ラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法
专利汇可以提供ラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本発明は、ラミニン511を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法を提供することを目的とする。本発明の方法は、血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、&bgr;−グロブリン、α1−アンチトリプシン(α1−AT)、へプトグロビン(Hp)、α2−マクログロブリン(α2−M)、α−フェトプロテイン(AFP)、トランスフェリン、レチノール結合タンパク(RBP)又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子(TNF)ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド及び/又はペプチドと、ラミニン511を固相化した条件下で前記細胞を培養することを含む、ことを特徴とする。，下面是ラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法专利的具体信息内容。
組織幹細胞が、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択され；あるいは、
体細胞が、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、繊維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される、
請求項４に記載の方法。
本出願は、２０１１年９月２９日に提出された日本国出願 特願２０１１−２１４５８９に基づく優先権を主張し、その全内容は本明細書中に取り込まれる。
本発明は、ラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法に関する。
ラミニンは様々な組織の基底膜に主として局在し、組織構造の維持及び細胞機能の制御において重要な役割を果たす細胞外マトリックスタンパク質である（Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．，１８：１９−２８，１９９９；Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．，２１８：２１３−２３４，２０００）。
ラミニンの構造としては、α鎖、β鎖、γ鎖がそれぞれジスルフィド結合で連結されたヘテロ３量体分子であり、特徴的な十字架構造をとる。 各鎖は複数のドメインからなり、ドメインＩおよびＩＩはトリプルへリックスを形成している。 本出願前に、ラミニン分子は５種類のα鎖（α１ないしα５）、３種類のβ鎖（β１ないしβ３）、３種類のγ鎖（γ１ないしγ３）の異なる組み合わせによって、少なくとも１９種類が同定されており、実際にはその数倍の種類が存在することが示唆されている。 なお、ラミニンの名称は、命名法が１９９４年と２００５年に訂正され、その前後で異なっている（Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ．，２４：３２６−３３２，２００５；Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ．３３９（１）２５９-２６８，２０１０）。
ラミニンのα鎖、β鎖、γ鎖はそれぞれ異なる遺伝子によってコードされており、それぞれのラミニンアイソフォームは特有の存在部位や機能があり、主に細胞膜受容体インテグリンを介して細胞接着、増殖、運動、分化などを調節している（Ｄｅｖ．Ｄｙｎ．２１８，２１３−２３４，２０００；Ｐｈｙｓｉｏｌ．Ｒｅｖ．８５，９７９−１０００，２００５）。 各ラミニンアイソフォームを構成するα鎖、β鎖、γ鎖が異なると機能や活性も全く異なってくる。
ラミニン分子は、３本鎖のアミノ（Ｎ）末端部分（短腕）で互いに会合したり、他のマトリックス分子と会合して、基底膜を構築する。 一方、α鎖のカルボキシ（Ｃ）末端には５つの相同な球状ドメイン（Ｇ１−Ｇ５ドメインまたはＬＧ１−ＬＧ５）が存在し、主にこの部分でインテグリンやその他のリセプターと結合する。 α鎖は細胞の接着に関与し、ラミニン主要な機能を担っている。
ラミニン５１１
「ラミニン５１１」（旧称「ラミニン１０」）は、α５鎖、β１鎖、γ１鎖からなるラミニン分子で、肝臓の門脈や肝動脈、中心静脈、胆管の基底膜に存在するラミニンの主要なアイソフォームである。 ラミニン５１１の生体内の機能についてはまだ十分な解明がされていないが、ラミニンα５鎖の欠損が様々な組織形成不全を引き起こすことから、胎児期の組織形成において重要な役割を担っているのではないか、と示唆されている。 ラミニン５１１については、Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． ２１８，２１３−２３４，２０００、及びＪ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７（１５），１２７４１−１２７４８，２００２に詳細な記載がある。 これらの文献に記載された内容は、本明細書中に援用する。
Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ． ，１８：１９−２８，１９９９ Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． ２１８， ２１３−２３４，２０００ Ｍａｔｒｉｘ Ｂｉｏｌ． ，２４：３２６−３３２，２００５ Ｃｅｌｌ Ｔｉｓｓｕｅ Ｒｅｓ． ３３９（１）２５９-２６８，２０１０ Ｐｈｙｓｉｏｌ． Ｒｅｖ． ８５，９７９−１０００，２００５ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７（１５），１２７４１−１２７４８，２００２ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６２（２２），１０４５４−１０４６２，１９８７ Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２６３（１４），６７５１−６７５８，１９８８
本発明は、ラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法を提供することを目的とする。
本発明者らは、ラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法において、特定のポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化した条件下で前記細胞を培養すると、ラミニン５１１の細胞に対する種々の活性が上昇することを見出し、本発明を想到した。
本発明は、好ましい態様として以下の態様を含む。
［態様１］
ラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法において、血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化した条件下で前記細胞を培養することを含む、前記方法。
［態様２］
ポリペプチド及び／又はペプチドが、血清アルブミン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質又はペプトンである、態様１に記載の方法。
［態様３］
細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性、多能性維持活性及びコロニー形成促進活性からなる群から選択される、ラミニン５１１の細胞に対する活性が上昇する、態様１又は２に記載の方法。
［態様４］
細胞が、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、生殖細胞、及び肉腫細胞からなる群から選択される、態様１〜３のいずれか１項に記載の方法。
［態様５］
多能性幹細胞が、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性生殖細胞、又は生殖幹細胞から選択され；
組織幹細胞が、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択され；あるいは、
体細胞が、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、繊維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される、
態様４に記載の方法。
［態様６］
ポリペプチド及び／又はペプチドを０．４〜２００μｇ／ｍｌの範囲の濃度で使用する、態様１〜５のいずれか１項に記載の方法。
［態様７］
血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化した条件下で哺乳類細胞を培養することを含む、ラミニン５１１の細胞に対する活性を上昇させる方法。
［態様８］
細胞に対する活性が、細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性、多能性維持活性及びコロニー形成促進活性からなる群から選択される、態様７に記載の方法。
［態様９］
血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化した、ラミニン５１１を含んだ系で細胞を培養するための細胞培養容器。
［態様１０］
血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を含む、ラミニン５１１を含んだ系で細胞を培養するための細胞培養容器を固相化するための、組成物。
本発明において、ラミニン５１１と特定のポリペプチド及び／又はペプチドを固相化して併用することにより、細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性及び多能性維持活性からなる群から選択される、ラミニン５１１の細胞に対する活性が上昇する。
５９５ 、横軸はラミニン濃度（μｇ／ｍｌ）を示す。 使用したｒＨＳＡ濃度は５μｇ／ｍｌである。
本発明は、ラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法に関する。
ラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法において、血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択されるポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化した条件下で前記細胞を培養することを含む、ことを特徴とする。
ラミニン５１１
表１に示されるように「ラミニン５１１」（旧称「ラミニン１０」）は、α５鎖、β１鎖、γ１鎖からなるラミニン分子で、肝臓の門脈や肝動脈、中心静脈、胆管の基底膜に存在するラミニンの主要なアイソフォームである。 ラミニン５１１の生体内の機能についてはまだ十分な解明がされていないが、ラミニンのα５鎖の欠損が様々な組織形成不全を引き起こすことから、胎児期の組織形成において重要な役割を担っているのではないか、と示唆されている。
ラミニン５１１については、例えば、Ｄｅｖ． Ｄｙｎ． ２１８，２１３−２３４，２０００、Ｊ． Ｂｉｏｌ． Ｃｈｅｍ． ２７７（１５），１２７４１−１２７４８，２００２に詳細な記載がある。 これらの文献に記載された内容は、本明細書中に援用する。
ラミニン５１１タンパク質は天然型であっても、あるいはその生物学的活性、特に細胞接着促進活性保持したまま１又はそれ以上のアミノ酸残基が修飾された修飾型であってもよい。 また、本発明におけるラミニン５１１タンパク質は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。 即ち、本発明のラミニン５１１タンパク質は、天然産のタンパク質、遺伝子工学的手法により組換えＤＮＡから発現させたタンパク質、あるいは化学合成タンパク質の何れでもよい。
ラミニン５１１タンパク質の由来は特に、限定されないが、好ましくは、ヒト由来のものである。 再生医療の材料を得る目的などでヒト多能性幹細胞を培養する場合には、他の動物に由来する材料の使用を避けるために、ヒト由来のラミニン５１１を用いることが好適である。
本明細書中の配列表の配列番号１−６は、ヒトラミニン５１１のα５鎖、β１鎖及びγ１鎖の塩基配列及びアミノ酸配列を示す。 本発明で使用するラミニン５１１タンパク質は、好ましくは、配列番号２のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するα５鎖（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ． ２７７（１５），１２７４１−１２７４８，２００２；ＵＳ６，９３３，２７３ Ｂ２）、配列番号４のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するβ１鎖（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６２（２２），１０４５４−１０４６２，１９８７；ＵＳ６，９３３，２７３ Ｂ２）、及び配列番号６のアミノ酸配列、またはこの配列において１またはそれ以上のアミノ酸が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するγ１鎖（Ｊ．Ｂｉｏｌ．Ｃｈｅｍ．２６３（１４），６７５１−６７５８，１９８８；ＵＳ６，９３３，２７３ Ｂ２）の各サブユニットからなるタンパク質である。
ラミニン５１１の各鎖は、対応する配列番号で示されるアミノ酸配列において、１またはそれ以上のアミノ酸残基が欠失、付加、または置換されているアミノ酸配列を有するものであってもよい。 このような天然のタンパク質と相同なアミノ酸配列を有するタンパク質も、本発明において使用可能である。 変更可能なアミノ酸数は、α５鎖、β１鎖及びγ１鎖の各アミノ酸配列において、限定されるわけではないが、好ましくは１ないし３００アミノ酸残基、１ないし２００アミノ酸残基、１ないし１５０アミノ酸残基、１ないし１２０アミノ酸残基、１ないし１００アミノ酸残基、１ないし８０アミノ酸残基、１ないし５０アミノ酸残基、１ないし３０アミノ酸残基、１ないし２０アミノ酸残基、１ないし１５アミノ酸残基、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし５アミノ酸残基である。 公知の部位特異的突然変異法で修飾可能な数のアミノ酸残基、例えば、１ないし１０アミノ酸残基、１ないし８、１ないし５、１ないし３アミノ酸残基がより好ましい。
アミノ酸の保存的置換を行って元の機能を保持しているタンパク質またはポリペプチドを得ることができることは、当技術分野においてよく知られている。 そのような置換には、アミノ酸を類似の物理化学的特性を有する残基で置き換えること、例えば、１つの脂肪酸残基（Ｉｌｅ、Ｖａｌ、ＬｅｕまたはＡｌａ）を脂肪酸残基の別なもので、または塩基性残基ＬｙｓとＡｒｇ、酸性残基ＧｌｕとＡｓｐ、アミド残基ＧｌｎとＡｓｎ、ヒドロキシル残基ＳｅｒとＴｙｒ、または芳香族残基ＰｈｅとＴｙｒの間で置換することが含まれる。
また、本発明で用いるラミニン５１１は、配列番号２、４、６に記載されるアミノ酸配列と、少なくとも８０％、８５％、９０％、９５％、９８％または９９％の同一性を有する各鎖からなり、かつ細胞接着活性を促進することができるタンパク質であってもよい。
２つのアミノ酸配列の同一性％は、視覚的検査および数学的計算によって決定してもよい。 あるいは、２つのタンパク質配列の同一性パーセントは、Ｎｅｅｄｌｅｍａｎ，Ｓ． Ｂ． 及びＷｕｎｓｃｈ，Ｃ． Ｄ． （Ｊ．Ｍｏｌ．Ｂｉｏｌ．，４８：４４３−４５３，１９７０）のアルゴリズムに基づき、そしてウィスコンシン大学遺伝学コンピューターグループ（ＵＷＧＣＧ）より入手可能なＧＡＰコンピュータープログラムを用い配列情報を比較することにより、決定してもよい。 ＧＡＰプログラムの好ましいデフォルトパラメーターには：（１）Ｈｅｎｉｋｏｆｆ，Ｓ． 及びＨｅｎｉｋｏｆｆ，Ｊ． Ｇ． （Ｐｒｏｃ．Ｎａｔｌ．Ａｃａｄ．Ｓｃｉ．ＵＳＡ，８９：１０９１５−１０９１９，１９９２）に記載されるような、スコアリング・マトリックス、ｂｌｏｓｕｍ６２；（２）１２のギャップ加重；（３）４のギャップ長加重；及び（４）末端ギャップに対するペナルティなし、が含まれる。
当業者に用いられる、配列比較の他のプログラムもまた、用いてもよい。 同一性のパーセントは、例えばＡｌｔｓｃｈｕｌら（Ｎｕｃｌ．Ａｃｉｄｓ．Ｒｅｓ．，２５，ｐ．３３８９−３４０２，１９９７）に記載されているＢＬＡＳＴプログラムを用いて配列情報と比較し決定することが可能である。 当該プログラムは、インターネット上でＮａｔｉｏｎａｌ Ｃｅｎｔｅｒ ｆｏｒ Ｂｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ Ｉｎｆｏｒｍａｔｉｏｎ（ＮＣＢＩ）、あるいはＤＮＡ Ｄａｔａ Ｂａｎｋ ｏｆ Ｊａｐａｎ（ＤＤＢＪ）のウェブサイトから利用することが可能である。 ＢＬＡＳＴプログラムによる同一性検索の各種条件（パラメーター）は同サイトに詳しく記載されており、一部の設定を適宜変更することが可能であるが、検索は通常デフォルト値を用いて行う。 又は、２つのアミノ酸配列の同一性％は、遺伝情報処理ソフトウエアＧＥＮＥＴＹＸ Ｖｅｒ． ７（ゼネティックス製）などのプログラム、又は、ＦＡＳＴＡアルゴリズムなどを用いて決定してもよい。 その際、検索はデフォルト値を用いてよい。
本発明におけるラミニン５１１は本明細書に記載した特徴を有する限り、その起源、製法などは限定されない。 即ち、ラミニン５１１は、ラミニン５１１を分泌するヒト或いは動物細胞の培養液上清、あるいはそこから精製した天然型ラミニン５１１タンパク質であってもよい。 しかしラミニン５１１は、当該技術分野において知られる組換えＤＮＡ技術を用いて各サブユニットを発現させることにより遺伝子組換えタンパク質として効果的に製造することができる。 しかし不必要な動物性の因子を避けるという意味から、ヒト組換えラミニン５１１が特に好ましい。
ラミニン５１１のα５鎖をコードする、配列番号１の核酸残基６８−１１１５５を含むＤＮＡ配列、β１鎖をコードする配列番号３の核酸残基１１８−５４７８及びγ１鎖をコードする配列番号５の核酸残基２６０−５０８９の塩基配列に基づいてプライマーを設計し、適切なｃＤＮＡライブラリーをテンプレートとして、ポリメラーゼ連鎖反応（ＰＣＲ）により目的とする配列を増幅することにより製造することができる。 このようなＰＣＲ手法は、当該技術分野においてよく知られており、例えば、“ＰＣＲ Ｐｒｏｔｏｃｏｌｓ，Ａ Ｇｕｉｄｅ ｔｏ Ｍｅｔｈｏｄｓ ａｎｄ Ａｐｐｌｉｃａｔｉｏｎｓ”，Ａｃａｄｅｍｉｃ Ｐｒｅｓｓ，Ｍｉｃｈａｅｌ，ｅｔ ａｌ． ，１９９０に記載されている。
ラミニン５１１の各鎖遺伝子をコードするＤＮＡを、適当なベクター中に組み込み、これを真核生物または原核生物細胞のいずれかに、各々の宿主で発現可能な発現ベクターを用いて導入し、それぞれの鎖を発現させることにより所望のタンパク質を得ることができる。 ラミニン５１１を発現させるために用いることができる宿主細胞は特に限定されるものではなく、大腸菌、枯草菌等の原核宿主細胞、および酵母、真菌、昆虫細胞、植物及び植物細胞、哺乳動物細胞等の真核生物宿主が挙げられる。
ラミニン５１１を発現するように構築したベクターを、トランスフォーメーション、トランスフェクション、コンジュゲーション、プロトプラスト融合、エレクトロポレーション、粒子銃技術、リン酸カルシウム沈殿、アグロバクテリウム法、直接マイクロインジェクション等により、上記の宿主細胞中に導入することができる。 ベクターを含む細胞を適当な培地中で成長させて、本発明で使用するラミニン５１１を産生させ、細胞または培地から精製することにより、ラミニン５１１を得ることができる。 精製はサイズ排除クロマトグラフィー、ＨＰＬＣ、イオン交換クロマトグラフィー、および免疫アフィニティークロマトグラフィー等を用いて行うことができる。
ラミニン５１１は、あるいは、市販されているものを利用することも可能である。 例えば、ＢｉｏＬａｍｉｎａ社よりラミニン５１１の組換えタンパク質を購入可能である。
代表的なラミニンであるラミニン１１１（旧称「ラミニン１」）はα１、β１、γ１で構成されるヘテロ３量体分子であり、本発明で用いるラミニン５１１はα５、β１、γ１で構成される。 例えば、ラミニン１１１とラミニン５１１のポリペプチド鎖の同一性をＧｅｎｅｔｙｘなどのソフトウエアで解析するとα１とα５の同一性は、３５％である。 同じラミニンという名前がついていても、それぞれ異なる２つの遺伝子でコードされるα１とα５の同一性はたかだか３５％程度であり、ラミニン１１１とラミニン５１１は異なった性質を示すと考えられている。
ポリペプチド及び／又はペプチド
本発明は、細胞培養において、ラミニン５１１を含む細胞培養系において、特定のポリペプチド及び／又はペプチドを併せて使用することにより、種々のラミニン５１１の活性を上昇させることを特徴とする。
ポリペプチドは、血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンである細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質、並びに、ゼラチン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質、ペプトン、からなるグループから選択される。
１）血中タンパク質 本発明においては、好ましくは、血中タンパク質、より好ましくは、細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質をラミニン５１１タンパク質とともに使用する。
血中タンパク質は、好ましくは血清、血清アルブミン、プレアルブミン、免疫グロブリン、α−グロブリン、β−グロブリン、α１−アンチトリプシン（α１−ＡＴ）、へプトグロビン（Ｈｐ）、α２−マクログロブリン（α２−Ｍ）、α−フェトプロテイン（ＡＦＰ）、トランスフェリン、レチノール結合タンパク（ＲＢＰ）又はアディポネクチンから選択される。 これらはいずれも細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質である。
「細胞外マトリックス」とは、細胞外の空間を充填する物質であると同時に骨格的役割（例：動物の軟骨や骨）、細胞接着における足場の役割（例：基底膜やフィブロネクチン）、細胞増殖因子などの保持・提供する役割（例：ヘパラン硫酸に結合する細胞増殖因子ＦＧＦ）などを担う。 多細胞生物を構成する個々の細胞の多くは細胞外マトリックスのベッドあるいは巣に埋もれて生活しているとも言える。 ヒトを含めた脊椎動物の細胞外マトリックスに顕著な成分は、コラーゲン、プロテオグリカン、フィブロネクチンやラミニンといった糖タンパク質（一部は細胞接着分子）である。 「細胞外マトリックスタンパク質」とは、このような細胞外マトリックスを構成するタンパク質を意味する。
本発明における、「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質」とは、血中タンパク質のうちでも、細胞接着等に関与する細胞外マトリックスタンパク質以外のものを意味する。 これらは、いずれも公知のタンパク質であり当業者は適宜入手することが可能である。
「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質」は、限定されるわけではないが、好ましくは、ヒト血清アルブミン（ＨＳＡ／例えば、Ｎａｃａｌａｉより入手可能）、組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ／例えば、ＳＩＧＭＡより入手可能）、またはウシ血清アルブミン（ＢＳＡ／例えば、ＳＩＧＭＡより入手可能）である。
「細胞外マトリックスタンパク質以外の血中タンパク質」は、あるいは、免疫グロブリンであってもよい。 免疫グロブリンは当業者に周知であり、ＩｇＧ、ＩｇＡ、ＩｇＭ、ＩｇＤ、ＩｇＥなどが含まれる。 例えば、ヒト免疫グロブリン（ＩｇＧ／例えば、オリエンタル酵母工業株式会社より入手可能）を使用することができる。
２）ゼラチン ゼラチンとは、動物の皮膚や骨、腱などの結合組織の主成分であるコラーゲンに熱を加えて抽出したもので、タンパク質を主成分とする。
３）腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質 「腫瘍壊死因子（Ｔｕｍｏｒ Ｎｅｃｒｏｓｉｓ Ｆａｃｔｏｒ、ＴＮＦ）」は、サイトカインの一種であり、狭義にはＴＮＦはＴＮＦ−α、ＴＮＦ−β（リンホトキシン（ＬＴ）−α）およびＬＴ−βの３種類である。 「ＴＮＦファミリーに属するタンパク質」には、受容体活性化因子ＮＦκＢリガンド（ＲＡＮＫＬ）、Ｆａｓリガンド、ＣＤ４０リガンド等の少なくとも１９種類以上の分子が含まれる。
本発明において、「ＴＮＦファミリーに属するタンパク質」の例として、好ましくは、受容体活性化因子ＮＦκＢリガンド（ＲＡＮＫＬ、ｓＲＡＮＫＬ）が使用されうる。
４）ペプトン 「ペプトン」とは、タンパク質をタンパク質分解酵素で分解したものである。 生体内ではタンパク質が胃でペプシンにより消化されてペプトンとなり、膵臓で分泌される膵液や空腸で分泌される腸液によりさらにアミノ酸まで消化される。
微生物の栄養源として適しているため、培地においてしばしば添加される。 この培地栄養源としてのペプトンは、蛋白質をアミノ酸および低分子量のペプチドまで加水分解したもので、一般には牛乳の蛋白質（ミルクカゼイン）を酵素分解（豚の膵臓から抽出したパンクレアチンなどのプロテアーゼを使用）したものが一般的に使用されている。
限定されるわけではないが、ペプトンは好ましくは植物由来のものが使用される。 例えば、綿実由来ペプトン、大豆由来ペプトン、小麦由来ペプトン及びエンドウ豆由来ペプトンからなる群から選択される。
限定されるわけではないが、本発明の一態様において、ポリペプチド及び／又はペプチドは、血清アルブミン、腫瘍壊死因子（ＴＮＦ）ファミリーに属するタンパク質又はペプトンである。 本発明の一態様において、ポリペプチド及び／又はペプチドは、免疫グロブリン又はゼラチンである。
哺乳類細胞
本発明の方法において培養される哺乳類細胞の種類、由来は特に限定されない。
好ましくは、多能性幹細胞、組織幹細胞、体細胞、生殖細胞、及び肉腫細胞からなる群から選択される。 限定されるわけではないが、好ましくは、多能性幹細胞は、胚性幹細胞、人工多能性幹細胞、胚性生殖細胞、又は生殖幹細胞から選択される。 好ましくは、組織幹細胞は、間葉系幹細胞、肝幹細胞、膵幹細胞、神経幹細胞、皮膚幹細胞、又は造血幹細胞から選択される。 好ましくは、体細胞は、肝細胞、膵細胞、筋細胞、骨細胞、骨芽細胞、破骨細胞、軟骨細胞、脂肪細胞、皮膚細胞、繊維芽細胞、膵細胞、腎細胞、肺細胞、又は、リンパ球、赤血球、白血球、単球、マクロファージ若しくは巨核球の血球細胞から選択される。
細胞が由来する哺乳類の生物種も特に限定されない。 好ましくは、マウス、ラット、ヒト、サル、ブタ、イヌ、ヒツジ、ヤギなどに由来する。 より好ましくは、マウス、ラット及びヒトからなる群から選択される種に由来する。
本発明において「多能性幹細胞」とは、あらゆる組織の細胞へと分化する能力（分化多能性）を有する幹細胞の総称することを意図する。 本明細書において後述する実施例ではＥＳ細胞（ＥＢ３細胞）を用いて検討を行っているが、本発明の方法に使用できる多能性幹細胞には、胚性幹細胞のみに限らず、哺乳動物の成体臓器や組織の細胞、骨髄細胞、血液細胞、更には胚や胎児の細胞等に由来する、胚性幹細胞に類似した形質を有する全ての多能性幹細胞が含まれる。 この場合、胚性幹細胞と類似の形質とは、胚性幹細胞特異的な遺伝子の発現や内胚葉、中胚葉、外胚葉の全ての胚葉への分化能を有するといった、胚性幹細胞に特異的な細胞生物学的性質をもって定義することができる。
限定されるわけではないが、本発明の方法で増殖させることができる細胞の具体例としては、例えば、胚性幹細胞（ＥＳ細胞）、人工多能性幹細胞（ｉＰＳ細胞）、胚性生殖幹細胞（ＥＧ細胞）、生殖幹細胞（ＧＳ細胞）等が挙げられる。 なお本発明における多能性幹細胞として、ＥＳ細胞とｉＰＳ細胞が好ましい。 ｉＰＳ細胞は倫理的な問題もない等の理由により特に好ましい。 多能性幹細胞としては公知の任意のものを使用可能であるが、例えば、国際公開ＷＯ２００９／１２３３４９（ＰＣＴ／ＪＰ２００９／０５７０４１）に記載の多能性幹細胞を使用可能である。
「組織幹細胞」とは、分化可能な細胞系列が特定の組織に限定されているが、多様な細胞種へ分化可能な能力（分化多能性）を有する幹細胞を意味する。 例えば骨髄中の造血幹細胞は血球のもととなり、神経幹細胞は神経細胞へと分化する。 このほかにも肝臓をつくる肝幹細胞、皮膚組織になる皮膚幹細胞などさまざまな種類がある。
「体細胞」とは、多細胞生物を構成する細胞のうち生殖細胞以外の細胞のことを言う。 有性生殖においては次世代へは受け継がれない。 本明細書においては、「多能性幹細胞」、「組織幹細胞」以外の種々の細胞を意味する。
ラミニン５１１を含んだ系
本発明においては、ラミニン５１１を含んだ系で細胞を培養する。 本発明で「ラミニン５１１を含んだ系」とは、細胞の培養システム中に何らかの形でラミニン５１１を含むことを意味するものであり、その態様は特に限定されない。
本発明において、特定のポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化した条件下で細胞を培養する。 「固相化した」とは、細胞を培養する系において、ポリペプチド及び／又はペプチドとラミニン５１１とが、例えば液体培地中に単に添加されて溶解しているという状態ではなく、培養容器等に吸着している状態を意味する。
具体的には、例えば、特定のポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１とで細胞の培養容器を処理し、培養容器をコーティングした状態を意味する。 よって、ラミニン５１１を含んだ系で細胞を培養するのに、特定のポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１とでコーティングした培養容器を用いることが好適な態様である。
本発明において「細胞培養容器」とは、は特に限定されるものではなく、細菌の混入を防ぐために滅菌処理され、かつ細胞を培養するのに適した任意の材料、任意の形状の容器を用いることができる。 そのような培養容器の例として、本技術分野で一般的に用いられている培養用ディッシュ、培養用フラスコ、培養用シャーレ、９６ウェル、４８ウェル、１２ウェル、６ウェル、４ウェル等の培養用プレート、培養用ボトルなどを挙げることができるが、それらに限定されるものではない。
本発明の一態様において、細胞培養容器の表面に特定のポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化する（コーティングする）などの処理を施す。 培養容器の表面にラミニンを固相化する処理技術は本技術分野で公知であり、当業者は本発明の目的に応じて任意の培養容器を採用して該容器を処理し、該容器を本発明の方法に用いることができる。
細胞培養容器の処理に使用されるラミニン５１１の量は特に限定されない。 好ましくは、０．０１μｇ／ｍｌ以上、好ましくは０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、より好ましくは０．０１−２μｇ／ｍｌのラミニン５１１溶液で処理した場合、良好な結果が得られる。 ０．０１〜１０μｇ／ｍｌ、０．０１μｇ／ｍｌ−２μｇ／ｍｌのラミニン５１１は、培養容器の面積あたりの固相化するラミニン５１１の量としては、０．００１５〜１．５μｇ／ｃｍ ２ 、０．００１５−０．３μｇ／ｃｍ ２に相当する。
本発明において、ポリペプチド又はペプチドの使用量は特に限定されない。 当業者は使用するポリペプチド又はペプチドの種類、培養する細胞の鮎類、等の要素に応じて適切な量を適宜選択することが可能である。 限定されるわけではないが、好ましくは、ポリペプチド又はペプチドは０．４μｇ／ｍｌないし２００μｇ／ｍｌの間の濃度で使用する。 これは培養容器の面積あたりの固相化するポリペプチド又はペプチドの量としては、０．０６〜３０μｇ／ｃｍ ２に相当する。
本発明の一態様において、培養容器の内部表面にラミニン５１１を塗布した後に乾燥するなどして培養容器をラミニン５１１で処理してもよい。 ラミニン５１１処理した培養容器にＧＭＥＭ（ＧＩＢＣＯ）やＤＭＥＭなどの細胞の培養に一般的に使用される培地を入れ、その培地中に多能性幹細胞を添加する。 次いで、公知の適切な培養条件下、例えば限定するわけではないが３７℃、５％二酸化炭素気層条件下などで細胞の培養を行う。
本発明において、特定のポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化する順序は特に限定されない。 一態様において、ポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１とで同時に固相化する。 あるいは、ポリペプチド及び／又はペプチドで固相化した後にラミニン５１１で固相化する。
細胞培養容器、組成物、剤、キット
本発明は、一態様において、上述したポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化した、細胞培養容器に関する。
本発明はまた、上記ポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を含む、ラミニン５１１を含んだ系で細胞を培養するための細胞培養容器を固相化するための組成物、あるいは、細胞培養容器を固相化するための剤に関する。 本発明の組成物または剤は、一態様において、コーティング用組成物又はコーティング剤である。
本発明はさらに、上記組成物又は剤を含む、キットに関する。 本発明のキットは、さらに、細胞培養用培地、細胞培養容器等を含んでもよい。 細胞培養容器は、例えば、プレコート培養ディッシュ、プレコート培養プレート等でもよい。 あるいは、キットの細胞培養容器は、上記ポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化した状態あってもよい。
本発明の細胞培養容器、組成物、剤、キットは、本発明のラミニン５１１を含んだ系で哺乳類細胞を培養する方法に使用することができる。
本発明の効果
本発明において、ラミニン５１１が細胞培養において奏する種々の活性が、ポリペプチド及び／又はペプチドとの併用において上昇される。 限定されるわけではないが、ラミニン５１１の効果としては、細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性及び多能性維持活性が含まれる 「細胞接着活性」とは、細胞を接着させる効果を意味する。 本願発明においてポリペプチド又はペプチドの使用により、ポリペプチド又はペプチドを使用しない場合と比較して好ましくは、細胞接着活性が４倍以上、より好ましくは８倍以上、もっとも好ましくは１６倍以上上昇する。
「細胞分散活性」とは、細胞を分散させる効果を意味する。 本願発明においてポリペプチドの使用により、ポリペプチドを使用しない場合と比較して好ましくは、細胞分散活性が２倍以上上昇する。
「創傷治癒活性」とは、傷を治癒する効果を意味する。 即ち、物理的に外傷を受けて細胞がいなくなった部分に、例えばラミニン５１１などを塗布することで、塗布した部分に周りから細胞を遊走させてくる活性である。 傷を治癒する効果は、例えば、損傷を受けてから一定時間（例えば１４時間経過後）の傷の幅を測定することによって治癒率を確認することが可能である。 例えば実施例２では、ヒトラミニン５１１（０．１２５μｇ／ｍｌ）に加えてｒＨＳＡを併用することにより傷の治癒率が３２％から５５％に上昇した。
「増殖促進活性」とは、細胞の増殖を促進させる効果を意味する。 例えば、細胞行ってから一定期間経過後の細胞数を測定することによって、細胞増殖の効果を確認することが可能である。
「未分化維持活性」とは、培養される細胞が未分化の細胞、例えば、多能性幹細胞、組織幹細胞の場合、その未分化の状態を維持することを意味する。 ラミニン５１１でこれらの細胞を培養する場合、細胞の分化は進まず、未分化の状態が維持される。 例えばＳｏｘ２、Ｎａｎｏｇ、Ｏｃｔ４などの未分化マーカーを測定することにより、培養中に組織幹細胞が分化していないか評価することができる。
「多能性維持活性」とは、培養される細胞が多能性を有する細胞、例えば、多能性幹細胞の場合、その多能性を維持することを意味する。 本発明において、ラミニン５１１とポリペプチド及び／又はペプチドを併用した場合も、多能性が維持される。
ラミニン５１１の細胞に対する活性を上昇させる方法
本発明はまた、特定のポリペプチド及び／又はペプチドと、ラミニン５１１を固相化した条件下で前記細胞を培養することを含む、ラミニン５１１の細胞に対する活性を上昇させる方法を提供する。
特定のポリペプチド及び／又はペプチド、ラミニン５１１等の定義は、哺乳動物細胞を培養する方法に関して上述した通りである。
本発明の一態様において、細胞に対する活性は、細胞接着活性、細胞分散活性、創傷治癒活性、増殖促進活性、未分化維持活性、多能性維持活性及びコロニー形成促進活性からなる群から選択される。 各活性の定義も上述した通りである。
以下、実施例に基づいて本発明を詳細に説明するが、本発明はこれらの実施例に限定されるものではない。 当業者は本明細書の記載に基づいて容易に本発明に修飾・変更を加えることができ、それらは本発明の技術的範囲に含まれる。
実施例１ 細胞接着アッセイ
本実施例では、各種細胞に対するｒＬｍ５１１およびｒＬｍ５１１に添加物を加えた際の接着アッセイの結果を示す。
組換えヒトラミニン５１１（ｒＬｍ５１１）は、Ｂｉｏｌａｍｉｎａ社より購入したものを使用した。
細胞はラット肝細胞株（ＢＲＬ）、ヒト肉腫細胞株（ＨＴ１０８０）、マウス筋芽細胞株（Ｃ２Ｃ１２）の３種類を用いた。 ＢＲＬはヒューマンサイエンス振興財団より入手した（ＪＣＲＢ００２５）。 ＨＴ１０８０は理化学研究所バイオリソースセンターより入手した（ＲＣＢ１９５６）。 Ｃ２Ｃ１２はＤＳファーマバイオメディカルより入手した（ＥＣ−９１０３１１０１）。
各種細胞は以下の培地を用いて培養・増殖させた。 ＢＲＬは１０％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＧＩＢＣＯ）、ＨＴ１０８０は１０％ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）、Ｃ２Ｃ１２は１５％ウシ胎仔血清を添加したＤＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）を用いた。 ただし、接着アッセイではこれらの培地から血清を除いた無血清培地を用いた。
濃度を調製したｒＬｍ５１１で９６ウェルプレート（Ｃｏｒｎｉｎｇ）を３７℃で２時間または４℃で一晩処理し、ＰＢＳ（−）で処理表面を洗浄後、１．２％ＢＳＡ（ＳＩＧＭＡ）溶液にて３７℃で１時間ブロッキング処理を行った。 必要に応じてｒＬｍ５１１の処理は組換えヒト血清アルブミン（ｒＨＳＡ／ＳＩＧＭＡ）、組換えヒト受容体活性化因子ＮＦκＢリガンド（ｓＲＡＮＫＬ／ＯＹＣ）、綿実由来ペプトン（Ｐｅｐ／ＤＭＶ）、グリシン（Ｇｌｙ／Ｎａｃａｌａｉ）を混ぜて処理を行った。
各種細胞を無血清培地にて洗浄後、上記調製した９６ウェルプレートに２００００個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ ２ 、９５％空気の気層条件下で１時間培養を行った。 培養後、ボルテックスミキサーで軽く震動させて接着の弱い細胞をプレート表面から浮遊させ、パーコール（ＧＥヘルスケア）処理にて該細胞を除いた。 接着した細胞はグルタルアルデヒド（ナカライテスク社）で固定し、２．５％クリスタルバイオレット（ナカライテスク社）にて染色してＯＤ ５９５を測定することで様々な条件でのｒＬｍ５１１の接着活性を評価した。
図１Ａ−図１ＤにＢＲＬを用いた接着アッセイの結果を、図２Ａ−図２ＤにＨＴ１０８０を用いた接着アッセイの結果を、図３にＣ２Ｃ１２を用いた接着アッセイの結果を示す。
ＢＲＬ細胞を用いた細胞接着アッセイにおいて、ｒＬｍ５１１にｒＨＳＡを３．１３〜１００μｇ／ｍｌで併用すると、ｒＨＳＡ濃度１２．５μｇ／ｍｌ以下ではｒＬｍ５１１単体で使用するよりも、細胞接着活性が上昇することが分かった（図１Ａ、Ｂ）。 次に、接着活性の上昇の認められたｒＨＳＡ濃度１２．５μｇ／ｍｌ以下で細かく濃度を分けて設定し併用したところ、いずれの濃度でも接着活性の上昇が認められたが、特にｒＨＳＡ濃度１．５６〜６．２５μｇ／ｍｌで大きく接着活性が上昇することが分かった（図１Ｃ）。 次に大きく接着活性が上昇したｒＨＳＡ濃度１．５〜６．３μｇ／ｍｌでさらに細かく濃度を分けて設定して併用したところ、この濃度範囲ではいずれも大きく接着活性が上昇することが確認できた（図１Ｄ）。
次に、ＨＴ１０８０細胞を用いた接着アッセイを実施した。 ｒＬｍ５１１にｒＨＳＡを０．３９〜２５μｇ／ｍｌで併用したところ、ＢＲＬ細胞を用いたアッセイと同様に、ｒＨＳＡ濃度１２．５μｇ／ｍｌ以下では接着活性の上昇が認められた（図２Ａ）。 このことから、ｒＨＳＡ併用によるｒＬｍ５１１の接着活性上昇効果はＢＲＬ細胞だけでなく他の細胞株でも起こる現象であることが分かった。
次に、ｒＬｍ５１１にｒＨＳＡ以外のポリペプチドを併用した際の接着活性への影響についてｓＲＡＮＫＬ（ＲＡ）を用いて検討した。 ＲＡを０．３９〜２５μｇ／ｍｌで併用したところ、６．２５〜２５μｇ／ｍｌで接着活性の上昇が認められ、特に１２．５〜２５μｇ／ｍｌで大きく接着活性の上昇が認められた（図２Ｂ）。 このことから、ポリペプチド併用によるｒＬｍ５１１の接着活性上昇効果はｒＨＳＡだけでなく他のポリペプチドでも起こる現象であることが分かった。
次に、ｒＬｍ５１１にペプチドを併用した際の接着活性への影響について綿実由来ペプトン（Ｐｅｐ）を用いて検討した。 Ｐｅｐを０．７８〜２００μｇ／ｍｌで併用したところ、１２．５〜２００μｇ／ｍｌで接着活性の上昇が認められ、特に５０〜２００μｇ／ｍｌで大きく接着活性の上昇が認められた（図２Ｃ）。 このことから、ｒＬｍ５１１の接着活性を上昇させるために併用する添加剤はポリペプチドだけでなくペプチドでも良いことが分かった。
次に、ｒＬｍ５１１にアミノ酸を併用した際の接着活性への影響についてＧｌｙを用いて検討した。 Ｇｌｙを０．７８〜２００μｇ／ｍｌで併用したところ、接着活性の上昇は認められなかった（図２Ｄ）。 このことから、ｒＬｍ５１１の接着活性を上昇させるために併用する添加剤はペプチド以上の分子量でなければならないことが分かった。
次に、Ｃ２Ｃ１２を用いた接着アッセイを実施した。 ｒＬｍ５１１およびｒＬｍ２１１にｒＨＳＡを５μｇ／ｍｌで併用したところ、ｒＨＳＡの併用によってｒＬｍ５１１の接着活性はｒＨＳＡを併用しない時に比べておよそ１６倍以上上昇したが、ｒＨＳＡの併用によるｒＬｍ２１１の接着活性上昇は４倍に満たなかった（図３）。
具体的には、図３に示されるように、ｒＬｍ２１１は、２μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加しても、ラミニン２１１単独の８μｇ／に活性が及ばなかった。 同様に、８μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加してもラミニン２１１単独の３２μｇ／に活性が及ばなかった。 このことからｒＨＳＡの併用によるｒＬｍ２１１の接着活性上昇は４倍以下である、と判断した。 一方、ｒＬｍ５１１は、０．１２５μｇ／ｍｌのｒＨＳＡを添加すると、ラミニン５１１単独の２μｇ／ｍｌや８μｇ／ｍｌとほぼ同等の活性が認められた。 このことから、ｒＨＳＡの併用によってｒＬｍ５１１の接着活性上昇はｒＨＳＡを併用しない時に比べておよそ１６倍以上である、と判断した。
このことから、ｒＨＳＡの併用によるラミニンの活性上昇作用はどのアイソフォームでも同じように起こる訳ではないことが分かった。
実施例２ ＨＴ１０８０細胞を用いた創傷治癒アッセイ
本実施例では、各種細胞に対するｒＬｍ５１１およびｒＬｍ５１１にｒＨＳＡを加えた際の創傷治癒アッセイの結果を示す。
細胞はＨＴ１０８０細胞を用いた。 ＨＴ１０８０は理化学研究所バイオリソースセンターより入手した（ＲＣＢ１９５６）。
１０％ウシ胎仔血清を添加したＭＥＭ（ＳＩＧＭＡ）を用いてＨＴ１０８０細胞を培養・増殖させた。 ただし、創傷治癒アッセイでは前記培地の他に培地から血清を除いた無血清培地を添加した培地を用いた。
２４ウェルプレート（Ｎｕｎｃ）に細胞を１０％ウシ胎仔血清培地にて４０００００個／ウェルで播種し、３７℃、５％ＣＯ ２ 、９５％空気の気層条件下で３時間培養を行った。 血清添加培地を用いて細胞の培養を行ったのは、先ず培養表面に細胞を一様に接着させるためである。 培養後各ウェルの接着細胞集団にブルーチップを用いて一定幅の傷をつけ血清を除いた無血清培地にて２回洗浄を行った。
無血清培地にて濃度調製したｒＬｍ５１１で各ウェルを３７℃で３０分処理し、ｒＬｍ５１１を固相化した。 必要に応じてｒＬｍ５１１の処理はｒＨＳＡ（５μｇ／ｍｌ）を混ぜて行い、ｒＨＳＡも固相化した。 ｒＬｍ５１１処理後、無血清培地で処理表面を２回洗浄し、無血清培地を添加した。
培養開始時（０ｈｒ）に顕微鏡にて観察し、傷をつけた付近の写真を撮影した。 その後無血清培地にて３７℃、５％ＣＯ ２ 、９５％空気の気層条件下で１４時間培養を行い、同一部位付近の写真を撮影した（図４）。 写真を利用して、傷の治り具合を開始時の傷と１４時間後の傷の幅を測定し、治癒の度合いを計算した。
図５に細胞分散アッセイの結果を示す。 ０．１２５μｇ／ｍｌ−０．５μｇ／ｍｌのＬｍ５１１に、ｒＨＳＡを加えた場合は創傷治癒活性の上昇が認められた。
以上のより、ｒＨＳＡをはじめとするポリペプチドの併用は細胞接着活性だけでなく、ｒＬｍ５１１の活性としてすでに報告されている創傷治癒活性についても上昇させることが分かった。
実施例３ ヒトｉＰＳ細胞を用いたコロニー形成試験
本実施例では、ヒトｉＰＳ細胞を用いたコロニー形成試験の結果を示す。 細胞は２０１Ｂ７株を用いた。 ２０１Ｂ７株はｉＰＳアカデミアジャパン株式会社より入手した。
２０１Ｂ７株のコロニー形成試験ではマウス胎仔性線維芽細胞馴化培地（ＭＥＦ−ＣＭ）に４ｎｇ／ｍｌ ｂＦＧＦ（ＷＡＫＯ）を添加したものを培地として用いた。 ＭＥＦ−ＣＭは２０％ノックアウトＴＭ血清代替添加物（ＫＳＲ）（ＧＩＢＣＯ）、２ｍＭグルタミン（ナカライテスク社）、１％非必須アミノ酸（ＧＩＢＣＯ）、及び１０ −４ Ｍ ２−メルカプトエタノール（ＷＡＫＯ）を添加したＤＭＥＭ／Ｆ１２（ＳＩＧＭＡ）を用いて調製を行った。
培養プレートには、濃度調製したｒＬｍ５１１にて３７℃で２時間または４℃で一晩処理した１２ウェルプレート（ＮＵＮＣ）を用いた。 必要に応じてｒＬｍ５１１の処理はｒＨＳＡを５μｇ／ｍｌで混ぜて処理を行った。 また、陽性コントロールとして３００μｇ／ｍｌマトリゲル（ＢＤ，ベクトンディッキンソン）の実験区も設定した。
２０１Ｂ７は細胞塊の状態で回収し、１２ウェルプレートに等量ずつ播種し、３７℃、５％ＣＯ ２ 、９５％空気の気層条件下で培地交換を行いながら６日間培養を行い、フィーダー細胞非存在下にてコロニーを形成させた。 コロニー形成後、４％パラホルムアルデヒドにて固定し、アルカリフォスファターゼ染色（Ｖｅｃｔｏｒ Ｌａｂｏｒａｔｏｒｉｅｓ）を行うことで、未分化性を保持している正常なコロニーのみを検出した。 その結果、ｒＬｍ５１１単体で使用すると、０．５μｇ／ｍｌ以下の濃度ではほとんどコロニー形成は認められないが、ｒＨＳＡを併用することで、０．５μｇ／ｍｌでも十分にコロニーが形成されることが分かった（図６及び７）。
以上のことから、ｒＨＳＡをはじめとするポリペプチドの併用はｒＬｍ５１１の細胞接着活性や創傷治癒活性を上昇させるだけでなく、多能性幹細胞の培養・増殖・コロニー形成においてもｒＬｍ５１１の機能を高めることが分かった。
＜配列番号１＞
配列番号１は、ヒトラミニンα５鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号２＞
配列番号２は、ヒトラミニンα５鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号３＞
配列番号３は、ヒトラミニンβ１鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号４＞
配列番号４は、ヒトラミニンβ１鎖のアミノ酸配列を示す。
＜配列番号５＞
配列番号５は、ヒトラミニンγ１鎖の塩基配列を示す。
＜配列番号６＞
配列番号６は、ヒトラミニンγ１鎖のアミノ酸配列を示す。
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