一种L-脯氨酸-4-羟化酶及其基因工程菌、构建方法与应用
阅读：1037发布：2020-06-21
专利汇可以提供一种L-脯氨酸-4-羟化酶及其基因工程菌、构建方法与应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供了一种新型L‑脯 氨 酸‑4‑羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，来源于Micromonospora sp.CNB394。本发明还提供一种高效表达上述L‑脯氨酸‑4‑羟化酶，从头合成高产反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸的基因工程菌E.coli HYP，该基因工程菌具有遗传 稳定性 好和 发酵 产酸能 力 较强的优势，不含质粒，利用基因组表达上述新型L‑脯氨酸‑4‑羟化酶，以 葡萄糖 等廉价 碳 源为底物从头高效合成反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸，发酵42h反式‑4‑羟基‑L‑脯氨酸产量高达51g/L，具有很好的工业应用前景。，下面是一种L-脯氨酸-4-羟化酶及其基因工程菌、构建方法与应用专利的具体信息内容。
1.一种新型L-脯氨酸-4-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。
2.权利要求1所述新型L-脯氨酸-4-羟化酶的基因，其核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
3.权利要求1所述新型L-脯氨酸-4-羟化酶在微生物发酵合成反式-4-羟基-L-脯氨酸中的用途。
4.一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述基因工程菌是以大肠杆菌E.coli W3110为出发菌株，在其基因组上整合了T7噬菌体的RNA聚合酶基因，由木糖启动子启动；基因组上的L-脯氨酸脱氢酶基因putA缺失；在基因组上两个不同位点整合了脯氨酸操纵子基因proBA，并分别由Ptrc启动，其中proB基因进行了点突变N107D；在基因组上两个不同位点整合了权利要求1所述新型L-脯氨酸-4-羟化酶基因p4H1，并分别由强启动子PT7启动；基因组上的sucCD基因缺失。
5.如权利要求4所述的一种高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的基因工程菌，其特征在于，所述L-脯氨酸-4-羟化酶基因p4H1的核苷酸序列如SEQ ID No.1所示。
6.一种构建权利要求4或5所述基因工程菌的方法，其特征在于，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110进行定向改造，包括如下步骤：
(1)在E.coli W3110中构建T7启动子表达系统：在E.coli W3110的基因组上，将T7噬菌体的RNA聚合酶基因整合到lacI-lacZ位点，由木糖启动子启动；
(2)将基因组上的L-脯氨酸脱氢酶基因putA敲除；
(3)构建启动子Ptrc和proBA基因的连接片段Ptrc-proBA，并将其整合在假基因yghX位点；
(4)构建启动子Ptrc和proBA基因的连接片段Ptrc-proBA，并将其整合在trpR基因位点；
(5)构建启动子PT7和p4H1基因的连接片段PT7-p4H1，并将其整合在假基因yjiP位点；
(6)构建启动子PT7和p4H1基因的连接片段PT7-p4H1，并将其整合在假基因ycjV位点；
(7)将基因组上的sucCD基因敲除。
7.权利要求4或5所述基因工程菌在发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的用途。
8.如权利要求7所述的用途，其特征在于，利用所述基因工程菌进行摇瓶发酵：
将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％m/v葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期24-30h；
发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH4)2SO4 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，MgSO4·7H2O
1-2g/L，酵母提取物0.1-0.3g/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·7H2O 80-100mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
9.如权利要求7所述的用途，其特征在于，利用上述基因工程菌进行发酵罐发酵：
将菌种活化后制备种子液，按照15-20％接种量接入发酵培养基，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％m/v的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-2g/L；发酵周期35-42h；
发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠
0.1-1g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·H2O
80-100mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各0.5-2mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。
一种L-脯氨酸-4-羟化酶及其基因工程菌、构建方法与应用
技术领域
[0001] 本发明属于基因工程技术领域，具体涉及一种新型高效L-脯氨酸-4-羟化酶以及一株无质粒高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的基因工程菌及其构建方法与应用。
背景技术
[0002] 反式-4-羟基-L-脯氨酸(trans-4-hydroxy-L-proline，H-Hyp-OH，CAS:51-35-4)是一种稀有的亚氨基酸，广泛应用于医药、食品、化工和化妆品行业，尤其作为血管紧张肽转化酶制剂、碳青霉烯类抗生素、消炎药等药物的的前体，具有极其重要的医药价值；在食品领域，反式-4-羟基-L-脯氨酸可作为营养物质来补充新生儿所需的葡萄糖、甘氨酸、丙酮酸等。在化工领域，反式-4-羟基-L-脯氨酸可作为合成多种高附加值产品的一种手性原料，如N-烷基吡咯、聚酯碳酸及生物碱等。在美容领域，许多化妆品都会添加反式-4-羟基-L-脯氨酸，以达到保养皮肤、延缓衰老等功效。总之反式-4-羟基-L-脯氨酸具有十分重要的实用价值。
[0003] 目前反式-4-羟基-L-脯氨酸的生产方法有生物组织提取法、化学合成法、生物催化法和微生物发酵法。生物组织提取法存在生产和纯化步骤多、杂酸含量高、产率低、成本高、原料利用率低、环境污染大、废水废渣难处理等问题；化学合成法生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法存在反应步骤多、反应条件苛刻、操作繁琐、环境污染较大和原料成本高的问题；生物催化法需要额外添加底物L-脯氨酸，有的还要添加α-酮戊二酸，这两种原料的成本较高，且存在转化率低，最终体系中残留L-脯氨酸而难于纯化的问题，使其生产成本居高不下。微生物发酵法因其周期短、易控制、产率高、污染小等优点，是大规模工业化生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的理想方法。
[0004] L-脯氨酸-4-羟化酶(L-Proline-4-hydroxylase，P4H)是合成反式-4-羟基-L-脯氨酸的关键酶。关于关键酶L-脯氨酸-4-羟化酶的筛选，1996年，Lawrence等人从放线菌Streptomyces griseoviridus P8648中分离纯化出L-脯氨酸-4-羟化酶，该酶为单体酶，在酶反应中需亚铁离子和α-酮戊二酸作为底物，并对L-脯氨酸-4-羟化酶的酶学性质作了初步研究，但此酶的表达量较低，且每毫克蛋白每分钟的反式-4-羟基-L-脯氨酸产量仅为907pmol/L。1999年，Shibasaki等人通过全细胞酶活的测定，从3千多株菌(包括菌株Streptomyces griseoviridus P8648)中筛选具有L-脯氨酸-4-羟化酶活性的菌株，最后发现指孢囊菌RH1的酶活最高。2003年，Petersen等人从真菌Glarea lozoyensis中分离出L-脯氨酸-4-羟化酶，然而从放线菌Streptomyces griseoviridus P8648和真菌Glarea lozoyensis中分离出的L-脯氨酸-4-羟化酶酶活较低，一直未用于工业化应用。到目前为止，具有工业应用前景的L-脯氨酸-4-羟化酶只有来源于指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶，但是，指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶基因的GC含量为74％，并且含有大肠杆菌的稀有密码子，在大肠杆菌中主要以无活性和活性较低的包涵体形式存在，经过密码子优化的L-脯氨酸-4-羟化酶在表达量和催化性能依然较差，将该基因整合于基因组上，菌株在发酵培养的过程中L-脯氨酸-4-羟化酶的催化活性很低，发酵液中只有微量反式-4-羟基-L-脯氨酸的积累。
[0005] 关于反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌株的研究进展。1995年，Serizawa等人首次发表了采用微生物发酵生产游离的反式-4-羟基-L-脯氨酸的报道，他们采用自动筛选系统，对60株细菌、180株放线菌和300株真菌进行反式-4-羟基-L-脯氨酸生产能力的筛选，23℃、200rpm培养9天后，仅有一株真菌能产反式-4-羟基-L-脯氨酸，该真菌被鉴定为Clonostachys cylindrospora SANK14591，产量为13.8mg/L；2000年，Shibasaki等人将筛选出的指孢囊菌RH1中的L-脯氨酸-4-羟化酶基因进行密码子优化后置于一个强启动子的调控下，导入到大肠杆菌W1485中，在添加外源L-脯氨酸的情况下，于发酵罐中发酵100h，反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到41g/L，转化效率只有87％。Shibasaki等为进一步降低反式-
4-羟基-L-脯氨酸的生产成本，将L-脯氨酸代谢中的关键酶基因导入到反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌重组质粒中，在以葡萄糖为碳源、不添加L-脯氨酸的条件下，5L发酵罐发酵中培养99h后，反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到25g/L，发酵过程L-脯氨酸最高积累量达到7.8g/L，初步实现了反式-4-羟基-L-脯氨酸的从头合成。国内现有的反式-4-羟基-L-脯氨酸菌种中，发明专利申请CN103509813A公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，构建羟化酶质粒导入大肠杆菌，在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，24h后产生
0.3g/L的反式-4-羟基-L-脯氨酸；发明专利申请CN104278047A公开了一种使含有重组DNA的反式-4-羟基-L-脯氨酸生物合成系统活性增强的方法，向羟化酶大肠杆菌工程菌中导入透明颤菌血蛋白基因，在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，48h后产生4.9g/L反式-4-羟基-L-脯氨酸；发明专利申请CN1150821A公布了一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，利用胞囊菌羟化酶基因构建表达质粒，导入大肠杆菌，构建工程菌，在发酵表达酶的同时流加葡萄糖和L-脯氨酸，发酵72h，累积产物24g/L。2014年，袁春伟等利用E.coli BL21(pUC19-Hyp)为出发菌株，在装液量为4L的7L发酵罐中，以0.30g/min的补糖速率恒速流加葡萄糖溶液，发酵44h，反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达42.50g/L。这些菌株中的关键酶L-脯氨酸-4-羟化酶基因均来源于指孢囊菌RH1中的L-脯氨酸-4-羟化酶基因，且以各种质粒为表达载体，抗生素的使用以及质粒易丢失等问题的存在，限制了菌种在规模化生产中的应用。
4-羟基-L-脯氨酸的生产成本，将L-脯氨酸代谢中的关键酶基因导入到反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌重组质粒中，在以葡萄糖为碳源、不添加L-脯氨酸的条件下，5L发酵罐发酵中培养99h后，反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达到25g/L，发酵过程L-脯氨酸最高积累量达到7.8g/L，初步实现了反式-4-羟基-L-脯氨酸的从头合成。国内现有的反式-4-羟基-L-脯氨酸菌种中，发明专利申请CN103509813A公开了一种利用重组大肠杆菌发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，构建羟化酶质粒导入大肠杆菌，在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，24h后产生
0.3g/L的反式-4-羟基-L-脯氨酸；发明专利申请CN104278047A公开了一种使含有重组DNA的反式-4-羟基-L-脯氨酸生物合成系统活性增强的方法，向羟化酶大肠杆菌工程菌中导入透明颤菌血蛋白基因，在摇瓶发酵过程中加入L-脯氨酸，48h后产生4.9g/L反式-4-羟基-L-脯氨酸；发明专利申请CN1150821A公布了一种生产反式-4-羟基-L-脯氨酸的方法，利用胞囊菌羟化酶基因构建表达质粒，导入大肠杆菌，构建工程菌，在发酵表达酶的同时流加葡萄糖和L-脯氨酸，发酵72h，累积产物24g/L。2014年，袁春伟等利用E.coli BL21(pUC19-Hyp)为出发菌株，在装液量为4L的7L发酵罐中，以0.30g/min的补糖速率恒速流加葡萄糖溶液，发酵44h，反式-4-羟基-L-脯氨酸产量达42.50g/L。这些菌株中的关键酶L-脯氨酸-4-羟化酶基因均来源于指孢囊菌RH1中的L-脯氨酸-4-羟化酶基因，且以各种质粒为表达载体，抗生素的使用以及质粒易丢失等问题的存在，限制了菌种在规模化生产中的应用。
发明内容
[0006] 针对上述存在问题，本发明目的是通过筛选获得一种新型高效L-脯氨酸-4-羟化酶并且提供一株高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的大肠杆菌基因工程菌及其构建方法，并制定了相应的发酵过程控制方案，具有很好的工业应用前景。
[0007] 本发明技术方案概述如下：
[0008] 本发明提供了一种新型L-脯氨酸-4-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示。所述新型L-脯氨酸-4-羟化酶来源于Micromonospora sp.CNB394。所述L-脯氨酸-4-羟化酶应用于微生物发酵合成反式-4-羟基-L-脯氨酸。
[0009] 本发明还提供一种高效表达上述L-脯氨酸-4-羟化酶、从头合成高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的基因工程菌E.coli HYP。E.coli HYP是在E.coli W3110(ATCC 27325)的基因组上整合T7噬菌体的RNA聚合酶基因(核苷酸序列如SEQ ID No.3所示)，由木糖启动子启动，此改造可以使菌株在木糖诱导的情况下利用T7启动子对基因进行强表达；基因组上的L-脯氨酸脱氢酶基因putA缺失，切断了L-脯氨酸的降解途径；在基因组上两个不同位点整合脯氨酸操纵子基因proBA(核苷酸序列如SEQ ID No.4所示，脯氨酸操纵子由proB基因与proA基因组成，其中proB基因进行了点突变N107D，即proB基因所编码的氨基酸序列位置107的氨基酸由天冬酰胺替换成天冬氨酸)，解除γ-谷氨酸激酶所受的反馈抑制作用，并分别由Ptrc(核苷酸序列如SEQ ID No.5所示)启动，强化了前体物L-脯氨酸的合成途径；在基因组上两个不同位点整合了新型L-脯氨酸-4-羟化酶基因p4H1(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示)，并分别由强启动子PT7启动(核苷酸序列如SEQ ID No.6所示)，构建了反式-4-羟基-L-脯氨酸合成途径；基因组上的sucCD基因缺失，阻断琥珀酰-CoA到琥珀酸的路径，使羟化反应途径和TCA相偶联，增强前体物α-KG的供应，从而实现前体物L-脯氨酸和α-KG的协调供应。
[0010] 本发明还提供一种上述基因工程菌的构建方法，采用CRISPR/Cas9介导的基因编辑技术对E.coli W3110进行定向改造，步骤概述如下：
[0011] (1)在E.coli W3110中构建T7启动子表达系统：在E.coli W3110的基因组上，将T7噬菌体的RNA聚合酶基因整合到lacI-lacZ位点，由木糖启动子启动；
[0012] (2)将基因组上的L-脯氨酸脱氢酶基因putA敲除；
[0013] (3)构建启动子Ptrc和proBA基因的连接片段Ptrc-proBA，并将其整合在假基因yghX位点；
[0014] (4)构建启动子Ptrc和proBA基因的连接片段Ptrc-proBA，并将其整合在trpR基因位点；
[0015] (5)构建启动子PT7和p4H1基因的连接片段PT7-p4H1，并将其整合在假基因yjiP位点；
[0016] (6)构建启动子PT7和p4H1基因的连接片段PT7-p4H1，并将其整合在假基因ycjV位点；
[0017] (7)将基因组上的sucCD基因敲除。
[0018] 本发明还提供了利用上述基因工程菌在发酵生产反式-4-羟基-L-脯氨酸中的应用。
[0019] (1)利用上述基因工程菌进行摇瓶发酵如下：
[0020] 将菌种活化后制备种子液，按10-15％接种量接种到装有发酵培养基的三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期24-30h。
[0021] 优选的发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH4)2SO4 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，酵母提取物0.1-0.3g/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·7H2O 80-100mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
[0022] 基因工程菌E.coli HYP利用摇瓶发酵24-30h后反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量可达10-12g/L。
[0023] (2)利用上述基因工程菌进行发酵罐发酵如下：
[0024] 将菌种活化后制备种子液，按照15-20％接种量接入发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-2g/L；发酵周期35-42h；
[0025] 优选的发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·H2O 80-100mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各0.5-2mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。
[0026] 基因工程菌E.coli HYP利用5L发酵罐发酵35-42h后反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量可达45-51g/L。
[0027] 本发明具有如下优点和有益效果：
[0028] 本发明提供了与反式-4-羟基-L-脯氨酸积累相关的新型L-脯氨酸-4-羟化酶，该酶能在大肠杆菌基因组上稳定遗传和高效表达。同时本发明也提供了一株无质粒、从头合成高产反式-4-羟基-L-脯氨酸的基因工程菌，与现有的反式-4-羟基-L-脯氨酸生产菌相比，该基因工程菌具有遗传稳定性好和发酵产酸能力较强的优势，不含质粒，利用基因组表达上述新型L-脯氨酸-4-羟化酶，以葡萄糖等廉价碳源为底物从头高效合成反式-4-羟基-L-脯氨酸，发酵42h反式-4-羟基-L-脯氨酸产量高达51g/L，具有很好的工业应用前景。附图说明
[0029] 图1：(a)pREDCas9质粒图谱，(b)pGRB质粒图谱。
[0030] 图2：PxylFT7RNAP基因替换片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：T7RNAP基因；3：下游同源臂；4：阳性菌鉴定片段；5：原菌对照。
[0031] 图3：putA基因敲除片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性菌鉴定片段；5：原菌对照。
[0032] 图4：Ptrc proBA基因替换片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：proBA基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：阳性菌鉴定片段；6：原菌对照。
[0033] 图5：Ptrc proBA基因替换片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：proBA基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：阳性菌鉴定片段；6：原菌对照。
[0034] 图6：PT7p4H1基因替换片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：p4H1基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
[0035] 图7：PT7p4H1基因替换片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：p4H1基因；3：下游同源臂；4：重叠片段；5：原菌对照；6：阳性菌鉴定片段。
[0036] 图8：sucCD基因敲除片段构建及验证电泳图。其中：M：1kb DNA marker；1：上游同源臂；2：下游同源臂；3：重叠片段；4：阳性菌鉴定片段；5：原菌对照。
[0037] 图9：菌株E.coli HYP发酵过程曲线图。
具体实施方式
[0038] 下面通过具体的实施方案叙述本发明。除非特别说明，本发明中所用的技术手段均为本领域技术人员所公知的方法。另外，实施方案应理解为说明性的，而非限制本发明的范围，本发明的实质和范围仅由权利要求书所限定。对于本领域技术人员而言，在不背离本发明实质和范围的前提下，对这些实施方案中的物料成分和用量进行的各种改变或改动也属于本发明的保护范围。
[0039] 实施方案中涉及到的百分号“％”，若未特别说明，指体积百分比；溶液的百分比“％(m/v)”指100mL溶液中含有溶质的克数。
[0040] 实施例1：
[0041] 本发明提供一种新型高效的L-脯氨酸-4-羟化酶，其氨基酸序列如SEQ ID No.2所示，来源于Micromonospora sp.CNB394。该酶的筛选工作如下：根据目前报道的来源于指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶的氨基酸序列(GenBank:BAA20094.1)，在NCBI数据库通过BLAST比对，选出一些来源于其他微生物且氨基酸序列与其有一定相似度的基因。然后，根据大肠杆菌密码子偏好性对这些基因进行密码子优化，将密码子优化完成的基因通过基因合成，连接到pTrc99a表达载体上。将构建完成的载体通过电转化的方式导入已经有一定L-脯氨酸积累的E.coli W3110中。然后将上述构建完成菌株进行摇瓶发酵，最终通过检测发酵结束时发酵液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量，测试所筛选的基因是否具有L-脯氨酸-4-羟化酶的活性。实验结果表明，所筛选来源于Micromonospora sp.CNB394的hypothetical protein基因可以表达出L-脯氨酸-4-羟化酶活性，且与源于指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶构建相同表达载体相比酶活提高至少10％。另外，我们对筛选来源于Micromonospora sp.CNB394且具有高效L-脯氨酸-4-羟化酶活性的基因命名为p4H1(核苷酸序列如SEQ ID No.1所示，编码的氨基酸序列如SEQ ID No.2所示)。
[0042] 实施例2：
[0043] 菌株E.coli HYP的构建：
[0044] 1基因编辑的方法
[0045] 本发明中采用的基因编辑方法参照文献(Li Y,Lin Z,Huang C,et al.Metabolic engineering of Escherichia coli using CRISPR–Cas9meditated genome editing[J].Metabolic engineering,2015,31:13-21.)进行，该方法所用的两个质粒图谱见附图1。其中pREDCas9携带gRNA表达质粒pGRB的消除系统，λ噬菌体的Red重组系统及Cas9蛋白表达系统，奇霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，32℃培养；pGRB以pUC18为骨架，包括启动子J23100，gRNA-Cas9结合区域序列和终止子序列，氨苄青霉素抗性(工作浓度：100mg/L)，37℃培养。
[0046] 该方法的具体步骤如下：
[0047] 1.1.pGRB质粒构建
[0048] 构建质粒pGRB的目的是为了转录相应gRNA，从而与Cas9蛋白形成的复合体，并通过碱基配对和PAM识别目的基因靶位点，实现目的DNA双链断裂。采用包含靶序列的DNA片段与线性化的载体片段重组的方法构建pGRB质粒。
[0049] 1.1.1靶序列设计
[0050] 使用CRISPR RGEN Tools设计靶序列(PAM:5’-NGG-3’)
[0051] 1.1.2包含靶序列的DNA片段的制备
[0052] 设计引物：5’-线性化载体末端序列(15bp)-酶切位点-靶序列(不包括PAM序列)-线性化载体末端序列(15bp)-3’及其反向互补的引物，通过单链DNA的退火制备包含靶序列的DNA片段。反应条件：预变性95℃，5min；退火30-50℃，1min。退火体系如下：
[0053] 退火体系
[0054]
[0055]
[0056] 1.1.3线性载体的制备
[0057] 载体的线性化采用反向PCR扩增的方法
[0058] 1.1.4重组反应
[0059] 重组体系如下表。所用重组酶均为 II One Step Cloning Kit系列的酶，重组条件：37℃，30min。
[0060] 重组体系
[0061]
[0062] 1.1.5质粒的转化
[0063] 取10μL反应液，加入到100mL DH5α化转感受态细胞中，轻轻混匀后冰浴20min，42℃热激45-90s，立即冰浴2-3min，加入900μL SOC，于37℃复苏1h。8000rpm离心2min，弃部分上清，留200μL左右将菌体重悬后涂布到含有100mg/L氨苄青霉素的平板，将平板倒置，于37℃过夜培养。待平板长出单菌落后通过菌落PCR鉴定，挑选阳性重组子。
[0064] 1.1.6克隆鉴定
[0065] 将PCR阳性菌落接种至含有100mg/L氨苄青霉素的LB培养基中过夜培养后保菌，提取质粒，酶切鉴定。
[0066] 1.2重组DNA片段的制备
[0067] 用于敲除的重组片段由需敲除基因的上下游同源臂组成(上游同源臂-下游同源臂)；用于整合的重组片段以整合位点的上下游同源臂及待整合的基因片段组成(上游同源臂-目的基因-下游同源臂)。利用引物设计软件primer5，以待敲除基因或待整合位点的上下游序列为模板，设计上下游同源臂引物(扩增长度约400-500)；以待整合基因为模板，设计整合基因的扩增引物。通过PCR的方法分别扩增上下游同源臂和目的基因片段后，再经过重叠PCR制备重组片段。PCR的体系和方法如下表：
[0068] PCR扩增体系
[0069]
[0070]
[0071] 重叠PCR的体系如下表：
[0072] 重叠PCR扩增体系
[0073]
[0074] 注：模板由上下游同源臂的扩增片段和目的基因等摩尔组成，且总量不超过10ng。
[0075] PCR反应条件(宝生物PrimeSTAR HS酶)：预变性(95℃)5min；然后进行30轮循环：变性(98℃)10s，退火((Tm-3/5)℃)15s，72℃延伸(此酶活力1min延伸约1kb)；72℃继续延伸10min；维持(4℃)。
[0076] 1.3质粒和重组DNA片段的转化
[0077] 1.3.1pREDCas9的转化
[0078] 利用电转的方法将pREDCas9质粒电转至W3110的电转感受态中，将菌体复苏培养后涂布于含奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。抗性平板上生长单菌落用鉴定引物进行菌落PCR,筛选阳性重组子。
[0079] 1.3.2含pREDCas9的目的菌株电转化感受态制备
[0080] 32℃培养至OD600＝0.1～0.2时，添加0.1M的IPTG(使其终浓度为0.1mM)，继续培养至OD600＝0.6～0.7时进行感受态制备。添加IPTG的目的是使pREDCas9质粒上的重组酶诱导表达。感受态制备所需培养基及制备过程参照常规标准操作。
[0081] 1.3.3pGRB和重组DNA片段的转化
[0082] 将pGRB和供体DNA片段同时电转化至含有pREDCas9的电转感受态细胞中。将电转化后复苏培养的菌体涂布于含氨苄青霉素和奇霉素的LB平板上，32℃过夜培养。用上游同源臂上游引物和下游同源臂的下游引物，或设计专门的鉴定引物，进行菌落PCR验证，筛选阳性重组子并保菌。
[0083] 1.4质粒的消除
[0084] 1.4.1pGRB的消除
[0085] 将阳性重组子置于含有0.2％阿拉伯糖的LB培养基中过夜培养，适量稀释后涂布于含有奇霉素抗性的LB平板上，32℃过夜培养。对点含有氨苄青霉素和奇霉素抗性的LB平板，挑选氨苄青霉素平板不生长，奇霉素抗性平板生长的单菌落保菌。
[0086] 1.4.2pREDCas9质粒的消除
[0087] 将阳性重组子转接到无抗性的LB液体培养基中，42℃过夜培养，适量稀释后涂布于无抗性的LB平板上，37℃过夜培养。对点含有奇霉素抗性和无抗性的LB平板，挑选奇霉素抗性平板不生长，无抗性平板生长的单菌落保菌。
[0088] 2.菌株构建过程中所涉及的引物见下表：
[0089]
[0090]
[0091]
[0092] 3菌株构建的具体过程
[0093] 3.1将来源于T7噬菌体的RNA聚合酶基因整合到E.coli W3110的基因组的lacI-lacZ位点
[0094] 以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其lacI-lacZ基因的上下序列设计上游同源臂引物(UP-lacI-lacZ-S、UP-lacI-lacZ-A)和下游同源臂引物(DN-lacI-lacZ-S、DN-lacI-lacZ-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得T7RNAP基因序列，其中包含木糖启动子PxlyA，根据其T7RNAP基因序列设计引物(T7RNAP-S、T7RNAP-A)，并PCR扩增T7RNAP片段；上述片段通过重叠PCR的方法获得T7RNAP基因的整合片段(上游同源臂-PxlyA-T7RNAP-下游同源臂)，构建pGRB-lacI-lacZ使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-lacI-lacZ-S和gRNA-lacI-lacZ-A的退火制得。制备E.coli W3110的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HYP1。PxlyA-T7RNAP片段整合过程中，整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图2。其中上游同源臂长度为424bp，T7RNAP基因片段长度为3034bp，下游同源臂长度为453bp，重叠片段的长度为3911bp，PCR验证重组子时，阳性重组子所扩增的片段长度应为3911bp，原菌扩增出来的片段长度应为4170bp。
[0095] 3.2putA基因的敲除
[0096] 以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其putA基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-putA-S、UP-putA-A)和下游同源臂引物(DN-putA-S、DN-putA-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法获得putA基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-putA使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-putA-S和gRNA-putA-A的退火制得。制备E.coli HYP1的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HYP2。putA敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图3。其中，上游同源臂的长度应为553bp，下游同源臂的长度应为636bp，敲除片段的总长应为3898bp，由于敲除片段过长，故设计鉴定引物，鉴定引物PCR片段长度为736bp，PCR验证时，阳性菌PCR不能扩增出片段，原菌PCR扩增片段长度应为736bp。
[0097] 3.3将Ptrc-proBA整合在假基因yghX位点处
[0098] 以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其yghX基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yghX-S、UP-yghX-A)和下游同源臂引物(DN-yghX-S、DN-yghX-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；根据proBA基因设计引物(proBA-S、proBA-A)，并扩增proBA基因片段。启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和proBA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得proBA基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-proBA-下游同源臂)，构建pGRB-yghX使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yghX-S和gRNA-yghX-A的退火制得。制备E.coli HYP2的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HYP3。Ptrc-proBA整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图4。其中，上游同源臂的长度应为602bp，proBA基因片段长度应为2369bp，下游同源臂的长度应为561bp，整合片段的总长应为3606bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为3606bp，原菌PCR扩增片段长度应为1765bp。
[0099] 3.4将Ptrc-proBA整合在trpR基因位点处
[0100] 以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其trpR基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-trpR-S、UP-trpR-A)和下游同源臂引物(DN-trpR-S、DN-trpR-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；以实验室保存的载有proBA基因(其中proB基因进行了点突变N107D)的质粒pET28-proBA为模板，根据proBA基因设计引物(proBA-S、proBA-A)，并扩增proBA基因片段。启动子Ptrc则设计在上游同源臂的下游引物和proBA基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得proBA基因的整合片段(上游同源臂-Ptrc-proBA-下游同源臂)，构建pGRB-trpR使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-trpR-S和gRNA-trpR-A的退火制得。制备E.coli HYP3的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HYP4。Ptrc-proAB整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图5。其中，上游同源臂的长度应为451bp，proBA基因片段长度应为2369bp，下游同源臂的长度应为404bp，整合片段的总长应为3298bp，由于整合片段过长，故设计鉴定引物，鉴定引物PCR片段长度为940bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为940bp，原菌PCR无法扩增出片段。
[0101] 3.5将PT7-p4H1整合在假基因yjiP位点处
[0102] 以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其yjiP基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-yjiP-S、UP-yjiP-A)和下游同源臂引物(DN-yjiP-S、DN-yjiP-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；根据p4H1基因设计引物(p4H1-S、p4H1-A)，并扩增p4H1基因片段。启动子PT7则设计在上游同源臂的下游引物和p4H1基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得p4H1基因的整合片段(上游同源臂-PT7-p4H1-下游同源臂)，构建pGRB-yjiP使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-yjiP-S和gRNA-yjiP-A的退火制得。制备E.coli HYP4的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HYP5。PT7-p4H1整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图6。其中，上游同源臂的长度应为499bp，p4H1基因片段长度应为807bp，下游同源臂的长度应为463bp，整合片段的总长应为1878bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1878bp，原菌PCR扩增片段长度应为
2055bp，由于两者PCR扩增片段长度相近，故设计鉴定引物，阳性菌PCR扩增片段长度应为
1219bp，原菌则无法扩增出片段。
2055bp，由于两者PCR扩增片段长度相近，故设计鉴定引物，阳性菌PCR扩增片段长度应为
1219bp，原菌则无法扩增出片段。
[0103] 3.6将PT7-p4H1整合在假基因ycjV位点处
[0104] 以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其ycjV基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-ycjV-S、UP-ycjV-A)和下游同源臂引物(DN-ycjV-S、DN-ycjV-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段；通过基因合成获得p4H1基因，根据p4H1基因设计引物(p4H1-S、p4H1-A)，并扩增p4H1基因片段。启动子PT7则设计在上游同源臂的下游引物和p4H基因的上游引物中。上述片段通过重叠PCR的方法获得p4H1基因的整合片段(上游同源臂-PT7-p4H1-下游同源臂)，构建pGRB-ycjV使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-ycjV-S和gRNA-ycjV-A的退火制得。制备E.coli HYP5的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HYP6。PT7-p4H1整合片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图7。其中，上游同源臂的长度应为428bp，p4H1基因片段长度应为807bp，下游同源臂的长度应为428bp，整合片段的总长应为1772bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1722bp，原菌PCR扩增片段长度应为1301bp。
[0105] 3.7sucCD基因的敲除
[0106] 以E.coli W3110(ATCC27325)基因组为模板，根据其sucCD基因的上下游序列设计上游同源臂引物(UP-sucCD-S、UP-sucCD-A)和下游同源臂引物(DN-sucCD-S、DN-sucCD-A)，并PCR扩增其上下游同源臂片段。上述片段通过重叠PCR的方法获得sucCD基因的敲除片段(上游同源臂-下游同源臂)。构建pGRB-sucCD使用的含靶序列的DNA片段通过引物gRNA-sucCD-S和gRNA-sucCD-A的退火制得。制备E.coli HYP6的感受态细胞，按照1.3和1.4所示的方法操作，最终获得菌株E.coli HYP。sucCD敲除片段的构建和阳性菌株的PCR验证的电泳图见附图8。其中，上游同源臂的长度应为493bp，下游同源臂的长度应为622bp，敲除片段的总长应为1112bp，PCR验证时，阳性菌PCR扩增片段长度应为1112bp，原菌PCR扩增片段长度应为2037bp。
[0107] 3.8对照菌株的构建及L-脯氨酸-4-羟化酶活性对比
[0108] 利用上述相同的基因编辑方法，我们将来源于指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶基因p4h分别整合于菌株E.coli HYP4基因组的假基因位点yjiP和ycjV，并都由强启动子PT7启动转录，最终获得对照菌株E.coli HYP-RH1。将菌株E.coli HYP6和对照菌株E.coli HYP-RH1在相同培养条件下发酵30h，利用氨基酸分析仪对检测两者发酵液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量，发现具有新型L-脯氨酸-4-羟化酶基因p4H1的菌株E.coli HYP6发酵液中反式-4-羟基-L-脯氨酸的含量高达12g/L，而对照菌株E.coli HYP-RH1发酵液中未检测到反式-4-羟基-L-脯氨酸。实验结果表明，来源于指孢囊菌RH1的L-脯氨酸-4-羟化酶基因p4h在基因组上不能表达出L-脯氨酸-4-羟化酶催化活性，而来源于Micromonospora sp.CNB394的新型L-脯氨酸-4-羟化酶在基因组p4H1上能表达出高效的催化活性。
[0109] 实施例3：
[0110] 菌株E.coli HYP的摇瓶发酵实验：
[0111] 斜面培养：取-80℃保藏菌种划线接种于活化斜面，37℃培养12h，并传代一次；
[0112] 摇瓶种子培养：用接种环刮取一环斜面种子接种于装有30mL种子培养基的500mL三角瓶中，九层纱布封口，37℃，200rpm培养7-10h；
[0113] 摇瓶发酵培养：按10-15％接种量接种到装有500mL三角瓶中(终体积为30mL)，九层纱布封口，37℃，200r/min振荡培养，发酵过程中通过补加氨水维持pH在7.0-7.2；补加60％(m/v)葡萄糖溶液维持发酵进行；发酵周期24-30h；
[0114] 斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，NaCl 1-2.5g/L，琼脂15-20g/L，其余为水，pH 7.0-7.2；
[0115] 种子培养基组成为：葡萄糖20-30g/L，(NH4)2SO4 1-5g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，酵母提取物5-10g/L，FeSO4·7H2O 1-3mg/L，MnSO4·H2O 1-3mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2；
[0116] 发酵培养基组成为：葡萄糖20-40g/L，(NH4)2SO4 1-3g/L，KH2PO4 1-3g/L，MgSO4·7H2O 1-2g/L，酵母提取物0.1-0.3g/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·7H2O 80-100mg/L，其余为水，pH 7.0-7.2。
[0117] 摇瓶发酵24-30h后反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量可达10-12g/L。
[0118] 实施例4：
[0119] 菌株E.coli HYP在发酵罐上的发酵实验：
[0120] 斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12-16h，转接茄形瓶继续培养12-16h；
[0121] 种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养至细胞干重达到5-6g/L；
[0122] 发酵培养：按照15-20％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-2g/L；发酵周期35-40h；
[0123] 斜面培养基组成为：葡萄糖1-5g/L，蛋白胨5-10g/L，牛肉膏5-10g/L，酵母粉1-5g/L，NaCl 1-2.5g/L，琼脂15-20g/L，其余为水，pH 7.0-7.2；
[0124] 种子培养基组成为：葡萄糖15-30g/L，酵母提取物5-10g/L，胰蛋白胨5-10g/L，KH2PO4 5-15g/L，MgSO4·7H2O 2-5g/L，FeSO4·7H2O 5-15mg/L，MnSO4·H2O 5-15mg/L，VB1 1-3mg/L，VH 0.1-1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。
[0125] 发酵培养基组成为：葡萄糖15-25g/L，酵母提取物1-5g/L，胰蛋白胨1-5g/L，柠檬酸钠0.1-1g/L，KH2PO4 1-5g/L，MgSO4·7H2O 0.1-1g/L，FeSO4·7H2O 80-100mg/L，MnSO4·H2O 80-100mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各0.5-2mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0-7.2。
[0126] 5L发酵罐发酵35-42h后反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量可达45-51g/L。
[0127] 实施例5：
[0128] 菌株E.coli HYP在5L发酵罐上的发酵实验：
[0129] 斜面活化培养：从-80℃冰箱保菌管中刮一环菌种，均匀涂布于活化斜面，37℃培养12h，转接茄形瓶继续培养12h；
[0130] 种子培养：取适量无菌水于茄形瓶中，将菌悬液接入种子培养基中，pH稳定在7.0左右，温度恒定在37℃，溶氧在25-35％之间，培养6h；
[0131] 发酵培养：按照15％接种量接入新鲜的发酵培养基，开始发酵，发酵过程中控制pH稳定在7.0左右，温度维持在37℃，溶氧在25-35％之间；当培养基中的葡萄糖消耗完之后，流加80％(m/v)的葡萄糖溶液，维持发酵培养基中的葡萄糖浓度在0.1-2g/L；发酵周期35-40h；
[0132] 斜面培养基组成为：葡萄糖1g/L，蛋白胨10g/L，牛肉膏10g/L，酵母粉5g/L，NaCl 2.5g/L，琼脂25g/L，其余为水，pH 7.0；
[0133] 种子培养基组成为：葡萄糖25g/L，酵母提取物5g/L，胰蛋白胨3g/L，KH2PO4 1.2g/L，MgSO4·7H2O 0.5g/L，FeSO4·7H2O 10mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各1mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。
[0134] 发酵培养基组成为：葡萄糖20g/L，酵母提取物4g/L，胰蛋白胨5g/L，柠檬酸钠2g/L，KH2PO4 2g/L，MgSO4·7H2O 2g/L，FeSO4·7H2O 20mg/L，MnSO4·H2O 10mg/L，VB1、VB3、VB5、VB12、VH各2mg/L，消泡剂2滴，其余为水，pH 7.0。
[0135] 5L发酵罐发酵42h后反式-4-羟基-L-脯氨酸的产量达到了51g/L。发酵过程曲线见附图9。
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