技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物技术领域，特别涉及奶山羊精液常温及低温保存稀释液配方。
背景技术
[0002] 随着羊奶的营养价值被越来越多的人认可并接受，奶山羊养殖数量也在逐年递增，目前在我国集中饲养区域主要为陕西、山东、河南，河北及
云南等省份，并呈现一种向东部沿海地区发展的趋势。值得注意的是，随着奶山羊集中养殖区如陕西、山东在人工授精技术的普及推广下逐渐形成了良种
公畜的人工授精站，其对加快奶山羊优良品种扩繁速度，提高优良种公畜利用率，降低生产成本，提高养殖户经济效益发挥了重要作用，但在当前形势发展下也带来了一些突出问题，如精液采集后的保存，通常鲜精采集后需存放8～12小时后间隔输精，更有些种公畜中心需要将新鲜精液采集后经过一段时间运送到配种中心使用，但新鲜精液经采集后暴露于空气中随
温度变化与保存时间延长会大大降低精子活性，从而导致人工授精受胎率低，降低良种公畜的利用率，因此为适应发展需要，在当前形势下迫切需要研制出一种液态保存稀释液，为提高公畜站工作效率，优良种公畜利用率及使用年限，加快种群扩繁速度，减少流行病传染，提高养殖户经济效益及加快奶山羊产业发展提供技术依据。同时精液液态保存与人工授精技术以其操作简单，携带方便，提高公畜利用率，获得高受胎率及经济实用等特点更加迎合以良种公畜的人工授精站为主的奶山羊发展现状。
[0003] 精液液态保存稀释液，分为常温（15～20℃）保存稀释液及低温（0～4℃）保存稀释液，其功能通过稀释液的组成成分、渗透压、PH值及精液的稀释倍数、保存温度共同决定对精液的保存效果，其主要成分可分为缓冲剂、营养剂、抗冷冻剂和添加剂。目前国内外研制的稀释液配方主要有以下几种：
柠檬酸钠-糖类、Tris-柠檬酸-糖类和EDTA-柠檬酸钠-糖类，因各自成分对精子的保护效果不同，研究者研制出的配方也不尽相同。
[0004] 但现有稀释液配方在实际应用中存在以下问题：
[0005] 1）尽管现有“山羊精液液态保存方法”可以在活率0.3的情况下（国标）保存较长的时间，但对于奶山羊而言，该活率
水平无法满足实际生产的需要，受胎率也无法保证。
[0006] 2）有报道“一种精液常温保存稀释液”可使精液活率保持在0.5-0.6左右，但维持保存时间有限，一般不超过24小时，对于扩大良种公畜站的
辐射范围及种畜利用率而言是不能满足发展需要的。
发明内容
[0007] 本发明的一个目的在于提供一种奶山羊精液常温保存稀释液；
[0008] 本发明的另一个目的在于提供一种奶山羊精液低温保存稀释液。
[0009] 为达到上述目的，本发明采用了以下技术方案。
[0010] 一种奶山羊精液常温保存稀释液，该常温保存稀释液的成分包括双蒸水、280～400mM的三羟甲基-
氨基甲烷、90～130mM的柠檬酸、20～50mM的果糖、200～300mM的海藻糖、4～6g/L的维生素c、1～12g/L的
牛血清
白蛋白、4～6mM的还
原型谷胱甘肽、1～
1.5mM的三
磷酸腺苷、0.05～0.055g/L的泰乐菌素、0.27～0.28g/L的庆大霉素、0.16～
0.18g/L的林可霉素以及0.3～0.35g/L的奇霉素。
[0011] 所述常温保存稀释液的成分包括双蒸水、300mM的三羟甲基-氨基甲烷、94.7mM的柠檬酸、30mM的果糖、225mM的海藻糖、5g/L的维生素c、3g/L的牛血清白蛋白、5mM的还原型谷胱甘肽、1.2mM的三磷酸腺苷、0.052g/L的泰乐菌素、0.275g/L的庆大霉素、0.17g/L的林可霉素以及0.33g/L的奇霉素。
[0012] 所述常温保存稀释液与精液混合后于15～20℃（常温）下进行保存。
[0013] 所述常温保存稀释液与精液混合后，精子的
密度稀释至4～6×108个/mL，保存时间至少为36小时。
[0014] 一种奶山羊精液低温保存稀释液，该低温保存稀释液的成分包括双蒸水、280～400mM的三羟甲基-氨基甲烷、90～130mM的柠檬酸、20～50mM的果糖、200～300mM的海藻糖、4～6g/L的维生素c、1～12g/L的牛血清白蛋白、4～6mM的还原型谷胱甘肽、1～
1.5mM的三磷酸腺苷、0.05～0.055g/L的泰乐菌素、0.27～0.28g/L的庆大霉素、0.16～
0.18g/L的林可霉素、0.3～0.35g/L的奇霉素以及终体积比为15～25%的无菌卵黄。
[0015] 所述低温保存稀释液的成分包括双蒸水、375mM的三羟甲基-氨基甲烷、124mM的柠檬酸、40mM的果糖、295mM的海藻糖、5g/L的维生素c、10g/L的牛血清白蛋白、5mM的还原型谷胱甘肽、1.2mM的三磷酸腺苷、0.052g/L的泰乐菌素、0.275g/L的庆大霉素、0.17g/L的林可霉素、0.33g/L的奇霉素以及终体积比为20%的无菌卵黄。
[0016] 所述低温保存稀释液与精液混合后经2～4小时降温至0～4℃（低温），然后置于保温瓶中进行精液保存。
[0017] 所述低温保存稀释液与精液混合后，精子的密度稀释至4～6×108个/mL，保存的时间至少为72小时。
[0018] 本发明所述奶山羊精液保存稀释液以良种公畜站人工授精中的精液保存问题为出发点，以三羟甲基-氨基甲烷-柠檬酸-糖类为
基础成分研制出能高效保存精液的稀释液配方（包括在常温下至少保存36小时的稀释液配方及在低温下至少保存3天的稀释液配方），本发明所述稀释液对奶山羊精液具有良好的液态保存效果，能有效解决鲜精人工授精的时效性，有利于提高优良品种利用率、获得高受胎率、实现真正意义上的良种资源共享；同时该稀释液制作方法简单，操作简单，生产成本低，便于大规模推广应用。
具体实施方式
[0020] 本发明以良种公畜的人工授精站为出发点，以三羟甲基-氨基甲烷-柠檬酸-糖类为基础成分研制出一种能有效保存精液36小时的常温保存稀释液配方及有效保存3天的低温保存稀释液配方，极大地解决了良种公畜站对采精时限及输精地点远近不同的问题，充分发挥了良种公畜（特别是奶山羊）的利用率，实现真正意义上的良种资源共享。
[0021] 本发明公开了一种奶山羊精液常温保存稀释液配方，所述稀释液由三羟甲基-氨基甲烷280～400mM，柠檬酸90～130mM，果糖20～50mM，海藻糖200～300mM，维生素c4～6g/L，牛血清白蛋白1～12g/L，还原型谷胱甘肽4～6mM，三磷酸腺苷1～1.5mM以及复合抗生素（0.05～0.055g/L的泰乐菌素、0.27～0.28g/L的庆大霉素、0.16～0.18g/L的林可霉素以及0.3～0.35g/L的奇霉素）与双蒸水混合而成。
[0022] 三羟甲基-氨基甲烷和柠檬酸具有无毒性、pH调节性及良好的缓冲
稳定性，本发明稀释液中按比例添加的三羟甲基-氨基甲烷和柠檬酸达到了很理想的提供缓冲及平衡渗透压作用效果。果糖及海藻糖具有提供营养以补充精子生存和运动所消耗的
能量，维持精子高活性的作用，本发明特点在于加入一定比例的果糖及海藻糖能有效维护精子质膜完整性、降低精子顶体受损及保持精子具有冲击能
力，从而提高精子活力。维生素c，还原型谷胱甘肽，牛血清白蛋白以及三磷酸腺苷具有极强的抗
氧化、抗衰老和防止细胞凋亡等特性，本发明按上述比例添加能有效降低有害物质
活性氧自由基（ROS）的脂质过氧化反应，提高超氧化物歧化酶（SOD）、过氧化氢酶（CAT）、谷胱甘肽过氧化物酶（GSHPX）活性，具有提高精子运动性能、介导
信号传递和防止脂质过氧化作用对精子的损伤及抗氧化等功能，大大提高精子膜脂流动性从而提高精子活力。复合抗生素的选择泰乐菌素，庆大霉素，林可霉素及奇霉素可有效控制精液中细菌的菌落数量并对精子无毒害作用，从而维护精子较高成活率。
[0023] 进一步说明，上述奶山羊精液常温保存稀释液配方的另一特征在于操作简单及经济实用，将各成分按比例充分混匀后与鲜精等温混合、密封保存，将精液与空气隔绝有利于精子免受外界环境的损伤。在常温下存放36小时后活率仍可达到0.65以上，完全满足种公畜站对周边养殖户（场）人工授精需求。
[0024] 本发明还公开了一种奶山羊精液低温保存稀释液配方，所述稀释液由三羟甲基-氨基甲烷280～400mM，柠檬酸90～130mM，果糖20～50mM，海藻糖200～300mM，维生素c4～6g/L，牛血清白蛋白1～12g/L，还原型谷胱甘肽4～6mM，三磷酸腺苷1～1.5mM，复合抗生素（0.05～0.055g/L的泰乐菌素、0.27～0.28g/L的庆大霉素、0.16～0.18g/L的林可霉素以及0.3～0.35g/L的奇霉素），经0.45μm滤
膜过滤后的无菌卵黄按比例与双蒸水混合而成，无菌卵黄在稀释液中的终体积分数为15～25%。
[0025] 稀释液各成分及功能前面已经详细介绍，本发明筛选出合适海藻糖添加比例可使精子在低温条件下处于相对高渗状态，能有效维护质膜完整性，免受精子低温损伤，使其维持较高活力。本发明选择卵黄作为低温保护剂可较好的保护精子在低温条件下所受冷打击，保护精子质膜完整性及顶体完整性，能有效保护精子在低温环境所受损伤并提高精子活力，从而延长精液保存时间。
[0026] 国内外有报道卵黄中的凝集酶（EYCE）具有磷脂酰肌醇A2活性可
水解卵磷脂（PC）产生溶血卵磷脂（LPC），LPC对精子有一定毒性作用，可对质膜完整性造成损伤。但这种毒性强度取决于卵黄的
质量，添加量及LPC的活性温度。本发明选用的卵黄，将其以0.45μm滤膜过滤并以终体积分数20%左右添加至稀释液后充分混匀，在0～4℃条件下保存精液可大大避免LPC的生成对精子的毒性作用。
[0027] 上述奶山羊精液低温保存稀释液配方的另一特征在于操作简单及精液保存时间长，将各成分按比例充分混匀，与鲜精等温混合密封后缓慢降温2h至0～4℃之间，利用保温瓶在该温度下存放72h后活率仍可达到0.55以上，完全满足精液长途运输要求及种公畜站对周边较偏远养殖户（场）人工授精需求。
[0028] 实施例1
[0029] 奶山羊精液常温保存稀释液配制，其成分最佳含量为：三羟甲基-氨基甲烷300mM，柠檬酸94.7mM，果糖30mM，海藻糖225mM，维生素c5g/L，还原型谷胱甘肽5mM，牛血清白蛋白3g/L，三磷酸腺苷1.2mM，0.052g/L的泰乐菌素、0.275g/L的庆大霉素、0.17g/L的林可霉素、0.33g/L的奇霉素。将上述成分与双蒸水充分混匀后即得到奶山羊精液常温保存稀释液。稀释液PH值6.8～7.0。
[0030] 实施例2
[0031] 奶山羊精液低温保存稀释液配制，其成分最佳含量为：三羟甲基-氨基甲烷375mM，柠檬酸124mM，果糖40mM，海藻糖295mM，维生素c5g/L，还原型谷胱甘肽5mM，牛血清白蛋白10g/L，三磷酸腺苷1.2mM，0.052g/L的泰乐菌素、0.275g/L的庆大霉素、0.17g/L的林可霉素、0.33g/L的奇霉素，将上述成分与双蒸水充分混匀得混合物A，选用卵黄（鸡蛋），将其以0.45μm滤膜过滤后添加至上述混合物A中，充分混匀，即得到奶山羊精液低温保存稀释液。卵黄在稀释液中的体积分数为20%，稀释液PH值6.8～7.0。
[0032] 奶山羊鲜精保存方法
[0033] 鲜精采集及质量评定：采用假
阴道法采集成年健康种公羊精液，在37℃下对精子的表观活率，活率及密度进行质量评定，在
显微镜100倍
视野下观察鲜精的表观活率，分为0～5级，0级为没有
波动，5级为快速漩涡状波动。在400倍视野下评定鲜精活率，大于0.8的样品可以进行保存，将鲜精稀释1000倍后在血球计数板上计算精液密度。
[0034] 常温保存方法：根据所采鲜精（温度为37℃）体积及密度，加入等温的所述奶山羊8
精液常温保存稀释液（实施例1），使精子密度为5×10个/mL，颠倒混匀密封，可根据具体室温用保温
棉包裹或用保温杯水浴调节温度，保存在15～20℃环境中可长达36h，期间可根据具体情况反复用于人工授精。
[0035] 低温保存方法：根据所采鲜精（温度为37℃）体积及密度，加入等温的奶山羊精液8
低温保存稀释液（实施例2），使精子密度为5×10个/mL，颠倒混匀密封，用保温棉包裹后置于
冰箱冷藏室2小时内缓慢降温至0～4℃之间，维持该温度基础上可继续保存在冰箱冷藏室中或转移至盛有冰水混合物的保温瓶中进行长途运输，保存时间长达3天。使用时将精液快速升温至35～37℃后即可用于人工授精，期间可根据具体情况反复使用。
[0036] 奶山羊精液保存后质量评定
[0037] 精子活率及密度测定：输精前取15μL样品在400倍视野下评定鲜精活率，精子运动参数主要包括精子活率、精子直线运动速率和曲线速率。
[0038] 精子顶体完整率的检测：取15μL样品制作抹片，经含有甲
醛的柠檬酸盐液固定、姬姆萨染液
染色后封装，1000倍或相差显微镜下随机计算每200个精子顶体完整率。
[0039] 精子质膜完整性检测：采用低渗肿胀试验（HOST）法检测。用低渗液调整精子密度6
至2×10个精子/mL，37℃孵育30min，取10μL精液即刻在400倍相差显微镜下计算精子肿胀情况，统计精子质膜完整率。
[0040] 具体实验例
[0041] 采用假阴道法采集27只成年健康西农萨能奶山羊种公羊（1～4周岁）精液，在37℃下对精液的表观活率，活率及密度进行评定。利用上述两种稀释液及操作方法分别将精液保存至说明时间，以传统三羟甲基-氨基甲烷保存液作为实验对照。对每只公羊精液
9
进行质量评定。结果表明所采集种公羊样品鲜精密度在1.9～2.8×10个/mL范围内变
