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培养表面展示 蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基

阅读：641发布：2020-05-11

专利汇可以提供培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明属于细菌培养基技术领域，具体涉及一种培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基。所述培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，包括如下组分：K2PO40.1-2.0g/L，酵母浸粉0.1-2.0g/L，酪蛋白水解肽0.1-2.0g/L，溶剂为水，pH为7.1-7.5。该培养基的培养效果好，能够显著提高获得的表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌落数。，下面是培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基专利的具体信息内容。

权利要求

1.培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，其特征在于，包括如下组分：K2PO4 0.1-2.0g/L，酵母浸粉0.1-2.0g/L，酪蛋白水解肽0.1-2.0g/L，溶剂为水，pH为
7.1-7.5。
2.根据权利要求1所述的培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，其特征在于，包括如下组分：K2PO4 0.2g/L，酵母浸粉0.6g/L，酪蛋白水解肽 0.6g/L，溶剂为水，pH为7.1。
3.根据权利要求1所述的培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，其特征在于，包括如下组分：K2PO4 1g/L，酵母浸粉1 g/L，酪蛋白水解肽 0.8g/L，溶剂为水，pH为7.3。
4.根据权利要求1所述的培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，其特征在于，包括如下组分：K2PO4 0.8g/L，酵母浸粉0.9 g/L，酪蛋白水解肽 0.9g/L，溶剂为水，pH为7.5。
5.根据权利要求1、2、3或4所述的培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，其特征在于：还包括琼脂10-20g/ L。
6.权利要求1-5任一项所述培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：按配比取K2PO4、酵母浸粉和酪蛋白水解肽，然后溶于配比量的水中，混匀，调节pH至7.1-7.5，即得。
7.权利要求1-5任一项所述培养基在培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌中的应用。

说明书全文

培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基

技术领域

[0001] 本发明属于细菌培养基技术领域，具体涉及一种培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基。

背景技术

[0002] 随着国民经济的快速发展和生活水平的日益提高，人们对养殖环境及安全、健康的动物产品提出了更高、更新的要求。然而，近年来，频频曝光的动物食品安全事件，如“瘦肉精事件”、“三聚氰胺奶事件”等等，无一不对动物养殖业造成了沉重的打击，从而引发了严重的信任危机。中国作为世界第一动物养殖大国，动物产品出口在国民经济中举足轻重，但近年来欧洲、日本等一些国家以食品安全问题为壁垒，拒绝中国动物产品的部分进入，给我国经济造成了严重损失。“动物产品安全”问题，已成为制约中国养殖业科学健康和可持续发展的瓶颈。

[0003] 动物微生态制剂是根据动物微生态学理论，利用动物体内正常的微生物成员及其代谢产物或生长促进物，经特殊的加工工艺制成的制剂。具有补充、调整或维持动物肠道内微生物平衡，达到防病、治病、促进健康和提高生产性能的目的(“动物微生物制剂的研究进展”，藤颖等，中国兽药杂志，2005年第39卷第11期，第43-46页，公开日2005年12月31日)。

[0004] 目前，应用最广泛的微生态制剂为枯草芽孢杆菌制剂。枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)是一类好氧型革兰氏阳性菌，为Generally Recognized As Safe(GRAS)菌种之一，对人和动物均无致病性，可作为益生菌用于食品和药品领域。在营养缺乏或其他胁迫条件下，枯草芽孢杆菌能形成具有抗逆性的休眠体-芽孢。芽孢的形成是一系列芽孢衣壳蛋白基因，包括CotA、CotB、CotC、CotF、CotG等70余种蛋白基因按一定的时序调控表达而成，且大多数衣壳蛋白基因的缺失并不会引起枯草芽孢杆菌性状方面的明显变化。芽孢由皮层、芽孢衣壳和芽孢外壁构成，这三层结构的功能及特征使得枯草芽孢杆菌成为生命世界中抗逆性最强的一种结构，能够抵御恶劣的环境条件，如抗热、抗辐射及抗化学药物等方面，从而在自然环境条件下芽孢可存活几年甚至上千万年。

[0005] 随着研究的不断深入，人们发现枯草芽孢杆菌可作为外源片段表达系统展示外源蛋白。随后人们研究和关注的热点逐渐趋向于以外层芽孢衣壳蛋白为分子载体，通过芽孢表面展示技术在枯草芽孢杆菌表面展示外源片段，成功展示外源片段的重组芽孢，成功展示外源段的重组芽孢不仅具有芽孢本身独特的抗逆性，而且还携带外源蛋白特有的生物活性。

[0006] Isticato等于2001年首次利用CotB作为载体蛋白，通过芽孢表面展示技术成功地将破伤风毒素(TTFC)C末端的459个氨基酸片段在枯草芽孢杆菌表面展示。另一芽孢外层衣壳蛋白基因CotC被作为融合载体，将TTFC和大肠杆菌的不耐热肠毒素B亚单位(LTB)分别展示于枯草芽孢杆菌表面。

[0007] 现有疫苗，其保存均须存放于4℃中，且半衰期较短，这种条件的限制给疫苗的运输和储存带来不便，同时，增加疫苗运输和储存成本。尤其，像我国这种受运输及条件局限的发展中国家，即使针对某些疾病已生产出很好的疫苗，由于条件的限制疫苗不能得到广泛的应用，疫苗的质量难以得到保障，使用后不能达到理性的免疫效果。而以枯草芽孢杆菌为疫苗载体制备的重组活载体疫苗相对于传统疫苗而言具有生产成本低，便于保存和运输等优点，尤其适合在我国这样的发展中国家推广应用。

[0008] 蜂毒是工蜂毒腺分泌出来的一种具有芳香气味的成分复杂的混合物，主要含有蛋白质多肽类、酶类、生物胺类和其他物质。蜂毒溶血肽又名蜂毒肽(melittin)，占蜂毒干重的50％，是蜂毒中主要功能物质。蜂毒肽具有抗菌、抗病毒、消炎、抗辐射等功效。近年来，人们发现，蜂毒肽还具有抗癌方面作用。然而，但是其临床应用却受到很多方面局限，主要原因是现有技术难以将蜂毒中有致敏反应并与蜂毒肽分子量接近的磷脂酶A2完全去除。基因工程的出现为人们解决这一问题找到了一条有效途径。通过基因工程获得蜂毒肽的方法已经取得一定进展，但仍有许多不足之处，距离大规模生产还有很长的一段路。

[0009] 现有的培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基(DSM肉汤培养基)，其组成及制备方法如表1所示：

[0010] 表1现有枯草芽孢杆菌培养基

[0011]

[0012] 其中，Bacto-nutrient broth为Bacto营养肉汤，其中，Bacto为试剂的英文品牌名称。

[0013] 然而，该培养基的培养效果差，获得的表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌菌落少。因此，急需一种培养效果好，获得的表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌落数多的培养基。

发明内容

[0014] 有鉴于此，本发明的目的在于提供一种培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，该培养基的培养效果好，能够显著提高获得的表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌落数。

[0015] 此外，发明人还发现，现有的培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基成本高。

[0016] 为实现上述目的，本发明的技术方案为：

[0017] 培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，包括如下组分：K2PO40.1-2.0g/L，酵母浸粉0.1-2.0g/L，酪蛋白水解肽0.1-2.0g/L，溶剂为水，pH为7.1-
7.5。

[0018] 所述酵母浸粉即粉状酵母浸出物(英文名称为Yeast extract fermentation，简称YEF)，是以高蛋白面包酵母或啤酒酵母为原料，经自溶、酶解、浓缩、干燥等工艺制成的一种富含蛋白质、氨基酸、肽、多肽、核酸、维生素及微量元素等营养成分的生物培养基产品。

[0019] 发明人意外发现，将包括如下组分：K2PO4 0.1-2.0g/L，酵母浸粉0.1-2.0g/L，酪蛋白水解肽0.1-2.0g/L，溶剂为水，pH为7.1-7.5的培养基用于培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌，培养效果好，能够显著提高获得的表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌落数。

[0020] 进一步，包括如下组分：K2PO4 0.2g/L，酵母浸粉0.6g/L，酪蛋白水解肽0.6g/L，溶剂为水，pH为7.1。

[0021] 进一步，包括如下组分：K2PO4 1g/L，酵母浸粉1g/L，酪蛋白水解肽0.8g/L，溶剂为水，pH为7.3。

[0022] 进一步，包括如下组分：K2PO4 0.8g/L，酵母浸粉0.9g/L，酪蛋白水解肽0.9g/L，溶剂为水，pH为7.5。

[0023] 进一步，还包括琼脂10-20g/L。

[0024] 本发明的目的之二在于保护所述培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基的制备方法，包括如下步骤：按配比取K2PO4、酵母浸粉和酪蛋白水解肽，然后溶于配比量的水中，混匀，调节pH至7.1-7.5，即得。

[0025] 本发明的培养基的制备方法简单，易于实现工业化生产。

[0026] 本发明的目的还在于保护所述培养基在培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌中的应用。

[0027] 将本发明的培养基用于培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌，能够显著提高获得的表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌落数。

[0028] 本发明的有益效果在于：

[0029] 本发明的培养基配方科学合理，为表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌创造了适宜的生长环境，培养效果好，培养后获得的枯草芽孢杆菌落数得到了显著提高，与现有培养基相比，采用本发明的培养基培养后长出的枯草芽孢杆菌感受态菌落数提高了288.03％-352.14％。

[0030] 本发明的培养基成本低，与现有技术比，本发明的培养基的成本降低了169.03-173.12元/L。

[0031] 本发明的培养基的制备方法简单，易于实现工业化生产。附图说明

[0032] 图1为采用实施例1制得的培养基培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养效果图；

[0033] 图2为采用实施例2制得的培养基培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养效果图；

[0034] 图3为采用实施例3制得的培养基培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养效果图；

[0035] 图4为采用对比例1制得的培养基培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养效果图。

具体实施方式

[0036] 所举实施例是为了更好地对本发明的内容进行说明，但并不是本发明的内容仅限于所举实施例。所以熟悉本领域的技术人员根据上述发明内容对实施方案进行非本质的改进和调整，仍属于本发明的保护范围。

[0037] 实施例1

[0038] 培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，其配方为：K2PO4 0.2g/L，酵母浸粉0.6g/L，酪蛋白水解肽0.6g/L，琼脂20g/L(使用前在121℃高压灭菌
20min)，溶剂为水，溶剂为水，pH为7.1。

[0039] 该培养基的制备方法，具体步骤为：

[0040] 称取0.2g K2PO4、0.6g酵母浸粉、0.6g酪蛋白水解肽恒温20g琼脂溶解于1L蒸馏水中，混匀，调节pH为7.1。

[0041] 实施例2

[0042] 培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，其配方为：K2PO4 1g/L，酵母浸粉1g/L，酪蛋白水解肽0.8g/L，溶剂为水，pH为7.3。

[0043] 该培养基的制备方法，具体步骤为：

[0044] 称取1g K2PO4、1g酵母浸粉和0.8g酪蛋白水解肽溶解于1L蒸馏水中，混匀，调节pH为7.3。

[0045] 实施例3

[0046] 培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养基，其配方为：K2PO4 0.8g/L，酵母浸粉0.9g/L，酪蛋白水解肽0.9g/L，溶剂为水，pH为7.5。

[0047] 该培养基的制备方法，具体步骤为：

[0048] 称取0.8g K2PO4、0.9g酵母浸粉和0.9g酪蛋白水解肽溶解于1L蒸馏水中，混匀，调节pH为7.5。

[0049] 对比例1

[0050] 培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌培养基(DSM肉汤培养基)，其配方及制备方法如表2所示。

[0051] 表2培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的DSM肉汤培养基[0052]

[0053] 性能测试

[0054] 采用实施例1-3及对比例1制得的培养基培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌，并检测菌落数，菌落数的检测方法具体步骤为：取1mL表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌接种于实施例1制得的培养基中，于30℃培养2天，将通过四种实例获得的培养物经生理盐水冲洗，获得四种实例的培养液，将培养液经80℃，10min水浴，离心，弃上清，加入9ml生理盐水，涡旋混匀，取1ml涂于肉汤培养基，37℃，过夜培养，结果分别如图1-4所示，其中，图1-3分别为采用实施例1-3制得的培养基培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养效果图；图4为采用对比例1制得的培养基培养表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌的培养效果图；然后观察，统计菌落数，结果如表3所示。

[0055] 由图1-4可知，与对比例1相比，采用实施例1-3的培养基培养的表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌，获得的枯草芽孢杆菌菌落数得到了显著提高。由此证明，本发明的培养基配方科学合理，为表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌创造了适宜的生长环境，培养效果好，培养后获得的枯草芽孢杆菌落数得到了显著提高。

[0056] 表3性能测试结果

[0057]组别实施例1 实施例2 实施例3 对比例1
菌落数/(cfu/mL) 529 454 523 117

[0058] 由表3可知，与对比例1相比，采用实施例1-3的培养基培养的表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌，长出的枯草芽孢杆菌菌落数提高了288.03％-352.14％。由此证明，本发明的培养基配方科学合理，为表面展示蜂毒肽蛋白片段重组枯草芽孢杆菌创造了适宜的生长环境，培养效果好，培养后长出的枯草芽孢杆菌感受态菌落数得到了显著提高。

[0059] 成本核算

[0060] 本发明的培养基的原料用量为：K2PO4 0.1-2.0g/L，酵母浸粉0.1-2.0g/L，酪蛋白水解肽0.1-2.0g/L。

[0061] 本发明的培养基的原料市场价格如表4所示。

[0062] 表4本发明的培养基的原料市场价格

[0063]K2PO4 酵母浸粉酪蛋白水解肽
80元/500g 77元/250g 168元/100g

[0064] 则本发明的培养基的成本(元/L)为：K2PO4每升培养基中用量×单价+酵母浸粉每升培养基中用量×酪蛋白水解肽单价+每升培养基中用量×单价＝0.21元/L-4.30元/L。

[0065] 对比例1的DSM肉汤培养基的原料市场价格如表5所示。

[0066] 表5对比例1的DSM肉汤培养基的原料市场价格

[0067]Bacto-nutrient broth 170/250g
1.2％(w/v)MgSO4·7H2O 36/500g
10％(w/v)KCl 38/500g
1mol/L NaOH 50/500g
0.01mol/L MnCl2 68/500g
1mol/L Ca(NO3)4 35/500g
1mmol/L FeSO4 39/500g

[0068] 则对比例1的DSM肉汤培养基的成本(元/L)为：5.44+0.0864+0.076+0.05+0.171+11.49+0.022＝173.33元/L。

[0069] 显然，与对比例1相比，本发明的培养基的成本降低了169.03-173.12元/L。由此证明，本发明的培养基的成本得到了显著降低。

[0070] 此外，应当理解，虽然本说明书按照实施方式加以描述，但并非每个实施方式仅包含一个独立的技术方案，说明书的这种叙述方式仅仅是为清楚起见，本领域技术人员应当将说明书作为一个整体，各实施例中的技术方案也可以经适当组合，形成本领域技术人员可以理解的其他实施方式。

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