500mL细菌悬浮液，悬浮液终浓度范围从1x10 至
9 5 7
1x10cfu/mL，更具体是从1x10 至1x10。
入蜂箱顶盖下。建议剂量是每个蜂箱500mL细菌悬浮液，悬浮液终浓度范围从1x10 至
9 5 7
1x10cfu/mL，更具体是从1x10 至1x10。
[0035] 实验部分
[0036] 已经在体外和体内研究中探讨了本发明特定的微生物混合物抗病原体的效果和对于蜜蜂健康的效果。研究的主要阶段如下进行。
[0037] 1.从表现出美国幼虫腐臭病症状的蜜蜂幼虫中分离幼虫类芽孢杆菌larvae种菌株
[0038] 从表现出AFD症状的突尼斯和意大利蜂箱取样10条幼虫。如文献所述，在含有哥伦比亚血琼脂(Columbia blood agar)的培养基上进行分离幼虫类芽孢杆菌larvae 种 (Genersch 等 人，2006.Reclassification ofPaenibacillus larvae subsp pulvifaciens and Paenibacillus larvae subsplarvae as Paenibacillus larvae without subspecies differentiation.Int J SystEvol Microbiol 56：501-511；Bakonyi等人，2003.Development andevaluation of PCR assays for the detection of Paenibacillus larvae in honeysamples：comparison with isolation and biochemical characterization.ApplEnviron Microbiol 69：1504-1510)。通过16S rRNA基因测序和使用引物ERIC的基因组重复序列扩增(rep-PCR)，进行类芽孢杆菌属(Paenibacillus spp.)的301株分离菌的分子分型。将16S rRNA序列与国际数据库中可获得的数据比对，而将ERIC谱与文献中可获得的比较。在301株分离菌中的2株被鉴定为ERIC I和ERIC II。这是类芽孢杆菌属传播最广的菌株，因此使用这两株分离菌进行所有的其它实验。
[0039] 2.从健康蜂箱的蜜蜂幼虫和成虫中分离共生细菌
[0040] 选择一个没有AFD症状的意大利蜂箱作为环境资源，分离具有潜在益生菌活性的细菌。通过16S rRNA基因测序，鉴别出共270株分离菌，在第2个阶段，根据其代谢能力将分离菌分组。鉴别出2个主要组：i)196株乙酸细菌；ii)64株产孢子细菌。
[0041] 3.体外筛选抗幼虫类芽孢杆菌larvae种的拮抗活性
[0042] 产孢子细菌
[0043] 通过抑制测定，在体外测试64株产孢子细菌，以研讨针对之前选定的2株幼虫类芽孢杆菌larvae种ERIC I和ERIC II菌株的拮抗活性。测试是在Tryptic Soy Agar(TSA)上进行的，如Sabatè等人，2009所述(SabatéD.C.，Carrillo L.，Audisio M.C.，2009.Inhibition of Paenibacillus larvaeand Ascophaera apis by Bacillus subtilis isolated from honeybee gut andhoney samples.Res.Microbiol.160：193-199)。
[0044] 在37℃孵育48h后，测量生长在测试菌株周围的幼虫类芽孢杆菌larvae种的抑制晕圈，评估拮抗活性。根据该测试的结果，选择2个产生较大晕圈的菌株(即，苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringensis)和侧孢短芽孢杆菌(Brevibacillus laterosporus))进行进一步的实验。
[0045] 评估了选定的细菌对于不同浓度的幼虫类芽孢杆菌larvae种菌株ERIC I和ERIC II的拮抗作用效力(表1)。使用大肠杆菌菌株作为阴性对照。
[0046] 表1：由于存在选定的产孢子共生生物导致的幼虫类芽孢杆菌larvae种生长的抑制晕圈的直径(cm)
[0047]
[0048] ND＝未检测到；BI＝模糊的抑制；＊＝在106/ml CFU/mL的浓度下[0049] 基于产孢子细菌的拮抗活性的作用机制是产生细菌素。
[0050] 乙酸细菌
[0051] 以产生对抗幼虫类芽孢杆菌larvae种有活性的细菌的协同混合物为目标，研究了从蜜蜂中分离的196株乙酸细菌的代谢活性。更具体的是，研究了通过产生乳酸造成的pH改变如何在不影响苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的生长的条件下，对抑制病原体生长发挥作用。
[0052] 在表2中，报道了幼虫类芽孢杆菌larvae种ERIC I和ERIC II、苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的菌株能够生长的pH范围。
[0053] 表2：幼虫类芽孢杆菌larvae幼虫、苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌响应不同pH范围的生长测定
[0054]
[0055] ND＝未检测到；+＝正生长；-＝不生长
[0056] 低于5.5的pH值抑制幼虫类芽孢杆菌larvae种的病原体菌株的生长，而益生菌菌株苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌能够在更低的pH(4.5)下生长，表示其相比病原体对亚酸性环境更高的耐受性。因此，考虑4.5-5.5的pH范围可以支持苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的生长，而不支持幼虫类芽孢杆菌larvae种菌株ERIC I和ERIC II的生长，鉴别了何种乳酸细菌能够将生长培养基的pH降低至低于5.5的值。结果从健康蜜蜂中分离的Saccharibacter sp.菌株是最佳候选对象，这还因为以下事实，即它可以在与苏云金芽孢杆菌和侧孢短芽孢杆菌的共培养中方便的容易的生长。
[0057] 通过不依赖于培养物的分子指纹技术PCR-DGGE(变性梯度凝胶电泳)，显示了Saccharibacter sp.和/或其它乙酸细菌与健康蜜蜂幼虫和成虫的普遍关联。
[0058] 4.选定的细菌抗幼虫类芽孢杆菌larvae种的体内拮抗活性。单个菌株及其混合物的效果
[0059] 体内研究证实了混合物改善和保护蜜蜂健康的功效。在来自10个不同蜂箱的不同年龄(12至36小时之间，对感染最敏感的时期)的2046条蜜蜂幼虫中测试本发明的功效。实验(按每批约500条幼虫进行)显示，向饮食中添加细菌混合物能够保护幼虫免受AFD感染。在存在幼虫类芽孢杆菌的条件下，幼虫的死亡率在50％至90％之间。死亡率水平降低至与用本发明的菌株预先处理时的幼虫没有暴露于病原体时死亡率水平相似的值。相比对照，单个菌株和细菌混合物都实现了90％至100％存活，其中后者具有最佳效果。
[0060] 表3中概括了体内的结果。
[0061] 表3：评估用益生菌菌株苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌、Saccharibacter sp.和非益生菌大肠杆菌处理时，保护蜜蜂免受幼虫类芽孢杆菌larvae种的程度的体内实验结果。通过一侧ANOVA评估处理之间的显著差异，使用Turkey’s检验比较单个平均值。具有不同字母的样品是统计学不同的(p＞0.05)。
[0062]
[0063]
[0064] 还测试了分离的益生菌菌株在蜜蜂胃肠道中建群的能力，所述能力因此可以导致竞争性排除病原体的机制。用补充了益生菌菌株的糖饮食喂养蜜蜂成虫3天。之后用病原体取代饮食中的益生菌菌株。一周后，将肠内容物置于选择性培养基上，研究病原体的存在。不可能重新获得病原体的存在，同时已经重新分离并通过分子技术表征了苏云金芽孢杆菌、侧孢短芽孢杆菌和Saccharibacter sp.。该方法显示，本发明的细菌在肠相关性微生物群落中成为主流。
[0065] 5.选定的益生菌混合物在蜜蜂的幼虫和成虫中的免疫刺激活性
[0066] 无脊椎动物的免疫系统通过2种机制控制感染：i)由具有抗微生物活性的可溶性
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