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水稻基因组学的研究方法

阅读：1025发布：2020-09-22

专利汇可以提供水稻基因组学的研究方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种水稻基因组学的研究方法，本发明根据粳稻日本晴全基因组BAC序列与籼稻93-11全基因组序列BLAST分析的结果，开发基于籼稻-粳稻第1 染色体序列差异的特异InDel标记，还对所设计引物在2个籼稻和5个粳稻品种之间进行多态性鉴定，获得分子标记除了在籼稻-粳稻亚种之间具有多态性之外，一些标记在亚种内也具有多态性，因此这些引物可以用于同一亚种间多态性鉴定。甚至少数标记对来自于同一遗传背景及其相应突变体之间有多态性。可以预见，开发的分子标记在籼稻-粳稻遗传分化、籼稻-粳稻杂种优势的分子机制解释、分子标记辅助育种等方面具有重要利用价值。，下面是水稻基因组学的研究方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.根据各对引物在（日本晴）染色体上的具体位置等相关信息，构建了水稻第1染色体的InDel分子标记的物理图谱，该图谱包括86对InDel分子标记，平均每1cM分布0.47对标记，平均每对引物的物理间隔为0.52Mb。

说明书全文

水稻基因组学的研究方法

技术领域

[0001] 水稻基因组学的研究方法，属于基因工程学领域。

背景技术

[0002] 水稻是最主要的粮食作物之一，也是重要的单子叶模式植物，共有12对染色体，其中第1染色体是最长的，其长度达51.4Mb，约占水稻基因碱基总数的1/10。其中短臂序列长493729bp，约6756个基因，约30%基因(2073个基因)已被功能分类。基因大小的均值是6.4kb。第1染色体是富含G＋C的染色体，特别是在编码区，具有几个分散或串联重复序列基因簇分布的特征。已经定位于第1染色体的基因有抗病性基因、白叶枯病抗性基因、稻瘟病抗性基因、抗虫性基因、品质相关性状基因、产量相关性状基因、株型相关性状基因、株高相关基因、育性相关基因等对水稻产量有很大影响的基因。发明内容

[0003] 水稻基因组的成功测序是继完成人类基因组测序后的又一巨大成功。进行水稻基因组及后基因组研究，对提升我国农作物育种水平和培育新品种具有重要意义，并将帮助全球解决食物问题。

[0004] 实验材料本研究材料包括2个高产籼稻恢复系93-11、T13与5个优良粳稻品种空育131、彩、加花1号、合江06、Ri22，用于籼稻-粳稻之间特异性分子标记的筛选。

[0005] 实验设计利用生物信息学的方法，根据粳稻日本晴和籼稻93-11的基因组序列差异来设计InDel标记。日本晴的BAC序列已在染色体上定位，用鸟枪法测序的93-11基因组序列也通过与日本晴的序列比对而被锚定在各个染色体。设计分子标记可按如下操作：
目标区段所包括的日本晴BAC序列
（http://rgp.dna.affrc.go.jp/cgi-bin/statusdb/irgsp-status.cgi）

目标BAC序列与93-11序列比对，筛选特异InDel特异位点
（http://blast.ncbi.nlm.nih.gov/）
含InDel的日本晴序列（1000bp）

软件设计特异InDel引物（长度200-300bp）

设计引物特异性的鉴定
（http://rapdb.dna.affrc.go.jp/tools/blast/）
多态性鉴定，获得籼稻-粳稻之间特异InDel标记
实验方法
1、 DNA的提取
(1) 提取方法
DNA的提取方法有很多种，经典的方法如SDS法，CTAB法等，本研究采用CTAB法进行水稻DNA的提取。将种子在37℃恒温培养箱中萌发后置于25℃温室中生长，当植株长出3-4片叶时，每个水稻品种选择一个单株，取约3g新鲜叶片，分别置于1.5mL的离心管中。将装有叶片的离心管迅速置于冰上，备用抽提DNA。按照CTAB方法提取DNA，各研究材料的DNA的含量在Bio—Photometer分光光度计(Eppendorf公司)中检查测定。 (2) 所用试剂：
① 2×CTAB
CTAB 2g
0.5M EDTA （PH8.0） 8mL
1M Tris-Hcl （PH8.0） 20mL
Nacl 12.3g
加ddH2O至 200mL
② 10% CTAB
CTAB 100g
Nacl 40.95g
加ddH2O至 1000mL
(3) CTAB法提取DNA的原理和步骤：
1）将种子在37℃恒温培养箱中萌发后置于25℃温室中生长，当植株长出3-4片叶时，取约3g新鲜叶片，加液氮研磨成粉末状，分别置于1.5mL的离心管中；
2）加入800μl的CTAB提取缓冲液，混匀（CTAB在65℃水浴预热），每5min轻轻震荡几次，20min后12000 r/min，离心15 min；
3）小心吸取上清液，加入等体积的酚：氯仿（各400μl）溶液，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min；
4）小心吸取上清液，加入等体积的氯仿，混匀，4℃，12000 r/min，离心10 min。

[0006] 5）重复步骤（4）1-2次，至蛋白层不出现为止；6）取上清，-20℃沉淀1h，4℃，12000 r/min，离心10 min；
7）弃去上清液，用70%乙醇洗涤沉淀2次；
8）室温下干燥后（一般干燥5-15 min），溶于30-50 μl DEPC去离子水中，于-20℃或者-70℃下保存备用。

[0007] 2、PCR反应程序(1) 引物来源
本研究所用引物均来自于自身设计的引物，由英骏生物技术有限公司合成。

[0008] (2)PCR反应体系本研究所用反应体系均采用2 × GC、总体积20μl进行配置，具体如下：
模板DNA (50ng/μl) 1.0 μl
2 × GC Buffer 10.0 μl
dNTP（2.5mM） 2.0 μl
Primer pair (10μM)-F 1.0 μl
Primer pair (10μM)-R 1.0 μl
r-TaqE （5U/μl） 0.20 μl
ddH2O 5.00 μl
总体积（Total） 2 0 μl
(3)PCR反应程序
本研究所设计引物退火温度绝大多数为50℃，因此具体反应程序如下：94℃预热
5min，然后进行35个循环的扩增，每个循环94℃30Sec、50℃ 40Sec、72℃40sec，最后72℃ 延伸10min。

[0009] (4)扩增产物的检测扩增产物中加入适量溴酚兰（产物/溴酚兰 4V/1V），混匀；根据扩增片段长度的不同，采用不同浓度的琼脂糖凝胶进行电泳分离（电泳电压5V/cm），凝胶经EB染色后用Tanon Gis-2010型凝胶成像系统观察。

[0010] 3、InDel物理图谱（遗传图谱）的绘制参照刘仁虎等所述方法进行。首先，我们根据每一个标记在日本晴序列上相对应的实际物理距离（或遗传距离），以第一个标记作为参照标记（距离设为0）；然后计算每个标记之间的物理间隔（图距单位为Mb）或遗传间隔（图距单位cM）；根据所有标记之间的物理间隔（或遗传间隔），利用MapDraw软件绘制水稻第1染色体InDel物理图谱（或遗传图谱）。其中，根据实际需要，可以通过调整MapDraw的相关参数获得更加清晰、美观的图谱。

[0011] 结果与分析本研究根据粳稻日本晴全基因组BAC文库序列与籼稻93-11全基因组序列BLAST分析的结果，采用Primer Premier 5.0软件进行第1染色体InDel引物的设计；将所设计引物序列及其在日本晴染色体上的物理距离和遗传距离等相关信息进行统一汇总并建立了一个InDel引物的数据库。目前，设计开发的Indel引物共计86对（表1）。

[0012] 表1 基于籼稻-粳稻第1染色体基因组序列差异的InDel 引物从表1中看出，水稻（粳稻）第1染色体长182cM，大小为45Mb，其上分布的引物为86对，平均每对引物在染色体上的物理距离为45/86=0.52Mb，遗传距离为181.8/86=2.11cM。这些引物为后续进行高密度InDel遗传图谱的绘制鉴定了基础。

[0013] 表2 基于籼稻-粳稻第1染色体基因组序列差异的多态性InDel 标记多态性引物在染色体上的平均分布密度0.4对/cM、1.62对/Mb，也即每两个多态性引物实际相当于水稻0.62Mb，每对引物间的遗传距离平均为2.49 cM。

[0014] 讨论本研究通过比较水稻品种日本晴和93-11的第1染色体序列的差异，设计了86对InDel引物，利用2个籼稻和5个粳稻品种对设计的引物进行了多态性鉴定，获得了籼稻-粳稻之间差异的InDel标记73对。

[0015] 本研究还根据各对引物在（日本晴）染色体上的具体位置等相关信息，构建了水稻第1染色体的InDel分子标记的物理图谱。该图谱包括86对InDel分子标记，平均每1cM分布0.47对标记，平均每对引物的物理间隔为0.52Mb。Shen等曾报道每953个碱基（bp）就有一个InDel，Feltus等的研究发现，日本晴与93-11的基因组每1kb就有0.11InDel，而本研究所获得的特异InDel的密度则远远没有达到这样的标准。因此，在现有分子标记的基础上，InDel分子标记还有更大的发展空间。当然，以上研究只是根据日本晴与93-11两个品种的第1染色体序列差异得出的理论值，这两个品种之间的InDel位点是否在籼稻与粳稻之间具有广泛的代表性还有待于进一步鉴定；另一方面，即便存在的InDel位点是籼稻-粳稻之间的差异位点，是否能开发为比较实用、可靠而稳定的InDel标记也需进一步验证。

[0016] 构建的InDel物理图谱给我们提供了第1染色体上分布的Indel分子标记的数量、名称、及其相关物理距离等信息，因此我们可以根据需要灵活选用相应的标记开展相关研究。另外，从对构建的InDel物理图谱分析发现，绝大多数图谱存在1个及以上的较大的间隔区域，也就是说，在该区域InDel分子标记分布较为稀疏，这些区域往往是水稻着丝粒区域与（或）每条染色体的Gap区域。因而，如果研究涉及到该区域，我们还需要对该区域发展更多可利用的分子标记。

[0017] 结论用粳稻日本晴第1染色体BAC文库序列与籼稻93-11全基因组序列进行BLAST比对，找出了第1染色体上的86个Indel位点，根据这些位点采用Primer Premier 5.0软件进行第1染色体InDel引物的设计。

[0018] 将所设计引物序列及其在日本晴染色体上的物理距离和遗传距离等相关信息，利用MapDraw软件绘制了水稻第1染色体的InDel物理图谱。其上分布的引物为86对，平均每对引物在染色体上的物理距离为45/86=0.52Mb，遗传距离为181.8/86=2.11cM。多态性引物在染色体上的平均分布密度0.4对/cM、1.62对/Mb，也即每两个多态性引物实际相当于水稻0.62Mb，每对引物间的遗传距离平均为2.49 cM。

[0019] 运用93-11、T13两个典型籼稻与空育131等5个粳稻品种对所设计的引物进行多态性鉴定，获得籼稻-粳稻特异InDel标记73对，设计引物多态率为84.9%。这些多态性引物扩增产物在籼稻与粳稻间具有多态性，表现为同一个引物对不同亲本扩增时，籼稻

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