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球体组织微阵列及制备方法

阅读:664发布:2020-05-16

专利汇可以提供球体组织微阵列及制备方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且球体组织微阵列包括包埋在多孔模具内的组织球体阵列。该产品可以灌注有蜡或 树脂 并切片,并且含有精确位于规则几何网格中的球体。制备球体组织微阵列的方法包括以下步骤:在 铸造 模具 中由液 体模 具材料形成多孔材料模具,并使该液体模具材料 凝固 ;从该铸造模具中除去多孔模具;用另外的液体模具材料加满该多孔模具,并通过随着该液体模具材料凝固而收缩以拉入液体模具材料,从而使得在该模具表面中形成凹部;将组织球体放置在该多孔模具表面的凹部中;以及通过灌满液体模具材料并使该液体模具材料凝固,从而将该组织球体密封在该模具内。替代方法包括以下步骤:在铸造模具中由液体模具材料形成多孔材料模具;使该液体模具材料凝固;从该铸造模具除去多孔模具;将球体放置于多孔材料模具中的孔基部处的凹部中;以及通过在该球体上方添加另外的多孔材料从而在该多孔模具内密封该球体;其中在该多孔材料中的孔基部处的凹部通过具有另外的 乳头 -形突出部的铸造模具的突出部形成。,下面是球体组织微阵列及制备方法专利的具体信息内容。

1.一种球体组织微阵列,其包括包埋在多孔模具内的组织球体阵列。
2.根据权利要求1所述的球体组织微阵列,其中所述多孔模具由琼脂糖或琼脂凝胶形成。
3.根据权利要求1或2所述的球体组织微阵列,所述球体组织微阵列形成为含有一系列以网格模式布置的规则定位的孔。
4.根据权利要求3所述的球体组织微阵列,其中所述孔的直径在0.2至3.0mm之间。
5.根据权利要求4所述的球体组织微阵列,其中所述孔的直径在0.5至1.5mm之间。
6.根据权利要求5所述的球体组织微阵列,其中所述孔的直径是约1mm。
7.根据权利要求3至6中任一项所述的球体组织微阵列,其中所述孔具有在2至5mm之间的深度。
8.根据权利要求7所述的球体组织微阵列,其中所述孔具有在3至4mm之间的深度。
9.根据权利要求8所述的球体组织微阵列,其中所述孔具有约4mm的深度。
10.根据权利要求3至9中任一项所述的球体组织微阵列,其中所述多孔模具含有100至
300个孔。
11.根据权利要求10所述的球体组织微阵列,其中所述多孔模具包含10×17网格的170个孔。
12.根据权利要求3至10中任一项所述的球体组织微阵列,其中所述多孔模具含有96个孔。
13.根据上述权利要求中任一项所述的球体组织微阵列,其中所述球体基本上以规则的正方形阵列平布置,使得每个球体的中心点距其所需的理想水平位置至多100微米。
14.根据上述权利要求中任一项所述的球体组织微阵列,其中每cm2的球体的密度是在
100至500之间。
15.根据上述权利要求中任一项所述的球体组织微阵列,其中所述组织球体包括来源于以下中的一种或多种的组织:诱导型多潜能干细胞、原代细胞、来源于癌组织的细胞系、神经元细胞、皮肤细胞、肝细胞肿瘤细胞、基质细胞、免疫细胞和内皮细胞。
16.根据上述权利要求中任一项所述的球体组织微阵列,其中所述组织球体由体外3D细胞培养形成。
17.根据上述权利要求中任一项所述的球体组织微阵列,其中所述组织球体具有50至
500μm的直径。
18.根据权利要求17所述的球体组织微阵列,其中所述组织球体具有100至500μm的直径。
19.根据权利要求18所述的球体组织微阵列,其中所述组织球体具有150μm或/至350μm的直径。
20.根据上述权利要求中任一项所述的球体组织微阵列,其中所述组织球体包括基质,在包埋前在所述基质上生长细胞。
21.根据权利要求20所述的球体组织微阵列,其中所述基质是由聚苯乙烯(安伯来特)或者另一种多孔塑料材料形成的珠。
22.根据权利要求20或21所述的球体组织微阵列,其中所述组织球体包含人皮肤细胞。
23.根据上述权利要求中任一项所述的球体组织微阵列,其中所述组织球体被染色用于组织学分析。
24.根据上述权利要求中任一项所述的球体组织微阵列,所述球体组织微阵列灌注有额外的结构剂。
25.根据权利要求24所述的球体组织微阵列,所述球体组织微阵列灌注有石蜡树脂
26.一种制备球体组织微阵列的方法,所述方法包括以下步骤:
铸造模具中由液体模具材料形成多孔材料模具,并使所述液体模具材料凝固
从所述铸造模具中除去多孔模具;
用另外的液体模具材料加满所述多孔模具,并通过随着所述液体模具材料凝固而收缩以拉入液体模具材料,使得在所述模具的表面中形成凹部;
将组织球体定位于所述多孔模具的表面中的凹部中;以及
通过灌满液体模具材料并使所述液体模具材料凝固从而将所述组织球体密封在所述模具内。
27.根据权利要求26所述的方法,用于制备根据权利要求1至25中任一项所述的球体组织微阵列。
28.根据权利要求26或27所述的方法,其中所述液体模具材料为0.5至4%的琼脂糖水溶液。
29.根据权利要求28所述的方法,其中所述液体模具材料为2%的琼脂糖/水混合物。
30.根据权利要求26至29中任一项所述的方法,其中在从60至70℃的温度下实施在铸造模具中由液体模具材料形成多孔材料模具的步骤。
31.根据权利要求26至30中任一项所述的方法,其中将所述铸造模具预平衡至适合的温度。
32.根据权利要求31所述的方法,其中将铸造模具预平衡至70℃。
33.根据权利要求26至32中任一项所述的方法,其中使所述液体模具材料在所述铸造模具中在室温下凝固20至45分钟,随后在0至5℃下冷冻20至45分钟。
34.根据权利要求33所述的方法,其中使所述液体模具材料在室温下凝固约30分钟,随后在约4℃下冷冻约30分钟。
35.根据权利要求26至33中任一项所述的方法,其中通过在约-20℃的温度下冷冻5至
15分钟使所述多孔模具硬化以用于从所述铸造模具中除去。
36.根据权利要求26至35中任一项所述的方法,其中在将所述多孔模具加满之前,将所述多孔模具在密封环境中在60至70℃下加热10至30分钟。
37.根据权利要求26至36中任一项所述的方法,其中利用包含0.1至1.0%琼脂糖凝胶水溶液的液体模具材料加满所述多孔模具。
38.根据权利要求37所述的方法,其中利用包含0.7%的琼脂糖凝胶水溶液的液体模具材料加满所述多孔模具。
39.根据权利要求26至38中任一项所述的方法,其中将适合的染料标志物添加至加满的液体模具材料。
40.根据权利要求39所述的方法,其中所述染料标志物为溴酚蓝。
41.根据权利要求26至40中任一项所述的方法,其中在所述模具顶部1mm内形成所述凹部。
42.根据权利要求26至41中任一项所述的方法,其中在从60至70℃的温度下通过灌满液体模具材料将所述组织球体密封在模具凹部内。
43.根据权利要求26至42中任一项所述的方法,其中在将所述组织球体密封在模具凹部内之后,通过冷却至0至5℃约30分钟使所述液体模具材料凝固。
44.根据权利要求26至43中任一项所述的方法,其中所述球体组织微阵列灌注有额外的结构剂。
45.根据权利要求44所述的方法,其中所述结构剂是石蜡或树脂。
46.根据权利要求45所述的方法,其中在大气压或较低的压力下,在60℃下,在约两小时的循环中将石蜡灌注到所述球体组织阵列中。
47.一种制备球体组织微阵列的方法,其中所述方法包括以下步骤:在铸造模具中由液体模具材料形成多孔材料模具;使所述液体模具材料凝固;从所述铸造模具除去多孔模具;
将球体定位于多孔材料模具中的孔基部处的凹部中;以及通过在所述球体的顶部添加另外的多孔材料以将所述球体密封在所述多孔模具内;其中通过具有另外的乳头-形突出部的铸造模具的突出部形成在所述多孔材料中的孔基部处的凹部。
48.如权利要求47所述的方法,进一步包括利用额外的结构剂灌注所述微阵列的后续步骤。
49.如权利要求48所述的方法,其中所述结构剂是石蜡或树脂。
50.一种参考附图基本如上所述的球体组织阵列。
51.一种制备参考附图基本如上所述的球体组织阵列的方法。

说明书全文

球体组织微阵列及制备方法

技术领域

[0001] 本发明涉及球体(球状体,spheroid)组织微阵列及其制备方法。

背景技术

[0002] 在生物科学中使用自动高通量技术来实施用于大规模重复的同时多次实验。以这种方式,可以同时大量实施通常单个进行的方法而不会影响它们的质量
[0003] 在生物科学中,微阵列是在固体基质(例如,载玻片薄膜)上的大量生物材料的阵列,通过该微阵列可以使用高通量筛选测定生物材料。多种不同类型的微阵列是已知的,包括DNA微阵列、蛋白质和肽微阵列、抗体微阵列和组织微阵列。
[0004] 组织微阵列是已知的,其包含石蜡,其中大量(例如,最高达1000)个分离的组织样品可以组装在阵列中以允许多元组织学分析。在常规技术中,使用中空针从所关注的材料中除去小(<1mm)组织样品,并将其以精确等距的阵列插入到石蜡块中。可以(例如)使用切片机切割来自该块的切片并进行组织学分析。每个微阵列块可以被切成多个切片(例如,100-500个),可以对它们进行单独测试。
[0005] WO 2015/069742公开了具有预装填了的孔阵列的模具的制备。将球体移液至充满水的孔中,然后用琼脂糖灌注该孔内的水和球体。一旦琼脂糖凝固,将其从该模具中移出。这意味着该球体位于向下延伸的琼脂糖元件的基部处,而不是包埋在该琼脂糖体内。当从模具移出时,球体保留在琼脂糖元件基部处的效率尚不清楚。该模具可以由塑料或制成。该文档教导球体位于相同水平上,使得可以将它们切片并在一个切片上染色。然而,该文档未公开球体的精确水平定位;相反,它仅公开了球体位于不同的隔室内。

发明内容

[0006] 本发明设法提供改善的球体组织微阵列及其制备方法。在本文中,术语“球体”旨在表示细胞团块(团聚体,agglomerate),例如,类器官,或者处于组织-样结构中的细胞球形团块。技术人员将理解这些结构不需要是严格球形的;而是它们具有反映体内性质的三个维度。
[0007] 根据本发明,因此提供了包括包埋在多孔模具内的组织球体阵列的球体组织微阵列。
[0008] 该球体组织微阵列适合于在高通量组织组织学中使用。该微阵列使得能够将组织球体在几何学网格内基本水平对齐、定位和包埋,从而允许同时对大量(例如,数百个)或单个球体进行切片以用于后续组织学分析,例如,染色、转录组学/蛋白组学谱图绘制和图像分析。然而,该球体组织微阵列适合于在其它领域中使用,例如,在其中可能无法进行动物试验的个人护理和美容行业中的组织测试中使用。
[0009] 本发明所述的球体组织微阵列包括多孔模具,即由多孔材料形成的模具。潜在地,可以使用任何适合的多孔材料,并且优选的材料是琼脂糖或琼脂凝胶。
[0010] 已发现孔隙度是重要的且有益的;一个后果是整个产品在后续步骤中可以用蜡灌注,并因此可以方便地切片。在整个产品中,而不是仅仅在每个球体的附近,相对于一些例如使用多孔基质但仅在单独划分的孔内的现有技术文档,孔隙度提供了另外且发明性的不同的点。在本发明中,使用了本身多孔的模具。本发明使得能够形成可以多次切片的有序蜡块。
[0011] 与本发明相反,WO 2015/069742公开了由塑料或其它材料制成的模具,而不是多孔模具。在本发明中,该球体被多孔基质围绕,这导致产生了更大的强度并且在单位面积内允许更高的球体密度
[0012] 起初,形成多孔模具以含有一系列规则布置的孔,其以网格形式布置。该孔的直径优选地在0.2至3.0mm之间,例如,0.5至1.5mm,优选地约1mm。该孔可以具有2至5mm之间,例如,3至4mm,优选地约4mm的深度。该模具可以含有(例如)从100至300个孔,如具有170个孔的10×17网格。然而,可以在该多孔模具中含有任何数目的孔,例如,96个孔以反映行业标准的96孔板。
[0013] 本发明所述的球体组织微阵列还包含包埋在多孔模具内的组织球体阵列。
[0014] 可以非常精确地布置该球体,使得它们之间的距离是非常均一的。这是因为,在该阵列的制备期间,其上将布置该球体的孔采取凹孔或“凹痕(dimples)”的形式,这意味着每个球体位于每个孔的中心。这与一些阵列中的平底孔形成对比。
[0015] 在阵列中,意在将该球体布置在预定的理想位置,通常以规则间隔布置在规则阵列中。任选地,在本发明中,该球体具有平均直径并且水平布置,使得它们的中心偏离它们的预定理想位置至多所述平均直径。任选地,它们偏离至多所述平均直径的一半,任选地偏离至多所述平均直径的0.1。
[0016] 球体的精确定位是指在其它方面,对于自动图像分析,有可能覆盖网格或模板。任选地,该方法可以通过使用机器人自动进行。
[0017] 任选地,每个球体的中心点距离所期望的水平位置至多500微米,任选地至多300微米,任选地至多200微米,任选地至多100微米,任选地至多50微米,任选地至多20微米,任选地至多10微米。
[0018] 任选地,在该球体基本以规则几何学(例如,正方形)阵列布置时,并且当相邻球体之间的距离为x时,球体偏离理想网格球体位置定位的标准偏差不大于0.5x,任选地不大于0.25x,任选地不大于0.2x,任选地不大于0.1x,任选地不大于0.05x,或者任选地不大于
0.02x。
[0019] 该阵列上球体的密度可以是非常高的,例如,100个球体/cm2或以上,例如,200个球体/cm2或以上,例如,400个球体/cm2或以上,例如,500个球体/cm2或以上,例如,最高达1000个球体/cm2或以上。可以使用如下所述的机器人装置和/或处理步骤来实现最高精度水平。
[0020] 该组织球体可以包含待测试或测定的任何适合的组织。例如,该组织可以来源于诱导型多潜能干细胞、原代细胞或细胞系,诸如来源于癌组织的细胞系。因此,该组织球体可以由一定范围的不同的细胞类型制成,该细胞类型包括例如神经元细胞、皮肤细胞、肝细胞肿瘤细胞、基质细胞(例如,纤维细胞和巨噬细胞)、免疫细胞(例如,淋巴细胞和T细胞)和内皮细胞(例如,血管内皮细胞)。该组织球体可以由体外3D细胞培养制成。
[0021] 该球体组织微阵列可以包含不同大小的组织球体。该组织球体可以具有50至500μm,例如,100至500μm,诸如150μm或/至350μm的球体直径。
[0022] 在该球体组织微阵列中使用的组织球体可以包括包埋前在基质上生长细胞的基质。例如,该基质可以是由适合材料诸如聚苯乙烯或另一种适合的塑料材料形成的珠。
[0023] 包含基质诸如聚苯乙烯珠的组织球体可以对皮肤细胞的生长具有特别的应用,例如,用于个人护理或美容行业。在欧洲,例如,不允许对化妆品进行动物试验,并因此需要人组织测试。人皮肤在珠上的生长是有用的,这是因为皮肤细胞倾向于在珠上生长,如它们将是天然的一样,即(当出现时)表皮在最外层,真皮在表皮之下并且真皮之下是下皮。研究已经发现如果形成无基质的人皮肤球体,那么与它们如何天然形成的相比,皮层往往会“从内向外”生长,从而使它们不适合用于测试。
[0024] 可以用另外的结构剂,诸如石蜡或树脂灌注该球体组织微阵列以用于额外的结构稳定性
[0025] 该组织球体可以染色用于组织学分析,例如,通过自动图像分析的生物标志物(生物指示剂分子)测量。例如,可以通过免疫染色显微镜类细胞成像,诸如通过共聚焦扫描仪和自动图像分析来监控细胞响应(生物标志物)。例如,苏木精和伊红染色剂是主要的组织学染色剂之一。通常,在例如通过切片机将该球体组织微阵列切成用于分析的切片后进行染色。
[0026] 根据本发明,还提供了一种制备球体组织微阵列的方法,该方法包括以下步骤:在铸造模具中由液体模具材料形成多孔材料模具,并使该液体模具材料凝固;从该铸造模具中除去多孔模具;用另外的液体模具材料灌满该多孔模具,并随着该液体模具材料凝固所造成的收缩拉入(引入,drawing-in)液体模具材料,从而使得在该模具表面中形成凹部;将组织球体布置在该多孔模具表面的凹部中;以及通过灌满液体模具材料并使该液体模具材料凝固,将该组织球体密封在该模具内。
[0027] 本发明的这种方法优选地制备了根据本发明的球体组织微阵列。
[0028] 因此,该方法包括在铸造模具中由液体模具材料形成多孔材料模具的步骤。该多孔材料将为液体处的温度将取决于正在使用的材料。优选的多孔模具材料为0.5-4%的琼脂糖水溶液,优选地,2%的琼脂糖/水混合物。对于这种材料,60至70℃的浇铸温度是适合的。将该铸造模具优选地预平衡至适合的温度,例如,对于液体琼脂糖凝胶为70℃。可以用液体模具材料灌满该铸造模具,例如,使用组织包埋盒。
[0029] 使该液体模具材料在该铸造模具中凝固。对此,适合的时间段和温度将取决于正在使用的材料。对于在本发明中使用的优选的琼脂糖凝胶,适合的凝固条件为在室温下20至45分钟,优选地约30分钟,随后在0至5℃(例如,4℃)冷冻20至45分钟(例如,30分钟)。
[0030] 然后,从该铸造模具中除去该多孔模具。这必需在不折断该多孔模具的情况下实现,并且可以通过使该多孔模具硬化,例如,通过冷冻硬化来辅助完成。因此,可以通过在例如-20℃的温度下冷冻适当的时间段(例如,5至15分钟)使琼脂糖凝胶模具硬化以用于从该铸造模具中除去。
[0031] 还可以通过在该铸造模具上使用硅酮、甘油或聚四氟乙烯(特氟隆)材料或其它疏水性材料,例如,硅酮、甘油或特氟隆喷雾来辅助该多孔模具从该铸造模具中的除去。
[0032] 一旦从该铸造模具中除去,用另外的液体模具材料灌满该多孔模具,并随着该液体模具材料凝固所造成的收缩拉入液体模具材料,使得在该模具表面中形成凹部。在灌满之前,可以在适合的温度,例如60至70℃将该多孔模具加热适合的时间段,例如10至30分钟(例如20分钟)以除去保留的气体或其它杂质。优选地,在密封环境中进行这种加热以防止材料蒸发。用如上文所述的液体模具材料灌满该多孔模具。该液体模具材料与用于形成该多孔模具的材料可以是相同或不同的;例如,可以使用0.1-1.0%的琼脂糖凝胶水溶液,任选地0.4%的水溶液或0.7%的水溶液。可以将适合的染料标志物添加至该灌满的液体模具材料,例如,溴酚蓝或考斯亮蓝。由于该液体材料凝固,它在表面张的作用下被拉成多孔模具,从而由于随着它凝固,模具材料收缩而在该模具表面中形成凹部。该凹部通常在该模具最上方1mm内形成。
[0033] 将组织球体置于该多孔模具表面中的凹部中,并通过灌满其它液体模具材料将其密封在该模具内。此外,对于琼脂糖凝胶的水溶液,60至70℃的温度是适合的。然后,使该液体模具材料凝固,例如,通过冷却至0至5℃(例如,4℃)30分钟来使其凝固。
[0034] 该铸造模具可以由多种材料诸如硅酮或聚酸酯制成。该铸造模具通常是惰性且无孔的。铸造模具的突出部用于在琼脂糖/多孔模具中制备与之互补的孔,并且可以改变它们的形状、尺寸和间距。
[0035] 在如上所述的方法中,在从该铸造模具中释放出该多孔(例如琼脂糖)模具后,将另外的多孔(例如琼脂糖)材料添加至该多孔(例如琼脂糖)模具的孔中,然后随着将其拉入该孔,在另外的多孔(例如琼脂糖)材料上形成凹部,随后将球体置于那些凹部中。
[0036] 对于该球体,提供适合的凹部的替代方法如下所述。该铸造模具的突出部(例如,U形突出部)可以在它们的顶部具有较小的突出部(例如,乳头-形突出部)。这些导致在多孔(例如,琼脂糖)模具中产生了在它们的基部(例如,在它们的中心点)处具有凹部(例如,凹痕)的孔(例如,U形孔),其使得该球体在重力的作用下能够准确定位在该孔的凹痕中并且当随后用多孔材料(例如琼脂糖)填充该孔时保留它们。因此,在该方法的这种变化形式中,通过具有在该多孔模具基部本身上而不是在额外的多孔材料上形成的凹痕或凹部实现精确度。实现高球体位置精确度水平的不同方式扩大了本发明的可应用性和自动化的可能性。
[0037] 因此,从另外的方面,本发明提供了一种制备球体组织微阵列的方法,该方法包括以下步骤:在铸造模具中由液体模具材料形成多孔材料模具;使该液体模具材料凝固;从该铸造模具除去多孔模具;将该球体布置在该多孔材料模具中的孔基部处的凹部中;以及通过在该球体上方添加另外的多孔材料将该球体密封在该多孔模具内;其中通过具有另外的乳头-形突出部的铸造模具的突出部形成该多孔材料中的孔基部处的凹部。
[0038] 在适当情况下,加以必要的改变,本发明所述的第一方法的任选和/或优选特征还施用于制备的替代方法。
[0039] 本发明该的方法因此导致产生了夹在多孔基质组分之间(例如,琼脂糖层之间)的球体。这是因为将该球体置于多孔基质(例如琼脂糖)上,然后将另外的多孔基质(例如,不同的琼脂糖材料)置于顶部。相反,在一些现有技术阵列中,将样品放置在无孔的孔的底部,从而任何多孔基质四处分布,但是不在该样品下方。
[0040] 然后,在适合的条件下,在一个或多个循环中,可以对通过这些方法所形成的球体组织微阵列灌注另外的结构剂,诸如石蜡或树脂(例如,甲基丙烯酸树脂)以用于额外的结构稳定性。例如,可以在60℃,在大气压力或较低的压力下(例如,0.5atm),在1小时循环中,将石蜡灌注到由琼脂糖凝胶形成的球体组织微阵列中。
[0041] 利用树脂,例如,聚合物材料,例如,甲基丙烯酸酯聚合物对该模具的灌注使得能够在切片机上使用例如玻璃或金刚石刀片对该块进行切片。树脂的刚性比蜡更强,并且使得能够切出更薄的切片(例如,<1μM)。当封固用于分析时,与蜡相比,该切片的刚性还更强并且不太可能变形。这使得进一步可能实现高精度水平,其反过来有利于制备高密度球体微阵列。
[0042] 在使用中,可以切片本发明的球体组织微阵列并将其用于分析。例如,可以将该切片置于玻璃显微镜用载玻片上,并且可以用组织学染色材料染色以用于图像分析。
[0043] 就成像而言,本发明提供了进步。一些已知的成像方法为“全封固”法,即它们设法对整个球体成像并且经受衍射,并且由于在全封固制备物中不能应用靶标的热诱导修复(HIER),因此还不能测定多个终点。本发明在避免光散射中是有利的,从而提供了更高的分辨率,并且由于它有利于在整个球体中成像,因此使得能够进行更准确的分析。新型应用包括具有炎性细胞标志物的肝脏球体的多路染色以及使用细胞因子标志物的药物诱导的肝损伤的定量。另外的应用包括在含有瘤和正常细胞两者的杂交球体中对瘤作用的药物的筛选;这可以包括通过用瘤特异性标志物,诸如绿色荧光(GF)标签的蛋白染色,然后对肿瘤细胞内药物靶标染色来鉴别肿瘤细胞。附图说明
[0044] 现将参考附图对本发明的实施方式进行详细描述,其中:
[0045] 图1a至1d示出了根据本发明的实施方式制备球体组织微阵列的方法;
[0046] 图2a示出了根据本发明的实施方式的肿瘤球体阵列,其示出了肿瘤球体的尺寸;
[0047] 图2b为利用苏木精和伊红染色的图2a中所示的肿瘤球体阵列的球体阵列切片的扫描图像;
[0048] 图2c是图2a和2b中所示的阵列中的单一球体的放大的高分辨率图像;
[0049] 图3a示出了根据本发明的实施方式的神经元球体阵列,其示出了神经元球体的尺寸;
[0050] 图3b为利用苏木精和伊红染色的图3a中所示的神经元球体阵列的球体阵列切片的扫描图像;
[0051] 图3c是图3a和3b中所示的阵列中的单一球体的放大的高分辨率图像;
[0052] 图4a示出了拉入聚苯乙烯珠的根据本发明的实施方式的球体组织微阵列;
[0053] 图4b示出了图4a中所示的球体组织微阵列的切片;
[0054] 图5a示出了根据本发明的实施方式来自球体组织阵列的肿瘤细胞球体的高分辨率图像;
[0055] 图5b示出了肿瘤球体的高分辨率图像;
[0056] 图5c示出了在根据本发明的实施方式的球体组织微阵列中的跨越所有球体的完整球体切片的自动图像分析;和
[0057] 图6示出了根据本发明的替代方法的在多孔模具中形成的孔的结构。

具体实施方式

[0058] 参考图1a至1d,描述了制备本发明的球体组织微阵列的优选的方法。
[0059] 在优选的方法中,通过将液体凝胶材料倒入铸造模具中来制备该多孔模具。可以将任何适合的多孔材料,优选地琼脂糖或琼脂凝胶材料用于形成该多孔模具。优选的琼脂糖凝胶组合物包含0.5至4%的琼脂糖水溶液,优选地,2%的琼脂糖/水混合物。将该液体凝胶琼脂糖在60至70℃的温度下倒入该铸造模具,并将该铸造模具在70℃预平衡。将组织包埋盒(例如,由缩聚合物制成)置于铸造模具顶部并灌满液体凝胶琼脂糖。使该液体凝胶琼脂糖在室温下凝固至少20至45分钟,优选地30分钟,然后在4℃下冷冻30分钟。然后,将凝胶在-20℃的温度下冷冻10分钟使凝胶变硬,从而可以将其从该铸造模具中除去而不会折断。可以通过将两个微小刮刀(宽度4mm,深度0.5mm,长度10cm)沿该铸造模具基部的每一侧向下插入并将该多孔模具从该铸造模具中撬出将该多孔模具从该铸造模具中除去。
[0060] 然后,将该多孔琼脂糖模具在烘箱中在密封的塑料袋中(防止蒸发)加热至70℃并保持20分钟,然后在60至70℃,优选地70℃的温度下,用含有考马斯亮蓝染料标志物的浓度为0.1至1.0%,优选地0.4%的液体琼脂糖凝胶水溶液填充该模具中的孔。在表面张力作用下,将该液体琼脂糖凝胶拉入该模具,并使其凝固,从而由于随其凝固,凝胶体积收缩而发生了在该模具顶部1mm中凹室的形成(参见图1a)。
[0061] 直径50至500μm,例如100至500μm,诸如150μm或/至350μm的组织球体可以由体外3D细胞培养形成并且可以来源于诱导型多潜能干细胞、原代细胞或细胞系,诸如来源于癌组织的那些,将该组织球体在中性缓冲甲醛(NBF)中固定,该中性缓冲甲醛(NBF)含有溶于含有4g一水合磷酸二氢钠和6.5g磷酸氢二钠的900ml去离子水中的100ml纯甲醛,然后置于该琼脂糖模具顶部的凹部中(参见图1b)。
[0062] 在将该组织球体置于该琼脂糖模具凹部中之后,通过在60至70℃的温度下灌满液体琼脂糖凝胶来将其密封(参见图1c)。然后,将该模具在4℃下冷却30分钟以使该琼脂糖凝胶密封剂凝固,并将其置于70%的乙醇溶液中至少1至10天,优选地5天。
[0063] 然后,使用以下循环,在组织处理器中用熔融石蜡灌注该球体组织微阵列(图1d):
[0064]时间(小时) 溶液 温度(℃) 真空度(单位:Hg)
2 70%乙醇 25 -
2 95%乙醇 25 -
2 100%乙醇 25 -
2 100%乙醇 25 -
2 100%乙醇 25 -
1 二甲苯 25 -
2 二甲苯 25 -
2 二甲苯 25 -
3 石蜡 60 -
3 石蜡 60 15
[0065] 在石蜡包埋后,可以将该球体组织微阵列切片并将该切片置于玻璃显微镜用载玻片上(25mm×75mm),然后进行组织学染色和/或基质辅助激光解吸成像质谱蛋白质组学谱图绘制和自动图像分析。
[0066] 在图2a至5c中示出了来自本发明的实施方式的不同球体组织微阵列的图像的实例。
[0067] 然而,图1示出了在阵列中布置球体的一种方法,图6示出了替代方法。参考图6,以横截面图示出的铸造模具20含有以放大形式示出的突出部21,其通常是U形的,但是具有较小的乳头-形突出部22。这些导致了多孔模具(例如,琼脂糖模具),其具有U形孔23,该孔23的基部具有凹痕24以用于球体25的布置。
[0068] 本发明的产品内的球体已示出维持了它们的完整性。这已使用由病理学家验证的细胞形态分析进行确认。
[0069] 因此,本发明可以提供用于在高通量组织学中使用的球体组织微阵列及其制备方法。该球体组织微阵列提供了组织球体在几何学网格上的水平对齐和定位,从而有利于同时对多个(例如,数百个)单个球体进行切片以用于后续分析。
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