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生物活性动物饲料中的古细菌，制造组合物的方法和使用该组合物的方法

阅读：0发布：2020-11-15

专利汇可以提供生物活性动物饲料中的古细菌，制造组合物的方法和使用该组合物的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及一种食品补充剂，其包括用作动物饲料益生菌添加剂的古细菌尤其是产甲烷古细菌或由其组成。所述补充剂可以在标准饲料之余提供给例如养殖动物或者作为食品组合物。该补充剂尤其在水产养殖上有作用，且证明能够提高动物生长速率、降低动物对寄生虫感染的敏感性和/或改善动物粪便废物对环境的影响。本发明还包括制备包含所述生物活性食品补充剂的组合物的方法及其应用。，下面是生物活性动物饲料中的古细菌，制造组合物的方法和使用该组合物的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种用于动物饲料的生物活性食品补充剂，其特征在于，其包括至少一种古细菌菌种的至少一个种群。
2.权利要求1所述的生物活性食品补充剂，其在动物养殖饲料中使用。
3.权利要求1或2所述的生物活性食品补充剂，其中，所述至少一种古细菌菌种为产甲烷古细菌菌种。
4.权利要求3所述的生物活性食品补充剂，其中，所述产甲烷古细菌菌种为斯氏甲烷球形菌菌种或史氏甲烷短杆菌菌种。
5.前述权利要求中任意一项所述的生物活性食品补充剂，其特征还在于，与标准养殖条件相比，其增加动物生长速率和/或降低动物对寄生虫感染的敏感性和/或改善动物粪便废物对环境的影响。
6.前述权利要求中任意一项所述的生物活性食品补充剂，其特征还在于，其基本上富含古细菌菌种。
7.一种包含如前述权利要求中任意一项所定义的生物活性食品补充剂的组合物。
8.权利要求7所述的组合物，其特征在于，每克组合物包含约105至约108个古细菌细胞。
9.权利要求7或8所述的组合物，其特征在于，其为固体形式。
10.一种制备权利要求7至9所述的组合物的方法，其特征在于，其包括以下步骤：
·获取至少一种古细菌菌种的至少一个种群；以及
·将所述至少一种古细菌菌种的至少一个种群与载体混合。
11.权利要求10所述的方法，其特征在于，所述载体包含以下成分或由以下成分组成：
水性溶液、油、古细菌培养基和/或瘤胃液。
12.权利要求10或11所述的方法，其特征在于，所述载体为液体载体，并且还包括以下步骤：
·向包含所述液体载体和所述至少一种古细菌菌种的至少一个种群的液体组合物中加入1％至10％w/v的增稠剂；
·混合所述液体组合物以获得增稠溶液；以及
·干燥所述增稠溶液以获得固体组合物。
13.权利要求10至12所述的方法，其特征在于，所述增稠剂是糖、淀粉和/或明胶。
14.权利要求10至13所述的方法，其特征在于，通过从瘤胃提取物中分离而获得所述至少一种古细菌菌种的至少一个种群。
15.通过权利要求10至14所述的方法获得的用作动物饲料，特别是用作动物养殖饲料的组合物。
16.一种用于提高动物生长速率的方法，其包括向动物提供权利要求1至6所述的生物活性食品补充剂或权利要求7至9或14所述的组合物的步骤。
17.一种用于降低动物对寄生虫感染的敏感性的方法，其包括向动物提供权利要求1至
6所述的生物活性食品补充剂或权利要求7至9或14所述的组合物的步骤。
18.一种用于改善动物排泄废物对环境的影响的方法，其包括向动物提供权利要求1至
6所述的生物活性食品补充剂或权利要求7至9或14所述的组合物的步骤。
19.用于制备用于动物饲料，尤其是动物养殖饲料的生物活性食品补充剂的斯氏甲烷球形菌古细菌菌种或史氏甲烷短杆菌古细菌菌种的种群。
20.权利要求1至6所述的生物活性食品补充剂、权利要求7至9或14所述的组合物、权利要求16至18所述的方法以及权利要求19所述的种群，其中，所述动物为鸟类、哺乳动物或水生动物。

说明书全文

生物活性动物饲料中的古细菌，制造组合物的方法和使用该

组合物的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及动物饲料补充剂领域，更具体地涉及一种包含古细菌的新型饲料组合物及其用途。

背景技术

[0002] 自80年代初期商业鱼类养殖出现以来，水产养殖业已发展成为全球重要的行业，并将超越捕捞渔业作为食物来源。据报道，2006年的产量为5170万吨，价值788亿美元，年增长率接近7％。根据FAO的预测，为了维持目前的人均消费水平，到2050年全球水产养殖产量需要达到8000万吨。

[0003] 水产养殖业的持续增长给该行业带来了一系列新的挑战。尽管投入了巨大的努力，但是与不断增长的水产养殖业的影响相关的环境、健康和质量问题仍然没有得到解决。一个能最大限度地减少对海洋环境的风险和抗生素使用的环境可持续的水产养殖业，是长期增长和发展的前提条件。

[0004] 动物养殖，特别是鱼类和禽类，充满了与传染病相关的挑战。这些挑战包括由于病原体的传染性传播而导致的大规模动物收成的频繁损失，以及对毒性抗生素类药物的严重依赖。尽管对于消费者而言，在养殖动物中过量使用抗生素是不期望的或不健康的，但是通常对鱼类、家禽和其他养殖动物施用抗生素类药物来提高家畜产量。由于农场中动物密度较高，水产养殖业中传染病爆发频繁发生且疾病传播迅速。养鱼者施用抗生素或其他抗菌药物作为控制疾病传播的手段。这种做法使得鱼类对抗生素和药物更具抵抗力(过度依赖)，因此随着时间的推移，饲养者被迫增加剂量。此外，大量使用抗微生物剂会增加对微生物的选择压力，并促进细菌耐药性的自然发生。因此，通常，甚至大剂量的抗生素都不能防止养鱼场的大规模死亡。由于上述原因，显而易见，重点应放在预防上，事实上这比治疗更划算。抗微生物剂、杀菌剂和杀虫剂主要是治疗问题的症状，但不治疗问题的原因。此外，动物养殖场的废物也对环境有强烈的影响——例如，养鱼场通过产生过量的硝酸盐污染水体系。

[0005] 开发提高产品产量诸如动物生长速率(例如，通过增加来自饮食的能量输出、质量)以及还能降低环境影响的可持续动物养殖技术是全球的一大挑战，并且可能会引起更环保的可持续发展实践。

[0006] 肠道菌群是指定殖于人类和动物肠道的微生菌种群(Eckburg et al,Science308:1635‐1638,2005)。它含有数十万亿个微生物，包括至少1000种不同菌种的具有超过300万个基因(人类基因的150倍以上)的已知细菌，并且在人类中，肠道菌群可以重达2kg。近期的科技书刊强调，肠道菌群在动物中的作用是重要的，并且它影响到对健康有直接影响的许多生理功能(Chervonsky,Immunological reviews 245:7-12,2012；Geuking et al,Gut microbes 5:411-418,2014；Hooper et al,Science 336:1268‐1273,2012)。其中，这些益处包括帮助消化某些营养物质、帮助预防病原微生物感染或在免疫系统的发展和维持中发挥重要作用。

[0007] 考虑到肠道菌群对生长和健康表现的影响，已经开创了一种调节鱼类肠道菌群组成的新方法，其有利于水产养殖业中的更好的生长和感染抵抗力的提高(Nayak,Fish&shellfish immunology 29:2‐14,2010)。尽管在许多情况下是必要的，但是广谱抗生素在畜牧业中的普遍使用可能会破坏固有肠道菌群，使动物对抗生素抗性病原体更敏感。

[0008] 在哺乳动物中，肠道菌群主要为两个菌门的细菌——拟杆菌门和厚壁菌门，它们共同组成所有种系型(phylogenetic types)(种系型(phylotypes))的90％。古细菌也存在于肠道菌群中，最主要的是一种产甲烷广古菌：史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)，其组成高达10％的健康成年人的结肠中的所有厌氧菌(Eckburg et al,2005；Miller et al,Applied and environmental microbiology 51:201‐202,1986)，而斯氏甲烷球形菌(Methanosphaera stadtmanae)不是主要的，是较少的成员(Rieu-Lesme et al,Current microbiology 51:317‐321,2005)。古细菌是能够促进有助于消化的健康肠道菌群的代谢活性的单细胞微生物(Dridi et al,PloS one 4:e70632009；Samuel et al,
Proceedings of the National Academy of Sciences of the United States of
America 104:10643‐10648,2007)。

[0009] 到目前为止，纳入鱼饲料产品的主要生物活性成分包括PUFA(多不饱和脂肪酸)、油、磷脂、蛋白质和肽、纤维、碳水化合物、壳聚糖、维生素和矿物质、岩藻黄质、多酚、植物甾醇和牛磺酸。已经证明这些成分可以提高对高血压、氧化应激、炎症、心血管疾病、癌症等疾病的抵抗力。然而，自80年代初以来，已经提出使用益生菌作为食物来源及生物控制剂。益生菌是一种活的微生物饲料补充剂，当施用足够量时，其可以赋予宿主健康益处。这个概念在上个世纪前半叶引入，声称肠微生物对食物的依赖使得有可能通过采取措施来改变动物体内的菌群，并用有用的微生物代替有害的微生物。益生菌通常所称的益处包括潜在致病性胃肠道微生物的减少、胃肠道不适的减少、免疫系统的增强、皮肤功能的改善、排便规律的改善、对雪松花粉过敏原抵抗力的增强、身体病原体的减少、肠胃气胀和腹胀的减轻、DNA的保护、保护蛋白质和脂质免受氧化损伤、以及在接受抗生素治疗的受试者中维持个体的肠道微生物。

[0010] 益生菌更详细的定义涉及通过改变宿主相关的或周围的微生物群落、通过确保饲料的改善使用或通过增强其营养、通过增强宿主对疾病的反应、或通过提高周围环境的质量来有益地影响宿主动物的微生物。当涉及水产养殖时，这一定义尤其适用。事实上，与其中肠道代表了水资源有限的自然界中的潮湿栖息地的陆地环境相反，在水环境中，宿主和微生物共享生态系统。因此，水生动物的环境对微生物群的影响要大于陆生动物，并且水介质中的细菌对宿主肠道菌群的组成影响很大。水生动物被支持独立于宿主动物的它们的病原体的环境所包围，因此在鱼周围，条件致病菌可以达到很高的密度，从而通常伴随饲料摄入或通过饮用摄入。此外，与具有来自于母体的固有定殖菌的陆生动物相反，水生动物主要产无菌卵。环境细菌定殖于卵的表面，且幼龄幼虫通常没有成熟的肠(例如，虾)和/或在肠、腮或皮肤中没有微生物群落。因此，由于环境水中细菌的特性非常重要，所以周围环境的改善对于养殖动物的健康至关重要。

[0011] 许多现有技术文献报道了微生物助剂在动物饲料中的应用。CN103783267提供了一种利用益生菌生产鱼粉的方法，特别是包括芽孢杆菌、乳酸杆菌、酵母菌、放线菌和光合菌菌株的一种或多种组合。

[0012] 类似地，CN103875977公开了一种用于水产养殖的混合饲料，包括基础饲料菌和复合饲料菌，复合菌的量为材料重量的1～10‰。水生饲料可用于调节具有水生生物平衡的肠道群落、预防胃肠道疾病、帮助消化吸收、以及增强免疫力和抗病力，从而避免使用抗生素和药物。动物饲料的复合菌成分可以包括质量比为5～7:2～3:1～2的芽孢杆菌、乳酸菌和酪酸梭菌。

[0013] WO2012/138477公开了一种用于降低鱼的细菌性疾病死亡率的方法，其包括对所述鱼施用能够有效降低细菌性疾病死亡率的剂量的C6-6菌株(指定保藏号为B-50481)和C6-8菌株(指定保藏号为B-50482)中的一种或两种。还公开了包含细菌菌株C6-6和C6-8中的一种或两种的鱼饲料。这两种肠杆菌菌株可单独、或彼此组合、或与一种或多种其它细菌菌株组合作为益生菌使用，用于治疗和预防或防止鲑科鱼的感染性疾病，如冷水病。

[0014] CN102132788涉及益生菌的使用，特别是橙色粘球菌菌株，用于抑制水产养殖中致病微生物的生长，提高鱼对饲料的利用效率，降低死亡率。

[0015] WO2012105804公开了用于生物控制弧菌属细菌的益生菌，特别是涉及一种新分离的芽孢杆菌菌株，其降解弧菌属病原菌的群体感应信号分子，并且抑制生物被膜的形成。在本发明的目的中，还要求保护含有该菌株的益生菌组合物、饲料添加剂、抗微生物剂或水质改善剂。

[0016] WO2003/038109公开了一种抑制产甲烷古菌生长的方法，以及一种提高反刍动物的饲料转化效率的方法。

[0017] 尽管为了提高和改善养殖动物的条件，在益生菌和动物饲料补充剂领域做了大量工作，但在本领域，特别是在水产养殖中，仍然需要替代组合物，以用于预防寄生虫衍生疾病、用于提高膳食能量输出、以及用于改善粪便废物质量。

发明内容

[0018] 本发明至少部分基于以下发现：属于古细菌界的生物，特别是产甲烷古细菌，可以用作动物饲料，特别是养殖动物饲料的天然生物活性补充剂。根据本发明的一个方面，这些微生物可以是例如，从诸如反刍动物的牛的胃肠道中收获的，并且作为益生菌助剂被包括在动物饲料组合物中，其目的是利用和加强天然存在的改善膳食能量输出并最小化疾病的生物途径，从而降低对广谱抗生素治疗的依赖，以及降低动物粪便污染造成的环境影响。通过使用已建立的动物模型，发明人检测并验证了将产甲烷古细菌富集于动物饲料具有改善养殖动物的生长速率和对寄生虫感染的免疫响应的潜能。当施用于小鼠时，饲料补充剂增加了模型动物的生长速率和肠粘膜屏障功能，其对原型肠道寄生虫多形螺旋线虫(H.polygyrus)的感染具有更强的抵抗力。在水生动物例如鱼类或甲壳类动物中，除了上述优点外，还可以清楚地显示出更快的生长速率、更高的饲料消化/吸收和饲料转化率、以及水箱内水中污染物的量的降低。因此证明了这种生物活性助剂能够(i)提高能量利用，从而提高生长速率，(ii)通过降低对广谱抗生素治疗的需求来提高对感染的抵抗力，以及(iii)改善排泄质量，从而减少对环境的影响。

[0019] 因此，本发明的目的是提供一种用于动物养殖饲料的生物活性食品补充剂，其特征在于，其包含至少一种古细菌(Archaebacteria)菌种的至少一个种群。

[0020] 在一个优选的实施方案中，所述生物活性食品补充剂的至少一种古细菌菌种是产甲烷古细菌(methanogenic Archaebacteria)菌种。在一个更优选的实施方案中，所述产甲烷古细菌菌种是斯氏甲烷球形菌(Methanosphaera stadtmanae)菌种或史氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter smithii)菌种。

[0021] 在一个实施方案中，所述生物活性食品补充剂的特征还在于，与标准养殖条件相比，其增加动物生长速率和/或降低动物对寄生虫感染的敏感性和/或改善动物排泄废物对环境的影响。

[0022] 在一个实施方案中，所述生物活性食品补充剂的特征还在于，其基本上富含古细菌菌种。

[0023] 本发明的另一个目的是提供一种包含如前所述的生物活性食品补充剂的组合物。在一个实施方案中，上述组合物的特征在于，其为固体形式。在一个实施方案中，所述组合
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物的特征在于，每克组合物包含约10至约10个古细菌细胞。

[0024] 本发明的另一个目的在于一种制备包含如前定义的生物活性食品补充剂的组合物的方法，其特征在于，其包括以下步骤：

[0025] 获取至少一种古细菌菌种的至少一个种群；以及

[0026] 将所述至少一种古细菌菌种的至少一个种群与载体混合。

[0027] 在所述方法的一个实施方案中，所述载体包含以下成分或由以下成分组成：水性溶液、油、古细菌培养基和/或瘤胃液。

[0028] 在本发明的一个具体实施方案中，所述方法的特征在于，所述载体是液体载体，并且还包括以下步骤：

[0029] 向包含所述液体载体和所述至少一种古细菌菌种的至少一个种群的液体组合物中加入1％至10％w/v的增稠剂；

[0030] 混合所述液体组合物以获得增稠溶液；以及

[0031] 干燥所述增稠溶液以获得固体组合物。

[0032] 在另一个实施方案中，所述增稠剂是糖、淀粉和/或明胶。在一个具体实施方案中，通过从瘤胃提取物中分离而获得所述至少一种古细菌菌种的至少一个种群。

[0033] 本发明的另一个目的在于一种通过上述方法获得的用作动物养殖饲料的组合物。

[0034] 本发明的另一个目的涉及一种提高养殖动物生长速率的方法、一种降低养殖动物对寄生虫感染的敏感性的方法、以及改善养殖动物排泄废物对环境的影响的方法，这些方法中的每一个均包括向养殖动物提供如上所述的生物活性食品补充剂或组合物的步骤。

[0035] 本发明的另一个目的涉及一种用于制备用于动物养殖饲料的生物活性食品补充剂的产甲烷古细菌菌种的种群。

[0036] 在本发明的一个优选实施方案中，上述生物活性食品补充剂、组合物、方法和种群中涉及的所述养殖动物是鸟类、哺乳动物或水生动物。

[0037] 如前所述，根据本发明的食品补充剂可以有利地应用于动物养殖。然而，本发明不限于此应用。所述食品补充剂也可以施用于宠物、圈养动物或人类。附图说明

[0038] 图1示出了生物活性食品补充剂促进天然野生型小鼠的体重增加。用含有所述生物活性食品补充剂的以谷物为主的食物或未处理的对照品，喂养6周龄的无特定病原体(SPF)笼养雌性C57BL/6小鼠(n＝6)，喂养7周并测量体重。在实验开始时，各组之间的体重没有显著差异。与未处理的小鼠相比，在接受生物活性食品补充剂的4周后，小鼠的体重显著升高。在剩余的实验中，施用补充剂的小鼠的体重持续升高；

[0039] 图2示出了生物活性食品补充剂促进天然野生型小鼠的派伊尔结的大小。用含有所述生物活性食品补充剂的以谷物为主的食物或未处理的对照品，喂养6周龄的SPF笼养雌性C57BL/6小鼠(n＝6)，喂养7周后，解剖小鼠并根据大小对肠道派伊尔结进行评分。接受包含生物活性食品补充剂的饮食的小鼠具有明显较大的派伊尔结；

[0040] 图3示出了生物活性食品补充剂增加对肠寄生虫多形螺旋线虫(H.polygyrus)的抵抗力。用含有所述生物活性食品补充剂的以谷物为主的食物或未处理的对照品，喂养6周龄的SPF笼养雌性C57BL/6小鼠(n＝6,4)。随后通过灌胃用200个感染单位的多形螺旋线虫感染小鼠，并且通过测量排泄物寄生虫卵的数量，来测定感染后在2-6周之间的感染性。与未处理组相比，在饮食中用生物活性食品补充剂处理的小鼠每克排泄物的寄生虫卵数量显著减少；

[0041] 图4示出了所述生物活性食品补充剂降低小鼠内肠道寄生虫负担。用含有所述生物活性食品补充剂的以谷物为主的食物或未处理的对照品，喂养6周龄的SPF笼养雌性C57BL/6小鼠(n＝4-6)。随后通过灌胃用200个感染单位的多形螺旋线虫感染小鼠，通过解剖并对肠腔内的寄生虫进行观察计数来测定感染后6周的成年寄生虫负担。与未处理组相比，用生物活性食品补充剂处理的小鼠中寄生虫负担明显降低；

[0042] 图5示出了用于测定古细菌对三种不同致病性弧菌的生长抑制作用的体外试验。组a：在海洋琼脂(Marine Agar)上的哈氏弧菌BB120(V.harveyi BB120)；组b：在海洋琼脂上的坎氏弧菌LMG21363(V.campbellii LMG21363)；组c：在海洋琼脂上的副溶血性弧菌PV1(V.parahaemolyticus PV1)；组d：在九盐琼脂(Nine Salts Agar)上的哈氏弧菌BB120；组e：在九盐琼脂上的坎氏弧菌LMG21363；组f：在九盐琼脂上的副溶血性弧菌PV1；

[0043] 图6示出了体内激惹试验(challenge test)的结果，以评估古细菌对暴露于病原性哈氏弧菌BB120 48小时的丰年虾无节幼体(Artemia nauplii)的存活率(％)的影响。值表示平均值±平均值的标准误差(n＝5)。用不同字母表示的标尺显著不同(单因素方差分析，p≤0.05)；

[0044] 图7示出了对照、低剂量补充饲料和高剂量补充饲料三个实验组在四个月零两周的时间内的体重增加曲线。数据点对应于每组样品组的平均重量，带有标准偏差误差条形图；

[0045] 图8示出了三个实验组的水中鱼废物污染物的分析。A)3个重复操作的平均磷酸盐浓度。在减去实验前在水中测量的磷酸盐浓度后，得到目前的磷酸盐值，且磷酸盐以mg/l和每mg水箱中总鱼重计。B)3个重复操作的平均亚硝酸盐浓度。目前的值以mg/l和每mg水箱中总鱼重的亚硝酸盐计。

具体实施方式

[0046] 通过参考与构成本发明的一部分的附图关联而呈现的以下详细描述，可以更容易地理解本发明。应当理解，本发明不限于本文所描述的和/或所示出的具体条件或参数，并且本文使用的术语仅用于通过示例的方式描述具体实施方案的目的，而不是对所要求保护的本发明的限制。

[0047] 除非上下文另有明确规定，否则如本文和所附权利要求书中所使用的，单数形式的“一种”(“a”)、“和”(“and”)、以及“所述”(“the”)包括复数形式。因此，例如，提及“一种组合物”包括多种组合物，提及“一种益生菌”包括一种或多种益生菌，等等。

[0048] 此外，除非另有说明，否则使用“或”表示“和/或”。类似地，“包含”和“包括”是可以互换的，而非限制性的。还应当理解，在各种实施方案的描述中使用术语“包含”的情况下，本领域技术人员将理解，在一些具体情况下，可以使用“基本上由...组成”或“由...组成”的语言替代地描述实施方案。

[0049] 在本发明的背景中，“生物活性食品补充剂”(以下也有时称为“补充剂”)是包含活性剂的任何类型的食品补充剂。表述“活性剂”以及“生物活性化合物”是指具有生物活性(即对生物体、组织或细胞有作用)的任何化学或生物物质。本文使用该术语表示改变、抑制、活化或以其他方式影响生物或化学事件的任何化合物。特别地，根据本发明的活性剂或生物活性化合物基本上作为益生菌发挥作用，即通过改变宿主相关的或周围的微生物群落、通过确保饲料的改善使用或通过增强其营养、通过增强宿主对疾病的反应、或通过提高周围环境的质量来有益地影响宿主动物。更具体地，在本发明的背景中，生物活性化合物表示包含至少一种古细菌菌种的至少一个种群的生物活性食品补充剂。

[0050] 本文所用的术语“种群”(“population”)涉及一群由时间和空间限定的同种菌种的生物个体。然而，该术语也可以指一个群落(community)，即一群栖息在特定生态位的生物，其可包括任何数量的菌种。在这种情况下，术语“种群”也指“混合种群”。如相关领域的技术人员将显而易见的，如果没有设想出商业可用的替代方案，则可以通过任何常规分离方法(包括连续稀释法、平板划线法、倾注平板法/平板涂布法、富集培养法、利用选择性培养基的方法、利用鉴别培养基的方法等)来获得待纳入生物活性食品补充剂中的古细菌菌种的种群。

[0051] 在根据本发明的一个优选实施方案中，所述生物活性食品补充剂的活性剂是产甲烷古细菌菌种，即，在缺氧条件下产生甲烷作为代谢副产物的古细菌菌种。产甲烷菌是多种不同的严格厌氧菌，其在自然界中广泛分布，可以在多种长期缺氧的栖息地(如淹没的土壤、沉积物、污水-污泥消化器或某些动物的消化道)中发现。所有已知的产甲烷菌都属于古细菌，且对氧气极其敏感。产甲烷菌的标志性特征是将C-1化合物(例如，二氧化碳、甲醇、甲酸盐或N-甲基)还原成甲烷(CH4)。产甲烷菌在厌氧环境中起着至关重要的生态作用，其可以去除通过其他形式的厌氧呼吸产生的过量的氢和发酵产物。产甲烷古生菌还在具有从甲烷氧化中获得能量的生物的生态系统中发挥关键作用，这些生物中许多是细菌，因为在这种环境中它们通常是甲烷的主要来源，且可以作为初级生产者发挥作用。产甲烷菌还在碳循环中发挥关键作用，将有机碳分解成甲烷，这也是主要的温室气体。产甲烷菌还发现于人类和其他动物，特别是反刍动物的肠道中。在瘤胃中，包括产甲烷菌在内的厌氧生物将纤维素消化成动物可用的形式。没有这些微生物，诸如牛等动物将不能消化草。产甲烷菌的有用产物被肠道吸收，而甲烷则被动物释放。

[0052] 一系列产甲烷古细菌菌种包括布氏甲烷杆菌(Methanobacterium bryantii)、甲酸甲烷杆菌(Methanobacterium formicum)、嗜树木甲烷短杆菌(Methanobrevibacter arboriphilicus)、戈特氏甲烷短杆菌(Methanobrevibacter gottschalkii)、瘤胃甲烷短杆菌(Methanobrevibacter ruminantium)、史氏甲烷短杆菌、Methanococcus chunghsingensis、Methanococcus burtonii、杂色甲烷球菌(Methanococcus aeolicus)、Methanococcus deltae、詹氏甲烷球菌(Methanococcus jannaschii)、海沼甲烷球菌
(Methanococcus maripaludis)、万氏甲烷球菌(Methanococcus vannielii)、拉布雷甲烷粒菌(Methanocorpusculum labreanum)、布雷斯甲烷袋状菌(Methanoculleus
bourgensis)、黑海甲烷袋状菌(Methanoculleus marisnigri)、Methanoflorens
stordalenmirensis、Methanofollis liminatans、卡里亚萨产甲烷菌(Methanogenium cariaci)、嗜冷产甲烷菌(Methanogenium frigidum)、嗜器官产甲烷菌(Methanogenium organophilum)、沃氏甲烷嗜热杆菌(Methanogenium wolfei)、运动甲烷微菌
(Methanomicrobium mobile)、嗜热古细菌(Methanopyrus kandleri)、Methanoregula boonei、联合鬃毛甲烷菌(Methanosaeta concilii)、嗜热甲烷鬃菌(Methanosaeta
thermophila)、醋酸甲烷八叠球菌(Methanosarcina acetivorans)、巴氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina barkeri)、马泽氏甲烷八叠球菌(Methanosarcina mazei)、斯氏甲烷球形菌、Methanospirillium hungatei、德氏嗜热甲烷杆菌(Methanothermobacter
defluvii)、热自养甲烷嗜热杆菌(Methanothermobacter thermautotrophicus)、嗜热弯曲甲烷热杆菌(Methanothermobacter thermoflexus)、沃氏甲烷嗜热杆菌以及索氏甲烷杆菌(Methanothrix sochngenii)。在一个实施方案中，用作本发明的生物活性食品补充剂的活性剂的古细菌菌种是斯氏甲烷球形菌菌种和/或史氏甲烷短杆菌菌种。

[0053] 本发明的生物活性食品补充剂的特征在于包含至少一种古细菌菌种的至少一个种群。然而，补充剂中可以存在几种其他试剂，特别是其它种类的益生菌。如将在稍后详细介绍的，当所述古细菌种群是从可能存在有多种微生物的混合物(通常称为微生物群)的牛的瘤胃提取物中获得时，这一点尤其如此。本发明人发现的一些观察数据表明，古细菌种群维持一个积极的共生关系，并且促进所谓的“古细菌相关微生物群”(即，通常在选定环境中与古细菌建立共生关系的微生物群，包括例如厌氧/发酵益生菌)的适宜的环境生长/增殖条件，特别是当保存包含更多类型的厌氧微生物的复合种群时，但不必受这一理论束缚。根据本发明的富含古细菌的食品补充剂中多于一种益生菌之间的平衡，可能是本发明的补充剂对养殖动物的值得注意的积极影响的关键特征之一。

[0054] 因此，在本发明的一些优选实施方案中，所述生物活性食品补充剂的特征在于其基本上富含古细菌菌种。如本文所用，“基本上富含”(substantially enriched)是指，本发明的补充剂中的古细菌细胞种群占总微生物益生菌细胞的至少1％，优选占总微生物益生菌细胞的约2至约10％。当组合物中存在多于一个微生物种群，优选益生菌微生物时，该富含具有上述有益效果。在一些实施方案中，存在于补充剂中的较高百分比，例如15、20、30、40、50、60、70、80、90、高达100％的微生物细胞是古细菌细胞，即，生物活性食品补充剂不含任何其他微生物(包括益生菌微生物)。

[0055] 如上所述，本发明的生物活性食品补充剂作为益生菌起作用。特别地，本发明的生物活性食品补充剂的一个目的是促进和/或增强养殖动物的生理机能的某些方面，以及所述改善的生理机能相关状况对周围环境的影响。如背景部分所述，在水产养殖方面尤其如此，其中养殖动物(在这种情况下，水生动物，例如鱼类、鳗鱼类或甲壳类动物)与他们的养殖环境极为密切相关。然而，根据本发明的养殖动物还可以是例如鸡、家禽、鸵鸟等的鸟；或哺乳动物，例如驯养动物如牛、绵羊、猪、马、啮齿动物等；也可能是灵长类和人类。因此，所述生物活性食品补充剂的特征在于其作用于动物生理参数，通过积极地影响它们，来使得与标准养殖条件相比有利地改善养殖条件。特别地，本发明的所述生物活性食品补充剂在增加动物生长速率、和/或降低动物对寄生虫感染的敏感性、和/或改善动物排泄废物对环境的影响上是有益的。如下面将在实施例部分中详细描述的，在用补充剂喂养了合适时间段的哺乳动物和水生动物模型中，已经显示了本发明补充剂的这些有益的性质，从而支持上述有利特征。此外，因此，本发明的目的之一是提供用于增加动物生长速率、降低动物对寄生虫感染的敏感性、或改善动物排泄废物对环境的影响的方法，所述方法包括将所述生物活性食品补充剂或包含其的组合物施用于养殖动物的步骤。

[0056] 因此，针对上述内容，根据本发明的一个方面，还提供了一种组合物，其特征在于，其包含本发明的生物活性食品补充剂。在本发明的背景中，术语“组合物”可与术语“制剂”互换使用。本文使用的“组合物”是指，以某种方式制备的并用于特定目的的成分或化合物的混合物。该概念还显然与将不同化合物(包括活性剂)组合以产生最终产物的过程相关。通常，由于这些成分在投入使用时赋予最终产品(即最终组合物)特有的特性，因此根据具体的配方混合所述成分，以获得最终组合物的特征，例如，获得当单独使用这些组分时不能得到的效果，促进其组分的任何潜在的协同作用的更高程度的效果，来改善最终用户等的操作性能和/或安全性。

[0057] 本发明的组合物可以是多种形式，优选的形式通常取决于预期的施用方式和/或预期的应用。组合物通常包含用于活性剂的至少一种可接受的载体(并且，为防万一，也可以用作稀释手段)、赋形剂等。如本文所用，“可接受的载体”是用作递送手段的，以及，如果需要，用作用于活性剂的分散手段的任何试剂。该术语包括与最终用户(在这一情况下是养殖动物)生理兼容的任何和所有溶剂、液体稀释剂、吸收延迟剂等，还包括作为预构建食物颗粒的固体载体。合适的载体的实例是本领域公知的并包括水溶液(例如，氯化钠溶液、氯化钠的磷酸盐缓冲溶液等)；水；油，如鱼油；乳液，如油/水乳液；各种类型的润湿剂等。

[0058] 根据本发明的组合物可以以液体形式提供。液体组合物是其中载体是液体载体，且即使存在有任何另外添加的赋形剂，其仍然保持液体形式的组合物。液体制剂包括例如水性溶液、非极性溶液或乳液。“水性溶液”是其中的溶剂基本上由水构成的溶液。在本发明的背景中，术语“水性”(aqueous)是指与水相关、涉及水、类似水，或溶于水中。该表述还包括高度浓缩的和/或粘稠的溶液，例如糖浆(即，饱和水/糖溶液)等，其中水的含量例如低于总溶液重量的5％。“非极性溶液”是其中的溶剂是非极性化合物的溶液。非极性溶剂是指具有低介电常数且不与水混溶的化合物。非极性溶液可以包括例如油。“油”是在环境温度下为粘性液体并且是疏水性和亲脂性的任意非极性化学物质。根据本发明的特别合适的油是鱼油。“乳液”是两种或更多种通常不混溶(不可混合)的流体的混合物。乳液是称为胶体的更一般的物质系统类型的一部分。虽然术语胶体和乳液有时可互换使用，但在本发明的背景中，当分散相和连续相都是流体，例如液体时，使用术语“乳液”。在乳液中，一种流体(“分散相”)分散在另一种流体(“连续相”)中。

[0059] 在根据本发明的一个具体实施方案中，包含本发明的生物活性食品补充剂的组合物是固体形式，即，其中载体是固体载体，或其中液体载体(或液体组合物)的含量，和/或液体载体(或液体组合物)中其它赋形剂的存在使得产生非流体组合物的制剂。其中，这还包括半固体组合物、冻干组合物、油灰状制剂、凝胶状材料、复合水凝胶等。如本文所用的，术语“凝胶”是指非流体的、液体充满其整个体积的胶体网状物或聚合物网状物。凝胶是一种固体三维网状物，其跨越液体介质的体积，并通过表面张力效应使其进入网状物。内部网状结构可能是由物理键(物理凝胶)或化学键(化学凝胶)引起的。如本文所用的，术语“水凝胶”是指其中溶胀剂是水性溶液的凝胶。水凝胶是由交联聚合物链的网状结构构成的高分子聚合物凝胶。它是由亲水单体合成的，有时被认为是一种其中水是分散介质的胶体凝胶。水凝胶是高度吸水的(它们可以含有超过90％的水性溶液)天然或合成聚合网状物。由于其特性，水凝胶具有典型的坚固而有弹性的机械性能。

[0060] 如上所述，也可以通过向液体载体或液体组合物中加入特定的赋形剂来制备固体组合物。如在本发明的情况下，当活性剂已经包含在液体溶液中时，该方法是特别有利的。事实上，在本发明的一个实施方案中，古细菌(事实上，是本发明的活性剂)在液体培养基(也称为“培养液”)中培养。如果固体组合物预期用于动物饲养，则可以通过加入增稠剂来固化或增稠该液体培养基。“增稠剂”(“thickening agent”)或“增稠剂”(“thickener”)是在基本不改变液体的其它性能的情况下，能够增加液体粘度的物质。增稠剂还可以改善其它成分或乳液的悬浮情况，这增加了产品的稳定性。食品增稠剂通常基于多糖(淀粉、植物胶和果胶)或蛋白质。该种类包括淀粉，如竹芋粉、玉米淀粉、猪苓(katakuri)淀粉、马铃薯淀粉、西米、木薯淀粉及它们的淀粉衍生物。用作食品增稠剂的植物胶包括藻酸及其盐(例如海藻酸(E400)、藻酸钠(E401)、藻酸钾(E402)、藻酸铵(E403)、藻酸钙(E404))、瓜尔胶、刺槐豆胶和黄原胶。用作食品增稠剂的蛋白质包括胶原蛋白、蛋清、红藻胶和明胶。糖包括琼脂糖、海藻糖、蔗糖、葡萄糖、甘露醇和角叉菜胶。一些增稠剂是胶凝剂(“gelling agents”)(胶凝剂(“gellants”))，形成凝胶，溶解在液相中作为形成弱粘结内部结构的胶体混合物。
典型的胶凝剂包括例如天然树胶、淀粉、果胶、琼脂和明胶。由于味道、透明度及其对化学和物理条件的反应的差异，不同的增稠剂可能多少不等地适合于给定的应用。在本发明的一个优选实施方案中，饲料组合物中包含的增稠剂选自糖、明胶和/或淀粉。

[0061] 根据具体需要，组合物通常包括其它组分，例如有机酸或其盐；抗氧化剂，例如抗坏血酸；低分子量(少于约十个残基)(聚)肽，例如聚精氨酸或三肽；蛋白质，例如源自植物来源如大豆的蛋白质；氨基酸，例如甘氨酸、谷氨酸、天冬氨酸、赖氨酸、甲硫氨酸、色氨酸或精氨酸；单糖、二糖和其他碳水化合物，包括纤维素或其衍生物、葡萄糖、甘露糖或糊精；糖醇，例如甘露醇或山梨糖醇；维生素；油，例如大豆油；脂肪酸；磷脂和/或离子，例如钠。

[0062] 在本发明的一些实施方案中，在保留固体制剂的所有优点(易于储存、精确剂量、真空包装等)的同时，也可设想在日后将固体组合物溶解于水(例如饮用水)中，以便为养殖动物(例如鸡和猪)提供简单的、按需递送的方式。

[0063] 抛开剂型不谈，本发明组合物的一个重要方面是其古细菌细胞含量，其预期是为了发挥益生菌典型的生理作用。在本发明优选的实施方案中，所述组合物的特征在于，每克组合物包含约105至约108个古细菌细胞。在此基础上，可以根据几个参数，例如动物类型、其饮食、其体重等，来优化剂量。无论如何，上述浓度范围不是限制性的，并且在本发明的背景中可以预期更低或更高的范围。在一种情况下，本发明的生物活性食品补充剂可以与例如，用于养殖动物的预制的或市售的饲料混合：在混合物中保持每克最终动物饲料含约105至约108个古细菌细胞被认为是优选实施方案。

[0064] 本发明的另一方面在于用于制备根据本发明的组合物的方法，以及通过所述方法获得的组合物。一般而言，根据本发明，用于制备适合作为动物饲料的组合物的方法包括以下步骤：获取至少一种古细菌菌种的至少一个种群，并将其与合适的载体混合。根据需要，载体可以是液体载体或固体载体，从而可以得到液体制剂或固体制剂。

[0065] 如技术人员显而易见的，可以用任何已知的方法获得至少一种古细菌菌种的一个种群，例如以交易方式购买分离的古细菌菌株(包括其冻干形式)、伴随或者不伴随造粒步骤在合适的培养液(例如，来自莱布尼茨研究所德国微生物和细胞培养物保藏中心(Leibniz Institute DSMZ-German Collection of Microorganisms and Cell Cultures GmbH)的甲烷球菌培养基I或甲烷杆菌培养基)中培养古细菌等。另外或替代地，可以从其他来源，例如，从如牛的瘤胃提取物中分离得到古细菌。瘤胃提取物对古细菌而言是一个完美的培养基，因为它含有在完美的培养条件-牛瘤胃中的厌氧条件-下，滋养微生物(特别是产甲烷古菌)的养分。通过常规实验室程序，可以每天从一头牛中提取大量的瘤胃提取物；这可以被消毒(例如，通过暴露于氧气和/或极端温度下)，并且由此获得的瘤胃液可以在厌氧、受控的实验室条件下用作培养古细菌的基质。此外，即使便利地从死后的牛中获得，牛的产甲烷微生物群的高功能潜力也可以被保存，以利用其促进基于植物的饮食的更好消化以及养殖动物(例如鸡、猪和鱼)的免疫系统活化。例如，通过机械压榨法可以从瘤胃中提取死后的牛的厌氧瘤胃微生物群，以获得富含产甲烷古菌的瘤胃液；这可以是网过滤法，并且最终可能使用合适的冷冻保护剂(糖、淀粉、明胶等)通过常规冷冻干燥或喷雾干燥方法保存。

[0066] 一旦获得了至少一种古细菌菌种的一个种群，则将其与载体(液体或固体载体)混合。在某些方面，特别是预期为液体组合物时，载体甚至可以与培养微生物的培养液和/或经提取过程(例如，压榨瘤胃提取物)从瘤胃提取物中获得的瘤胃液相同。

[0067] 在本发明的一个具体实施方案中，为了从液体组合物开始获得固体组合物，可以进行附加步骤。根据本发明的具体方法可知，向包含液体载体和至少一种古细菌菌种的至少一个种群的液体组合物中加入1％至10％w/v的增稠剂，用任意合适的方法(例如搅拌)混合得到的液体组合物/增稠剂，以得到增稠溶液，加热或不加热液体组合物，并干燥增稠溶液以获得固体组合物。所述固体组合物在下文中可以以最方便的方式被塑形为棒、块、丸、颗粒、(微)球等的形状。

[0068] 为了更好地澄清以下段落，“派伊尔结”是一种类卵形淋巴组织结节，其结构类似于淋巴结，不同之处在于它不被结缔组织被膜包围。派伊尔结属于称为淋巴小结的非包膜淋巴组织中的一类，其包括扁桃体和阑尾淋巴组织。称为微褶细胞(M细胞)的特殊上皮细胞排列在派伊尔结面向肠腔的一侧，而外侧包含许多淋巴样细胞和淋巴管。派伊尔结的功能是分析并回应回肠中的病原微生物。通过排列于每个派伊尔结表面的M细胞的内吞作用，来吸收源自肠道微生物的抗原。这些抗原被传递到淋巴组织，在那里它们被巨噬细胞吸收并呈递给T淋巴细胞和B淋巴细胞。当呈递危险的致病性抗原时，淋巴细胞通过产生病原体特异性抗体触发免疫响应，转化为病原体杀伤性细胞毒性T淋巴细胞，并通过淋巴管迁移至淋巴结，以提醒免疫系统的其他细胞。然后，在病原体能够蔓延到肠道外之前，机体准备好对病原体的全身免疫响应。像淋巴系统的其他组分一样，当其周围的组织变得发炎时，派伊尔结会变得发炎或溃烂，使其能够渗透毒素和外来细菌。

[0069] 实施例

[0070] 实施例1

[0071] 为了更清楚地描述和说明本发明，详细地提供了以下实施例，然而其并不旨在限制本发明。在本文所述的示例性实施方案中，从牛瘤胃收获和制备本发明的生物活性成分以改善小鼠的饲料颗粒。这是通过从牛瘤胃中分离天然存在的古细菌，并随后加入到小鼠饲料中来实现的。

[0072] 方法

[0073] 小鼠：雌性C57BL/6小鼠于8周龄时开始处理。定期测量体重，并密切监测小鼠的健康。

[0074] 生物活性食品补充剂生产：斯氏甲烷球形菌菌株DSZM 3091和史氏甲烷短杆菌菌株DSMZ 861购自德国微生物和细胞培养物保藏中心(德国，布伦瑞克，DSMZ)，均属于古细菌界；广古菌门；甲烷杆菌纲；甲烷杆菌目；甲烷杆菌科。在37℃的厌氧条件下，在2-巴H2/CO2(80％-20％)气氛并伴有搅拌的亨盖特管中，参照培养产甲烷菌的专门说明书和培养厌氧菌的专门说明书，分别在液体培养基322和119(德国，布伦瑞克，DSMZ)中对其进行生长。

[0075] 生物活性食品补充剂作为补充饲料施用：每只鼠笼自由采食特制的饲料颗粒。孵育5天后，从培养瓶中各收集500mL斯氏甲烷球形菌和史氏甲烷短杆菌液体培养物，并与5g琼脂糖/明胶结合并混合以生产固体产物。将琼脂糖/明胶生物活性食品补充剂混合物机械粉碎成约2-4mm直径的固体块。将19kg标准小鼠饲料颗粒溶于6L蒸馏水中，随后加入琼脂糖/明胶生物活性食品补充剂混合物。将完全混合物搅拌5分钟以获得均质体。将该均质体分解成0.5×1cm的块，铺展在铝箔上，并在21℃下干燥过夜。

[0076] 多形螺旋线虫模型：在无特定病原体(SPF)条件下繁殖并供养C57BL/6。在实验开始之前，所有小鼠用标准养殖饮食喂养。为了标准化同一实验中所分析的不同组的SPF小鼠的肠道细菌，在寄生虫感染前，所有小鼠同笼饲养3周。然后用200L3Heligmosomoides polygyrus bakeri(Hpb)口服感染小鼠，同时将饮食改为标准对照饮食，或包括如前所述的生物活性食品补充剂的实验饮食。Hpb感染后，针对剩余的实验，停止同笼饲养或同垫料饲养(bedding mixs)。在整个实验中，通过使用饱和NaCl收集潮湿粪便浮选，并使用麦克马斯特虫卵计数板(美国新泽西州汉密尔顿Weber Scientific International有限公司)进行肉眼计数来对卵产量进行定量。在实验结束时，处死动物，并使用解剖显微镜分别对小肠内容物和外表面人工计数，来确定成年蠕虫负担以及肠道派伊尔结大小。

[0077] 结果

[0078] 生物活性食品补充剂促进天然野生型小鼠的体重增加

[0079] 检测了生物活性食品补充剂对小鼠体重的影响(图1)。将常规饲料与含有补充剂的1％琼脂基介质混合，或仅与琼脂基介质混合作为对照。监测小鼠对琼脂基介质和生物活性食品补充剂的可能的厌恶。小鼠没有显示出对食用含有琼脂基介质或补充剂的饲料的厌恶。当引入生物活性补充剂的初始时，小鼠重量没有显著差异。相应饲料喂养4周后，与接受对照介质的小鼠相比，接受补充剂的小鼠显示出统计学上的显著体重增加。

[0080] 生物活性食品补充剂促进粘膜免疫

[0081] 检测了生物活性食品补充剂对小鼠小肠粘膜免疫的影响(图2)。肠道是病原菌进入脊椎动物的常见途径，因此粘膜形成了防止病原体入侵的重要屏障。派伊尔结-小肠中的淋巴样聚集体-是产生黏膜屏障功能所必需的肠粘膜抗体分泌细胞以及滋养流行菌群的起始部位。由于小鼠肠道派伊尔结的大小与粘膜抗体的生产和质量直接相关，因此发明人确定了持续7周接受生物活性食品补充剂或对照介质的小鼠的派伊尔结的大小。派伊尔结大小按照小、常规或增大排列，并计算每个肠道的平均大小得分。每个小鼠小肠通常具有7个派伊尔结，并且在各组中没有变化。与接受对照介质的小鼠相比，接受生物活性食品补充剂的小鼠的派伊尔结的平均大小较高。

[0082] 生物活性食品补充剂增加对寄生虫感染的抵抗力

[0083] 检测了生物活性食品补充剂对天然肠道寄生虫抵抗力的影响(图3和图4)。肠道寄生虫(蠕虫)是农业中常见的负担；因此，发明人使用原型蠕虫感染(Hpb)来确定在其饮食中接受生物活性食品补充剂的小鼠的感染敏感性的变化。按照标准模式口服施用Hpb，并在感染后2-4周内，通过进行粪便虫卵计数来确定蠕虫适合度。与仅接受对照介质的小鼠相比，接受生物活性食品补充剂的小鼠的蠕虫卵数显著较低，表明经处理的小鼠的寄生虫抵抗力增加。在感染后4周，处死小鼠并解剖以确定肠道蠕虫负担(确定宿主对感染的敏感性的另一个关键参数)。与仅接受对照介质的小鼠相比，经生物活性食品补充剂处理的小鼠中检测到的蠕虫数量显著降低，从而验证了生物活性食品补充剂增加对原型肠道寄生虫感染的抵抗力这一发现。

[0084] 该研究检测了将本发明的生物活性食品补充剂用作可以促进养殖动物的生长速率和先天疾病抵抗力的生物活性饲料成分的潜力。该数据清楚地表明，在完善构建的小鼠模型中，补充剂促进了生长和对感染的抵抗力，从而提供了概念的第一个关键证据。由于该补充剂利用了动物肠道中天然存在的生物相互作用，因此它代表了农业行业中目前基于药物的疾病治理方法的生理学和生态学上更安全的替代方法。

[0085] 在接受生物活性食品补充剂的小鼠中观察到的体重增加与产甲烷古菌与细菌进行生化共生以消化复杂的膳食碳水化合物，从而提高能量输出的报道相符合。该数据还提供了生物活性食品补充剂主要在肠腔和/或粘液中发挥其有益作用的证据。首先，体重的增加最有可能是肠道中膳食能量输出的增加所致。其次，肠道相关淋巴组织(派伊尔结)发育的增强，由肠道微环境的局部变化导致。第三方面，观察到了对位于肠道的感染的抵抗力的增加。与渗透入大多数宿主组织的抗生素药物相反，补充剂通过靶向动物肠道而被纳入/定位。

[0086] 粘膜屏障在预防病原体入侵中起着重要作用，而且在滋养对延伸超出肠道的宿主免疫系统有重要影响的流行菌群上也起着重要作用。因此，通过促进肠道内稳态，可以预期生物活性食品补充剂能够改善整体免疫系统的适合度，从而增加各种组织(上皮表面、呼吸系统、鱼鳃等)中的免疫抵抗力。

[0087] 实施例2

[0088] 已经评估了本发明的生物活性补充剂对致病性弧菌的生长(体外)以及对这些致病性弧菌的毒性(体内)的影响。具体地，本发明人使用依赖培养法评估了生物活性补充剂对三种指定病原体的拮抗活性(体外)，并使用无菌丰年虾丰年虾系统(gnotobiotic brine shrimp Artemia system)评估了古细菌针对抗选定病原体哈氏弧菌BB120的保护作用(体内)。

[0089] 细菌菌株和制备

[0090] 本检测中使用了致病性菌株坎氏弧菌LMG21363、哈氏弧菌BB120和副溶血性弧菌PV1。所有菌株在-80℃下，保存于含有20％无菌甘油的海洋培养液2216(美国密歇根州底特律Difco Laboratories)中。致病性弧菌初始时在海洋琼脂(美国密歇根州底特律Difco Laboratories)上、于28℃下生长24小时，然后在海洋培养液中、于28℃下连续震荡孵育至对数阶段。制备古细菌浓度为1011CFU g-1的本发明的冻干组合物。

[0091] 丰年虾幼虫的无菌孵化

[0092] 经脱壳和孵化后获得了无菌幼虫。简言之，将来自美国犹他州大盐湖的2.5g丰年虾(Artemia franciscana)卵(比利时登德尔蒙德英伟水产公司，EG型，批号21452)，在89ml蒸馏水中水合1小时。通过使用3.3ml NaOH(32％)和50ml NaOCl(50％)进行脱壳(decapsulation)获得无菌卵和幼虫。在反应期间，提供0.22μm过滤曝气。所有操作均在层流罩下进行，所有工具在121℃下高压蒸汽处理20分钟。约2分钟后，通过加入50ml 10g/L的Na2S2O3来停止脱壳处理。然后终止曝气，并用过滤的(0.2μm)且高压蒸汽处理的含有35g/L即食海洋合成海盐(法国萨尔堡Aquarium Systems)的人工海水(FAASW)清洗脱壳的卵。然后将卵悬浮在含有FAASW的1L玻璃瓶中，并在曝气入口和出口处提供0.22μm的空气过滤。将瓶子放置于28℃、约2000lux的恒定照明下。收集所出现的到达第二阶段(此时它们开始摄入细菌)的幼虫。

[0093] 体外平板测定

[0094] 将每种致病性弧菌的等分样品(50μL)铺在普通生长琼脂(海洋琼脂，MA)和加入虾饲料的极少的琼脂上。在灭菌前，由九盐琼脂(NSA)组成的后一琼脂补充有500mg/L虾饲料(Crevetec PL500，Crevetec，Belgium)。铺板后，将平板在无菌条件下保持开放直到晾干。接下来，以100mg/L(＝107CFU/mL)将本发明的组合物悬浮在相应的生长培养基(即海水培养液或九盐溶液)中，并将50μL等分样品转移到放置于琼脂平板中心的无菌接种盘上。将每个平板用封口膜密封并置于28℃的培养箱中。监测48小时内致病性弧菌的生长，并测定接种盘周围的空白区域的出现。

[0095] 在每个接种的琼脂平板上，可以清楚地观察到病原体的生长。然而，如图5所示，在接种古细菌的盘周围，没有平板显示出指示生长抑制的空白区域。

[0096] 体内激惹测定(challenge assay)

[0097] 在该实验中，评估了通过使用本发明的组合物对丰年虾无节幼虫针对选定致病性弧菌哈氏弧菌BB120激惹的保护作用。用100μm无菌筛从孵化瓶中收集无菌孵化的丰年虾，并用FAASW洗涤。将丰年虾转移到含有10mL FAASW的50mL无菌试管中，密度为2丰年虾/mL(＝20丰年虾无节幼虫每管)。将高压蒸汽处理的嗜水气单胞菌LVS3(Aeromonas hydrophila LVS3)以107CFU/mL加入到每个试管中，作为丰年虾无节幼虫的饲料。该测定由以下处理组成(每个处理n＝5)：

[0098] -中性控制(不添加古细菌，也不添加哈氏弧菌BB120)

[0099] -阳性对照(仅添加古细菌)

[0100] -阴性对照(仅添加哈氏弧菌BB120)

[0101] -试验(添加古细菌+添加哈氏弧菌BB120)

[0102] 以107细胞/mL(在益生菌的情况下，相当于100mg/L)的密度添加古细菌和致病性哈氏弧菌BB120。在48小时后测定丰年虾的存活率。48小时后，通过在TCBS培养基上的平板稀释并在28℃下培养平板48小时，来测定试验处理组(＝添加古细菌+添加哈氏弧菌BB120)中致病性弧菌的数目。

[0103] 图6给出了古细菌对经不同处理的丰年虾无节幼虫存活率的影响。未激惹的丰年虾无节幼虫显示出近90％的平均存活率，用哈氏弧菌BB120激惹的丰年虾无节幼虫显示出了平均35％的显著较低的存活率。这些是48小时内用哈氏弧菌激惹的无菌丰年虾激惹系统的正常结果。单独使用古细菌的平均存活率为64％，显著低于未激惹对照组。当将古细菌应用于用致病性哈氏弧菌BB120激惹的丰年虾无节幼虫时，与用病原体激惹但不用产物处理的丰年虾相比，存活显著更高。

[0104] 另外观察到，用古细菌处理的丰年虾无节幼虫似乎比未激惹的对照处理的丰年虾无节幼虫更活跃且更大。

[0105] 在试验开始时，作为激惹物加入的病原体的密度平均为7.0×106CFU mL-1(见表1)。在仅使用古细菌的处理中，在试验开始和结束时均没有检测到弧菌的存在。在试验结束时，当古细菌与激惹物联合添加时，病原体的密度平均为7.5×106CFU mL-1。

[0106]

[0107] 表1丰年虾无节幼虫体内试验开始和结束时，水中的哈氏弧菌BB120的浓度(如在TCBS琼脂上计数的)，以评估古细菌对暴露于致病性哈氏弧菌BB120的丰年虾无节幼虫存活率的影响。

[0108] 从结果可以得出结论，古细菌向用已知水产养殖病原体哈氏弧菌BB120激惹的丰年虾无节幼虫提供了显著的保护。由于在体外平板试验中没有出现空白区域，以及在体内激惹试验中哈氏弧菌BB120的数量没有减少，因此不能得出这种保护是由于益生菌针对病原体的直接抗微生物作用的结论。然而观察到(定性地)，来自仅暴露于古细菌的体内试验的丰年虾似乎比来自对照处理(即，仅用LVS3喂养)的丰年虾无节幼虫更大且更活跃。这表明在试验期间，古细菌支持丰年虾无节幼虫的发育和生长，以及作为其结果的潜在的疾病抵抗力。

[0109] 实施例3

[0110] 为了证明本发明的生物活性补充剂对鱼类的营养、生长、粪便污染物和肠道微生物群变化的影响，对食草白边白珍珠大胡子异型(Ancistrus dolichopterus)鲶鱼进行了多次实验。

[0111] 方法

[0112] 鱼：

[0113] 使用幼体的同属白边白珍珠大胡子异型鲶鱼(试验开始时1月龄)。起始时，用来自其父亲的粪便接种幼体鱼的肠道，以促进鱼肠以均质化方式的微生物定殖。将鱼养殖在50升的具有自来水过滤系统的水族箱中。每周更换一次四分之一的水。定期核查鱼的健康和正常行为。

[0114] 标准和生物活性饲料的生产：

[0115] 用由蔬菜(菠菜叶、黄瓜、西葫芦、绿豆和土豆，占总湿重的75％)、白豆酱(15％湿重)以及鱼肉(10％湿重)组成的自制饲料喂养鱼。将这些成分剁碎并混合以形成糊状物，加入预热琼脂并充分混合。将最后的糊状物倒入塑料袋中，压扁并在-20℃下冷冻。切割成小块，解冻并称重喂鱼。

[0116] 为了检测生物活性饲料补充剂的效果，制备了一批自制饲料，其包括低剂量的生物活性饲料补充剂，其最终浓度为每克饲料中含有106个古细菌细胞(称为低剂量补充饲料)。还制备了一批自制饲料，其包括高剂量的生物活性饲料补充剂，其最终浓度为每克饲料中含有108个古细菌细胞(称为高剂量补充饲料)。

[0117] 如下将幼体钩鲶属鲶鱼分为三个实验组，每组20个样本，每周6天自由采食：

[0118] 1.对照：不含生物活性饲料补充剂的标准自制饲料

[0119] 2.低剂量补充剂：含有低剂量补充剂的自制饲料

[0120] 3.高剂量补充剂：含有高剂量补充剂的自制饲料

[0121] 将鱼在这些喂养条件下喂养4个月零3周。

[0122] 鱼体重增加：

[0123] 在喂养实验的第1天，每组中的20只鱼的重量最接近5mg。随后在四个月零两周的期间内的六个时间点，对鱼进行称重。

[0124] 饲料转化率(FCR)：

[0125] 饲养实验开始四个月后，将3个实验组的每一组中的8个样本单独称重，并放置在具有减少的过滤的水循环(0.5升/小时)的独立的3升水箱中。在四天的时间里，在早上分别给予每条鱼精确称重的饲料。每日饲料重量约为100mg。在第五天早晨，对每条鱼进行称重，对水箱底部的残留饲料进行称重，并对粪便进行收集和称重。通过合算每日饲料的重量然后减去残留饲料的重量，来计算4天期间内总共摄入的饲料。通过将第5天早上鱼的重量减去起始时鱼的重量，来计算4天的期间内鱼增加的体重。通过将4天期间内摄入的饲料的重量除以相同期间内的鱼增加的体重，以得到FCR。根据USAID技术公报#07中提出的规则计算FCR。

[0126] 水箱水质测定：

[0127] 饲养实验开始三个月零三个星期后，该天喂食6小时后，将3个实验组的每一组中的8个样本从其水族箱中取出，放入3个小的3升水箱中，每组一个水箱。这3个水箱先前已经装满了来自同一个水库的干净水，以确保3组的初始水质相同。保留一份初始水样品以进行后续水质分析。鱼禁食饲料30小时。30小时后，从每个实验组中收集500mL水箱的水，以测量水质参数，并将鱼更换到其各自原来的水族箱中。使用光度计AL450(Aqualytic)和相应的试剂盒，来测量以下水参数：磷酸盐、亚硝酸盐、pH、电导率。减去初始水中测定的值，以得到最终磷酸盐和亚硝酸盐值。对每个实验组的8条鱼进行称重，并得到水箱中每克鱼的最终磷酸盐和亚硝酸盐值。该完整的程序总共重复了3次，用同样的鱼组，并间隔7天。

[0128] 微生物群宏条形码(metabarcoding):

[0129] 饲养实验开始三个月后，将5个对照组样本和5个高剂量补充组样本分别置于装有干净水且没有水循环的3升水箱中。2小时后，分别收集每个样本的粪便，并直接放入PowerSoil DNA分离试剂盒(MoBio)的DNA提取管中。DNA提取后，使用Takahashi等人(PLoS One,DOI:10.1371/journal.pone.0105592,2014)公布的引物Pro341F/Pro805R(不包括伊鲁米那衔接子序列)通过PCR扩增原核(细菌和古细菌)16S高变区V3-V4。使用高纯度PCR产物纯化试剂盒(罗氏)纯化10个PCR产物。使用TruSeq纳米DNA文库制备试剂盒(伊鲁米那)为
10个样品中的每一个制备了一个文库。通过实时定量PCR对文库进行定量，并以等摩尔量混库。使用MiSeq Reagent Nano Kit V2(500循环)，采用双端测序、2×250-bp循环，在MiSeq illumina设备上，对混库进行测序。使用伊鲁米那实时分析软件(版本1.17.28)对双端测序数据进行质量控制。使用BaseSpace Illumina平台实施的伊鲁米那的16S Metagenomics分析流程(版本1.0.1.0，2016)对收集的数据进行分析。

[0130] 结果

[0131] 生物活性补充剂增强钩鲶属鲶鱼的生长速率：

[0132] 肠道微生物群在饲料消化和营养吸收中起着核心作用，高度专门化的微生物群落已经在食草动物中演变，以从它们缺乏能量的植物膳食中提取营养物质。用有益微生物补充饲料可以改善营养吸收并提高生长速率。

[0133] 与对照组相比，用生物活性补充剂喂养的钩鲶属鲶鱼显示出较高的生长速率，表现为体重增加(图7)。然而，生长速率仅在对照和高剂量补充饲料组之间存在显著差异。因此，营养和生长响应视饲料中补充剂的剂量而定。

[0134] 生物活性补充剂改善钩鲶属鲶鱼的饲料转化率：

[0135] 通过添加有益微生物来改善肠道微生物群的功能，可以导致生长期间的加速生长和体重增加。在4个饲养日期间，计算每个实验组的8个样本的饲料转化率(FCR)，其衡量将饲料质量转化为体重增加的效率(表2)。对照组的FCR值范围为24至207，低剂量补充饲料组的FCR值范围为19.9至196.7，高剂量补充饲料组的FCR值范围为6.5至139。与高产养殖鱼相比，这些值相对提高，因为钩鲶属鲶鱼的增长缓慢，这特别是由其高度发达和强壮的骨骼及其食草食性导致。与对照相比，用高剂量补充饲料喂养的鱼的FCR结果显示显著升高(t检验，双尾：t-统计值＝2.4178，df＝9.69，P＝0.0369)。与对照相比，用低剂量补充饲料喂养的鱼中也观察到轻微的FCR增加(t-检验，双尾：t-统计值＝1.575,df＝12,P＝0.141)。因此，钩鲶属鲶鱼中的FCR的改善取决于包含古细菌的生物活性补充剂的剂量，并且与对照相比，仅大剂量补充饲料组显示出显著的改善。

[0136]

[0137] 表2：三个实验组(对照、低剂量补充饲料和高剂量补充饲料)的饲料转化率(FCR)的数据和结果。

[0138] 生物活性补充剂减少钩鲶属鲶鱼粪便的量：

[0139] 由饲料生物活性补充剂触发的消化改善和营养吸收预期将降低每单位重量的摄入饲料所产生的粪便的重量。使用与计算FCR相同的数据，并通过对实验第5天产生的粪便进行称重，来计算粪便重量/摄入饲料重量的比(表3)。结果表明，用生物活性补充剂喂养的鱼所产生的粪便量低于对照组。独立样品的T检验表明，低剂量和高剂量补充饲料均导致每单位重量的摄入饲料的粪便重量显著降低(低剂量:t-统计值＝2.227，df＝12，P＝0.023；高剂量:t-统计值＝3.761,df＝12,P＝0.0014)。该结果表明，由于单纯的粪便量减少，生物活性补充剂可能会减少粪便污染物的量。

[0140]

[0141] 表3：在FCR实验的4个喂养日期间产生的粪便重量，表示为粪便重量/摄入饲料重量×100。鱼的样本和总摄入饲料重量与表1相同。

[0142] 生物活性补充剂减少钩鲶属鲶鱼废物污染物：

[0143] 动物粪便是亚硝酸盐和磷酸盐污染物的来源。大量的亚硝酸盐和磷酸盐的存在表明废水污染，对环境有害。在食草白边白珍珠大胡子异型鲶鱼上检测了生物活性补充剂对粪便污染物减少的影响。水质参数测量结果(图8)表明，与含有对照组鱼的水箱中水的相比，含有用生物活性补充饲料(高剂量补充饲料或低剂量补充饲料)喂养的鱼的水箱中的水的磷酸盐和亚硝酸盐的浓度显着降低(两个独立样品的t检验：对照组与低剂量补充饲料组中的磷酸盐，t-统计值＝6.478,df＝2,P＝0.0115；对照组与高剂量补充饲料组中的磷酸盐，t-统计值＝6.298,df＝2,P＝0.012；对照组与低剂量补充饲料组中的亚硝酸盐，t-统计值＝24.779,df＝2,P＝0.0008；对照组与高剂量补充饲料组中的亚硝酸盐，t-统计值＝29.86,df＝2,P＝0.0006)。两种实验剂量的生物活性饲料补充剂(高剂量或低剂量实验饲料)之间没有观察到显著差异。

[0144] 起始水的pH值在7.76和7.91之间。实验结束时，对照组的水的pH值在7.57～7.67的范围内，而在低剂量和高剂量补充饲料组中，水的pH值在7.59～7.85的范围内。在实验结束时，与低剂量补充饲料组(275-277μS/cm)或高剂量补充饲料组(270-274μS/cm)相比，对照组(280-283μS/cm)的水导电率(μS/cm)较高。这些结果表明，与用生物活性补充剂喂养的鱼相比，对照组中的水有轻微酸化和电导率增加。

[0145] 生物活性补充剂改变钩鲶属鲶鱼的微生物群：

[0146] 本实验旨在表征新鲜粪便中测定的、由白边白珍珠大胡子异型鲶鱼中的生物活性益生菌x诱导的微生物群变化。收集5个对照组样本和5个高剂量补充饲料组样本的新鲜粪便，并对其微生物群进行宏条形码(metabarcoded)分析。每个标本中高质量的双端测序数据在48'500到57'200的范围之间。宏条形码分析结果表明，与对照相比，在用生物活性补充剂喂养的鱼中微生物群有显著地改进。这在对照组相对于高剂量补充饲料组中的六种更丰富的菌纲的频率的显著变化中可以观察到，如表4所示(对照组与高剂量组之间的多变量方差分析(MANOVA)检验：Pillai Trace t-统计值＝0.984，F＝29.98，df1＝6，df2＝3，P＝0.009)。微生物群改进也可以通过样品中发现的细菌和古细菌属的多样性来鉴别，其在对照组(范围：每个样品中246至313个属)中比在高剂量补充饲料组(范围：每个样品中179至
267个属)中更高。单因素方差分析表明，这种差异是显著的(组内：SS＝7272,df＝8,MS＝
909；组间：SS＝10112.4,df＝1,MS＝10112.4,F＝11.125,P＝0.0103)。另一个重要的区别是，构成生物活性补充剂的古细菌菌种有秩序地存在于高剂量补充饲料组的鱼的微生物群中，且与对照组的鱼的微生物群(范围在所有指定的读数的0至0.004％之间)相比，丰度更大(范围在所有指定的读数的0.005至0.225％之间)。根据t检验，这一差异是显著的(t-统计值＝2.532，df＝7，P＝0.019)。

[0147] 鉴于实施例中所示的补充剂的有利性质，可以确定，使用生物活性食品补充剂可以对养殖动物产生影响，特别是对免疫系统和消化性能，以及对粪便废物质量的改善，尤其是硝酸盐含量(动物养殖产生的重要污染物)有有益的影响。

[0148]

[0149] 表4.在对照组中发现的六种最丰富的菌纲的频率变化，对于五条对照组的鱼和五条高剂量补充饲料组的鱼。数字代表所给定的细菌纲相对于总数值的百分比数值。

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