一种甘蓝型油菜育性相关BnCP20基因及其应用
阅读：1024发布：2020-08-30
专利汇可以提供一种甘蓝型油菜育性相关BnCP20基因及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 属于油菜基因工程技术领域，与分子育种领域有关，具体涉及一种甘蓝型油菜育性相关BnCP20基因及应用。本发明克隆得到一种花药雄性不育的甘蓝型油菜BnCP20基因，将其在拟南芥和油菜中表达，后代为雄性不育。发明特征为，扩增甘蓝型油菜总DNA，确定扩增 片段 序列与拟南芥中半胱 氨 酸蛋白酶CP基因为同源性序列，通过分离甘蓝型油菜花蕾不同时期BnCP20基因,RT-PCR检测，发现该基因只在可育的花蕾中表达。利用花药特异表达基因A9启动子构建表达载体，通过农杆菌介导的遗传转化将表达载体转化野生型拟南芥或甘蓝型油菜，得到了完全不育的转基因植株。本发明对油菜 杂种优势 利用具有开发利用价值。，下面是一种甘蓝型油菜育性相关BnCP20基因及其应用专利的具体信息内容。
1.一种分离自甘蓝型油菜的半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20在调控甘蓝型油菜花药发育中的应用，其特征在于，所述的BnCP20基因的核苷酸序列是序列表SEQ ID NO:1中
1-1056bp碱基所示的序列。
2.一种分离自甘蓝型油菜的半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20基因在调控甘蓝型油菜花药发育中的应用，其特征在于，所述的BnCP20基因的编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:2所示。
3.如权利要求1所述的应用，其中包括在甘蓝型油菜花粉败育中的应用。
4.如权利要求2所述的应用，其中包括在甘蓝型油菜花粉败育中的应用。
5.一种拟南芥或甘蓝型油菜的遗传转化方法，其特征包括如下步骤：
(a)从甘蓝型油菜中克隆得到半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20，其编码的蛋白质序列如序列表SEQ ID NO:2所示；
(b)以pMDC83载体作骨架，以花药特异表达基因A9片段作启动子，构建植物表达载体pMDC83-BnCP20，用该植物表达载体转化农杆菌；
(c)通过农杆菌介导的遗传转化方法将所述的半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20导入拟南芥或甘蓝型油菜中，筛选得到拟南芥或甘蓝型油菜转基因阳性植株；
其中：
步骤(b)中的花药特异表达基因A9片段的核苷酸序列如SEQ ID NO:3所示；
步骤(b)中的植物表达载体pMDC83-BnCP20如图5中的(B)图所示。
一种甘蓝型油菜育性相关BnCP20基因及其应用
技术领域：
[0001] 本发明属于油菜基因工程技术领域，涉及油菜的分子育种领域，具体涉及一种甘蓝型油菜育性相关BnCP20基因及其应用。
背景技术
[0002] 植物在有性繁殖的过程中不能正常产生花粉的遗传现象称为雄性不育，它涉及到花器官中雄蕊的发生与发育、绒毡层结构、小孢子形成、花药开裂以及外部生态环境等很多环节。其中，绒毡层发育的异常并不影响花粉母细胞的减数分裂，但是影响到四分体的分离和花粉壁的形成，由此可见绒毡层在小孢子发育中起着重要的作用。可以归纳为以下两个方面：1.提供四分体分离所需要的酶类：胼胝质酶和多聚半乳糖醛酸酶，目前研究表明这两种酶都是在绒毡层中合成的(Rhee et al.,2003；Wan et al.,2011)；2.提供花粉外壁发育所需要的各种成分，花粉外壁主要是由孢粉素组成的，孢粉素的主要成分是脂类和酚类的化合物，参与到该类物质合成的基因，一般都是在绒毡层中特异表达的(Ariizumi and Toriyama,2011)。
[0003] 绒毡层的降解过程是一个精密的调控过程，具有典型的细胞壁分离、染色质聚集、细胞胞质凝缩等细胞程序化凋亡(PCD)的特征。在动物细胞中，半胱氨酸蛋白酶的活性与PCD相关。植物细胞和动物细胞在PCD的表征上具有高度的相似性。因此，绒毡层的PCD可能也与植物的半胱氨酸蛋白酶有关(Wilson and Zhang,2009)。在植物中，半胱氨酸蛋白酶是普遍存在的一种水解酶，参与细胞变性，蛋白质降解以及生物的程序化死亡PCD(Solomon et al.,1999)。在水稻中，OsCP1编码半胱氨酸蛋白酶，该基因的突变会导致小孢子降解，其可能与水稻绒毡层细胞程序性死亡直接相关(Lee et al.,2004)。OsAPI5编码细胞程序性死亡抑制因子，该基因的突变会引起绒毡层PCD的延迟从而导致小孢子的降解(Li et al.,2011)。在拟南芥ms1突变体中，绒毡层降解延迟，PCD的发生转化成细胞的坏死(Vizcay-Barrena and Wilson,2006)。在水稻Ostdr突变体中，绒毡层PCD延迟导致花粉壁的发育失败，随后小孢子降解(Li et al.,2006)。在油菜中，Bnms1和Bnms3突变体的绒毡层细胞程序化凋亡(PCD)都发生了延迟变化(Dun et al.,2011；Yi et al.,2010)。因此，绒毡层PCD的启动时间非常重要，它的启动一般可能发生在四分体早期(Wilson and Zhang,2009)。
[0004] 在十字花科植物中，A9基因在开花期的早期阶段开始表达，是早期花粉发育所必须的(Aarts et al.1997)，而与其同源的白菜基因BrA9，从花粉母细胞时期到花粉粒的形成阶段，该基因一直在绒毡层中高效表达，融合一个在种子中特异表达的半胱氨酸蛋白酶会导致花药的败育(Konagaya et al.,2008)。
[0005] 本发明开发了一个影响绒毡层发育相关的半胱氨酸蛋白酶BnCP20基因，通过花药差异表达分析发现，这个基因在可育植株>2mm的花蕾中表达；通过转基因实验证实，用一个白菜基因的花药特异表达的启动子A9启动BnCP20基因表达，可以导致拟南芥或油菜花药发育异常，获得雄性不育植株。申请人的结果预示着BnCP20基因在控制油菜或拟南芥花粉的育性，创造雄性不育转基因新材料中具有相当的应用前景。
[0006] 油菜作为中国主要的油料作物，在长江流域广泛种植，对国计民生具有重要影响。油菜杂种优势比较明显，雄性不育是杂种优势利用的重要途径。目前，国内外已发现了多种类型的雄性不育材料，在理论和应用方面取得了重要的进展，而新型不育源的发现和研究一直是杂种优势研究的基础，并以此创造出更多的天然和人工不育材料，为油菜育种和生产所广泛应用。
发明内容
[0007] 本发明的目的在于分离出一个半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20，通过RT-PCR发现该基因在可育和不育材料的花蕾存在差异表达，通过blast比对拟南芥，白菜，甘蓝型油菜基因组测序数据库，通过PCR获得该基因的核苷酸序列，该基因的核苷酸序列如序列表SEQ ID NO:1所示，该基因编码的蛋白质序列如如序列表SEQ ID NO:1所示，编码351个氨基酸。可以采用已经克隆的多核苷酸作探针，从cDNA和基因组文库中筛选得到本发明的基因或同源基因。同样，采用PCR(polymerase chain reaction)技术，也可以从基因组、mRNA和cDNA中扩增得到本发明的基因以及任何感兴趣的一段多核苷酸或与其同源的一段多核苷酸。
[0008] 本发明的另一个目的在于应用花药特异表达基因A9作为启动子，构建含有半胱氨酸蛋白酶BnCP20基因的重组表达载体，对本发明的半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20的启动子分析发现，该基因在花药发育后期即成熟花粉粒时期表达，而在四分体时期不表达，所以本发明采用了在花粉母细胞时期特异表达基因A9的启动子。本发明提供的表达载体可用于制备转基因植物和植物育种。
[0009] 本发明提供了一种获得拟南芥转化不育株的方法：将构建得到的具有BnCP20基因的表达载体转入到拟南芥的花序中，具体方法是：(1)种植野生型拟南芥，直至其抽薹开花备用；(2)培养用于侵染的农杆菌菌液，将收集的菌液侵染拟南芥花序；(3)鉴定阳性植株。
[0010] 本发明还提供了一种获得甘蓝型油菜雄性不育株的转基因植物的方法：将构建得到的含有BnCP20基因的表达载体转入到宿主甘蓝型油菜的下胚轴中，具体方法是：(1)取甘蓝型油菜品系Westar(由加拿大Plant Biotechnology Institute Saskatoon提供)种子，用70％酒精、0.1％升汞灭菌，放入培养室中暗处培养；(2)利用农杆菌侵染的方法将含有BnCP20基因的表达载体转入到甘蓝型油菜的下胚轴；(3)利用PCR的方法鉴定转基因的阳性植株。
[0011] 本发明利用PCR方法从甘蓝型油菜7365B(Huang Z,Chen Y F,Yi B,Xiao L,Ma C Z,Tu J X,Fu T D.Fine mapping of the recessive genic male sterility gene(Bnms3)in Brassica napus L.Theor Appl Genet,2007， 115:113-118.)中扩增半胱氨酸蛋白酶BnCP20基因，通过转基因进行功能验证发现，与对照组相比，转基因植株所能产生正常可育的花粉非常少，基本不能结实，由此初步证明了半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20与油菜的育性相关。
[0012] 本发明的另一个目的在于利用模式植物拟南芥分析其半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20败育的特征，主要是通过细胞学观察的方法：取不育植株的花蕾，通过50％FAA固定、脱水、包埋等程序，对样品进行半薄及超薄切片，并在显微镜下进行观察。
[0013] 本发明中所述的表达载体是指现有技术中已知的、能够在植物中进行表达的任何载体，例如适用于构建本发明所述的表达载体包括但不限于，如：PbI101、pCAMBIA2300、pBI121、pMDC83等。本发明的一个实施案例中，所述的表达载体优选的空载体是pMDC83(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室周永明教授馈赠)。
[0014] 本发明获得的甘蓝型油菜不育株在营养期与正常可育株无明显差异，在进入生殖生长阶段后雄性生殖发育异常，其花粉败育，可以利用其这一特性培育新的雄性不育材料，该遗传资源在油菜杂种优势利用和农业生产上具有十分重要的应用。附图说明
[0015] 序列表SEQ ID NO:1是分离自甘蓝型油菜的半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20的核苷酸序列(1-1056bp)，序列长度为1056bp，其中1-1056bp也是CDS，可见对应的氨基酸序列。
[0016] 序列表SEQ ID NO:1是分离自甘蓝型油菜的半胱氨酸蛋白酶基因基因BnCP20编码的蛋白质序列。
[0017] 序列表SEQ ID NO:3是本发明制备的启动子的核苷酸序列，序列长度为847bp。
[0018] 图1：从甘蓝型油菜中分离并鉴定BnCP20基因与应用的总体技术流程图。
[0019] 图2：是本发明分离的半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20在甘蓝型油菜不育及可育材料花蕾中的差异化表达情况。图中标记说明：甘蓝型油菜7365A和7365B分别代表甘蓝型油菜隐形核不育两型系中的不育系和可育系。<1mm表示花蕾直径小于1mm；1-2mm表示花蕾直径为1-2mm；2-3mm表示花蕾直径为2-3mm；3-4mm表示花蕾直径为3-4mm.
[0020] 图3：是BnCP20基因的启动子分析载体的结构图。附图标记说明：RB和LB:T-DNAr的右侧和左侧边界：NOS-pro:NOS启动子；NPTII(Kan)：新霉素磷酸转移酶II基因(r:resisitance)；NOS-ter：NOS终止子；GUS：葡萄糖醛酸糖甘酶基因。
[0022] 图5：BnCP20基因功能验证的植物表达载体的结构示意图。图5中的(A)图为空载体pMDC83的图谱, 图5中的(B)图表示本发明构建的植物表达载体pMDC83-BnCP20的图谱。附图标记说明：RB和LB:T-DNA的右侧和左侧边界；A9pro：A9启动子；HindIII、PstI、KpnI：限制性内切酶；mgfp6：绿色荧光蛋白；nos T：终止子；hgyromycin resistance：潮霉素抗性基因；Kanamycin resistance：卡那霉素抗性基因。
[0023] 图6：BnCP20基因转拟南芥得转化植株的形态学观察。附图标记说明：图6中的A图：表示拟南芥转化植株结角果的一个侧枝；图6中的B图：表示野生型拟南芥(非转基因)植株结角果的一个侧枝；图6中的C图和E图：表示拟南芥转化植株的花的形态；图6中的D图和F图：表示野生型拟南芥花的形态；图6中的G图：表示拟南芥转化植株雄蕊的亚历山大染色；图6中的H图:表示野生型拟南芥植株雄蕊的亚历山大染色。
[0024] 图7.BnCP20基因转拟南芥的转化不育植株半薄切片观察结果图。附图标记说明：图7中的a,b,c,d图分别是拟南芥正常花药减数分裂时期、四分体时期、单核期和成熟期半薄切片显微照片，图7中的e,f,g,h图分别是拟南芥转化不育植株对应时期的半薄显微照片。其中：PMC：小孢子母细胞。T：绒毡层。Tds：四分体。PCW：胼胝质璧。Ms：小孢子。Pg：
花粉粒。
花粉粒。
[0025] 图8：本发明转化的甘蓝型油菜的不育植株超薄切片显微解剖结构。图中标记说明：图8中的a,b,c图表示甘蓝型油菜正常花药四分体时期绒毡层和胼胝质细胞结构；图8中的d,e,f图表示不育花药四分体时期绒毡层和胼胝质细胞结构。其中：T：绒毡层。Te：四分体。N：细胞核。ER：内质网。Va：液泡。TCW：绒毡层细胞壁。CW：胼胝质璧。
[0026] 图9：BnCP20基因转甘蓝型油菜westar所得的不育植株的花及花药染色后的显微照片图。图中标记说明：图9中的A图和B图：野生型(非转基因)甘蓝型油菜正常花及花粉的醋酸洋红染色结果。图9中的C图和D图为转化的甘蓝型油菜不育株的花及花粉的醋酸洋红染色结果。
具体实施方式
[0027] 以下结合具体实施例，进一步定义本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不是用于限制本发明的范围。下列实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件如工具书《分子克隆：实验室指南》(New York：Cold Spring Harbor Laboratory,1989)中所述的条件，或者按照生产商提供的操作手册中建议的方法。
[0028] 实施例1 从甘蓝型油菜中分离、克隆半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20基因[0029] 1.1实验材料
[0030] 本实施例所用的材料为甘蓝型油菜隐形核不育系7-7365A,保持系7-7365B(Huang Z,Chen Y F,Yi B,Xiao L,Ma C Z,Tu J X,Fu T D.Fine mapping of the recessive genic male sterility gene(Bnms3)in Brassica napus L.Theor Appl Genet,2007,115:113-118.)，将不育系和可育系同时播种于大田，按正常田间管理，并用保持系7-7365B为不育系7-7365A授粉，保存种子。另一种材料为加拿大甘蓝型春油菜Westar,为本领域的常规材料，该遗传资源由加拿大Plant Biotechnology Institute Saskatoon提供。
[0031] 1.2半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20基因的制备
[0032] 根据甘蓝型油菜(Brassica napus)基因组测序资源，通过ORF FINDER和BLAST软件进行序列比对分析，得到一个半胱氨酸蛋白酶基因，我们将这个基因命名为BnCP20基因或半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20。通过在线软件Genescan(http：//genes.mit.edu/GENSCAN.html)分析得到该基因的CDS序列及对应氨基酸序列。用NCBI的提供的Conserved domain工具(http://www.ncbi.nlm.nih.gov/Structure/cdd/wrpsb.cgi)在线进行保守区域分析结果表明该基因属于木瓜蛋白酶家族(papain family)的半胱氨酸蛋白酶。将该基因的CDS序列(见序列表SEQ ID NO：1所示中的1-1056bp所示的序列)与拟南芥的CDS序列通过NCBI比对分析，发现该区段中含有完整的ORF阅读框及起始密码子ATG。根据其开放读码框所推导的蛋白质序列，可知该基因共编码351个氨基酸(见序列表SEQ ID NO：2所示)。
[0033] 1.3半胱氨酸蛋白酶基因在花药中的差异表达
[0034] (a)RNA提取及cDNA合成
[0035] 本发明分别提取不育系7-7365A和保持系7-7365B植株的四个时期花药(花蕾的大小分别为小于1mm、1mm-2mm、2mm-3mm、3mm-4mm)的总RNA。具体方法如下：选取同一大田生长条件相同的甘蓝型油菜不育植株7365A和可育植株7365B，开花期时取不同时期花蕾，取样后用锡箔纸包裹，迅速放置于液氮中，-80℃保存。根据Trizol提取试剂盒的要求进行RNA的提取，将提取0.1g的样品，在液氮中研磨至粉状，加1ml的裂解液RL(试剂盒自带)和38ul的沉淀剂A(试剂盒自带)匀浆；将匀浆样品剧烈震荡混匀，在室温下孵育5分钟使核蛋白体完全分解；4℃的条件下12,000rpm离心10分钟，小心取上清转移到一个新的RNase free离心管中；每1ml RL加0.2ml氯仿，盖紧样品管盖，剧烈震荡15秒并将其在室温下孵育3分钟；在4℃12,000rpm离心10分钟，样品分三层：下层为有机相，中间层和上层即无色的水相，RNA存在于水相中，把水相转移到新管中，加入1倍体积的70％乙醇，颠倒混匀(此时可能会出现沉淀)，得到的溶液和可能沉淀一起转入吸附柱RA中；
10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管，加500ul去蛋白液RE(试剂盒自带)，12,000rpm离心45秒，弃掉废液；加700ul的漂洗液RD(试剂盒自带)，10,000rpm离心15秒，弃掉废液；加700ul的漂洗液RW(提前加入无水乙醇)，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量去除漂洗液；去除RA放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加60ul的RNase free water，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。用蛋白检测仪(DU 650BECKMAN,USA)分别检测RNA在260nm和280nm下的吸光值，结 合1％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度和浓度。以上述获取的RNA为模板，按下列方案进行反转录：2ug RNA中加入DNAase
1μl,DNAase Buffer+Mgcl21μl,DEPC H2O至10μl,37℃30分钟；立即置于冰上，加入
1μl的EDTA,65℃10分钟；加1ul Oligo(dT),65℃，5分钟，立即置于冰上5分钟，短暂离心，加入5×M-MLV Buffer 4μl,dNTP(10mmol/L)2μl,RNase Inhibitor 1μl，RTase
1μl,42℃，60min,70℃，5min，得到的cDNA分装后于-80℃冰箱中保存备用。
10,000rpm离心45秒，弃掉废液，将吸附柱重新套回收集管，加500ul去蛋白液RE(试剂盒自带)，12,000rpm离心45秒，弃掉废液；加700ul的漂洗液RD(试剂盒自带)，10,000rpm离心15秒，弃掉废液；加700ul的漂洗液RW(提前加入无水乙醇)，12,000rpm离心60秒，弃掉废液；将吸附柱RA放回空收集管中，12,000rpm离心2分钟，尽量去除漂洗液；去除RA放入一个RNase free离心管中，在吸附膜的中间部位加60ul的RNase free water，室温放置2分钟，12,000rpm离心1分钟。用蛋白检测仪(DU 650BECKMAN,USA)分别检测RNA在260nm和280nm下的吸光值，结 合1％(质量体积比)琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的纯度和浓度。以上述获取的RNA为模板，按下列方案进行反转录：2ug RNA中加入DNAase
1μl,DNAase Buffer+Mgcl21μl,DEPC H2O至10μl,37℃30分钟；立即置于冰上，加入
1μl的EDTA,65℃10分钟；加1ul Oligo(dT),65℃，5分钟，立即置于冰上5分钟，短暂离心，加入5×M-MLV Buffer 4μl,dNTP(10mmol/L)2μl,RNase Inhibitor 1μl，RTase
1μl,42℃，60min,70℃，5min，得到的cDNA分装后于-80℃冰箱中保存备用。
[0036] (b)基因的差异化表达分析
[0037] 利用常用的DNAstar软件对获得的序列和拟南芥的ORF进行拼接，据拼接结果，在保守的位点设计RT-PCR的引物F1,R1(F表示左引物(或称正向引物)，R表示右引物(或称反向引物))，BnCP20基因正向引物F1为5'–CAGTGACGTTCGTTGGGTAC-3'，BnCP20基因反向引物R1为5'–ATACTGAGCCACACCACACA-3'。以BnACTIN3作为内参引物，Actin基因引物其正向引物'–TCCATCCATCGTCCACAG-3'，反向引物为5'–GCATCATCACAAGCATCCTT-3'。RT-PCR反应体系为20μl：其中模板2μl,左右引物(10mmol/L)各1μl,10×Ex Taq Buffer 2μl,25mM Mgcl21.6μl，TaqE 0.2ul,ddH2O 11.8μl。反应程序为94℃5min；
94℃30s,55℃30s,72℃1min；33个循环；72℃10min；25℃30min。其中模板用ddH2O稀释20倍，以Actin作内标，显示结果cDNA浓度基本一致；图2显示BnCP20基因在不育材料
7365A中的4个花蕾时期均不表达，而在7365B中的(1-2mm,2-3mm,3-4mm)表达比较明显。
94℃30s,55℃30s,72℃1min；33个循环；72℃10min；25℃30min。其中模板用ddH2O稀释20倍，以Actin作内标，显示结果cDNA浓度基本一致；图2显示BnCP20基因在不育材料
7365A中的4个花蕾时期均不表达，而在7365B中的(1-2mm,2-3mm,3-4mm)表达比较明显。
[0038] 实施例2 遗传转化实验
[0039] 2.1启动子分析
[0040] (a)本实施例中通过设计引物扩增BnCP20基因上游非编码区段924bp作为该基因的启动子区段(简称启动子)，正向引物为5'-TAATCTTTACGAGAAATTTACTAGG-3'，反向引物为5'-ACCACAAACATGAGTACTATCGA-3'，以HindIII、BamHI为正、反向引物的酶切位点，以纯合可育株7365B的DNA为模板，采用热启动高保真长片段聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerase(Thermo Scientific，http://www.thermoscientificbio.com)进行PCR扩增。PCR扩增体系如下：
[0041]
[0042] PCR扩增程序：98℃总变性1min；98℃变性10S，55℃退火15S，72℃延伸4min，34circles；72℃总延伸10min。扩增后产物通过琼脂糖凝胶电泳检测后，产物挖胶回收使用天根(北京)生物科技有限公 司(http://www.tiangen.com/)的琼脂糖凝胶回收试剂盒(按该试剂盒说明书操作)。回收产物直接用fermentas(Thermo Scientific，http://www.thermoscientificbio.com)的快速限制性内切酶进行双酶切，双酶切体系如下：
[0043]
[0044] 酶切反应在37℃水浴锅进行，时间为2h。酶切产物用天根(北京)生物科技有限公司(http://www.tiangen.com/)的DNA纯化试剂盒回收。转化载体与候选基因扩增片段的酶切回收产物连接后转化大肠杆菌DH5ɑ(购自宝生物工程大连有限公司)，筛选阳性克隆后提质粒酶切鉴定，每个反应选取3个阳性克隆送样测序。经测序无误后提取质粒转化农杆菌菌株GV1301(陈苇等，2006)，挑选阳性克隆于-70℃超低温保存。
[0045] (b)构建启动子分析载体：用常规农杆菌沾花的方法转化拟南芥野生型植株。在含25mg/L卡那霉素的1/2MS培养基(1/2MS培养基：Murashige&Skoog基本培养基(简称MS，MS培养基或简称MS基本培养基，三者同义)2.2g/L；蔗糖10g/L；琼脂粉(Agarose)6g/L；用超纯水(ddH2O)定容至1L；调pH至5.8-5.9)上筛选转化拟南芥植株的种子，抗性植株的形态特征为根伸长，植株较大，子叶和真叶的颜色为鲜绿色；非抗性植株的形态特征为根不能伸长，植株矮小，子叶黄化。将筛选的抗性植株长到3-5片真叶后移植到营养土中，共得到20株抗性植株。提取拟南芥抗性植株的阳性植株叶片总DNA(Stewart et al.,1993)，用pbI101(Jefferson et al.,1987)载体上的序列设计引物为NPT-F和NPT-R，通过PCR进一步鉴定转化植株。在开花期取转化植株的花蕾，用90％丙酮处理后，以X-Glue染色液(Jefferson et al.,1987)在37℃避光条件下过夜染色，第2天用70％酒精脱色并观察，染色结果发现只有即将开花和已经开花的花蕾有GUS着色信号(如图4)。说明BnCP20基因只在花药发育后期才开始表达。
[0046] 引物NPT-F和NPT-R的DNA序列：
[0047] NPT-F(正向引物)：GCCACAGTCGATGAATCCAG；
[0048] NPT-R(反向引物)：ATGGTGGAGCACGACACTCT。
[0049] 2.2半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20载体的构建及转化
[0050] (a)半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20载体的构建
[0051] 本发明中采用白菜基因花药特异表达启动子A9序列(如SEQ ID NO：3所示)，其所用的引物序列为：A9-pro(F)正向引物5'-CTAGTCCAATAATGTGAGTCATGTGAC-3'，A9-pro(R)反向引物为5'-TTTGTTTAGATATTGTAGGAGTCTTCG-3'，用HindIII 和PstI分别作为正、反向引物的限制性内切酶位点，采用热启动高保真长片段聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增(扩增体系如上的本实施例所述)，扩增片段用胶回收试剂盒(购自上海生工生物工程有限公司)回收，用HindIII和PstI双酶切回收847bp的片段，连接到经HindIII和PstI双酶切的表达载体pMDC83(华中农业大学作物遗传改良国家重点实验室周永明教授惠赠)上，连接产物转化大肠杆菌菌株DH5ɑ,在含有50ug/ml潮霉素的LB 培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，并用通过测序检测该核苷酸序列完全正确；设计引物扩增BnCP20基因，以甘蓝型油菜7365B的cDNA为模板，BnCP20-F为正向引物5'-ATGTCATCGATAGTACTCATGTTTGTGG-3'，BnCP20-R为反向引物5'-TTAAGCAATAGGATAATAAGCATACTGAG-3'，以PstI和KpnI作为酶切位点，同样采用热启动高保真长片段聚合酶Phusion High-Fidelity DNA Polymerase进行PCR扩增，产物用胶回收试剂盒(天根(北京)生物科技有限公司)回收，用PstI和KpnI双酶切回收得到1056bp长的片段，连接到经PstI和KpnI酶切的含有A9启动子的表达载体pMDC83上，然后将连接产物转化大肠杆菌菌株DH5ɑ,在含有50μg/ml潮霉素的LB培养基上筛选转化子，挑选单菌落提取质粒，通过测序检测证明该核苷酸序列完全正确，成功构建了转化植株的植物表达载体pMDC83-BnCP20(如图5中的(B)图所示)。将构建正确的重组质粒载体pMDC83-BnCP20通过冻融法(陈苇等，2006)导入农杆菌菌株GV1301，挑选阳性单克隆于-80℃冰箱保存。
[0052] (b)拟南芥转化
[0053] 将上步获得的农杆菌菌株侵染野生型拟南芥花序(农杆菌侵染拟南芥花序的操作方法为常规方法)，将收获的种子在含25mg/ml潮霉素的1/2MS培养基上进行筛选，12天之后，抗性植株会逐渐长高，根会伸长，而非抗性植株比较矮小，后期会慢慢变黄，将抗性植株移栽到营养土中进行生长，观察其表型(图6)，其中野生型的角果生长正常，但转化株的角果比较短小；将其花放在显微镜下观察发现，野生型的雄蕊上有花粉溢出，并沾染到柱头上，而其转化株的雄蕊上没有花粉出现；随后取即将开花的花蕾放入亚历山大染色液中，并加入冰醋酸，二者的体积比(10:1)，放入37℃的水浴锅中水浴2小时，取出花蕾，放入ddH2O中去掉浮色，用镊子取其花药于载玻片上，用盖玻片封片在显微镜下观察，正常可育的花药中花粉饱满，充满整个腔室，而不育花药的花粉呈现空瘪状态。
[0054] (c)甘蓝型油菜转基因试验
[0055] 对甘蓝型油菜的遗传转化采用常规农杆菌转化法(陈苇等，2006)，转化的品种为甘蓝型油菜Westar(一个来自加拿大惠赠的甘蓝型油菜品系，本发明的转化不限于此品种)。具体步骤为：先将甘蓝型油菜westar种子用70％的酒精浸泡2min，0.1％升汞溶液消毒15min，无菌ddH2O清洗5-6次，每次清洗5min；将灭菌的种子播于编号为M0培养基中(配方见表1)，于25℃暗培养5天；挑取-80℃保存的农杆菌，接种到50ml的液体LB中，28℃，180r/min培养，摇至OD600＝0.3-0.5(约需12-14h),4000r/min离心收集菌体，加等体积悬浮液，用无菌镊子和解剖刀切幼苗下胚轴，每个长度为0.8-1.0cm(切外植体时尽量一刀垂直切下)。将切好的外植体置于放有菌液的皿中，浸染30min,隔段时间摇晃一次，
4-5次即可。用悬浮液培养基DM(配方见表1)稀释(含有乙酰丁香酮，其终浓度为0.05mM)悬浮，28℃，200r/min培养1小时，倒入培养皿中待用；将已侵染的外植体转入编号为M1培养基(配方见表1)中，24℃暗培养，1.5-2天后转入到编号为M2培养基(配方见表1)中，将培养物置于长日照条件的培养室中(16h光照，光照强度为6000Lux，8h黑暗)，3个周后转入到编号为M3培养基(配方见表1)中，此后，每2-3周继代一次，直到出现绿芽；将分化出来的绿芽转入编号为M4培养基(配方见表1)中生长，长根后再移入营养钵中炼苗，一个月后移入大田。
4-5次即可。用悬浮液培养基DM(配方见表1)稀释(含有乙酰丁香酮，其终浓度为0.05mM)悬浮，28℃，200r/min培养1小时，倒入培养皿中待用；将已侵染的外植体转入编号为M1培养基(配方见表1)中，24℃暗培养，1.5-2天后转入到编号为M2培养基(配方见表1)中，将培养物置于长日照条件的培养室中(16h光照，光照强度为6000Lux，8h黑暗)，3个周后转入到编号为M3培养基(配方见表1)中，此后，每2-3周继代一次，直到出现绿芽；将分化出来的绿芽转入编号为M4培养基(配方见表1)中生长，长根后再移入营养钵中炼苗，一个月后移入大田。
[0056] 提取转基因阳性甘蓝型油菜Westar植株叶片的总DNA(制备方法见：Stewart et al.,1993)，用引物NOS-R结合基因的正向引物BnCP20-F，通过PCR进一步鉴定转化植株。所述的正向引物BnCP20-F为：5'-ATGTCATCGATAGTACTCATGTTTGTGG-3'，反向引物NOS-R为：
5'-AGAAAACAAAATATAGCGCGCAAA-3'。对转基因的T0代甘蓝型油菜植株观察育性的表现。结果显示在12株转基因的甘蓝型油菜T0代植株中，有9株表现为花药中有微量花粉，花药干瘪且不饱满，而正常花药表面饱满，呈金黄色(见图9)。
5'-AGAAAACAAAATATAGCGCGCAAA-3'。对转基因的T0代甘蓝型油菜植株观察育性的表现。结果显示在12株转基因的甘蓝型油菜T0代植株中，有9株表现为花药中有微量花粉，花药干瘪且不饱满，而正常花药表面饱满，呈金黄色(见图9)。
[0057] 表1 甘蓝型油菜遗传转化步骤中所用的培养基配方及编号
[0058]
[0059] 表1的说明：MS为MS基本培养基，1/2MS为MS基本培养基中的无机盐量减半。
[0060] 实施例3 拟南芥不育植株的细胞学切片分析
[0061] 为了进一步确定半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20败育的细胞学特点，并阐明其功能，本发明对拟南芥转化植株的不育花药进行半薄切片及超薄切片，重点观察了其绒毡层发育情况，比较了不育花药和可育花药绒毡层和小孢子在各时期发育的差异。比较后发现：不育花药和可育花药在花粉母细胞时期没有差异，减数分裂时期不育和可育花药的花粉母细胞均可进行正常的减数分裂，当可育花药绒毡层细胞质和细胞壁分 离，细胞质浓缩，细胞壁降解时(图7a、图7b和图8a、图8b)，不育花药绒毡层细胞异常增大，质壁不能发生分离，细胞内的细胞器比较少(图7e、图7f和图8d、图8e)。虽然不育和可育花药均可形成四分体，且四分体被胼胝质包裹(图7b、图7f和图8c、图8f)，可育花药绒毡层细胞壁降解，细胞质中内质网较发达(图8b)，而不育绒毡层细胞内基本没有内质网等亚细胞结构(图8e)。在花药发育后期，可育花药绒毡层开始降解并分泌小孢子发育所需的各种酶类和营养物质，直至最后形成成熟花粉粒(图7c、图7d)，而不育花药绒毡层大量液泡化，包裹四分体的胼胝质不能降解，小孢子一直以四分体形式存在，直到最后随着绒毡层一起降解(图7g、图7h)。由于甘蓝型油菜转化植株的花药败育方式与拟南芥类似，这里不再重复描述。
[0062] 绒毡层细胞质浓缩，细胞质与细胞壁分离，内质网等分泌型细胞器大量增加是绒毡层细胞向分泌型细胞转移的特征，在这个过程之后，通过细胞的降解，绒毡层释放大量的酶及营养物质供小孢子的发育(Wison和Zhang,2009)，因此提前表达半胱氨酸蛋白酶基因BnCP20基因导致的不育是由于在减数分裂时期，由于绒毡层发育异常，导致绒毡层细胞无法向分泌型细胞转移，未能及时供应小孢子发育所需的酶及营养物质而引起花粉发育异常，最后走向解体。
[0063] 参考文献
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