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特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨 生物膜效应的D8多肽及其脑靶向递药系统

阅读：605发布：2020-05-11

专利汇可以提供特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽及其脑靶向递药系统专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属药学领域，涉及D8多肽及其脑靶向递药系统，具体涉及特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽及其脑靶向递药系统，本发明的多肽分子D8所修饰的纳米载体被表达乙酰胆碱受体的阳性细胞特异性结合或摄取，具有很强的脑靶向和影像功能和亲和生物膜屏障组成细胞的能力；构建的纳米递药系统如脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等可更有效地将所包载模型药物递送至脑组织及表达乙酰胆碱受体的细胞内，显著提高脑内疾病的治疗效果，且副作用低，具有较好的免疫相容性在脑内肿瘤等脑内疾病的诊断和靶向治疗中具备良好的应用前景。，下面是特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽及其脑靶向递药系统专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8多肽其氨基酸序列为精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸-谷氨酸-色氨酸，为DRTGDRDADREDw，所述D8多肽肽链中部分D型氨基酸被L型替换，其中苏氨酸和谷氨酸为L型氨基酸，其余均为D型氨基酸。
2.按权利要求1所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8多肽以共价键与影像物质X连接得到D8-X复合物，用于高表达乙酰胆碱受体的实体瘤和脑肿瘤的影像诊断和示踪。
3.按权利要求2所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8-X复合物中，X是荧光分子Fluorescein和近红外染料分子cy5.5、IR820、DiR。
4.按权利要求1所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8多肽以共价键与抗肿瘤药物Y连接得到D8-Y复合物，用于高表达乙酰胆碱受体的实体瘤和脑肿瘤的靶向治疗。
5.按权利要求4所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8-Y复合物中，Y是阿霉素、表阿霉素含酮或醛基的抗肿瘤药物。
6.按权利要求4所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8-Y复合物中，Y是紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱或长春新碱含羟基或氨基的抗肿瘤药物。
7.按权利要求4所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8-Y复合物中，Y是硼替佐米含硼酸基团的抗肿瘤药物。
8.按权利要求4所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8-Y复合物中，Y是p53激活肽、抗菌肽或多肽毒素抗肿瘤药物。
9.按权利要求1所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8多肽以共价键与聚乙二醇-Z复合物连接得到D8-聚乙二醇-Z复合物，用于纳米递药系统的制备。
10.按权利要求9所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8-聚乙二醇-Z复合物中，Z是磷脂、聚乳酸(PLA)、乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)或聚己内酯(PCL)。
11.按权利要求10所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8-聚乙二醇-磷脂复合物在用于制备脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统或聚合物圆盘递药系统中的用途。
12.按权利要求10所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的D8-聚乙二醇-聚乳酸复合物或-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物或D8-聚乙二醇-聚己内酯复合物在用于制备聚合物胶束递药系统或纳米粒递药系统中的用途。
13.按权利要求11或12所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统或纳米粒递药系统用于包载诊断药物，进行高表达乙酰胆碱受体的外周实体瘤和脑肿瘤的影像诊断和示踪。
14.按权利要求13所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的递药系统所包载的诊断药物是5-羧基荧光素5-FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR或DiD。
15.按权利要求12所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统和纳米粒递药系统用于包载抗肿瘤药物，进行高表达乙酰胆碱受体的外周实体瘤和脑肿瘤的靶向治疗。
16.按权利要求15所述的特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽，其特征在于，所述的包载的药物是阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替佐米、卡非佐米、p53激活肽、蜂毒肽或蝎毒肽。

说明书全文

特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨 生物膜效应的D8多肽及其

脑靶向递药系统

技术领域

[0001] 本发明属药学领域，涉及D8多肽及其脑靶向递药系统，具体涉及一种可以跨生物膜屏障，特别是血脑屏障(BBB)的靶向多肽分子，特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽及其脑靶向递药系统，及其修饰的复合物、纳米递药系统在制备诊断与治疗外周肿瘤，脑肿瘤等脑内疾病的制剂中的用途，本发明的多肽在血清中较稳定，靶向效果较好，具有较好的免疫相容性。

背景技术

[0002] 由于血脑屏障的存在，传统药物很难进入脑内，造成临床治疗脑内疾病的的一大难题，因此，主动靶向递药系统在脑内疾病的治疗中至关重要。利用多肽、蛋白或抗体与其相应的配体或抗原相互作用，介导药物入脑是目前主动靶向递药的主要策略，其中多肽类具有合成方便，结构简单，高亲和性和低免疫原性等特征，已应用广泛，但是天然多肽均为由L型氨基酸组成的多肽，即L型多肽，极易被蛋白酶水解，影响了靶向效率。据近几年的研究，将L型多肽转变为D型多肽，可以使多肽更加稳定性，提高靶向效率，但是D型多肽在体内很难被降解，随着蓄积量的增加和时间的延长，容易引起机体免疫应答，产生免疫反应，因此，如何在保证靶向效率的前提下，降低靶向分子引起的免疫反应是靶向递药系统研究的又一难题。

[0003] 研究显示，血脑屏障(BBB)上表达多种受体，包括低密度脂蛋白受体、转铁蛋白受体和烟碱型乙酰胆碱受体等，其中烟碱型乙酰胆碱受体是一类在BBB上高表达的门控型离子通道，基于现有技术的基础，本申请的发明人拟提供一种可以跨生物膜屏障，特别是血脑屏障(BBB)的靶向多肽分子，特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽及其脑靶向递药系统，及其修饰的复合物、纳米递药系统在制备诊断与治疗外周肿瘤，脑肿瘤等脑内疾病的制剂中的用途，进一步为后续靶向多肽的设计提供参照。

发明内容

[0004] 本发明的目的在于，基于现有技术的基础，提供一种D8多肽及其脑靶向递药系统，尤其是一种可以跨生物膜屏障，特别是血脑屏障(BBB)的靶向多肽分子，特异性靶向乙酰胆碱受体和具有跨生物膜效应的D8多肽及其脑靶向递药系统，及其修饰的复合物、纳米递药系统在制备诊断与治疗外周肿瘤，脑肿瘤等脑内疾病的制剂中的用途。

[0005] 本发明设计并制备了D8多肽，氨基酸序列为DRTGDRDADREDW的多肽(D8)，所述的D8多肽其氨基酸序列为精氨酸-苏氨酸-甘氨酸-精氨酸-丙氨酸-精氨酸-谷氨酸-色氨酸，所述D8多肽肽链中部分D型氨基酸被L型替换，其中苏氨酸和谷氨酸为L型氨基酸，其余均为D型氨基酸。

[0006] 本发明利用计算机辅助设计方法将可以靶向乙酰胆碱受体的DCDX多肽进行修饰，在保证活性和较好稳定性的前提下，缩短肽链，使其即具有靶向血脑屏障(BBB)的功能，又具有较好的免疫相容性，实现D8修饰的复合物、纳米递药系统在制备诊断与治疗脑部肿瘤等脑内疾病的制剂中的用途，本发明的多肽在血清中较稳定，靶向效果较好，具有较好的免疫相容性。

[0007] 本发明中，连接半胱氨酸的D8多肽，可以共价键修饰在含马来酰亚胺功能基团的聚乙二醇-二硬脂酰基磷脂酰乙醇胺(PEG-DSPE)、聚乙二醇-聚乳酸(PEG-PLA)、聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物(PEG-PLGA)、聚乙二醇-聚己内酯(PEG-PCL)等高分子载体材料上，可用于构建D8修饰的脂质体、聚合物胶束、聚合物圆盘、纳米粒等纳米递药系统。

[0008] 本发明所设计的D8多肽修饰的纳米递药系统可包载紫杉醇、多烯紫杉醇，阿霉素、表阿霉素，喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱，长春新碱，硼替唑米、卡非佐米，p53激活肽如PMI、sPMI和DPMI等，蜂毒肽，蝎毒肽等抗肿瘤药物；也可包载荧光物质，如FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR、DiD等。

[0009] 本发明所设计的stapled-RGD修饰药物，包括通过马来酰亚胺己肼衍生物反应形成pH敏感腙键(涉及阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物)、或通过3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应形成二硫键(涉及紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱等含羟基或氨基的药物)、或通过多巴胺与药物中硼酸基团反应形成pH敏感硼酸脂(涉及药物硼替佐米等含硼酸基团的药物)、或通过固相合成直接形成酰胺键(涉及药物p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物)等的多肽-药物复合物。

[0010] 本发明中，所述的D8多肽以共价键与影像物质X连接得到D8-X复合物，用于高表达乙酰胆碱受体的实体瘤和脑肿瘤的影像诊断和示踪；所述的D8-X复合物中，X是荧光分子Fluorescein和近红外染料分子cy5.5、IR820、DiR。

[0011] 本发明中，所述的D8多肽以共价键与抗肿瘤药物Y连接得到D8-Y复合物，用于高表达乙酰胆碱受体的实体瘤和脑肿瘤的靶向治疗；所述的D8-Y复合物中，Y是阿霉素、表阿霉素含酮或醛基的抗肿瘤药物；优选的，所述的D8-Y复合物中，Y是紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱或长春新碱含羟基或氨基的抗肿瘤药物；优选的，所述的D8-Y复合物中，Y是硼替佐米含硼酸基团的抗肿瘤药物；优选的，所述的D8-Y复合物中，Y是p53激活肽、抗菌肽或多肽毒素抗肿瘤药物。

[0012] 本发明中，所述的D8多肽以共价键与聚乙二醇-Z复合物连接得到D8-聚乙二醇-Z复合物，用于纳米递药系统的制备；所述的D8-聚乙二醇-Z复合物中，Z是磷脂、聚乳酸(PLA)、乳酸羟基乙酸共聚物(PLGA)或聚己内酯(PCL)；所述的D8-聚乙二醇-磷脂复合物用于制备脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统或聚合物圆盘递药系统；所述的D8-聚乙二醇-聚乳酸复合物或-聚乙二醇-乳酸羟基乙酸共聚物复合物或D8-聚乙二醇-聚己内酯复合物用于制备聚合物胶束递药系统或纳米粒递药系统；

[0013] 本发明中，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统或纳米粒递药系统用于包载诊断药物，进行高表达乙酰胆碱受体的外周实体瘤和脑肿瘤的影像诊断和示踪；所述的递药系统所包载的诊断药物是5-羧基荧光素5-FAM、近红外染料Cy5.5、IR820、DiR或DiD；

[0014] 本发明中，所述的脂质体递药系统、聚合物胶束递药系统、聚合物圆盘递药系统和纳米粒递药系统用于包载抗肿瘤药物，进行高表达乙酰胆碱受体的外周实体瘤和脑肿瘤的靶向治疗；所包载的药物是阿霉素、表阿霉素、紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱、硼替佐米、卡非佐米、p53激活肽、蜂毒肽或蝎毒肽。

[0015] 本发明中，通过下述技术方案实现：

[0016] 1.D8多肽的合成

[0017] 采用Boc保护固相合成法制备D8-Cys。

[0018] 2.D8的稳定性考察

[0019] 将D8多肽用水稀释至1mg/mL。取0.1mL与0.9mL 25％的灭菌大鼠血清混匀，在37℃孵育。分别在0.25h，0.5h，1h，2h，4h，8h和12h时各取出100μL，各加入20μL含0.1％TFA的乙腈，在4℃静置20min后，12000rpm离心10min，取上清，RP-HPLC测定D8多肽的含量。

[0020] 3.D8多肽与乙酰胆碱受体的亲和力测定

[0021] 将D8和DCDX多肽分别用PBS稀释至不同浓度，在4℃与表达乙酰胆碱受体的细胞共孵育一定时间后，加入包载荧光素的脂质体DCDX-Lip，与D8多肽或DCDX多肽竞争结合细胞表面的乙酰胆碱受体，在4℃孵育过夜后，用冷的PBS洗3次后，流式细胞仪检测荧光素阳性细胞率。评价D8多肽与乙酰胆碱受体的亲和力。

[0022] 4.D8对药物修饰

[0023] 连接半胱氨酸后的D8与药物的马来酰亚胺己肼衍生物反应，形成含pH敏感腙键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括阿霉素、表阿霉素等含酮或醛基的药物；

[0024] 连接半胱氨酸后的D8多肽与药物的3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物反应，形成含二硫键的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括紫杉醇、多烯紫杉醇、喜树碱、羟基喜树碱、9-硝基喜树碱、长春新碱等含羟基或氨基的药物；

[0025] D8多肽通过修饰多巴胺进与药物的硼酸基团反应，形成含pH敏感硼酸脂的多肽-药物复合物，其中所涉及药物包括硼替佐米等含硼酸基团的药物；

[0026] D8多肽通过固相合成直接与多肽药物缩合制成融合多肽，其中所涉及药物包括p53激活肽、抗菌肽、多肽毒素等多肽药物。

[0027] 5.D8-PEG-PLA、D8-PEG-DSPE、D8-PEG-PLGA合成

[0028] 通过D8多肽上的游离巯基与Mai-PEG-PLA、Mal-PEG-DSPE、Mal-PEG-PLGA所含马来酰亚胺的反应实现D8-PEG-PLA、D8-PEG-PLA、D8-PEG-DSPE、D8-PEG-PLGA的合成，并进行纯化和冻干。

[0029] 6.D8-PEG-PLA、D8-PEG-DSPE、D8-PEG-PLGA纳米递药系统制备

[0030] 称取一定量的D8-PEG-PLA或D8-PEG-PLGA或D8-PEG-DSPE，与处方量的mPEG-PLA和模型药物(荧光素如香豆素-6、DiR，或药物如紫杉醇、阿霉素、p53激活肽sPMI)，溶解于一定溶媒中，成膜，水化，柱层析除去游离模型药物，制得D8-PEG-PLA或D8-PEG-PLGA聚合物胶束或纳米粒递药系统、D8-PEG-DSPE聚合物胶束递药系统。激光散射粒度仪表征其粒径；

[0031] 称取一定量的D8-PEG-DSPE，与处方量的mPEG-PLA、磷脂、胆固醇和模型药物(荧光素如香豆素-6、DiR，或药物如阿霉素、紫杉醇、硼替佐米、蜂毒肽)，溶解于一定溶媒中，成膜，水化，柱层析除去游离模型药物，制得D8-PEG-DSPE聚合物圆盘递药系统。激光散射粒度仪表征其粒径；

[0032] 称取一定量的D8-PEG-DSPE，与处方量的mPEG-PLA、磷脂、胆固醇和模型药物(荧光素如香豆素-6、DiR，或药物如阿霉素、紫杉醇、硼替佐米、p53激活肽PMI)，溶解于一定溶媒中，成膜，水化，柱层析除去游离模型药物，制得D8-PEG-DSPE脂质体递药系统。激光散射粒度仪表征其粒径。

[0033] 7.D8多肽及其修饰的纳米递药系统跨生物膜屏障能力评价

[0034] 体外评价：通过构建生物膜(如BBB)模型，分析单位时间内D8多肽转运药物、荧光素或递药系统跨BBB的量，体外评价D8跨生物膜的能力；

[0035] 通过给正常小鼠(如BALB/C品系)，尾静脉注射连接荧光素或药物的D8多肽及其修饰的纳米递药系统与对照组(如：游离荧光素、药物及未修饰多肽的纳米递药系统)比较，体内评价D8多肽及其修饰的纳米递药系统跨生物膜的能力。

[0036] 8.D8多肽修饰的纳米递药系统在体内的药代动力学参数评价及在肝脏和脾脏中的分布

[0037] 将包载药物或荧光素的，D8多肽修饰的纳米递药系统通过尾静脉注射到大鼠体内，并分别在预先设计好的时间点通过尾静脉取血，离心分离出血清后，用荧光分光光度计或HPLC对血清中药物或荧光素定量，分析其在体内的药代动力学参数；

[0038] 将包载药物或荧光素的，D8多肽修饰的纳米递药系统通过尾静脉注射到正常小鼠体内，并在预先设计好的时间点，用8％水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血后分离出主要脏器组织。将脏器称重，并用相应的试剂萃取出组织中的荧光素或药物，统计分析。

[0039] 9.D8多肽及其修饰的纳米递药系统比DCDX多肽或其修饰的纳米递药系统具有更好的免疫相容性

[0040] 通过比较D8多肽及DCDX多肽修饰的脂质体进入血循环后吸附IgM的量，评价其免疫原性强弱；

[0041] 重复给正常小鼠尾静脉注射包载Lipid A的脂质体，比较D8多肽及DCDX多肽修饰的纳米递药系统在体内产生的IgG和IgM的量，进一步分析D8多肽修饰的纳米递药系统的免疫相容性。

[0042] 10.D8修饰的纳米递药系统的体内抗肿瘤效果评价

[0043] 通过荷U87脑原位瘤模型裸鼠尾静脉分别注射D8修饰的纳米递药系统、DCDX修饰的纳米递药系统、mPEG化纳米递药系统、游离药物和生理盐水，以模型裸鼠的平均生存时间为指标评价不同D8修饰的纳米递药系统的体内抗肿瘤效果。

[0044] 表1、D8多肽修饰脂质体的表征

[0045]

[0046]

[0047] D8多肽修饰的脂质体D8-sLip粒径为：136.5nm，电位为：-37.85mV；DCDX多肽修饰的脂质体粒径为136.4nm，电位为：-31.4mV；与普通脂质体的粒径：138.9nm和电位-48.33mV，没有统计学差异，将脂质体与血清孵育形成蛋白冠后，粒径变化不大，但电位均明显升高，接近血清电位。

[0048] 本发明所设计的D8多肽可介导药物或纳米递药系统靶向高表达乙酰胆碱受体的细胞及其组织，且具有跨生物膜屏障的能力，特别是跨血脑屏障(BBB)，可用于脑部肿瘤等脑内疾病的靶向诊断和治疗。

[0049] 本发明提供了D8多肽的制备和性质考察以及上述所修饰的药物复合物和纳米递药系统用于脑部肿瘤等脑内疾病诊断和治疗的物质基础。本发明的试验结果表明：D8多肽与烟碱型乙酰胆碱受体的亲和性高，在模型动物体内具有很好的肿瘤组织靶向能力和影像效果；与DCDX修饰的纳米递药系统相比，D8多肽修饰的纳米递药系统显示出了更低的免疫原性和较好的免疫相容性。附图说明

[0050] 图1、D8多肽的稳定性，与乙酰胆碱受体的结合能力，

[0051] D8多肽在大鼠血清中的孵育结果表明：D8与DCDX多肽在血清中孵育12h后，降解量低于10％，在血清中较稳定，D8多肽与DCDX多肽修饰的脂质体竞争结合Neuro2a细胞表面的乙酰胆碱受体实验表明：D8多肽与DCDX多肽与乙酰胆碱受体均有很强的结合活性。

[0052] 图2、D8多肽修饰的脂质体跨BBB能力，

[0053] 体外跨BBB实验表明，在37℃条件下，D8多肽修饰的脂质体D8-sLip跨BBB的量呈时间依赖性，随着时间的延长，D8多肽修饰的脂质体的转运量增加，在各时间点的转运量均高于普通脂质体的sLip，4h内，D8-sLip下室的转运量是对照脂质体的3.0倍；

[0054] 体内跨BBB结果显示，D8多肽修饰的脂质体sLip在正常小鼠大脑皮层内的分布明显高于普通脂质体。

[0055] 图3、D8多肽修饰的脂质体在体内的药代动力学参数评价及在肝脏和脾脏中的分布，

[0056] 给大鼠注射包载DiI的药时曲线表明：D8多肽修饰的脂质体在大鼠体内的药时曲线下面积明显高于DCDX修饰的脂质体，D8多肽修饰的脂质体在肝脏和脾脏中的蓄积量在1h和4h时均明显低于DCDX组。

[0057] 图4、D8多肽修饰的脂质体具有较好的免疫相容性，

[0058] D8多肽修饰的脂质较DCDX修饰的脂质体进入血循环后，吸附的Ig M量少，与普通脂质体无统计学差异，当重复给正常小鼠(如：BAL B/C品系)尾静脉注射包载Lipid A的脂质体时，D8多肽修饰的脂质体在体内产生的IgM和IgG量较少。

[0059] 图5、载阿霉素的脂质体递药系统体内抗原位脑胶质瘤药效，

[0060] D8-PEG-DSPE/阿霉素脂质体递药系统，DCDX-PEG-PLGA/阿霉素脂质体递药系统组、mPEG-PLA/阿霉素脂质体递药系统组、游离阿霉素组和生理盐水组的平均生存时间分别为26天、25.5天、22.5天、22天、19天，相比生理盐水组、游离阿霉素组和mPEG-DSPE/阿霉素脂质体递药系统组，D8-PEG-DSPE/阿霉素脂质体递药系统组显著延长了模型鼠的生存时间。

具体实施方式

[0061] 通过下述实施例将有助于进一步理解本发明，但本发明不局限于如下描述范围。

[0062] 实施例1 制备D8、D8-FAM和D8-抗肿瘤药物复合物、D8-PEG-DSPE

[0063] 制备D8多肽：

[0064] 采用固相合成法，制备了氨基酸序列为DRTGDRDADREDW的多肽(D8)，将PAM-氨基酸-Boc树脂用DMF溶胀15min，三氟乙酸(TFA)脱保护两次，每次1min，将Boc保护氨基酸溶解在0.5M的HBTU(溶剂为DMF)中，室温反应15min，DMF洗涤，TFA脱除Boc保护，按照氨基酸序列依次反应，反应完成后，用20％的哌啶DMF溶液脱除CHO(含有W的氨基酸序列)保护基两次，每次15min。TFA脱Boc保护后，用氟化氢将多肽从树脂上切割下来，冰乙醚沉淀后砂芯漏斗抽滤得到多肽粗品。用50％乙腈(含0.1％TFA)溶解后，制备液相纯化、冻干后得D8纯品。

[0065] 制备D8-FAM：

[0066] 通过sRGD-SH的巯基与荧光素的马来酰亚胺的加成反应，合成D8-FAM。将多肽D8与马来酰亚胺荧光素(1.5倍过量)溶解于少量DMF中，加1％体积DIEA，反应2h，高效液相监测反应，制备液相纯化。

[0067] 制备D8-抗肿瘤药物复合物：

[0068] 以D8-阿霉素复合物制备作为D8连接含酮或醛基药物的实施例，取一定量的巯基化D8多肽溶于磷酸盐3mL缓冲液(0.1mM，pH7.0)，加入10倍摩尔量的三(2-羧乙基)膦(TCEP)，于4℃搅拌20min。加入4倍摩尔量的阿霉素6-马来酰亚胺己肼衍生物，于室温避光反应1h，反应液用C18制备柱进行分离(色谱柱：waters X bridge 19×300mm；流动相：A纯水，B乙腈；洗脱方法：100％A～100％B线性梯度)，收集相应组分，冷冻干燥得D8-阿霉素复合物；

[0069] 以D8-紫杉醇复合物作为D8以二硫键连接药物的实施例，200mg紫杉醇溶于10mL氯仿中，冷却至0～5℃，先后加入39.99mg DCC及60.4mg 3-(2-吡啶二巯基)丙酸，加料完毕后，升至室温反应过夜，反应液过滤，经柱层析纯化(CHCl3/MeOH＝50∶1～15∶1，V/V洗脱)得紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物，紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物溶解在5mL DMF中，1.5倍摩尔量的D8溶解在PBS/DMF中，溶液pH值保持4～5将紫杉醇3-(2-吡啶二巯基)丙酸衍生物滴加至巯基多肽溶液中，于室温反应6h，经制备液相制备冻干得多肽-紫杉醇复合物；

[0070] 以D8-硼替佐咪复合物作为D8氮端修饰药物的实施例，依照D8的合成在树脂上依次接入氨基酸，待多肽的所有氨基酸残基接入完毕，三氟乙酸脱去氮端的Boc保护，加入含3倍摩尔量的丁二酸酐与DIEA的DMF溶液，于室温反应30min。洗涤树脂后，加入5倍摩尔量的三甲基氯硅烷保护多巴胺，并以HBTU/DIEA为缩合剂，于室温反应1h，树脂用HF切割，并经制备型HPLC纯化得多肽-多巴胺衍生物，在pH7.4的缓冲液中，多肽-多巴胺衍生物与硼替佐咪以摩尔比1∶1混合即得多肽-硼替佐咪复合物；

[0071] 以D8-p53激活肽PMI复合物作D8融合多肽药物的实施例，直接通过固相多肽合成法制得，具体方法为：确定D8-PMI多肽序列后，按与制备SRGD相同的方法依次接入氨基酸，经HF切割并纯化后得D8-PMI融合多肽；

[0072] 制备D8-PEG-DSPE：

[0073] 通过多肽的游离巯基与Mal-PEG-DSPE所含马来酰亚胺的反应实现膜材料的合成，将40mg Mal-PEG-DSPE溶解在5mL乙腈中，旋转蒸发，成膜，加入3mL PBS(pH8.0，0.2M)在37℃水化形成胶束，8h内加入9.6mg D8-SH并反应过夜，HPLC检测反应，过量的D8-SH通过透析除去，冻干备用。

[0074] 实施例2 D8的稳定性及其与乙酰胆碱受体结合活性试验

[0075] D8多肽稳定性试验：

[0076] 将D8多肽用水稀释至1mg/mL，取0.1mL与0.9mL 25％的灭菌大鼠血清混匀，在37℃孵育，分别在0.25h，0.5h，1h，2h，4h，8h和12h时取出100μL，加入20μL含0.1％TFA的乙腈，在4℃静置20min后，12000rpm离心10min，取上清，RP-HPLC测定D8多肽的量，实验结果如图1a所示；

[0077] D8多肽与乙酰胆碱受体的亲和力测定：

[0078] 将D8和DCDX多肽分别用PBS稀释至不同浓度(10μM，25μM，50μM，100μM和200μM)，在4℃与表达乙酰胆碱受体的Neuro 2a细胞共孵育2h后，加入包载DiI的脂质体DCDX-Lip，与D8多肽或DCDX多肽竞争结合Neuro 2a细胞表面的乙酰胆碱受体，4℃孵育过夜后，用冷的PBS洗3次后，流式细胞仪检测DiI阳性细胞率，评价D8多肽与乙酰胆碱受体的亲和力，实验结果如图1b所示。

[0079] 实施例3 D8多肽修饰的脂质体跨生物膜活性测定

[0080] 体外验证D8多肽修饰的脂质体可跨BBB：

[0081] 体外BBB模型的构建：4周龄SD大鼠断头后取脑，于冰冷的D-Hank’s溶液中迅速分离得到大脑皮层，除去脑膜和脑部大血管后剪碎，加入胶原酶和DNA酶在37℃消化90min，1000r/min离心8min，弃去上清，转移至20％的BSA中，1000g/min4℃离心20min，弃去中上层液体，将底部微血管转移至DMEM中，1000r/min离心5min后，底部微血管段用含20％胎牛血清的DMEM培养液配成微血管段悬液，接种于预先铺有鼠尾胶原的Transwell板中，移入二氧化碳培养箱中，37℃，5％CO2及饱和湿度条件下培养24h，使微血管段贴壁后，换为含嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养，72h后，将培液换为不含嘌呤霉素的内皮专用培养液继续培养48h，测得跨膜电阻(TEER)不小于250Ω·cm2后方可进行实验；

[0082] 用含10％胎牛血清的DMEM培养液配制D8-sLip/DiI和sLip/DiI溶液。将transwell上室培养液吸出，加入上述溶液100μL，下室加入600μL DMEM培养液，37℃孵育，分别在0.5h，1h，2h，3h取出下室液体100μL，并补充新鲜的DMEM。实验结果如图2a所示；

[0083] 体内验证D8多肽修饰的脂质体可跨BBB：

[0084] 将包载荧光速DiI的脂质体，尾静脉注射到BALB/C小鼠体内，4h后，用8％水合氯醛麻醉小鼠，取出脑组织，用4％的多聚甲醛中固定24h，30％蔗糖脱水，OCT包埋，冰冻切片，DAPI染细胞核，置于显微镜下观察并拍照，同时，用与包载相同荧光染料DiI的普通脂质体作对照，按相同步骤处理，实验结果如图2b所示。

[0085] 实施例4 D8多肽的修饰对体内药动学参数及分布的影响

[0086] D8多肽的修饰对体内药动学参数的影响：

[0087] SD大鼠，每组每个时间点各3只，通过尾静脉注射包载荧光素DiI的脂质体(sLip，DCDX-sLip，D8-sLip)，分别在给药5min，15min，30min，1h，2h，4h，8h，12h和24h时，通过尾静脉取血，在4℃，3000rpm离心10min后，分离出血清，用荧光分光光度计定量血清中DiI的量，实验结果如图3a所示；

[0088] D8多肽的修饰对脂质体载药系统在脏器中分布的影响：

[0089] BALB/C小鼠，每组每个时间点各3只，通过尾静脉注射包载荧光素DiI的脂质体(sLip，DCDX-sLip，D8-sLip)，分别在给药1h，4h，8h和24h后，用8％水合氯醛麻醉小鼠，眼球取血后分离出主要脏器组织。血样离心，取上清。将脏器称重，并用甲醇萃取出组织中的DiI，用荧光分光光度计进行定量(激发波长555nm，发射波长570nm)，实验结果如图3b所示。

[0090] 实施例5 D8多肽修饰的脂质体具有较好的免疫相容性

[0091] D8多肽修饰的脂质体在血清中吸附较少的Ig M：

[0092] 将包载荧光素的脂质体sLip，DCDX-sLip及D8-sLip通过尾静脉注射到小鼠体内(50mgHSPC/1kg小鼠体重)，分别在1h及4h时，通过眼内眦取血，室温静置30min后，3000rpm离心10min后，分离出血清，按荧光素的浓度，将血清中脂质体浓度统一，在4℃，14000g，离心30min后分离出蛋白冠，并用冷的PBS洗三遍。最后，用30μL的PBS将沉淀溶解，加入2μL的β-巯基乙醇，8μL 5×loading，95℃，5min，使蛋白变性；

[0093] 按照westernblot的实验方法，利用电泳原理，将蛋白在SDS胶上分离，并转移至PVDF膜上，加入anti-mouse IgM抗体，在4℃孵育过夜后，用ECL显影液显色，实验结果如图4a，b所示；

[0094] 重复给D8多肽修饰的脂质体后，体内免疫应答产生的IgG和IgM较少：

[0095] 将包载Lipid A的脂质体sLip，DCDX-sLip及D8-sLip通过尾静脉注射到小鼠体内(50mg HSPC/1kg小鼠体重)，每周一次，共给4次，在第4次给药一周后，通过小鼠眼内眦取血，，分离出血清，并以mPEG-DSPE为抗原，用ELISA检测血清中IgG及IgM的量，实验结果如图4c，d所示。

[0096] 实施例6载药D8多肽修饰的脂质体递药系统体内药效学试验

[0097] PEG-脂质体膜材料处方组成为HSPC/Chol/mPEG2000-DSPE(52∶43∶5，mol/mol)，DCDX修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG2000-DSPE/DCDX-PEG-DSPE(52∶43∶3∶2，mol/mol)，D8修饰的PEG脂质体膜材料处方为HSPC/Chol/mPEG2000-DSPE/D8-PEG-DSPE(52∶43∶3∶2，mol/mol)。分别称取上述膜材料溶于氯仿，减压旋转蒸发除去氯仿，得均匀脂质膜，真空干燥24h，加入一定体积0.32M硫酸铵溶液，60℃水浴震荡2h，得脂质体混悬液。在
60℃水浴中，使用高压均质机(若脂质体体积少于10mL则改用微型挤出器)依次将脂质体挤压过400、200、100核孔膜，得空白脂质体，将上述空白脂质体用生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱更换外水相，按照药脂比1∶10(w/w)加入阿霉素生理盐水溶液，60℃水浴20min，以生理盐水洗脱通过Sephadex G-50凝胶柱，除去游离药物，得阿霉素脂质体；

[0098] 原位胶质瘤模型鼠尾静脉分别注射生理盐水、游离阿霉素、sLip/阿霉素、DCDX-sLip/阿霉素和D8-sLip/阿霉素脂质体递药系统各200μL，阿霉素制剂的给药剂量为10mg/kg，分别在肿瘤种植后第7、9、11、13和15天给药，记录裸鼠的生存时间。裸鼠生存曲线如图5所示，与其他组别比，载阿霉素的D8-sLip和DCDX-sLip递药系统显著延长原位肿瘤裸鼠生存时间，而两组之间没有明显统计学差异。

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