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制备去除过敏成分的精制 蜂毒的方法及通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒

阅读：716发布：2020-05-15

专利汇可以提供制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法及通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法及通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)向蜂毒中添加缓冲溶液进行稀释；(b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加蛋白酶后进行酶反应；(c)在所述步骤(b)的反应物中加入经过冷却的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；(d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液后进行干燥。，下面是制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法及通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒专利的具体信息内容。

权利要求

1.制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)向蜂毒中添加缓冲溶液进行稀释；
(b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加蛋白酶后进行酶反应；
(c)在所述步骤(b)的反应物中加入经过冷却的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；
(d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液后进行干燥。
2.根据权利要求1所述的制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法，其特征在于，所述过敏成分为磷脂酶A2及透明质酸酶。
3.根据权利要求1所述的制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法，其特征在于，所述步骤(b)的蛋白酶为碱性蛋白酶。
4.根据权利要求1所述的制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法，其特征在于，所述方法进一步包括将所述步骤(b)的经过酶反应的反应物进行加热的步骤。
5.根据权利要求3所述的制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)向蜂毒中添加pH为6～9的缓冲溶液，稀释为8～12％(w/v)；
(b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加0.8～1.2单位/mL的碱性蛋白酶，然后在34～40℃下进行酶反应5～20分钟；
(c)在所述步骤(b)的反应物中加入冷却至-15～-25℃的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；
(d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液后进行干燥。
6.根据权利要求4所述的制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：
(a)向蜂毒中添加pH为6～9的缓冲溶液，稀释为8～12％(w/v)；
(b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加0.8～1.2单位/mL的碱性蛋白酶，然后在34～40℃下进行酶反应5～20分钟；
(c)在75～85℃下，将所述步骤(b)的经过酶反应的反应物进行加热10～20分钟；
(d)在所述步骤(c)的经过加热的反应物中加入冷却至-15～-25℃的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；
(e)将所述步骤(d)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(f)取所述步骤(e)的凝固物沉淀的反应物中的上清液后进行干燥。
7.去除过敏成分的精制蜂毒，其根据权利要求1至6中任一项所述的方法制备。

说明书全文

制备去除过敏成分的精制 蜂毒的方法及通过所述方法制备的

去除过敏成分的精制蜂毒

技术领域

[0001] 本发明涉及制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法及通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)向蜂毒中添加缓冲溶液进行稀释；(b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加蛋白酶后进行酶反应；(c)在所述步骤(b)的反应物中加入经过冷却的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；(d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液后进行干燥。

背景技术

[0002] 蜂毒是指蜜蜂所具有的毒，自古以来，蜂毒的医学上的治疗效果得到认证。根据最近的研究结果发现蜂毒除了具有诸如抗癌作用、缓解关节炎、缓解动脉硬化、缓解腰痛、治疗皮肤伤口、增强免疫的作用、抗炎症作用、降低血压并增加血液中的淋巴细胞及红血球的再生的医学功能之外，还具有改善皱纹、美白作用等以美容为目的的作用。

[0003] 观察蜂毒的主要组成成分及其药理功能如下述表1中所示。

[0004] [表1]

[0005]成分药理功能成分比(％)
肽(蜂毒肽、蜂毒明肽) 镇静作用、免疫作用 50％左右
蛋白质(磷脂酶A2) 破坏细胞、过敏 15％
胺类(组胺) 降低血压 1～2％

[0006] 蜂毒包含肽、蛋白质及低分子活性胺等，由40种以上的物质组成，主要的有效成分如上述表中所示。

[0007] 蜂毒的组成中，蛋白质类是由具有13kDa以上的分子量的磷脂酶A2(Phospholipase A2，PLA2)、透明质酸酶(Hyaluronidase)、磷酸酶(phosphatase)、α-葡萄糖苷酶(α-Glucosidase)等成分组成，主要起到破坏血液细胞膜、血液凝固、血管扩张及渗透、促进血液循环、促进蛋白质的水解等生理活性作用。

[0008] 尤其，磷脂酶和透明质酸酶为诱发强烈的过敏反应的蜂毒组成物质，对蜂毒具有过敏性的使用者而言，会引起非常严重的安全上的问题。因此，为了以治疗的目的使用蜂毒，可以说上述成分的失活或完全去除是必需的。

[0009] 据此，目前已知一些从蜂毒中去除上述诱发过敏的物质的技术。例如，韩国授权专利第1382404号中记述了将蜂毒进行溶解以制备蜂毒溶液，并将该蜂毒溶液加入到乙二胺-N-丙基硅烷(primary secondary amine，PSA)吸附剂中制备混合物，之后将其进行精密过滤，从而大规模制备去除杂质的纯蜂毒的方法。此外，韩国授权专利第1364506号中公开了使用截留(cut-off)分子量的大小为10kDa以上的超滤膜去除蜂毒中的磷脂酶，并使精制蜂毒中含有4重量％以上的蜂毒明肽、50重量％以上的蜂毒肽的方法。此外，韩国授权专利第1608045号中公开了利用阳离子交换树脂去除蜂毒中的磷脂酶，并只分离蜂毒肽的技术。但是，目前还没有如同本发明的利用蛋白酶制备去除过敏成分的无毒化精制蜂毒的方法。

发明内容

[0010] 要解决的技术问题

[0011] 本发明是根据如上所述的需求而提出的，本发明的目的在于提供利用蛋白酶制备无毒化精制蜂毒的方法，所述方法能够完好地保留蜂毒肽及蜂毒明肽等蜂毒的有效成分的同时，能够有效地完全去除蜂毒的过敏成分磷脂酶A2及透明质酸酶。

[0012] 技术方案

[0013] 为了解决上述技术问题，本发明提供制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：(a)向蜂毒中添加缓冲溶液进行稀释；(b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加蛋白酶后进行酶反应；(c)在所述步骤(b)的反应物中加入经过冷却的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；(d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及(e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液后进行干燥。

[0014] 此外，本发明提供通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒。

[0015] 有益效果

[0016] 通过本发明的方法制备的精制蜂毒完全去除诱导强烈的过敏反应的磷脂酶A2及透明质酸酶，从而能够制备从根本上对过敏反应安全的精制蜂毒，并且完好地保留蜂毒中包含的有效成分，因此具有为了各种药理功能能够更加安心使用的优点。附图说明

[0017] 图1示出用磷酸缓冲溶液稀释非精制蜂毒的稀释液和通过制备例2的方法制备的精制蜂毒磷酸缓冲溶液的电泳谱图分析结果。

[0018] PLA2：磷脂酶A2

具体实施方式

[0019] 为了实现本发明的目的，本发明提供制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法，其特征在于，所述方法包括以下步骤：

[0020] (a)向蜂毒中添加缓冲溶液进行稀释；

[0021] (b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加蛋白酶后进行酶反应；

[0022] (c)在所述步骤(b)的反应物中加入经过冷却的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；

[0023] (d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及[0024] (e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液后进行干燥。

[0025] 本发明的制备精制蜂毒的方法中，所述过敏成分可以是磷脂酶A2(Phospholipase A2)及透明质酸酶(Hyaluronidase)，但并不受限于此。

[0026] 此外，本发明的制备精制蜂毒的方法中，所述步骤(a)的缓冲溶液优选可以是pH为5～9且1～150mM浓度的EDTA、Tris、磷酸盐(phosphate)或柠檬酸盐(citrate)缓冲溶液，更优选可以是pH为6～9且50～150mM浓度的磷酸缓冲液，最优选可以是pH为7.5且100mM浓度的磷酸缓冲液。所述缓冲溶液可以去除起到蜂毒的过敏成分磷脂酶A2的辅因子(cofactor)作用的Ca离子。此外，若缓冲溶液中含有氧，则反应过程中会发生氧化反应，导致所得到的蜂毒的效价降低。因此，为了去除缓冲溶液中的氧，可以在90℃以上的温度下将缓冲溶液加热5～30分钟，或者用精制的氮气对缓冲液进行置换30分钟以上来去除氧。

[0027] 此外，本发明的制备精制蜂毒的方法中，所述步骤(a)的稀释优选可以在蜂毒中添加pH为6～9的缓冲溶液，稀释为8～12％(w/v)，更优选可以在蜂毒中添加pH为7.5的缓冲溶液，稀释为10％(w/v)。蜂毒中以蜂毒肽为代表的肽成分是蜂毒的固体成分的约50％，其余的50％为磷脂酶A2等诱发过敏的蛋白质成分。将这两种成分加起来的总固体成分达到蜂毒的30％。因此，可以认为1mL的蜂毒中的过敏蛋白质成分的含量达到约150mg。本发明中以约10％的浓度将蜂毒稀释于缓冲溶液中，因此，1mL的反应物中的诱发过敏的蛋白质的含量约为15mg。

[0028] 此外，本发明的制备精制蜂毒的方法中，所述步骤(b)的蛋白酶可以为选自胰蛋白酶及胰腺酶等源自动物的蛋白酶、菠萝蛋白酶及木瓜酶等植物性蛋白酶和源自微生物的蛋白酶中的一种以上的蛋白酶，更优选为碱性蛋白酶(Alcalase)。碱性蛋白酶可以为丝氨酸内肽酶(Serine endopeptidase)。与其他蛋白酶相比，碱性蛋白酶能够有效地去除蜂毒中的过敏成分，使用浓度优选可以为0.8～1.2单位(unit)/mL，更优选可以使用1单位/mL。以上述浓度进行处理时能够有效地去除蜂毒中的诱发过敏的成分，但是碱性蛋白酶的使用浓度超过上述范围时，蜂毒的有效成分蜂毒肽等会分解，从而具有降低有效成分的含量的问题。

[0029] 此外，本发明的制备精制蜂毒的方法中，所述步骤(c)优选可以在反应物中加入冷却至-15～-25℃的乙醇以凝固反应物的蛋白质，更优选可以在反应物中加入冷却至-20℃的乙醇以凝固反应物的蛋白质。为了对反应物进行冷却，可以利用添加冷却至-20℃的乙醇、添加干冰、添加液氮等方法，但是蜂毒中的肽对乙醇具有溶解性，因此，优选使用冷却至-20℃的乙醇。此时所使用的乙醇是纯度为95％的乙醇，可以使反应物中乙醇的含量达到30～65％的方式添加乙醇，更优选可以使乙醇的含量达到50％的方式添加。当乙醇的添加量小于上述范围时，蛋白质凝固效果低，即使乙醇的添加量超过上述范围，蛋白质的凝固程度也没有变化，因此优选以上述范围添加。

[0030] 本发明的制备精制蜂毒的方法中，更具体地，可以包括以下步骤：

[0031] (a)向蜂毒中添加pH为6～9的缓冲溶液，稀释为8～12％(w/v)；

[0032] (b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加0.8～1.2单位/mL的碱性蛋白酶(Alcalase)，然后在34～40℃下进行酶反应5～20分钟；

[0033] (c)在所述步骤(b)的反应物中加入冷却至-15～-25℃的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；

[0034] (d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及[0035] (e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液后进行干燥。

[0036] 本发明的制备精制蜂毒的方法中可以进一步包括将所述步骤(b)的经过酶反应的反应物进行加热的步骤，更具体地，所述方法可以包括以下步骤：

[0037] (a)向蜂毒中添加pH为6～9的缓冲溶液，稀释为8～12％(w/v)；

[0038] (b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加0.8～1.2单位/mL的碱性蛋白酶(Alcalase)，然后在34～40℃下进行酶反应5～20分钟；

[0039] (c)在75～85℃下，将所述步骤(b)的经过酶反应的反应物进行加热10～20分钟；

[0040] (d)在所述步骤(c)的经过加热的反应物中加入冷却至-15～-25℃的乙醇，从而凝固反应物的蛋白质；

[0041] (e)将所述步骤(d)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀；以及[0042] (f)取所述步骤(e)的凝固物沉淀的反应物中的上清液后进行干燥。

[0043] 将以如上所述的条件进行酶反应的反应物进行热处理，从而中断反应物中包含的蛋白酶的酶活性，并且使可存在于反应物中的蜂毒过敏蛋白质磷脂酶A2及透明质酸酶发生热变性。

[0044] 此外，本发明还提供通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒。本发明的精制蜂毒的特征在于，未检测出诱发过敏的物质磷脂酶A2(Phospholipase A2)及透明质酸酶(Hyaluronidase)，并且作为蜂毒的有效成分包含50％以上的蜂毒肽、1％以上的蜂毒明肽。此外，在以小鼠为对象的毒性评价中，与精制前的蜂毒的LD50值相比，本发明的精制蜂毒显示出显著高的LD50值，几乎没有毒性。此外，在以金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株及痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne)菌株为对象的抗菌实验中，与精制前的蜂毒相比，本发明的精制蜂毒显示出相似的抗菌效果，以豚鼠为对象确认精制蜂毒的抑制过敏的效果的结果，在豚鼠中没有观察到异常变化，并且可以确认没有抗原性。

[0045] 下面，通过本发明的实施例进行详细的说明。但是，下述实施例仅用于例示本发明，本发明的内容并不受下述实施例的限定。

[0046] 制备例1：去除诱发过敏的物质的精制蜂毒的制备

[0047] (a)向0.1g的购自大韩养蜂协会的固含量为30％(w/w)的蜂毒中添加1mL的pH为7.5且100mM的磷酸缓冲溶液，将蜂毒稀释为10％(w/v)。

[0048] (b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加1单位/mL的碱性蛋白酶(Alcalase，诺维信(Novozyme)公司)，然后在37℃下进行酶反应10分钟。

[0049] (c)在所述步骤(b)的经过酶反应的反应物中加入1mL的冷却至-20℃的95％(v/v)乙醇，从而凝固反应物的蛋白质。

[0050] (d)将所述步骤(c)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀。

[0051] (e)取所述步骤(d)的凝固物沉淀的反应物中的上清液，然后进行低温真空干燥(Speed Vac)以去除溶液中的乙醇，从而得到1mL的精制蜂毒磷酸缓冲溶液。

[0052] 制备例2：去除诱发过敏的物质的精制蜂毒的制备

[0053] (a)向0.1g的购自大韩养蜂协会的固含量为30％(w/w)的蜂毒中添加1mL的pH为7.5且100mM的磷酸缓冲溶液，将蜂毒稀释为10％(w/v)。

[0054] (b)向所述步骤(a)的经过稀释的稀释液中添加1单位/mL的碱性蛋白酶(Alcalase，诺维信(Novozyme)公司)，然后在37℃下进行酶反应10分钟。

[0055] (c)在80℃下，将所述步骤(b)的经过酶反应的反应物进行加热15分钟。

[0056] (d)在所述步骤(c)的经过加热的反应物中加入1mL的冷却至-20℃的95％(v/v)乙醇，从而凝固反应物的蛋白质。

[0057] (e)将所述步骤(d)的经过凝固的反应物进行离心分离，从而使凝固物沉淀。

[0058] (f)取所述步骤(e)的凝固物沉淀的反应物中的上清液，然后进行低温真空干燥(Speed Vac)以去除溶液中的乙醇，从而得到1mL的精制蜂毒磷酸缓冲溶液。

[0059] 实施例1：精制蜂毒的抗菌能力

[0060] 为了确认制备例2中得到的精制蜂毒是否保持生理活性，通过最低抑菌浓度(minimum inhibition concentration，MIC)和最低杀菌浓度(minimum bactericidal concentration，MBC)分析对金黄色葡萄球菌(Staphylococcus aureus)菌株及痤疮丙酸杆菌(Propionibacterium acne)菌株的抗菌能力。

[0061] [表2]

[0062] 精制前蜂毒和精制后蜂毒的抗菌能力的比较

[0063]

[0064] 其结果，与精制前蜂毒相比，制备例2的精制蜂毒的MIC和MBC有所增加，但是其增加的幅度不大，可以确认完好地保持蜂毒原有的抗菌效果。

[0065] 实施例2：改变蜂毒种类的精制蜂毒的成分变化

[0066] 使用将非精制蜂毒稀释于磷酸缓冲溶液中的稀释液和如下的精制蜂毒，即，通过所述制备例1的方法制备精制蜂毒但改变蜂毒的购买地进行制备的精制蜂毒(制备例1-2)和改变碱性蛋白酶的购买地进行制备的精制蜂毒(制备例1-3)，对精制蜂毒中诱发过敏的物质磷脂酶A和透明质酸酶的成分变化进行分析。

[0067] 对于是否去除过敏成分，使用液相色谱仪进行分析，所使用的柱为Sephadex TM 75、Source 15RPC ST、C18、RP-amide、Peptide ES-C18，并通过下述式计算蜂毒中的蜂毒肽、蜂毒明肽、磷脂酶A2、透明质酸酶的含量，将其结果示于下述表3中。

[0068] 所取的标准品的量(mg)×(标准品的纯度/100)×(蜂毒中所需成分的峰面积)/标准品的峰面积)×(100/蜂毒的量)

[0069] [表3]

[0070] 精制蜂毒的成分变化(％)

[0071]成分含量(％) 蜂毒肽蜂毒明肽磷脂酶A2 透明质酸酶
精制前蜂毒 65 2.5 11 1.8
精制蜂毒(制备例1) 61 2.0 0 0
精制蜂毒(制备例1-2) 60 2.1 0 0
精制蜂毒(制备例1-3) 61 2.0 0 0

[0072] 制备例1：利用购自大韩养蜂协会的精制前蜂毒及购自诺维信公司(Novo Co.)的碱性蛋白酶的精制蜂毒

[0073] 制备例1-2：利用购自IBEE Agricultural Union Corporation的精制前蜂毒及购自诺维信公司(Novo Co.)的碱性蛋白酶的精制蜂毒

[0074] 制备例1-3：利用购自大韩养蜂协会的精制前蜂毒及购自西格玛公司的碱性蛋白酶的精制蜂毒

[0075] 确认是否去除精制蜂毒中的诱发过敏的物质磷脂酶A和透明质酸酶的结果，如所述表3所示，可以确认改变蜂毒的种类进行制备的制备例1-2的精制蜂毒中未检测出磷脂酶A2和透明质酸酶成分，改变碱性蛋白酶的种类进行制备的制备例1-3的精制蜂毒中也未检测出过敏成分。而且，可以确认以本发明的制备例1的方法制备的精制蜂毒中未检测出诱发过敏的物质磷脂酶A2(Phospholipase A2)及透明质酸酶(Hyaluronidase)，并且作为蜂毒的有效成分包含60％以上的蜂毒肽、2％以上的蜂毒明肽。

[0076] 实施例3：改变蛋白酶的精制蜂毒的成分变化

[0077] 用磷酸缓冲溶液稀释非精制蜂毒的稀释液和通过制备例2的方法制备的精制蜂毒磷酸缓冲溶液的电泳谱图分析结果如图1所示。在电泳谱图中，与非精制蜂毒相比，本发明的精制蜂毒中的磷脂酶A2完全被去除，并且与非精制蜂毒相比，蜂毒肽的浓度并没有显示出很大的变化。

[0078] 此外，使用通过制备例2的方法制备的精制蜂毒磷酸缓冲溶液和通过制备例2的方法制备精制蜂毒但改变步骤(b)中的蛋白酶的种类进行制备的精制蜂毒磷酸缓冲溶液分别进行冷冻干燥的粉末，对蜂毒肽、蜂毒明肽、磷脂酶A2、透明质酸酶成分进行分析。

[0079] [表4]

[0080] 精制蜂毒的成分变化(％)

[0081]

[0082] 其结果，可以确认制备例2的精制蜂毒中未检测出诱发过敏的物质磷脂酶A2(Phospholipase A2)及透明质酸酶(Hyaluronidase)，并且作为蜂毒的有效成分包含50％以上的蜂毒肽、1％以上的蜂毒明肽。另一方面，可以确认使用中性蛋白酶或复合蛋白酶而未使用碱性蛋白酶进行制备的精制蜂毒的情况下，与制备例2相比，蜂毒的有效成分的含量显著减少，并且蜂毒的诱发过敏的物质未能完全被去除。

[0083] 实施例4：被动皮肤过敏(Passive cutaneous anaphylaxis，PCA)反应为了确认通过本发明的制备例1及2的方法制备的精制蜂毒的抑制过敏的效果，进行如下被动皮肤过敏反应(Passive cutaneous anaphylaxis，PCA)试验，实验方法为如下。

[0084] 1)试验物质：制备例1或制备例2的精制蜂毒

[0085] 2)赋形剂：生理盐水注射液

[0086] 3)阳性对照物：卵白蛋白(Ovalbumin：源自鸡蛋)

[0087] 4)阳性对照物质赋形剂：生理盐水注射液

[0088] 5)试验动物：300～380g的无特定病原体(SPF)的豚鼠(guinea pig)[0089] 6)试验组的组成，施用量的决定，组的分离及施用

[0090] [表5]

[0091] 试验组的组成及施用量的决定

[0092]组动物数量施用液量(ml/kg) 施用量(mg/kg)
G1(赋形剂对照组) 5 1 0
G2(低用量组) 5 1 0.025
G3(高用量组) 5 1 0.05
G4(OVA+佐剂(adjuvant)组) 5 1 2.5

[0093] 7)施用量的决定：使致敏和PCA的施用量相同。

[0094] 8)施用：致敏是施用于豚鼠的颈背部，PCA反应的引发是使用致敏后采集的血液的血清。就引发PCA那天的被检血清而言，不同个体的每个血清使用2只用于引发的动物来实施PCA反应。用生理盐水注射液将被检血清从10倍稀释至5120倍，每次以2倍进行连续稀释，然后分别以100μl施用于豚鼠背部皮内。皮内施用4小时后，将含有2％的伊文思蓝(Evan's blue)的引发抗原液施用于后肢静脉内，从而引发PCA反应。

[0095] 9)观察及检查：对一般症状及体重进行检查。PCA反应的判定为如下，即，在引发PCA反应30分钟后，以乙醚麻醉法牺牲试验动物，然后将豚鼠的背部皮肤进行剥皮，并观察是否有青白色斑。出现青白色斑时，测量长径和短径，将通过(长径+短径)/2计算的平均值为5mm以上的判定为阳性，并将显示出阳性的最终血清稀释倍数(最大稀释倍数)定为该血清的最终效价(抗体效价)。

[0096] [表6]

[0097] 制备例1及2的精制蜂毒的PCA结果(阳性反应动物数量/试验动物总数量)[0098]

[0099] 对通过制备例1及2的方法制备的精制蜂毒的抑制过敏的效果进行确认的结果，如所述表6所示，可以确认未观察到由本发明的精制蜂毒引起的特异症状及死亡动物，并且PCA反应结果，包括阴性对照组G1在内的蜂毒低用量施用组G2、高用量施用组G3中均未观察到青白色斑，但是在阳性对照组G4中，抗体效价为5120倍，出现了明显的PCA反应。由上述结果最终可以确认，根据本发明制备的精制蜂毒没有抗原性。

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制备去除过敏成分的精制蜂毒的方法及通过所述方法制备的去除过敏成分的精制蜂毒

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