一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用
阅读：673发布：2020-05-08
专利汇可以提供一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于 家畜 分子 生物 学技术领域，具体涉及一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用。所述circRNA为circSETD2，其线性核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。本发明针对circSETD2设计特异性扩增引物，经PCR扩增及RNase R酶消化验证所述的circSETD2的真实存在。利用 荧光 定量PCR检测到circSETD2在猪睾丸支持细胞以及在输精管、附睾头中高表达。在75d和270d“梅山”公猪睾丸中表达量极显著高于同日龄“杜洛克”公猪睾丸中表达量(p，下面是一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用专利的具体信息内容。
1.一种与公猪繁殖相关的circRNA，其特征在于，所述的circRNA为circSETD2，其核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
2.一种特异性扩增circSETD2的引物对，其特征在于，所述引物对的序列如SEQ ID NO：
2和SEQ ID NO：3所示。
3.权利要求1所述的circRNA在动物细胞和组织表达量检测中的应用。
4.权利要求1所述的circRNA在公猪繁殖性能检测中的应用。
5.权利要求2所述的引物对在细胞和组织表达量检测中的应用。
6.权利要求2所述的引物对在公猪繁殖性能检测中的应用。
7.权利要求1所述的circRNA在公猪的选择评定、配种以及遗传改良中的应用。
8.权利要求2所述的引物对在公猪的选择评定、配种以及遗传改良中的应用。
一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用
技术领域
背景技术
[0002] 睾丸的发育影响精子的产生及各种雄性激素的分泌，进而影响公猪的繁殖性能，而公猪的初情期和性成熟期与睾丸发育密切相关，因此探究公猪的睾丸发育调控对种公猪的选育具有指导性作用(姜勋平；1998)。梅山公猪繁殖性能高，性成熟较早，与其他品系母猪杂交后代育肥效果较好，体格大，瘦肉率多，胴体重及饲料利用率高，适用于多品种猪群杂交的育肥改良(甘丽娜；2017)。杜洛克公猪瘦肉率高，增重快，性成熟较晚，一般为7～ 8月龄。二者在性成熟早晚的差异为种公猪的繁殖研究提供了良好模型。研究发现不同品种公猪睾丸中某些RNA分子存在差异性表达，其可能与公猪性成熟早晚有关。如120日龄达性成熟的二花脸公猪睾丸生长激素受体(GHR)表达量与240日龄达性成熟的大白公猪相比差异显著(p<0.05)，其通过特异性结合生长激素(GH)调节公猪繁殖性能(李发弟；2006)。因此研究不同猪种睾丸中某些RNA分子的表达模式，具有重要的现实意义。
[0003] 环状RNA(circRNA)是由RNA 3’端与5’端共价连接形成的闭合环状非编码RNA分子，分布广泛、保守性强、结构稳定。随着高通量分子测序的快速发展，在动植物体真核细胞内发现大量的circRNA。研究表明circRNA参与基因的表达(Li et al；2015)、细胞的增殖分化(Li et al；2017)、癌症的发生及转移(Dai et al；2017)等过程。circRNA具有时间及组织表达特异性，研究发现circRNA在猪妊娠中期脑皮质层中表达量显著增高，与猪胚胎脑部发育有关(Morten et al；2015)。睾丸性别决定基因SRY的环状结构-circSRY 通过吸附miR-138调节下游靶基因的表达(Hansen et al；2013)。目前circRNA在公猪繁殖方面研究还较少，因此寻找影响公猪繁殖性能的circRNAs成为当前公猪繁殖与遗传育种研究的新方向。
[0004] 公猪的繁殖过程涉及基因表达、表观遗传修饰(如DNA甲基化，组蛋白修饰等)等过程。研究表明组蛋白甲基转移酶SETD2调控精子发生、成熟等过程，敲除SETD2后组蛋白甲基转移酶缺失，精子发生基因ACRBP、PRM1表达量下降，造成精子发生异常、顶体畸形及不育(Zuo et al；2018)。研究发现SETD2基因能够表达一种环状RNA，因此鉴定和检测此环状RNA在公猪睾丸中的表达情况，分析其在公猪繁殖中的作用，将为种公猪的选择评定与遗传育种改良提供新的思路。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一种与公猪繁殖性状相关的circRNA及应用。所述的circRNA 为猪circSETD2，其线性核苷酸序列如SEQ ID NO：1所示。
[0006] 本发明提供了一种特异性扩增circSETD2环化位点的引物对，该引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO:3所示。
[0007] 本发明所述的circRNA可在动物细胞和组织表达量检测中的应用。尤其用于公猪的选择评定及遗传育种改良。
[0008] 本发明提供了一种纯化circRNA及对其环状结构鉴定的方法。具体步骤如下：(1)以 RNase R酶消化公猪睾丸支持细胞环状RNA。(2)以β-actin为对照，以cDNA、gDNA为模板，利用Divergent Primer和Convergent Primer进行扩增(图4)。(3)以β-actin 为内参基因，利用qRT-PCR检测circRNA对RNase R酶的耐受性(图5)。
[0009] 本发明的circRNA Divergent/Convergent引物如SEQ ID NO:2、SEQ ID NO:3以及 SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示；其中β-actin Divergent/Convergent引物如SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7以及SEQ ID NO：8和SEQ ID NO：9所示。
[0010] 本发明提供了一种有效检测circRNA在动物细胞或组织中相对表达量的方法，即以 circRNA特异引物进行实时定量PCR的方法。
[0011] 本发明还涉及到一种β-actin内参基因，扩增该基因的引物序列如SEQ ID NO：8和 SEQ ID NO：9所示。
[0012] 本发明提供了一种对circRNA细胞定位的方法。具体步骤如下：
[0013] (1)分离、提取睾丸支持细胞的细胞核与细胞质RNA。
[0014] (2)分别以细胞核与细胞质cDNA为模板，以18s RNA为细胞核内参基因(引物序列如SEQ ID NO：10和SEQ ID NO：11所示)。
[0015] (3)本发明以GAPDH基因为细胞质内参基因(其引物序列如SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13所示)。利用qRT-PCR方法检测circRNA在细胞核、细胞质的相对表达量(见图7)。
[0016] 本发明的circRNA在75d和270d“梅山”公猪睾丸中的表达量极显著高于同日龄的“杜洛克”公猪睾丸中的表达量(p<0.01)(见图9)。
[0018] 图1：circSETD2 Divergent/Convergent引物的设计。
[0019] 图2：circSETD2反向剪接位点测序图，箭头处为环化位点；
[0020] 图3：通过RNase R酶消化对circSETD2的鉴定，从左到右依次为睾丸组织总RNA、SETD2 mRNA及circSETD2 PCR产物的电泳图。其中，SETD2产物为211bp，circSETD2产物为305bp。
[0021] 图4：以β-actin为对照，Divergent/Convergent primer对gDNA、睾丸cDNA扩增。附图标记说明：M泳道为DL 2000DNA Marker；NO RT泳道为睾丸RNA；cDNA及gDNA泳道为RNase R消化后的cDNA及gDNA；β-actin Convergent primer产物为167bp；circSETD2 Divergent Primer产物为305bp；circSETD2 Convergent Primer产物为357bp。
[0022] 图5：利用qRT-PCR方法检测circSETD2对RNase R酶的耐受性结果。
[0023] 图6：利用qRT-PCR方法检测circSETD2在猪肾细胞、睾丸支持细胞及睾丸间质细胞的相对表达量。
[0024] 图7：利用qRT-PCR方法检测circSETD2在猪睾丸支持细胞的细胞核和细胞质中的相对表达量。
[0025] 图8：利用qRT-PCR方法检测circSETD2在“梅山”公猪各组织中的相对表达量。
[0026] 图9：qRT-PCR检测circSETD2在“杜洛克”、“梅山”公猪睾丸中的相对表达量。
具体实施方式
[0027] 以下结合具体实施例及附图对本发明做进一步的阐述。以下具体实施例仅限于解释本发明，但并不限制本发明的范围。实施例中未说明具体条件的实验方法，通常按照常规条件，或按照厂商所建议的条件进行。
[0029] SEQ ID NO：1是猪circSETD2的线性核苷酸序列。
[0030] SEQ ID NO：2是特异性扩增circSETD2环化位点的引物对的上游引物序列。
[0031] SEQ ID NO：3是特异性扩增circSETD2环化位点的引物对的下游引物序列。
[0032] SEQ ID NO：4是circSETD2 Convergent引物对的上游引物序列。
[0033] SEQ ID NO：5是circSETD2 Convergent引物对的下游引物序列。
[0034] SEQ ID NO：6是β-actin Divergent引物对的上游引物序列。
[0035] SEQ ID NO：7是β-actin Divergent引物对的下游引物序列。
[0036] SEQ ID NO：8是β-actin Convergent引物对的上游引物序列。
[0037] SEQ ID NO：9是β-actin Convergent引物对的下游引物序列。
[0038] SEQ ID NO：10是细胞核内参基因的18s rRNA引物对的上游引物序列。
[0039] SEQ ID NO：11是细胞核内参基因的18s rRNA引物对的下游引物序列。
[0040] SEQ ID NO：12是细胞质内参基因GAPDH引物对的上游引物序列。
[0041] SEQ ID NO：13是细胞质内参基因GAPDH引物对的下游引物对序列。
[0042] 实施例1猪circSETD2的鉴定
[0043] 1.1猪circSETD2引物的设计：
[0044] 登录circBase数据库，下载人hsa_circ_0065148线性核苷酸序列，在NCBI数据库寻找并下载与猪同源性较高的核苷酸序列，将此序列的3’端100-200bp片段移到5’端 100-200bp最前端形成新序列，针对新序列设计跨反向剪接位点(back-splice site)的 circSETD2的Divergent引物对，该引物对的序列如SEQ ID NO：2和SEQ ID NO：3所示。将剩余的线性核苷酸序列按常规方法设计引物，即circSETD2的Convergent引物，引物序列如SEQ ID NO：4和SEQ ID NO：5所示(图1)。
[0045] 1.2猪睾丸支持细胞(Sertoli cell)全基因组DNA的提取：
[0046] 细胞复苏：
[0047] (1)在超净台中进行，超净台需提前消毒和20min以上的紫外线照射杀菌。
[0048] (2)从液氮取出细胞冻存管置于37℃水浴锅迅速融化，于离心机中1500rpm，离心5min。
[0051] 具体步骤如下：
[0052] (1)弃掉细胞培养液，用1-2ml磷酸盐缓冲液(PBS)洗涤细胞2次。
[0053] (2)加入0.5-1ml胰酶消化细胞，加入180ul PBS缓冲液使细胞悬浮并移至2.0ml 离心管中，300×g离心5min，弃上清。
[0054] (3)加入20ul蛋白酶K和200ul Buffer SL，漩涡15s，56℃水浴10min，低速离心数秒使溶液沉降到管底。
[0055] (4)加200ul无水乙醇，漩涡振荡15s。
[0056] (5)移上清液于核酸纯化柱中，在12000rpm下离心30s，弃滤液。
[0057] (6)加入500ul Buffer WA，再12000rpm下离心30s，弃滤液。
[0058] (7)加入600ul Buffer WB，再12000rpm下离心30s，弃滤液。
[0059] (8)再14000rpm下离心1min，加100-200ul 56℃温育的Buffer TE，静置1min，在12000rpm下离心30s，洗脱DNA放于-20℃备用。
[0060] 1.3组织及细胞RNA提取(常规TRIZOL法)：
[0061] 按照每100-500ng组织或T25细胞瓶加入1ml TRIZOL试剂(购自宝生物工程大连有限公司)，反复吹打，将匀浆样品移至1.5ml离心管中(离心管内均无RNA酶)，室温下置5min 使核酸蛋白复合物完全分离。加入0.2ml氯仿，剧烈振荡15s，室温下放置3min。于4℃， 12000×g离心15min，样品分三层，RNA主要在最上层水相中，吸取600ul上清移至1.5ml 离心管，加500ul异丙醇，颠倒混匀，冰浴10min。然后在2-8℃，12000×g下离心10min，弃上清。
加入1ml 75％浓度的乙醇，振荡混匀，于4℃，7500×g下离心5min，弃上清。室温晾5-10min干燥RNA，加20ul无RNA酶水，混匀，吸取1ul于Thermo NANO Drop2000紫外分光光度计下测量浓度及纯度，取质量合格的RNA放于-80℃下保存。
加入1ml 75％浓度的乙醇，振荡混匀，于4℃，7500×g下离心5min，弃上清。室温晾5-10min干燥RNA，加20ul无RNA酶水，混匀，吸取1ul于Thermo NANO Drop2000紫外分光光度计下测量浓度及纯度，取质量合格的RNA放于-80℃下保存。
[0062] 1.4circRNA的富集纯化：
[0063] 利用核糖核酸外切酶RNase R(Lucigen，Cat.No.RNR07250)消化线性RNA，富集纯化circRNA。取1ugRNA加入3-4U RNase R(20U/ul)，2ul 10×RNase R Reaction Buffer，加水补至20ul，37℃孵育10-15min。
[0064] 1.5RNA反转录：
[0065] 按照Vazyme反转录试剂盒(R223-01)说明书介绍的操作方法进行RNA反转录，具体步骤如下：(1)基因组DNA去除：1ug RNA，4ul 4×gDNA wiper Mix，RNase free ddH2O 至16ul，混匀，于42℃2min。(2)反转录反应：在步骤(1)的反应液中加5×HiScript II qRT SuperMix II 4ul,混匀，50℃15min，85℃5s。
[0066] 1.6PCR扩增及qRT-PCR：
[0067] PCR扩增体系：1μL模板，上、下游引物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3或SEQ ID NO： 4，SEQ ID NO：5或SEQ ID NO：6，SEQ ID NO：7或SEQ ID NO：8，SEQ ID NO：9)各 10μM，2×ES Taq MasterMix 5μL(购自康为生物公司)，加ddH2O至10μl。95℃预变性 5min；35个循环(95℃变性30s；60℃退火30s；72℃延伸20s)；72℃10min，产物在1.5％琼脂糖凝胶(含染料)中电泳，将目的片段回收纯化并测序。qRT-PCR反应体系：SYBR Green I real-time PCR Mix(TOYOBO)5μL，上、下游引物(SEQ ID NO：2，SEQ ID NO：3)0.15μL，200ng cDNA，加水至10μL。
反应程序：95℃预变性2min；40个循环(95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸15s)。生物学及技术性重复各3个，利用2-△△Ct法计算基因相对表达量，其中△△Ct＝(Ct目的基因-Ct内参)-(Ct目的基因-Ct内参)最大值，T检验进行显著性分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
反应程序：95℃预变性2min；40个循环(95℃变性15s；60℃退火15s；72℃延伸15s)。生物学及技术性重复各3个，利用2-△△Ct法计算基因相对表达量，其中△△Ct＝(Ct目的基因-Ct内参)-(Ct目的基因-Ct内参)最大值，T检验进行显著性分析。P<0.05表示差异显著，P<0.01表示差异极显著。
[0068] 1.7结果：
[0069] 如图2所示，以跨反向剪接位点的特异性引物扩增circSETD2，经一代测序比对确定其环化位点(箭头处)。如图3所示，总RNA经RNase R酶消化后电泳无条带，PCR检测SETD2 mRNA在RNase R(+)组条带较弱；而circSETD2在RNase R(-)和RNase R(+)组中均有条带，表明circSETD2结构较稳定且耐消化。如图4所示，以β-actin为对照，使用 Divergent/Convergent引物对No RT对照组、猪睾丸支持细胞cDNA及基因组gDNA扩增， cDNA组Divergent/Convergent primer均有条带，gDNA组只有Convergent引物有条带，说明此circRNA是客观存在的。如图5所示，以β-actin为内参基因，qRT-PCR检测到RNase R酶消化猪睾丸支持细胞RNA后circSETD2表达量无显著性变化(p>0.05)，而线性SETD2 mRNA表达量极显著性下降(p<0.01)，进一步证实了circSETD2的环状结构。
[0070] 实施例2.circSETD2在猪细胞中的差异表达及定位
[0071] 2.1circSETD2在猪细胞中的差异表达：
[0072] 如图6所示，以β-actin为内参基因，qRT-PCR检测circSETD2在猪肾细胞、睾丸支持细胞及睾丸间质细胞的相对表达量。结果表明circSETD2在睾丸支持细胞、睾丸间质细胞的表达量均显著高于在猪肾细胞中的表达量(p<0.05)，其中在猪睾丸支持细胞中表达量最高。
[0073] 2.2猪睾丸支持细胞核、质RNA的分离：
[0074] 选取6孔板中汇合度在90％以上的睾丸支持细胞，弃掉培养液，用PBS清洗2次。加入 1ml冰TD溶液吹打制备细胞悬液，移至1.5ml离心管中(离心管均无RNA酶)，最大转速离心30s，弃上清。加入100ul冰TD溶液吹打10次，加入100ul VRC/1％NP-40/TD，振荡5s，冰浴5min，最大转速离心30s，样品分层，移上层细胞质成分于新离心管中并加1ml TRIZOL 待提取RNA；在下层成分中加200ul 0.5％NP-40/TD吹打数次，振荡5s，冰浴5min，最大转速离心
30s，弃上清。加入200ul 0.5％NP-40/TD吹打数次使悬浮，再加1ml TRIZOL吹打即可提取RNA。RNA提取步骤见实施例1.3所示。
30s，弃上清。加入200ul 0.5％NP-40/TD吹打数次使悬浮，再加1ml TRIZOL吹打即可提取RNA。RNA提取步骤见实施例1.3所示。
[0076] TD溶液(2L):NaCl 16.0g，KCl 0.76g，Na2HPO4 0.20g，Tris-HCL 6g，加水至2L， pH 7.4-7.5。
[0077] 2.3circSETD2在猪睾丸支持细胞的分布：
[0078] 如图7所示，以18s RNA为细胞核内参基因(引物序列见SEQ ID NO：10和SEQ ID NO： 11)、GAPDH为细胞质内参基因(引物序列见SEQ ID NO：12和SEQ ID NO：13)，qRT-PCR 检测circSETD2在猪睾丸支持细胞核、质中的表达量。结果显示circSETD2在睾丸支持细胞的细胞质中表达量最高，SETD2 mRNA在睾丸支持细胞的细胞核中表达量最高，circSETD2 可能作为miRNA的分子海绵发挥作用。
[0079] 实施例3.circSETD2组织表达谱及在“梅山”公猪、“杜洛克”公猪睾丸中的差异表达 3.1公猪组织RNA提取、反转录以及qRT-PCR：
[0080] 具体步骤见实施例1的1.3；1.5；1.6。公猪组织包括淋巴、肝、胃、精囊腺、前列腺、背最长肌、睾丸、附睾头、输精管、肠、尿道球腺、脂肪、附睾体、附睾尾等。
[0081] 3.2circSETD2组织表达谱：
[0082] 如图8所示，以β-actin为内参基因，qRT-PCR检测到circSETD2在公猪各组织中均有表达，其中在输精管、附睾头及睾丸中表达量较高，表明circSETD2可能与精子的发生或成熟过程有关。
[0083] 3.3circSETD2在“梅山”公猪、“杜洛克”公猪睾丸中的差异表达
[0084] 如图9所示，以β-actin为内参基因，qRT-PCR检测circSETD2在20d、75d及270d 杜洛克公猪及“梅山”公猪睾丸中的相对表达量，结果显示circSETD2在75d“梅山”公猪 (达到初情期)睾丸中表达量极显著高于75d“杜洛克”公猪(未达到初情期)睾丸中的表达量(p<0.01)，同时，在270d“梅山”公猪睾丸中的表达量也极显著高于270d杜洛克公猪睾丸中表达量(p<0.001)。circSETD2在75d和270d“梅山”公猪睾丸中高表达表明其可能与“梅山”猪性成熟早和高繁殖力等特性相关，因此，circSETD2有望可以作为检测公猪繁殖性能的分子标志物，在种公猪的选择评定及遗传育种改良等领域具有较大的应用价值。
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