干奶时加速乳腺退化和预防乳腺感染的方法
阅读：570发布：2020-05-16
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1.一种在干奶时预防泌乳的哺乳动物中的乳房内感染或加速退化的组合物，所述组合物包括生物反应调节剂和可接受的载体。
2.根据权利要求1所述的组合物，其中所述生物反应调节剂包括含有壳聚糖和弱碱的壳聚糖水凝胶。
3.根据权利要求2所述的组合物，其中所述壳聚糖具有大于90％的脱乙酰化程度。
4.根据权利要求2或3所述的组合物，其中所述壳聚糖的重均分子量为约110kD到约
250kD。
5.根据权利要求4所述的组合物，其中所述壳聚糖的重均分子量为约160kD到约170kD。
6.根据权利要求5所述的组合物，其中所述壳聚糖的粘度为约90cP到约130cP。
7.根据权利要求2到6中任一项所述的组合物，其中所述弱碱的pKa为约6到约7。
8.根据权利要求2到7中任一项所述的组合物，其中所述弱碱是β-甘油磷酸盐。
9.根据权利要求2到8中任一项所述的组合物，其中所述生物反应调节剂的pH是6.8。
10.一种在干奶时预防泌乳的哺乳动物中的乳房内感染的方法，包括施用根据权利要求1到9中任一项所述的组合物至泌乳的哺乳动物的一个或多个乳头。
11.根据权利要求10所述的方法，其中所述泌乳的哺乳动物是牛科动物。
12.根据权利要求10或11所述的方法，其中施用所述组合物包括注射所述组合物到所述泌乳的哺乳动物的一个或多个乳头内。
13.一种在干奶时在泌乳的哺乳动物中加速退化的方法，包括施用根据权利要求1到9中任一项所述的组合物至泌乳的哺乳动物的一个或多个乳头。
14.根据权利要求13所述的方法，其中所述泌乳的哺乳动物是牛科动物。
15.根据权利要求13或14所述的方法，其中施用所述组合物包括注射所述组合物到所述泌乳的哺乳动物一个或多个乳头内。
干奶时加速乳腺退化和预防乳腺感染的方法
背景技术
[0002] 奶牛的泌乳周期应当包括妊娠结束前的干乳期(dry period)，在干乳期期间动物停止产奶。这使得在下一代出生之前，允许动物休息且再生它的乳腺细胞，以便于在下一次泌乳中优化产奶。干乳期是通过使动物“干奶(drying off)”引起。通常，动物的挤奶是突然地停止的，在乳房内积累的奶的回压可刺激乳腺细胞停止产奶。在干奶期期间，也可给予动物高纤维、低热量的饮食以促进产奶的中止。然而，处于干奶的动物具有增加的乳房内感染(IMI)的风险。
[0003] 在干奶期间，乳腺经历了一个自动退化(active involution)的时期，在所述时期期间乳腺组织退化并中止乳汁分泌。随着退化的完成，在乳头里经常形成角质栓(keratin plug)为细菌的进入提供了物理障碍，并且在乳腺分泌物中免疫细胞的数量增加，这进一步提供了对感染的防御。所以，当乳腺早期退化完成时，获得新的IMI的风险是最小的。然而，在早期的退化期期间，动物非常容易受IMI的影响，尤其是在干奶的时候如果奶产量高的情况下。通过乳头奶的累积和渗漏可损害角质栓的形成，导致微生物获得进入乳腺的入口。此外，在退化开始时，乳腺分泌物含有少量免疫细胞，并且乳腺分泌物中的高的脂肪和酪蛋白浓度可干扰免疫细胞呈现抵御这类微生物的能力。因此，在此期间实施有效的控制程序以预防IMI和所导致的炎症(乳腺炎)是重要的。
[0004] 在泌乳结束时用抗生素治疗动物是通常的做法，并且帮助治愈现有的IMI并且预防新的感染。预防和治疗IMI的可替换的方法包括使用体内乳头密封剂来预防病原微生物进入乳腺组织和使用基于碘的消毒的乳头浸液的外部乳头浸润(dipping)。然而，这些方法具有缺点。抗生素治疗不能对所有的病原体等同有效，并且在随后的泌乳期之前，如果干乳期不是足够长以允许从动物中充分清除抗生素，则存在抗生素污染奶的风险。此外，消费者消极地理解全部的动物的抗生素治疗，不管动物的感染情况。可是，只有那些处于高感染风险的动物的选择性抗生素治疗有必要使用在未治疗的动物中预防感染的替代方法，如基于惰性铋的乳头密封剂，所述基于惰性铋的乳头密封剂不是完全有效的，和体外乳头浸润，其是劳动密集型的并且在散养栏圈中实施是困难的。
[0005] 乳腺的先天性免疫对防御通过乳头管设法进入腺体的病原体感染是重要的，虽有乳头入口的物理障碍、如角质栓或乳头密封剂。白细胞(白血球)，尤其是中性粒细胞和巨噬细胞，是先天性免疫的重要组分，并且构成高比例的在奶中发现的体细胞。Furstenberg的玫瑰花结，一种策略上位于乳头管内部末端的结构，似乎是白细胞进入的主要点，认为在细菌到达乳腺前白细胞离开乳头壁并进入乳头池以拦截细菌。已经观察到一个区域内存在高的体细胞数(SCC)可预防奶牛实验性乳腺炎的诱发。因此，显而易见的是，刺激先天性免疫和增加SCC可增强乳腺对新的IMI的抵抗。另外，加速退化进程可缩短处于干奶的动物特别容易感染的时期，并且进一步增强对新的IMI的抵抗。
[0006] 生物反应调节剂(BRM)是调节宿主对病原体反应的药剂，所述药剂具有产生的有益的预防或治疗效果。尽管一些生物反应调节剂，包括但不限于疫苗，通过刺激适应性免疫来起作用，但是其他生物反应调节剂刺激先天性免疫应答，并且因此可以改善对IMI的抵抗。因此期望的是可以在干奶期期间改善产奶动物对乳房内感染的抵抗的生物反应调节剂。
[0007] 壳聚糖是生物活性的、生物相容性的、可生物降解的和无毒的水状胶体，具有止血、抑制细菌和其他有利于一系列的工业和生物医学应用的性能。壳聚糖是包括2-氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(氨基葡萄糖)和2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡萄糖(N-乙酰氨基葡萄糖)的1-4-连接残基的多糖。壳聚糖是通过对天然存在的多糖几丁质(聚-N-乙酰氨基葡萄糖或(1→4)-2-乙酰氨基-2-脱氧-β-D-葡聚糖)的至少部分脱乙酰作用而制备的。所述多糖几丁质天然存在于昆虫和甲壳类如螃蟹和虾中，以及真菌的细胞壁中。因此，乙酰基被从几丁质的至少一些N-乙酰氨基葡萄糖残基中去除，以形成氨基葡萄糖残基。
[0008] 在壳聚糖的商业制备中，通常几丁质的约50％到约100％的N-乙酰氨基葡萄糖残基被脱乙酰化，以形成氨基葡萄糖残基。所述脱乙酰化的氨基葡萄糖残基具有游离氨基，其在pH值6.5以下的水溶液中至少部分地以质子化形式存在。因此，壳聚糖在酸溶液中显著程度地溶解，并且溶解的壳聚糖是阳离子的，使其结合至带负电荷的表面和生物材料。然而，当壳聚糖溶液通过弱碱中和时，壳聚糖可形成水合的、凝胶状的沉淀物。因此，壳聚糖的脱乙酰化作用(DDA)的程度显著影响壳聚糖的性质。发明内容
[0010] 本发明的另一方面提供了加速退化和预防乳房内感染的方法，所述方法包括向干奶时的哺乳动物施用本文所述的生物反应调节剂或其组合物。
[0012] 根据下面的描述和附图，本发明进一步的特征将变得显而易见，其中：
[0014] 图1B为示出浓度为1.5％(w/v)的中等分子量壳聚糖(壳聚糖B)和β-甘油磷酸盐的制剂的剪切依赖性粘度的图；
[0015] 图1C为示出浓度为1.5％(w/v)的高分子量壳聚糖(壳聚糖C)和β-甘油磷酸盐的制剂的剪切依赖性粘度的图；
[0016] 图2为示出浓度(w/v)分别为0.5％、1％及1.5％的低分子量壳聚糖(壳聚糖A)、中等分子量壳聚糖(壳聚糖B)及高分子量壳聚糖(壳聚糖C)和β-甘油磷酸盐的不同制剂的挤压力和挤压能量的条形图；
[0017] 图3为示出制备后立刻(图块a)和制备后一小时(图块b)不同浓度(0.5％、1％及1.5％(w/v))的低分子量壳聚糖(壳聚糖A)和β-甘油磷酸盐的制剂随着温度储能(弹性)模量(G′)和损耗(粘性)模量(G″)的变化的一系列图。G′和G″上升是指当温度增加时的G′和G″的值；G′和G″恒定是指当温度恒定时的G′和G″的值；G′和G″下降是指当温度下降时的G′和G″的值；
[0018] 图4为示出制备后立刻(图块a)和制备后一小时(图块b)不同浓度(0.5％、1％及1.5％(w/v))的中等分子量壳聚糖(壳聚糖B)和β-甘油磷酸盐的制剂随着温度储能(弹性)模量(G′)和损耗(粘性)模量(G″)的变化的一系列图。G′和G″上升、G′和G″恒定和G′和G″下降具有如图3相同的含义；
[0019] 图5为示出制备后立刻(图块a)和制备后一小时(图块b)不同浓度(0.5％、1％及1.5％(w/v))的高分子量壳聚糖(壳聚糖C)和β-甘油磷酸盐的制剂随着温度储能(弹性)模量(G′)和损耗(粘性)模量(G″)的变化的一系列图。G′和G″上升、G′和G″恒定和G′和G″下降具有如图3相同的含义；
[0020] 图6为对于在37℃与水(图块a)、巴氏灭菌全乳(图块b)或超滤全乳(图块c)混合的浓度为1.5％的中等分子量壳聚糖(壳聚糖B)和β-甘油磷酸盐(w/v)的制剂，比较重量损失(左Y轴)和用δ度(δ°； )指示的弹性损失(右y轴)的一系列图；
[0021] 图7A为示出来自在干奶时使用5mL的5％(w/v)的低粘度中等分子量壳聚糖(壳聚糖B)的水凝胶制剂(治疗A；n＝7)、2.5mL的5％(w/v)的低粘度壳聚糖(壳聚糖B)的水凝胶制剂(治疗B；n＝7)、5mL的5％(w/v)的高粘度壳聚糖(壳聚糖B)的水凝胶制剂(治疗C；n＝7)或水(对照；n＝7)输注的奶牛乳房区域的奶和乳腺分泌物中的体细胞数(SCC)随着时间变化的图。治疗时间通过箭头所示。数据呈现为最小均方值±log10-转换值的均数的标准误差；
[0022] 图7B为示出图7A的奶和乳腺分泌物中乳酸脱氢酶(LDH)活性随着时间变化的图；
[0023] 图7C为示出图7A的奶和乳腺分泌物中牛血清白蛋白(BSA)浓度随着时间变化的图；
[0025] 图8A为来自在干奶时使用5mL的2％(w/v)的低粘度中等分子量壳聚糖(壳聚糖B)的水凝胶制剂(治疗D；n＝8)、4g乳头密封剂溶液之后5mL的2％(w/v)的低粘度壳聚糖(壳聚糖B)的水凝胶制剂(治疗E；n＝8)或水(对照；n＝8)输注的奶牛乳房区域的奶和乳腺分泌物中的体细胞数(SCC)随着时间变化的图。治疗时间通过箭头所示。数据呈现为最小均方值±log10-转换值的均数的标准误差；
[0026] 图8B为示出图8A的奶和乳腺分泌物中乳酸脱氢酶(LDH)活性随着时间变化的图；
[0027] 图8C为示出图8A的奶和乳腺分泌物中牛血清白蛋白(BSA)浓度随着时间变化的图；和
[0028] 图8D为示出图8A的奶和乳腺分泌物中乳铁蛋白浓度随着时间变化的图。具体实施方案
[0029] 在至少一个实施方式中，预防乳房内感染的方法包括向干奶时的泌乳的哺乳动物的一个或多个乳头施用生物反应调节剂。在至少一个实施方式中，所述方法包括向泌乳的哺乳动物的一个或多个乳头中注射所述生物反应调节剂。在至少一个实施方式中，所述泌乳的哺乳动物是牛科动物(bovine)。在至少一个实施方式中，所述方法进一步包括施用体内乳头密封剂。在至少一个实施方式中，在注射生物反应调节剂之前、同时或之后，向一个或多个乳头注射所述体内乳头密封剂。
[0030] 在不受理论束缚的情况下，可以预期在乳头池中存在的生物反应调节剂可以诱导免疫细胞流入乳头。在早期退化期期间乳头池中持续迁移的新鲜的免疫细胞被认为帮助预防病原体入侵乳腺。使用体内乳头密封剂连同施用生物反应调节剂可以通过帮助物理上预防细菌进入乳头而提供进一步对乳房内感染的防护。
[0031] 在至少一个实施方式中，在自动退化期期间，生物反应调节剂在乳头中将保持活性，但是在泌乳重新开始之前将被生物降解并从乳头中排除。在至少一个实施方式中，生物反应调节剂将在三周之内在乳头中被生物降解。在至少一个实施方式中，生物反应调节剂可诱导在乳房区域内体内免疫细胞的募集和中度的活化作用，同时避免乳腺的急性炎症症状和/或只引起最少的或中度的炎症症状。
[0032] 因此，在至少一个实施方式中，所述生物反应调节剂可以表现出一个或多个下述优势：
[0033] ·可以诱导免疫细胞的至少中度的募集；
[0034] ·可以避免急性炎症和/或只引起中度或最少的炎症；
[0035] ·可以引起限制于用生物反应调节剂注射的区域的效果；
[0036] ·可以在大部分或全部的自动退化期引起免疫刺激；
[0037] ·可以保持与乳头内部组织接触，即使干奶后的几天内发生奶渗漏；
[0038] ·可以在泌乳开始之前被生物降解和从乳头中排除；以及
[0039] ·可以与体内乳头密封剂结合使用。
[0040] 在至少一个实施方式中，生物反应调节剂包含壳聚糖水凝胶制剂。在至少一个实施方式中，壳聚糖水凝胶制剂通过用弱碱中和壳聚糖酸性溶液形成。在至少一个实施方式中，壳聚糖酸性溶液在以弱碱中和之前pH值为约3。在至少一个实施方式中，弱碱的pKa值为约6到约7。在至少一个实施方式中，弱碱的pKa值为约6.5。在至少一个实施方式中，弱碱是β-甘油磷酸盐。在至少一个实施方式中，壳聚糖水凝胶制剂通过向壳聚糖酸性溶液中添加β-甘油磷酸盐、直到所得混合物的pH约6.8而形成。在至少一个实施方式中，β-甘油磷酸盐是β-甘油磷酸二钠盐。
[0041] 在不受理论束缚的情况下，可以考虑使用具有接近壳聚糖的pKa(pKa是约6.5)的pKa值的弱碱中和壳聚糖酸性溶液，这将允许壳聚糖在室温(约25℃)或低于室温的温度下保持可溶解的，但是当加热例如至接近哺乳动物体温的温度或至约37℃到约39℃的温度时形成水凝胶。
[0042] 在至少一个实施方式中，壳聚糖的脱乙酰化程度为至少90％。在至少一个实施方式中，壳聚糖的重均分子量为约110kD到约250kD。在至少一个实施方式中，壳聚糖的重均分子量为约150kD到约175kD。在至少一个实施方式中，壳聚糖的重均分子量为约160kD到约170kD。在至少一个实施方式中，当在20℃对于1％醋酸中1％壳聚糖溶液测量时，壳聚糖的粘度为约90cP到约130cP。在至少一个实施方式中，壳聚糖在酸性pH下是可溶解的。在至少一个实施方式中，壳聚糖在约3的pH时是可溶解的。
[0043] 在至少一个实施方式中，壳聚糖水凝胶制剂在冷藏温度(从约0℃到约4℃)可保持液态。在至少一个实施方式中，壳聚糖水凝胶制剂在室温(约25℃)可保持液态超过一小时。在至少一个实施方式中，壳聚糖水凝胶制剂在约22℃的温度具有约400g到约800g的挤压力。在至少一个实施方式中，壳聚糖水凝胶制剂在体温(约37℃到约39℃)处形成凝胶。在至少一个实施方式中，在约30分钟内、或在约15分钟内、或在约10分钟内、或在约5分钟内、或在约4分钟内、或在约3分钟内、或在约2分钟内或在约1分钟内，壳聚糖水凝胶制剂在约37℃到约39℃的温度形成凝胶。
[0044] 有利的是，壳聚糖水凝胶在室温保持流质足够量的时间，以允许方便注射进乳头，但是一旦壳聚糖水凝胶注射进乳头内并且达到体温(近似37℃到近似39℃)，凝胶迅速地形成，使得壳聚糖水凝胶在乳头内保持最小的渗漏，并与乳头的内部组织紧密接触，内部组织包括但不限于Furstenberg的玫瑰花结。
[0045] 在至少一个实施方式中，壳聚糖水凝胶在泌乳的哺乳动物的乳头内进行生物降解。在至少一个实施方式中，壳聚糖水凝胶可被奶中存在的酶生物降解，所述酶包括但不限于溶解酵素、N-乙酰-D-氨基葡萄糖苷酶和脂肪酶中的一种或多种。在至少一个实施方式中，壳聚糖水凝胶可在泌乳重新开始之前被生物降解和从乳头中排除。在至少一个实施方式中，壳聚糖水凝胶可在注射进乳头后3周之内在乳头内被生物降解。
[0046] 定义
[0047] 如本文中使用的，术语“乳房”意欲指四足哺乳动物的包含产奶乳腺的器官，四足哺乳动物包括但不限于牛(cattle)、绵羊、山羊、鹿和其他反刍动物。如本文中使用的，术语“区域(quarter)”意欲指牛科动物乳房中四个乳腺中的一个。如本文中使用的，术语“乳头”意欲指奶经过其从乳腺中释放的突起。
[0048] 如本文中使用的，术语“乳腺分泌物”意欲指由乳腺所产生的分泌物，分泌物包括但不限于泌乳期期间的奶和其他可能包含或可能不包含一些奶的分泌物，所述分泌物在干奶期和/或干乳期期间由乳腺产生。乳腺分泌物可保持在乳腺内和/或通过乳头被释放。
[0049] 如本领域技术人员所理解的，当指本文所描述的生物反应调节剂的组合物时，如本文所使用的术语“液态(liquid)”和“流质(fluid)”意欲意指所述组合物适于使用合适尺寸的注射器容易人工注射进乳头。
[0050] 如本文中使用的，术语“约(about)”和“近似(approximately)”意欲指对于考虑到测量的性质或精度测量的量的可接受的误差程度。例如，如本领域理解的，误差程度可以通过测量提供的有效数字的数量来指示，并且误差程度包括但不限于测量所报告的最精确的有效数字中±1的变化。典型例示的误差程度是在给定的值或值范围的百分之20(％)之内、优选地在10％之内和更优选地在5％之内。可替选地，特别是在生物系统中，术语“约”和“近似”可以表示一个数量级之内的值，优选地在给定值的5倍之内，并且更优选地在给定值的2倍之内。除非另有说明，否则本文给出的数字的量均是近似值，这意味着在没有明确说明时，可以推断术语“约”或“近似”。
[0051] 如文中所使用的术语“大致上”是指作用、特征、性质、状态、结构、物品或结果的完全或近乎完全的范围或程度。例如，物体“大致上”被对齐，其意指该物体被完全地对齐，或者被几乎完全地对齐。在一些情况中，与绝对完全可允许的精确的偏差度取决于具体的环境背景。但是，一般而言，接近完全将以便具有与获得绝对和全面完全时相同的总体结果。
[0052] 当“大致上”被以否定含义使用以指作用、特征、性质、状态、结构、物品或结果的完全或近乎完全的缺乏时，“大致上”的使用是等同地适用的。例如，“大致上没有”粒子的组合物可完全缺乏粒子、或是与如同完全缺乏粒子相同的效果的近乎完全缺乏粒子。换句话说，“大致上没有”一种成分或元素的组合物只要不存在其可测量的效果，则实际上仍可包含这个项目。
[0053] 实施例
[0054] 本发明的其它特征从以下非限定性的实施例中将会变得显而易见，实施例以示例的方式阐述了本发明的原理。
[0055] 实施例1：壳聚糖水凝胶制剂的制备
[0056] 从不同分子量和脱乙酰化程度的壳聚糖样品的初步筛选中，选择三种壳聚糖类型以用于进一步测试：
[0057] 壳聚糖A(低分子量或食品级壳聚糖；分子量110kDa，92.5％脱乙酰化，G.T.C.Union Group-Bio Corp.，青岛，中国)
[0058] 壳聚糖B(中等分子量或酸可溶性壳聚糖；分子量166.7kDa，91.6％脱乙酰化，Qingdao Yuda Century Economy And Trade Co.,Ltd.，青岛，中国)；以及
[0059] 壳聚糖C(高分子量或高密度壳聚糖；分子量250kDa，95.6％脱乙酰化，G.T.C.Union Group-Bio Corp.，青岛，中国)。
[0060] 浓度(重量/体积)为0.5％、1％和1.5％的每种壳聚糖类型(A、B和C)的水凝胶制剂通过向80mL水中添加壳聚糖并且通过添加6.00N HCl调节混合物的pH至约3来制备。使混合物在室温静置过夜，通过添加50％(w/v)的β-甘油磷酸盐水溶液调节pH至约6.8，并且通过添加水将最终溶液的体积调节到100mL。
[0061] 实施例2：壳聚糖水凝胶的流变性质
[0062] 使用AR1000流变仪(TA Instrument,New Castle,DE,U.S.A.)测量包含如实施例1所述制备的壳聚糖水凝胶制剂的大量介质在22℃的流动特性指数(n)、稠度系数(m)和表观剪切黏度(ηγ)作为在0.1/s到100/s范围内的剪切速率的函数。包含1.5％w/v的壳聚糖A、B和C的制剂的粘度对剪切速率的图在图1A-C中显示。
[0063] 制剂的动力学特性，包括储能模量(G′)、损耗模量(G″)和δ度(δ°； )，在恒定温度(室温)随着频率(1-25rad/s)的变化，使用AR1000流变仪(TA Instrument,New Castle,DE,U.S.A.)通过下述步骤评估：首先在1Hz的恒定频率将压强从0.01Pa增加到100Pa，然后在1Pa的恒定压强以1-100rad/sec增加频率，以确保施加的应力和频率在线性区域内。弹性保持用表观δ度 表示，并且在升高的施加频率(25rad/s)下比较。结果如表1中所示：
[0064] 表1：壳聚糖制剂的幂律流变学参数(平均值±标准差)
[0065]
[0066]
[0067] 1A＝壳聚糖A；B＝壳聚糖B；C＝壳聚糖C
[0068] n：流动特性指数
[0069] m：稠度系数
[0070] ηo：牛顿粘度(0.1/s)
[0071] G’：储能(弹性)模量
[0072] G”：损耗(粘性)模量
[0073] δ°：δ度
[0074] 如图1A-C所示，所有测试的具有1.5％壳聚糖浓度的制剂显示出在低剪切速率下的恒定粘度(牛顿粘度，ηo或静置时粘度)，以及在更高剪切速率下的假塑性、剪切稀化(shear-thinning)或幂律特性，其中随着剪切速率增加，粘度降低。如表1所示，流动特性指数(n)的值对于每一种制剂没有(less than)一致性(unity)，进一步表明壳聚糖制剂是剪切稀化的。随着制剂中壳聚糖的分子量的增加(壳聚糖A<壳聚糖B<壳聚糖C)，粘度变得更加依赖于剪切速率，并且制剂变得更加假塑性。表现出更高假塑性特性的制剂可能在较高剪切下更容易被泵入或注射。此外，随着在每种制剂中壳聚糖浓度从0.5％增加到1.5％(w/v)，流动特性指数降低并且稠度系数(m)降低，这表明较低浓度的混合物更容易流动。
[0075] δ度(δ°)或相移角与消耗模量(G″，粘性性质的量度)对储能模量(G′，弹性性质的量度)的比例相关。对于完全粘性非弹性的系统，δ°的值是90°，而对于完全弹性的系统，δ°的值是0°。因此，在0°和90°之间的δ°值指示系统的相对弹性和粘度。此外，当物质的G′和G″的值作为频率和一些其他参数的函数发生改变时，在G′和G″彼此“交叉”的点代表液态和凝胶相之间的转化点。如表1所示，包括壳聚糖B和壳聚糖C二者的制剂的储能(弹性)模量G′大于损耗(粘性)模量G″(G′>G″)，并且因此所得的 小于45°，这证实了凝胶形成是可能的。而包括壳聚糖A的制剂的值表现出损耗(粘性)模量G″高于储能(弹性)模量G′，并且因此所得的 比45°的胶凝点高得多。
[0076] 实施例3：挤压力和能量
[0077] 使用类似于Leon等人(2016),Journal of Food Engineering,188,1-7所报道的方法确定转移(displace)如实施例1所述制备的壳聚糖水凝胶制剂所需的力和能量。装备有长度30mm和直径13.5mm的塞子与开口1mm和长度30mm的管口(nuzzle)的长度84mm和内部直径14mm的10mL注射器被改装为挤压单元。对于每种制剂，在凝胶化之前和凝胶化之后，将5mL具有32mm高度的每种制剂样品或作为对照的5mL蒸馏去离子(DDI)水置于注射器内并使用质构分析仪(Texture Technology,New Jersey)，在5秒内挤压出26mm。
[0078] 挤出制剂所需的力和能量在图2中显示。大体上，所有壳聚糖制剂的挤压力和挤压能量两者都大于水的挤压力和挤压能量。此外，挤压力的值和挤压能量的值与壳聚糖(具有最低分子量的壳聚糖A和具有最高分子量的壳聚糖C)的浓度和分子量两者一起增长。这些结果与所观察到的假塑性增加一致，如随着壳聚糖分子量的增加，流率和稠度系数增加所指示的(表1)。
[0079] 实施例4：热诱导的壳聚糖水凝胶的液态-凝胶转变
[0080] 通过确定G′和G″彼此“交叉”的温度，经由动力学流变测定法测量如实施例1所述制备的壳聚糖水凝胶制剂的热诱导相变(液态至凝胶)。在从22℃加热升高至37.5℃期间，在37.5℃的恒定温度保持3min以及从37.5℃冷却下降到22℃，评估G′和G″的温度进展。通过将5mL如实施例1所述制备的每种壳聚糖水凝胶制剂放置于渗析袋中并且在渗析袋的中心点插入热电偶校准达到期望温度所花费的时间。然后将渗析袋浸入水浴中，并记录渗析袋中溶液的温度从22℃增加到37.5℃所需的时间。对根据实施例1制备的制剂在制备后立刻进行实验和在室温静置1小时后进行实验。在测量期间，压强保持1Pa恒定并且频率保持1Hz恒定。结果在图3、4和5中显示。在图3到图5的每个图中，图块a)示出每种制剂制备后立刻进行的测量，而图块b)示出制剂已在室温保持1小时后进行的测量。
[0081] 如图3到图5所示出，随着温度的增加和制剂中壳聚糖的浓度以及分子量的增加，由储能(弹性)模量G′表示的凝胶强度增加。此外，对于壳聚糖A和壳聚糖C的制剂，可以看出在制剂在室温保持1小时后凝胶强度显著增加。而甚至在室温静置1小时后，壳聚糖B的制剂的凝胶强度仍然保持相对恒定。因此，壳聚糖B的制剂表现出更可预测的和一贯的凝胶特性，并且被选择用于进一步的测试。
[0082] 实施例5：接触水和奶的壳聚糖水凝胶制剂的稳定性
[0083] 在37℃和在约6.5的pH处，向5mL的水、巴氏灭菌全乳和超滤全乳中各自添加单独份的5mL如实施例1所述制备的含有1.5％(w/v)壳聚糖B的水凝胶制剂。混合物在37℃储存7天(开始储存是第0天)。在第1-7天的每一天收集每种混合物的样品(n＝3)，通过预称重漏斗筛过滤并允许其沥干60分钟，以分离凝胶与液态介质。称量包含沥干的凝胶的筛的重量，凝胶的重量使用下式计算：
[0084] 凝胶的重量＝包含凝胶的筛的重量-筛的重量
[0085] 此外，在储存期间，通过测量如实施例2所述的δ度 每天两次(in duplicate)测定水凝胶制剂和介质(水或奶)的混合物的搅拌样品的弹性损耗。结果在图6中显示。
[0086] 如图6所示，在第1天接触奶的壳聚糖水凝胶样品表现出重量更大的增加，并且在随后的几天，接触奶的壳聚糖水凝胶样品显示比接触水的样品更快速的重量损失。据信，壳聚糖已与奶中的酪蛋白反应形成凝固的酪蛋白微团，凝固的酪蛋白微团最初增加到沥干的凝胶的重量中。但是，随着持续接触奶，壳聚糖凝胶出现降解并且其重量降低。
[0087] 另外，接触水和奶两者导致弹性损耗，如δ度的增长所证明的。在37℃接触水7天导致δ度从第一天的21.46°的值增长到第7天的42.19°的值。然而，该值仍然保持在45°以下，这表明在水介质中保持凝胶网络。在巴氏灭菌奶存在的情况下，观察到相似的弹性损耗。然而，在超滤奶存在的情况下，壳聚糖制剂在37℃在第3天之后基本丧失了其形成凝胶的能力，并且截止第7天，显示出74.67°的δ度值，这表现出几乎完全的粘性特性和高的弹性损耗。结果表明壳聚糖水凝胶制剂在几天或数天之内在奶牛的乳头中可经历降解，并且因此在随后的泌乳开始之前从乳头中被清除。
[0088] 实施例6：壳聚糖水凝胶的抑菌性质
[0089] 通过监测包含壳聚糖水凝胶的细胞培养基的浑浊度(在640nm的吸光度)随着时间的变化，评估壳聚糖水凝胶对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株、乳房链球菌(Streptococcus uberis)菌株和大肠杆菌(Escherichia coli)菌株的抑菌活性。
[0090] 进行测试，以评估浓度和储存条件(温度和时间)对壳聚糖水凝胶的抗微生物性质(杀菌和/或抑菌)的影响。测试在含有5g如实施例1所述制备的水凝胶制剂的10mL注射器中进行。一半包含1.5％壳聚糖浓度的水凝胶且另一半包含2.0％壳聚糖浓度的水凝胶。对于每种浓度，一半在4℃存储且另一半在22℃存储。对于每种浓度和温度将注射器存储1h、48h或168h。存储之后，水凝胶被施加在用200μL感染的奶预接种的胰酶解大豆酪蛋白胨琼脂上，然后在37℃培养48小时。在培养后，观察平板。对于所有治疗，与琼脂的存在菌落的其他部分相比较，在施加水凝胶的精确位置处未观察到细菌生长。
[0091] 实施例7：在晚期泌乳的奶牛中乳房内输注壳聚糖水凝胶
[0092] 统计学分析
[0093] 使用SASTM软件9.0版(SAS Institute Inc.,Cary,NC)的MIXED程序，通过ANOVA分析数据。时间用作重复效应，并且治疗(奶牛)用作受试者(subject)。对于炎症的分数，进行正交对比来比较每种治疗的效果和对照的效果。对于其他参数，使用下面的对比：治疗A+B+C与对照；治疗A+B与治疗C；和治疗A与治疗B。使用Tukey–Kramer调节进行其他治疗的比较。当变化不均匀时，在分析之前对数据进行log10-转换。当P≤0.05时认为差异具有统计学上的显著性，并且当P<0.1时认为差异具有一个趋向。
[0094] 壳聚糖水凝胶治疗的准备
[0095] 所有治疗在层流净化罩中以无菌的、无热原的产品和材料准备。高粘度(130-厘泊)和低粘度(90-厘泊)的酸可溶解的壳聚糖(如上述实施例1所描述的壳聚糖B，分子量166.7kDa，91.6％脱乙酰作用)由青岛世纪经济贸易有限公司(市北区，青岛，中国)提供。对于壳聚糖的每个浓度(2％和5％(w/v))，通过添加120mL无热原的水(<0.005内毒素单位/mL；Lonza,Walkersville,MD)到预称重的壳聚糖中制备200mL溶液。溶液用金属搅拌棒以
200rpm搅拌。通过添加0.1M HCl(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO)使溶液的pH降至3。使制剂在室温保持过夜以用于完全水合。第二天，使用β-甘油磷酸二钠盐水合物(Sigma-Aldrich Co.)的50％(w/v)溶液使制剂的pH调整至6.8。然后，通过添加无热原的水(Lonza)使体积调整至200mL，以形成水凝胶制剂。将塑料注射器填充所需的体积、用盖子密封、并在室温储存。
200rpm搅拌。通过添加0.1M HCl(Sigma-Aldrich Co.,St.Louis,MO)使溶液的pH降至3。使制剂在室温保持过夜以用于完全水合。第二天，使用β-甘油磷酸二钠盐水合物(Sigma-Aldrich Co.)的50％(w/v)溶液使制剂的pH调整至6.8。然后，通过添加无热原的水(Lonza)使体积调整至200mL，以形成水凝胶制剂。将塑料注射器填充所需的体积、用盖子密封、并在室温储存。
[0096] 动物的治疗和样品的收集
[0097] 使用7头每天产奶多于15kg(平均22.6kg±1.9kg)的晚期泌乳(干奶时产奶天数(DIM)为319±29天)的荷斯坦(Holstein)奶牛。奶牛每天挤奶两次并工程化，或真正的305天奶产量是9312±749kg。同时，奶牛组在母牛预产期前90±17天干奶。在干奶之前(d-4)，区域体细胞数(SCC)平均为122,693±34,520细胞/mL。干奶前，给奶牛随意喂食晚期泌乳饮食。干奶后，给奶牛随意喂食干乳期饮食和干草。在整个实验期间，可以自由饮水。
[0098] 在干奶时，每个乳房区域随机地分配4种乳房内输注液中的1种，4种乳房内输注液如下：5mL 5％(w/v)的低粘度壳聚糖的水凝胶制剂(治疗A；n＝7)、2.5mL 5％(w/v)的低粘度壳聚糖的水凝胶制剂(治疗B；n＝7)、5mL 5％(w/v)的高粘度壳聚糖的水凝胶制剂(治疗C；n＝7)或无热原的水(Lonza)(对照；n＝7)。在输注之前，在顶部压住乳头以使得输注的制剂保留在乳头内。
[0099] 刚好在相对于干奶的第-4天早晨挤奶之前以及在干奶之前最后挤奶(第-1天)之前从每个区域手动收集奶样品(200mL)。在最后挤奶后的第1天、第3天、第5天、第7天和第10天从每个区域无菌地手动收集乳腺分泌物(100mL)。
[0100] 炎症反应
[0101] 对于在输注后的前12h每2h评估区域的炎症症状，然后再接下来的7d里每天3次(0900、1300和1900h)评估区域的炎症症状。根据由Rambeaud等人的(2003)Vet.Immunol.Immunopathol.96:193–205创建的乳腺图，将炎症评分为1到6，评分如下：1＝正常；2＝轻微肿胀；3＝中度肿胀；4＝严重肿胀；5＝疤痕组织；及6＝水肿。同时测定直肠温度。
[0102] 在表2中列出了输注后从0h至24h、25h至48h、49h至170h的时段乳房区域炎症评分。数据呈现为最小均方值。
[0103] 表2：平均炎症评分
[0104]
[0105] 1SEM＝均数的标准误差
[0106] 在0-24h的时期，用治疗A(P<0.01)和治疗B(P<0.01)处理的区域中的平均炎症评分稍微大于对照区域。而依据炎症评分，用治疗C处理的区域未显著(P>0.1)不同于对照区域。在24h后未观察到炎症评分的差异(P>0.1)。结果表明用壳聚糖治疗，如果有的话，仅与早期温和的和暂时的炎症症状有关联，并且不会引起严重的乳腺炎症。
[0107] 细菌的浓度
[0108] 将收集后的奶和乳腺分泌物在胰蛋白酶大豆琼脂、甘露醇盐琼脂和MacConkeyΙΙ琼脂(Becton,Dickinson and Company,Mississauga,ON,Canada)上铺平板。然后在菌落计数之前，将平板在37℃培养24h。病原体感染的奶牛乳房区域从试验中排除。因此，用治疗B处理的四分之一区域在第5天、第7天和第10天表现出细菌感染，因此在这些天来自这个区域的数据从进一步分析中删除。
[0109] 体细胞数
[0110] 在早期退化的期间，体细胞的数目增加，并且增加数目的免疫细胞对乳腺防御是重要的。在位于乳头管内部末端的Furstenberg的玫瑰花结处，免疫细胞进入乳头池，以在细菌到达乳腺前阻止入侵的细菌。在干奶期期间增加体细胞数(SCC)的治疗预期改善乳腺抵抗入侵的病原体的防御。表现出细菌感染的区域从分析中排除，以使细菌感染作为增加SCC的原因被排除。
[0111] 使用自动细胞计数器(DeLaval International AB,Tumba,Sweden)从新鲜的全乳样品和乳腺分泌物样品中测定体细胞数(SCC)。用市售的微量过滤的脱脂乳稀释乳腺分泌物样品，直到获得在100到200细胞/μL之间的体细胞数。
[0112] 结果在图7A中显示。在预治疗期间(在第-4天和第-1天)观察到各个区域之间没有差异(P>0.1)。不管治疗与否，体细胞数从干奶的那天(第-1天)到第10天增加(P<0.001)。然而，在第1天到第5天所有壳聚糖治疗的区域的体细胞数高于(P<0.001)对照区域。除了在第1天，与以治疗C(P<0.01)处理的区域的SCC相比，以治疗A和治疗B处理的区域中的SCC更大。
因此，壳聚糖治疗与在干奶时更快速的免疫细胞释放增加相关。
因此，壳聚糖治疗与在干奶时更快速的免疫细胞释放增加相关。
[0113] 乳房退化的标记物
[0114] 随着奶产量的降低，上皮细胞之间紧密连接的渗透性增加，这允许间隙空间和牛奶或乳腺分泌物之间的细胞旁路传输(paracellular transport)。这种传输可以通过测量牛奶或乳腺分泌物中的血清白蛋白和免疫球蛋白的浓度来评估。
[0115] 同样，随着乳腺分泌组织的退化，牛奶分泌物的组成发生变化。例如，随着退化的进行，上皮细胞产生更多的乳铁蛋白。乳铁蛋白至少部分地通过破坏革兰氏阴性细菌的外膜和结合铁，以致铁依赖性细菌不能获得铁，来充当保护乳腺的免疫因子。
[0116] 另外，由于白细胞具有高的LDH活性，释放白细胞进入乳腺分泌物可通过测量乳酸脱氢酶(LDH)活性来表示。增加的LDH活性还与乳房上皮细胞的损伤相关。
[0117] 因此，测量奶和乳腺分泌物中的乳酸脱氢酶活性以及牛血清白蛋白和乳铁蛋白的浓度可以提供乳腺退化和免疫细胞释放的进程的指示。
[0118] 通过离心(1,000×g，4℃，20分钟)从奶和乳腺分泌物样品中分离出脱脂乳和体细胞。在测定乳酸脱氢酶(LDH)活性、牛血清白蛋白(BSA)浓度和乳铁蛋白浓度之前，脱脂乳等份储存在-20℃。
[0120] 结果在图7B中显示。在预治疗期间(在第-4天和第-1天)在各区域之间未观察到差异(P>0.1)。不管是否治疗，从干奶时的这天(第-1天)到第10天(第10天)LDH活性增加(P<0.001)。在第1天到第7天，用壳聚糖治疗的区域(P>0.1)的LDH活性比对照区域更高，但是在壳聚糖治疗的区域之间没有差异。
[0121] 奶和乳腺分泌物样品中BSA的浓度由如先前Bouchard等人的(1999),J.Dairy Sci.82:2574–2581描述的经过一些改进的比色测定法评估。简要地说，将200μL脱脂乳样品与450μL水和450μL包含1体积的溶解在5mM NaOH中的1.2mM溴甲酚绿、3体积的0.2mM丁二酸(pH4.0)和0.8％Brij-35洗涤剂的溶液混合。然后通过倒置混合样品并在室温下离心分离(1,900×g，10分钟)。使用SpectraMaxTM 250酶标仪(microplate reader)(Molecular Devices,Sunnydale,CA)在640nm读取上清液的光密度。批内和批间的变异系数分别为4.6％和7.6％。
[0122] 结果在图7C中显示。在预治疗时期期间(在第-4天和第-1天)在各区域之间未观察到差异(P>0.1)。不管是否治疗，从干奶时的这天(第-1天)到第10天，BSA浓度增加(P<0.001)。在第1天到第5天，用壳聚糖治疗的区域中的BSA浓度比对照区域中的更高(P<
0.001)，但是在壳聚糖治疗的区域之间没有差异。
0.001)，但是在壳聚糖治疗的区域之间没有差异。
[0123] 脱脂乳和乳腺分泌物中的乳铁蛋白浓度使用市售的牛乳铁蛋白ELISA定量装置(Bethyl Laboratories Inc.,Montgomery,TX)通过ELISA测量。批内和批间的变异系数分别为4.6％和5.9％。
[0124] 结果在图7D中显示。在预治疗时期期间(在第-4天和第-1天)在各区域之间未观察到差异(P>0.1)。不管是否治疗，从干奶的这天(第-1天)到第10天乳铁蛋白浓度增加(P<0.001)。与对照区域相比，在第3天(P<0.001)和第5天(P<0.01)所有壳聚糖治疗的区域中的乳铁蛋白浓度更高，但是在壳聚糖治疗的区域之间没有差异。
[0125] 通过流式细胞术鉴定体细胞
[0126] 对在第-1天和第1天收集的样品进行体细胞的七色免疫分型。用20mL PBS 1X稀释奶样品(20mL)并离心(1,000×g，23℃，15分钟)。移除上清液并将团块(pellet)重悬于15mL洗涤缓冲液中，其中洗涤缓冲液由PBS 1X+1％BSA(Sigma-Aldrich Co.)+2％普通山羊血清(Meridian Life Sciences,Memphis,TN)组成。然后将混合物离心(500×g，4℃，10分钟)。用25mL洗涤缓冲液重复清洗细胞，直到观察到不再有脂肪。添加洗涤缓冲液至细胞团块中达到近似1×107体细胞/mL的浓度。用每个样品的100μL制备对照库(control pool)。每个样品的100μL体积和库(pool)转移到96孔圆底平板中。离心平板(300×g，4℃，5分钟)，并移除上清液。如表3列出的，细胞悬于100μL含有第一抗体的洗涤缓冲液中。
[0127] 表3：用于体细胞鉴定的抗体
[0128]
[0129] 1PE＝藻红蛋白
[0130] Cy＝青色素
[0131] FITC＝异硫氰酸荧光素
[0132] APC＝别藻蓝蛋白
[0133] 2维吉尼亚州立大学(WSU)单克隆抗体中心,普尔曼,华盛顿州
[0135] 4BioLegend,圣地亚哥,美国
[0136] 5AbD Serotec,罗利,NC
[0137] 6Jackson ImmunoResearch,West Grove,PA
[0138] 将平板在暗室中在冰上孵育25分钟。然后用洗涤缓冲液洗涤细胞3次。将平板离心(300×g，4℃，3分钟)，并将细胞用100μL含有第二抗体混合物的洗涤缓冲液重悬。将平板再一次在暗室中在冰上孵育25分钟，并将细胞洗涤3次。将细胞重悬于200μL洗涤缓冲液中。
[0139] 在以4-2-2构造配备有3个激光器的BD FACSCantoTM II流式细胞分析仪(BD Biosciences,Mississauga,ON,Canada)上立刻分析样品。BD FACSDivaTM 8.0.1版本操作软件(BD Biosciences)用于数据采集和数据分析。测定在粒细胞、单核细胞和淋巴细胞(表3)上发现的携带独特受体的每种体细胞类型的比例。通过使用其他特定受体评价T-淋巴细胞和非-T-淋巴细胞的亚类。在设计实验期间，选择荧光探针以最小化在所分析的不同类型的细胞内部待被完成的荧光补偿的量。试验开始之前，将每种第一抗体以第二抗体进行滴定并测试与第二抗体的交叉反应性。没有任一第一抗体表现出第二抗体的交叉反应或非特异性结合。最后，单一染色标记物和FMO(荧光扣除对照(Fluorescence Minus One))混合物用于测定所有通道(gate)。
[0140] 结果显示于表4中。数据呈现为最小均方值。
[0141] 表4：体细胞类型的百分率
[0142]
[0143] 1SEM＝均值的标准误差
[0144] 2TRT＝治疗
[0145] 在干奶后，单核细胞的比例减少(P<0.001)和粒细胞的比例增加(P<0.001)。然而，对于这些细胞群的比例，相对于对照，壳聚糖治疗未表现出效果。
[0146] 免疫调节剂的表达
[0147] 随着乳腺免疫系统被激活，乳房免疫中的免疫调节基因的表达和上皮细胞增加。细胞产生和释放促炎细胞因子，其增加巨噬细胞和中性粒细胞的杀菌能力。因此，通过体细胞测量关键免疫调节基因的表达水平可指示乳房免疫系统的激活程度。
[0148] 在壳聚糖治疗之后的第1天、第3天和第5天通过体细胞测定关键免疫调节基因的表达。所研究的基因是CXCL8[趋化因子(C-X-C基序)配体8]、CCL2[趋化因子(C-C基序)配体2]、TNF(肿瘤坏死因子)、CD14(CD14分子)和IL1β(牛白细胞介素1β)。也选择基因ACTB(肌动蛋白，β)、GAPDH(甘油醛-3-磷酸脱氢酶)、PPIA(肽基脯氨酰异构酶A)和YWHAZ(酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，Z)，用于作为基因表达的归一化的潜在持家基因进行测试。
[0149] 通过离心(1,000×g，4℃，20分钟)从奶和乳腺分泌物样品中分离脱脂乳和体细胞。将团化的体细胞用10mL磷酸盐缓冲盐水(PBS)(Mediatech,Manassas,VA)洗涤，并离心(500×g，4℃，10分钟)。PBS被丢弃，并将细胞团块悬浮于250μL的PBS中。然后，将样品稳定TM在1mL的RNAlater 溶液(Sigma-Aldrich Co.)中并在提取RNA之前储存在-80℃。
[0150] 根据制造商的说明书，使用PureLinkTM RNA Mini试剂盒和TRIzolTM RNA分离试剂(Life Technologies,Carlsbad,CA)从体细胞(-80℃样品)中提取总RNA。提取过程包括用PureLinkTM DNase(Life Technologies)柱上消化来去除可能的DNA污染。根据制造商的说明书，使用ND1000分光光度计(NanoDrop Technologies Inc.,Wilmington,DE)通过分光光度分析评估RNA的浓度和纯度，并且使用Agilent RNA600Nano试剂盒(Agilent Technologies)以Agilent 2100 Bioanalyzer系统评估RNA完整性。根据制造商的协议使用RNA Clean&ConcentratorTM-5(Zymo Research,Irvine,CA)浓缩包含小于31.25ng/μL的样品。
[0151] 根据制造商的协议使用TransScriptTM First-Strand cDNA Synthesis Super Mix(TransGen Biotech,北京,中国)进行逆转录。从所得的cDNA，使用3.5μL的每种样品用来制作一个库(116个样品)。剩下的cDNA在水中按1:15稀释。3μL的cDNA、5μL的Fast SYBRTM Green PCR Master Mix(Applied Biosystems Inc.,Foster City,CA)和2μL的引物(Applied Biosystems Inc.)的混合物用来扩增和定量。引物浓缩物列在表5中。
[0152] 表5：在实时PCR期间使用的引物
[0153]
[0154] 1ACTB＝肌动蛋白,β；
[0155] CCL2＝趋化因子(C-C基序)配体2；
[0156] CD14＝CD14分子；
[0157] CXCL8＝趋化因子(C-X-C基序)配体8；
[0158] GAPDH＝甘油醛-3-磷酸脱氢酶；
[0159] IL1β＝牛白细胞介素1β；
[0160] PPIA＝肽基脯氨酰异构酶A；
[0161] TNF＝肿瘤坏死因子；
[0162] YWHAZ＝酪氨酸3-单加氧酶/色氨酸5-单加氧酶激活蛋白，Z。
[0163] 2引物是a)从Dudemaine等人的(2014)Anim.Genet.45:629–640中得到的或b)根据Brosseau等人的(2010)RNA 16:442–449的引物设计使用Ensembl基因浏览器设计的(Yates等人,(2016),Nucleic Acids Res.44:D710–D716)。
[0164] 3在最佳化反应期间测试范围为50nM到900nM的引物浓度。
[0165] PCR条件包括在95℃变性20s，然后在95℃进行3s和在60℃进行30s的40个循环的扩增。使用来源于库的连续稀释的标准曲线，以在StepOnePlusTM实时PCR系统(Applied Biosystems Inc.)上运行的标准曲线实验定量样品。
[0166] 使用NormFinderTM软件(Andersen等人,(2004),Cancer Res.64:5245–5250)测试基因ACTB、GAPDH、PPIA和YWHAZ。在治疗之间，PPIA和YWHAZ基因的表达表现出较小的变化，因此那些基因被选择作为持家基因。归一化的值获得自感兴趣的基因的表达和各个的持家基因的几何平均数的比率。
[0167] 结果在表6中呈现。数据呈现为log10-转换值的最小均方值。在治疗之间，不同字母指示显著的差异(P<0.05)。
[0168] 表6：体细胞基因的归一化表达
[0169]
[0170]
[0171] 1SEM＝均数值的标准误差
[0172] 对于所有基因的表达，观察到治疗×天的相互作用(P<0.01)。对于CXCL8(P<0.001)、TNF(P＝0.09)和IL1β(P＝0.04)在第1天的基因表达大于第3天的基因表达。与第5天相比，CXCL8、CCL2、TNF、CD14和IL1β在第1天的基因表达更大。在第1天，以壳聚糖治疗的区域(治疗A、B和C)具有比对照区域更大的CXCL8(P<0.001)、CCL2(P<0.01)、TNF(P<0.001)、CD14(P<0.001)和IL1β(P<0.01)的表达。在第3天，以壳聚糖治疗的区域比对照区域具有更大的TNF(P<0.01)的表达。与对照区域相比，在第5天，以壳聚糖治疗的区域(治疗A、B和C)具有更大的CXCL8(P＝0.02)的表达，并且倾向于具有更大的TNF(P＝0.09)和CD14(P＝0.08)的表达。与以低粘度壳聚糖治疗的区域(治疗A和B)相比较，在第1天，以高粘度壳聚糖治疗的区域(治疗C)具有更大的CXCL8(P<0.01)、CCL2(P<0.01)、TNF(P<0.01)、CD14(P＝0.09)和IL1β(P＝0.06)的表达，在第3天，以高粘度壳聚糖治疗的区域(治疗C)具有更大的TNF(P<
0.01)和CD14(P<0.001)的表达，以及在第5天，以高粘度壳聚糖治疗的区域(治疗C)具有更大的IL1β(P<0.01)的表达。在第5天，以治疗A(5mL)治疗的区域具有比以治疗B(2.5mL)治疗的那些区域更大的IL1β(P<0.01)的表达。
0.01)和CD14(P<0.001)的表达，以及在第5天，以高粘度壳聚糖治疗的区域(治疗C)具有更大的IL1β(P<0.01)的表达。在第5天，以治疗A(5mL)治疗的区域具有比以治疗B(2.5mL)治疗的那些区域更大的IL1β(P<0.01)的表达。
[0173] 这些结果表明壳聚糖水凝胶输注加速乳腺退化，并引起激活的免疫细胞持续进入乳腺，其可降低在干奶期期间获得新的乳房内感染的风险。
[0174] 实施例8：在存在或不存在乳头密封剂的情况下在晚期泌乳的奶牛中乳房内输注壳聚糖水凝胶
[0175] 统计学分析
[0176] 使用SASTM软件9.0版的MIXED程序(SAS Institute Inc.,Cary,NC)作为因子设计，其中壳聚糖和乳头密封剂作为主要因子，通过ANOVA分析数据。时间用作重复效应，并且密封剂*壳聚糖(奶牛)用作受试对象。当变化不均匀时，在分析之前数据进行log10-转换。当P≤0.05时认为差异具有统计学上的显著性及当P<0.1时认为差异具有一个趋向。
[0177] 动物的治疗和样品收集
[0178] 使用8头每天产奶多于15kg(平均20.5kg±1.1kg)的晚期泌乳中的(干奶时的DIM为328±17)的荷斯坦奶牛。奶牛每天挤奶两次并工程化，或真正的305天奶产量是10,881±1359kg。同时，奶牛组在预产期前62±4天干奶。在干奶之前(d-4)，区域SCC平均为87,654±
23,287细胞/mL。
23,287细胞/mL。
[0179] 在干奶时，每个乳房区域随机地分配4种乳房内输注液中的1种，4种乳房内输注液如下：5mL 2％(w/v)的如实施例7中所述制备的低粘度壳聚糖的水凝胶制剂(治疗D；n＝8)、4g的OrbesealTM乳头密封剂溶液接着5mL 2％(w/v)的低粘度壳聚糖的水凝胶制剂(治疗E；n＝8)、4g的OrbesealTM乳头密封剂溶液(治疗F；n＝8)或无热原的水(对照；n＝8)。
[0180] 如实施例7所述，收集、制备、储存和分析在第-4天和第-1天的奶样品(200mL)以及第5天和第10天的乳腺分泌物。
[0181] 炎症反应
[0182] 如实施例7测量炎症反应，并且结果在以下表7中示出。数据呈现为最小均方值±最小均方值的标准误差。
[0183] 表7：平均炎症分数
[0184]
[0185] 1Seal＝治疗D+CTRL(没有密封剂)与治疗E+F(包括密封剂)
[0186] Chi＝治疗D+E(包括壳聚糖)与治疗F+CTRL(没有壳聚糖)
[0187] Seal×Chi＝治疗D+F(仅壳聚糖或仅密封剂)与治疗E+CTRL(密封剂+壳聚糖，或既没有壳聚糖又没有密封剂)
[0188] 在第一治疗期，治疗后的0-24h期间，通过壳聚糖(治疗D和治疗E)增加了乳房区域炎症评分(P<0.01)(表7)。对于炎症评分，密封剂没有作用或没有与壳聚糖之间的相互作用(P>0.1)。在第一天之后，密封剂和壳聚糖皆未影响炎症评分(P<0.1)。
[0189] 体细胞数
[0190] 如实施例7测定体细胞数(SCC)，并且结果在以下表8A中示出。在预治疗期(在第-4天和第-1天)期间，在乳房区域之间的SCC未观察到差异。此外，在每个区域中，SCC从干奶的那天(第-1天)到第10天增加(P<0.001)。然而，对于SCC观察到了壳聚糖×时间的相互作用(P<0.001)。在第5天，来自壳聚糖治疗的区域的奶具有比没有壳聚糖的区域更大的SCC(P<0.001)。输注密封剂未与壳聚糖相互作用或对SCC不产生影响(P>0.1)。
[0191] 乳腺退化的标记物
[0192] 如实施例7测量BSA、LDH和乳铁蛋白的水平，并且结果在下表8B-D中示出。对于LDH活性，批内和批间的变异系数分别为2.3％和4.8％；对于BSA浓度，批内和批间的变异系数分别为1.1％和3.1％；以及对于乳铁蛋白浓度，批内和批间的变异系数分别为4.5％和6.3％。
[0193] 在预治疗期(在第-4天和第-1天)期间，观察到在乳房区域之间任意BSA、LDH或乳铁蛋白的水平没有差异。此外，在每个区域中，BSA、LDH和乳铁蛋白的水平从干奶的那天(第-1天)到第10天增加(P<0.001)。然而，对于BSA浓度(P<0.01)、乳铁蛋白浓度(P＝0.06)和LDH活性(P<0.001)，观察到壳聚糖×时间的相互作用。在第5天，来自壳聚糖治疗的区域(治疗D和E)的奶比没有壳聚糖治疗的区域(治疗F和对照)具有更多的BSA(P<0.01)、乳铁蛋白(P＝0.001)和LDH(P<0.0001)。输注密封剂与壳聚糖没有相互作用或对任意BSA、LDH或乳铁蛋白的水平不产生影响(P>0.1)。
[0194] 通过流式细胞术鉴定体细胞
[0195] 如实施例7进行体细胞鉴定，除了对在第-1天和第5天收集的样品进行体细胞的七色免疫分型。结果在表8中显示。数据呈现为最小均方。
[0196] 表8：体细胞类型的百分率
[0197]
[0198] 1Seal＝治疗D+CTRL(没有密封剂)对治疗E+F(包括密封剂)
[0199] Chi＝治疗D+E(包括壳聚糖)对治疗F+CTRL(没有壳聚糖)
[0200] Seal×Chi＝治疗D+F(仅壳聚糖或仅密封剂)对治疗E+CTRL(密封剂+壳聚糖，或既没有壳聚糖也没有密封剂)
[0201] 在干奶后，单核细胞的比例减少(P<0.001)和淋巴细胞加其他细胞类型(P<0.01)的比例减少。而在干奶后粒细胞的比例增加(P<0.001)。壳聚糖或乳头密封剂对这些细胞群体的比例没有作用。
[0202] 免疫调节剂的表达
[0203] 如实施例7，在治疗后第5天进行通过体细胞表达关键免疫调节剂基因，除了GAPDH和YWHAZ选择作为持家基因。结果在以下表9中显示。数据呈现为log10-转换的值的最小均方值。不同字母指示治疗之间的显著差异(P＜0.05)。
[0204] 表9：体细胞基因的归一化表达
[0205]
[0206] 1Seal＝治疗D+CTRL(没有密封剂)对治疗E+F(包括密封剂)
[0207] Chi＝治疗D+E(包括壳聚糖)对治疗F+CTRL(没有壳聚糖)
[0208] Seal×Chi＝治疗D+F(仅壳聚糖或仅密封剂)对治疗E+CTRL(密封剂+壳聚糖，或既没有壳聚糖又没有密封剂)
[0209] 用壳聚糖治疗(治疗D和治疗E)增加了体细胞基因CXCL8(P<0.001)、CCL2(P<0.001)和IL1β(P<0.01)的表达。然而，壳聚糖对TNF和CD14的基因表达没有影响。输注密封剂未与壳聚糖相互作用和对于任意这些基因没有作用(P>0.1)。
[0210] 因此，存在或不存在乳头密封剂对壳聚糖诱导的退化标记物和免疫反应标记物中的改变没有影响，这显示两种方法是完全相容的并且可以结合使用。
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