蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法
阅读：299发布：2020-05-15
专利汇可以提供蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 蜜蜂 幼虫芽孢杆菌检测技术领域，公开了一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan 荧光 定量PCR检测方法，根据P.larvae 16S rRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，弥补了 现有技术 的不足。本发明建立的方法特异性好，灵敏度高，重复性好，批内和批间重复性试验Ct值变异系数均小于3％；适用范围广，检测成蜂、幼虫、蜂蛹、蜂蜜、蜂胶、 蜂王浆 和花粉等实验室模拟样品与预期结果一致。因此，可用于蜜蜂及蜂产品中AFB的早期、高通量快速诊断及P.larvae定量分析。，下面是蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法专利的具体信息内容。
1.一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法根据P.larvae 16S rRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。
2.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述特异性引物的序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
3.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述探针的序列为：SEQ ID NO：3。
4.如权利要求1所述的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，其特征在于，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法检测流程为：
DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；
对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；
PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2 1.5μL，dNTPs 2μL，上下游引物各1μL，特异性探针0.5μL，Taq DNA聚合酶0.5μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH2O 15.0μL，使反应总体积为25.0μL；
PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、56℃退火延伸45s，共45个循环，在56℃时收集荧光信号；
结果判定：阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤33，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无Ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤33，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值>33的样品重复检测，重复检测结果无Ct值表示样品中无幼虫芽孢杆菌，重复检测结果有Ct值表示样品中存在幼虫芽孢杆菌。
蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法
技术领域
[0001] 本发明属于蜜蜂幼虫芽孢杆菌检测技术领域，尤其涉及一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。
背景技术
[0002] 美洲幼虫腐臭病(American foulbrood，AFB)是由幼虫芽孢杆菌(Paenibacillus larvae，P.larvae)引起的蜜蜂幼虫和蛹的一种细菌性、急性、毁灭性传染病，其典型症状为封盖后死亡的幼虫巢房盖变潮湿、下陷、颜色发暗并显油光，大部分巢房盖穿孔，挑取虫体可拉出长10cm～15cm的胶体状细丝，患病幼虫虫体变软，失去正常白色和光泽，逐渐变成淡褐色至棕黑色。这种芽孢杆菌有7层结构包围，特殊的结构使其极具生命力，在恶劣环境下仍可存活35年以上。AFB一旦在蜂场发生，极易造成幼虫死亡和蜂群群势衰弱，且很难彻底清除，给养蜂业造成重大经济损失。世界动物卫生组织(OIE)将其列为法定报告动物疫病，我国将其列为二类动物疫病和进境动物检疫疫病。目前，AFB主要根据临床症状进行诊断，易造成误诊，实验室诊断主要是以病原形态学、病原分离培养、生理生化特征、PCR方法等，确诊需要4d～6d，而且由于P.larvae的生长需要复杂的营养，在普通培养基上不能萌发也不能形成芽孢。近年来，因荧光定量PCR技术具有特异性强、灵敏度高、稳定性好等优点逐渐应用于各种病原体的定性和定量检测。Han等建立了P.larvae的微流体芯片定量PCR方法，该方法只需7.9min完成30个循环，即可检测出16S rRNA基因，并可以进行熔解曲线分析，此方法是目前世界上最快的实时荧光定量分析方法。Martinez等针对P.larvae 16S rRNA基因设计引物，建立了SYBR Green荧光定量PCR检测方法，该方法用时2h，最低可检出3.75个细菌/mL和10个芽孢/mL。已报道的上述两种荧光定量PCR方法中，微流体芯片定量PCR专用仪器设备、试剂、耗材昂贵，检测成本较高，目前还不利于普及和推广应用；SYBR Green荧光定量PCR虽检测成本低，但PCR反应中的非特异性扩增或引物二聚体也会产生荧光，通常本底较高，引起假阳性，特异性较差。
[0003] 综上所述，现有技术存在的问题是：
[0004] 1.微流体芯片定量PCR检测速度快，但检测成本高，目前还不利于普及和推广应用；
[0005] 2.SYBR Green荧光定量PCR检测成本低，但检测结果假阳性率高，特异性较差。
发明内容
[0006] 针对现有技术存在的问题，本发明提供了一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。
[0007] 本发明是这样实现的，一种蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，所述蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法根据P.larvae 16S rRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。具体的检测流程：
[0008] 1.DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；
[0009] 2.对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；
[0010] 3.PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol)1.5μL，dNTPs(2.5mmol)2μL，上下游引物(10μmol)各1μL，特异性探针(10μmol)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA1μL，加灭菌ddH2O 15.0μL，使反应总体积为25.0μL；
[0012] 5.结果判定：阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤33，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无Ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤33，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值>33的样品重复检测，重复检测结果无Ct值表示样品中无幼虫芽孢杆菌，重复检测结果有Ct值表示样品中存在幼虫芽孢杆菌。
[0013] 进一步，所述特异性引物的序列为：SEQ ID NO：1和SEQ ID NO：2。
[0014] 进一步，所述探针的序列为：SEQ ID NO：3。
[0015] 本发明的优点及积极效果为：为建立蜜蜂幼虫芽孢杆菌(P.larvae)荧光定量PCR检测方法，根据GenBank中幼虫芽孢杆菌(P.larvae)16S rRNA基因保守序列设计特异性引物和探针，经反应体系及条件优化，建立了检测P.larvae TaqMan荧光定量PCR方法。本发明与其它病原无交叉反应；最低可检出1.3×10拷贝/μL的阳性质粒，比普通PCR灵敏度高100倍；重复试验显示该方法的批内和批间变异系数均小于3％。应用本发明对50份实验室模拟样品和100份临床样品进行了检测，与预期结果一致。
[0016] 本发明建立的方法可用于美洲幼虫腐臭病(AFB)的早期快速检测及P.larvae定量分析；本发明建立的TaqMan荧光定量PCR方法，为AFB的早期诊断、防控及在分子流行病学研究等方面提供一种新的技术手段。附图说明
[0017] 图1是本发明实施例提供的阳性模板的扩增示意图；
[0018] 图中：M：DL2000 DNA Marker；1：PCR product；2：Negative control。
[0019] 图2是本发明实施例提供的荧光定量PCR标准曲线示意图；
[0020] 图中：1-7：pXT-16S recombinant plasmid diluted from1.3×107copies/μL-1
1.3×10copies/μL。
1.3×10copies/μL。
[0021] 图3是本发明实施例提供的荧光定量PCR特异性试验扩增曲线示意图；
[0022] 图中：1：P.larvae；2：Negative；3：M.pluton；4：N.apis；5：A.apis；6：Blank contrast。
[0023] 图4是本发明实施例提供的荧光定量PCR(A)与普通PCR(B)敏感性试验示意图；
[0024] 图中：1-8：1.3×107copies to 1.3×100copies；9：Negative control。
具体实施方式
[0025] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。
[0026] 下面结合附图对本发明的应用原理作详细的描述。
[0027] 本发明实施例提供的蜜蜂幼虫芽孢杆菌TaqMan荧光定量PCR检测方法包括以下步骤：
[0028] 1.DNA抽提：采用CTAB法或煮沸法或其它常规DNA抽提方法提取样品、阳性对照、阴性对照中的DNA；
[0029] 2.对照设置：幼虫芽孢杆菌或含有目的DNA片段的阳性质粒作为阳性对照、健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照，同时设立无模板空白对照；
[0030] 3.PCR反应体系配置：在PCR管中加入10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol)1.5μL，dNTPs(2.5mmol)2μL，上下游引物(10μmol)各1μL，特异性探针(10μmol)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA1μL，加灭菌ddH2O 15.0μL，使反应总体积为25.0μL；
[0031] 4.PCR反应程序：94℃预变性2min；94℃变性15s、56℃退火延伸45s，共45个循环，在56℃时收集荧光信号；
[0032] 5.结果判定：阴性对照和空白对照无Ct值并且无扩增曲线，阳性对照的Ct值应≤33，并且出现典型的扩增曲线，说明试验为有效试验，否则试验无效；在试验有效的情况下，待测样品无Ct值，并且无扩增曲线，表示样品中无幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值≤33，并且出现典型的扩增曲线，表示样品中存在幼虫芽孢杆菌；待测样品Ct值>33的样品重复检测，重复检测结果无Ct值表示样品中无幼虫芽孢杆菌，重复检测结果有Ct值表示样品中存在幼虫芽孢杆菌。
[0033] 根据P.larvae 16S rRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法。
[0034] 下面结合试验对本发明的应用效果作详细的描述。
[0035] 1材料与方法
[0036] 1.1菌/虫株 P.larvae购自北京北纳创联生物技术研究院，蜂房蜜蜂球菌(Melissococcus pluton)购自美国典型培养物保藏中心，蜜蜂微孢子虫(Nosema apis)、蜜蜂子囊球菌(Asosphaera apis)均由伊犁出入境检验检疫局综合技术服务中心分离保存。
[0037] 1.2主要试剂 基因组DNA提取试剂盒购自QIAGEN公司；Taq DNA聚合酶、MgCl2、dNTPs、DL2000 Marker、pXT19-T Vector、胶回收试剂盒、质粒小量提取试剂盒等均购自宝生物工程(大连)有限公司。
[0038] 1.3引物和探针的设计与合成 根据GenBank登录的P.larvae基因保守序列(X60619.1)，使用Primer Primier 5和Primer Express 3.0软件设计上下游引物(SEQ ID NO：1F：5'-CTAATACATGCAAGTCGAGCGGA-3'，SEQ ID NO：2 R：5'–GGTATTAGCTCACGTTTCCGCA-3')和一条探针(SEQ ID NO：3P：5'-HEX-CTTGTGTTTCTTTCGGGAGACGCCA-BHQ1-3')，预期扩增片段为129bp。引物和探针均由北京鼎国昌盛生物技术有限公司合成。
[0039] 1.4细菌基因组提取及标准品制备采用基因组DNA提取试剂盒从P.larvae标准菌株中提取P.larvae基因组，应用特异性引物进行普通PCR扩增，产物经1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，切胶纯化PCR产物，克隆至pXT19-T中构建重组质粒pXT-16S，转化DH5α感受态细菌中，37℃过夜摇菌后提取质粒进行普通PCR扩增和送北京鼎国昌盛生物技术有限公司测序，将鉴定正确的重组质粒测定浓度，根据公式：拷贝数＝(质量/分子量)×6.0×1023计算其拷贝数，作为荧光定量PCR标准品。
[0040] 1.5反应体系及反应条件优化 以pXT-16S标准品作为模板，采用矩阵法分别对反应体系中的引物、探针、dNTPs、Mg2+浓度及反应条件中退火、延伸温度和时间进行优化。
[0041] 1.6标准曲线的建立 将pXT-16S标准品经微量紫外分光光度计测定浓度，使用缓冲液稀释成10倍系列梯度浓度作为模板，于-20℃保存。按优化好的体系条件进行荧光定量PCR，绘制标准曲线。
[0042] 1.7特异性试验 采用基因组DNA提取试剂盒提取P.larvae、M.pluton、N.apis、A.apis及健康蜜蜂幼虫DNA，以健康蜜蜂幼虫DNA作为阴性对照模板，设立无模板空白对照，采用本发明建立的荧光定量PCR进行检测，评价该方法的特异性。
[0043] 1.8敏感性试验 使用缓冲液将pXT-16S标准品进行10倍系列稀释8个梯度(1.3×107拷贝/μL～1.3×100拷贝/μL)，分别作为模板，按优化好的体系条件进行荧光定量PCR，确定反应的最小检出量。同时进行普通PCR反应，比较两种检测方法的敏感性。
[0044] 1.9重复性试验 选取5个不同浓度梯度的pXT-16S标准品分别作为模板，各浓度进行4次重复检测，根据Ct值计算批内变异系数；以上述5个不同浓度的标准品分别作为模板，在3个不同时间进行荧光定量PCR检测，根据Ct值计算批间变异系数，评价该方法的重复性和稳定性。
[0045] 1.10实验室模拟样品和临床样品检测 将定量的不同稀释倍数的pXT-16S标准品掺入健康成蜂、幼虫、蜂蛹、蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉样品中制成50份实验室模拟样品；采自新疆主要养蜂区域的100份蜜蜂幼虫及蜂产品作为临床样品，应用建立的荧光定量PCR方法进行检测，并与普通PCR方法进行比较。
[0046] 2结果
[0047] 2.1标准品的制备 将P.larvae DNA进行普通PCR扩增，获得长度约为130bp的目的片段(图1)，PCR产物经测序分析，与GenBank中登录序列的同源性达到100％。将目的片段克隆于pXT19-T中构建pXT-16S重组质粒标准品，经普通PCR和测序鉴定正确后，利用微量紫外分光光度计测定OD260nm/OD280nm＝1.86，计算其浓度为1.3×107拷贝/μL。
[0048] 2.2反应体系和条件的优化 通过采用矩阵法优选引物和探针最佳浓度配比，最佳反应体系为(25μL)：10×PCR buffer 2.5μL，MgCl2(25mmol)1.5μL，dNTPs(2.5mmol)2μL，上下游引物(10μmol)各1μL，特异性探针(10μmol)0.5μL，Taq DNA聚合酶(5U/μL)0.5μL，模板DNA 1μL，加灭菌ddH2O至25μL。最佳反应条件：94℃2min，94℃15s、56℃45s，45个循环，在56℃时收集荧光信号。
[0049] 2.3标准曲线的建立 以10倍系列梯度稀释的pXT-16S标准品分别作为模板进行荧光定量PCR反应，标准品浓度从1.3×107拷贝/μL～1.3×101拷贝/μL与Ct值呈良好的线性关系，斜率为-3.34，截距为37.89，从而可以得出标准曲线回归方程式：Ct＝-3.34×logCO+37.89，相关系数R2＝0.998(图2)。
[0050] 2.4特异性试验 应用建立的荧光定量PCR方法，利用蜜蜂常见疫病病原P.larvae、M.pluton、N.apis、A.apis及健康蜜蜂幼虫DNA作为模板，进行特异性试验，结果显示仅P.larvae有特异性曲线，其它病原、阴性对照及无模板空白对照检测结果均为阴性(图3)，表明建立的荧光定量PCR方法具有良好的特异性。
[0051] 2.5敏感性试验 用缓冲液将pXT-16S标准品10倍系列稀释8个梯度(1.3×107拷贝/μL～1.3×100拷贝/μL)，分别作为模板进行荧光定量PCR和普通PCR检测，结果显示荧光定量PCR最小检出量为1.3×10拷贝/μL，普通PCR最小检出量为1.3×103拷贝/μL(图4)，表明荧光定量PCR的敏感性比普通PCR提高了约100倍。
[0052] 2.6重复性试验 选取5个浓度的pXT-16S标准品进行批内和批间重复性试验，根据扩增反应的Ct值，计算变异系数(CV)，数据结果显示批内变异系数CV≤1.56％，批间变异系数CV≤2.37％(表1)，表明所建立的方法具有较好的重复性。
[0053] 表1荧光定量PCR的重复性试验
[0054]
[0055] 2.7实验室模拟样品和临床样品检测 应用建立的荧光定量PCR和普通PCR方法对50份实验室模拟样品和采自新疆主要养蜂区域的100份蜜蜂幼虫及蜂产品临床样品进行检测，结果显示实验室模拟样品荧光定量PCR和普通PCR方法共同检出20份阳性和10份阴性，两种检测方法的符合率为60％。其中荧光定量PCR方法检测为阳性的40份(阳性率80％)样品中，仅有20份普通PCR方法检测为阳性(阳性率40％)，荧光定量PCR能检出加入pXT-16S标准品浓度在1.3×10拷贝/μL以上的实验室模拟样品，与预期结果相一致；蜜蜂幼虫及蜂产品临床样品两种方法检测结果均为阴性。表明该荧光定量PCR具有良好的临床应用性。
[0056] 目前，已报道的P.larvae荧光定量PCR检测方法有微流体芯片定量PCR和SYBR Green荧光定量PCR方法，前者检测速度快，但成本高，后者检测成本低，但特异性差。本发明根据P.larvae 16S rRNA基因序列，设计了一对特异性引物和一条TaqMan荧光探针，建立了蜜蜂美洲幼虫腐臭病病原菌TaqMan荧光定量PCR检测方法，弥补了上述两种方法的不足。本发明建立的方法特异性好，灵敏度高，重复性好，批内和批间重复性试验Ct值变异系数均小于3％；适用范围广，检测成蜂、幼虫、蜂蛹、蜂蜜、蜂胶、蜂王浆和花粉等实验室模拟样品与预期结果一致。因此，该方法可用于蜜蜂及蜂产品中AFB的早期、高通量快速诊断及P.larvae定量分析。
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