经改良的抗GDF-8的拮抗剂抗体及其用途
阅读：869发布：2024-01-10
专利汇可以提供经改良的抗GDF-8的拮抗剂抗体及其用途专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 提供经改良的中和性抗GDF-8 抗体 ，其能在宿主细胞中以显著高于先前抗GDF-8抗体的 水 平表达。本发明还提供使用包含这些抗体的组合物增加肌肉 质量 或强度及 治疗 或 预防 肌肉病症、神经肌肉病症、代谢紊乱、脂肪组织病症或骨病的方法。，下面是经改良的抗GDF-8的拮抗剂抗体及其用途专利的具体信息内容。
1.特异性结合GDF-8的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段包含：
抗体重链可变(VH)区，其包含来自由氨基酸序列SEQ ID NO:44限定的所述VH区的第一、第二及第三互补决定区(CDR)；及
抗体轻链可变(VL)区，其包含来自由氨基酸序列SEQ ID NO:46限定的所述VL区的第一、第二及第三互补决定区(CDR)；
其中所述VH区在对应于SEQ ID NO:44的残基编号111(Kabat位置108)的氨基酸位置处包含亮氨酸。
2.权利要求1的抗体或片段，其中VH CDR1包含SEQ ID NO:10或SEQ ID NO:20，VH CDR2包含SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21，VH CDR3包含SEQ ID NO:12，VL CDR1包含SEQ ID NO:13，VL CDR2包含SEQ ID NO:14且VL CDR3包含SEQ ID NO:15。
3.权利要求2的抗体或片段，其中在每一CDR内最多三个非接触氨基酸残基经保守取代。
4.权利要求1的抗体或片段，其中所述VH区的第四框架区(FR4)包含SEQ ID NO:44的氨基酸106至116。
5.权利要求1的抗体或片段，其中所述VL区在对应于SEQ ID NO:46的残基编号
100(Kabat位置100)的氨基酸位置处包含甘氨酸。
6.权利要求1的抗体或片段，其中所述VL区在对应于SEQ ID NO:46的残基编号
100(Kabat位置100)的氨基酸位置处包含谷氨酰胺。
7.权利要求5的抗体或片段，其中所述VL区的第四框架区包含SEQ ID NO:46的氨基酸98至107。
8.权利要求6的抗体或片段，其中所述VL区的第四框架区包含SEQ ID NO:9的氨基酸
98至107。
9.权利要求1的抗体或片段，其中所述VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:44。
10.权利要求9的抗体或片段，其中所述VL区包含氨基酸序列SEQ ID NO:46。
11.权利要求9的抗体或片段，其中所述VL区包含氨基酸序列SEQ ID NO:9。
12.权利要求1的抗体或片段，其进一步包含衍生自选自IgA、IgG、IgD、IgE或IgM抗体亚型的抗体重链恒定(CH)区。
13.权利要求12的抗体或片段，其中所述IgG亚型进一步选自IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。
14.权利要求13的抗体或片段，其中所述IgG亚型是IgG1。
15.权利要求13的抗体或片段，其中所述IgG亚型包含至少一个改变Fc结构域功能的突变。
16.权利要求12的抗体或片段，其中所述抗体或片段的重链包含氨基酸序列SEQ ID NO:57。
17.权利要求1的抗体或片段，其进一步包含抗体轻链恒定(CL)区。
18.权利要求17的抗体或片段，其中所述CL区是κ或λCL区。
19.权利要求17的抗体或片段，其中所述抗体或片段的轻链包含氨基酸序列SEQ ID NO:17。
20.权利要求9的抗体或片段，其中所述VH区是由核酸序列SEQ ID NO:43编码。
-6 -7 -8 -9
21.权利要求1的抗体或片段，其中所述抗体或片段以至少10 M、10 M、10 M、10 M、-10 -11
10 M或10 M的Kd结合GDF-8。
22.权利要求1的抗体或片段，其中所述抗体或片段选自Fab、F(ab’)2、scFv、scFv-Fc、scFv-CH、scFab、scFv-拉链、双抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、Fv及双特异性抗体。
23.权利要求1的抗体，其中由转染细胞产生的所述抗体的量大于在类似条件下产生的其中VH区在Kabat位置108处包含甲硫氨酸的其它方面均相同的抗体的量。
24.权利要求23的抗体，其中由转染细胞产生的所述抗体的量超过在类似条件下产生的所述其它方面均相同的抗体的量至少约以下的量：1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、
8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍及30倍。
25.特异性结合GDF-8的抗体或其抗原结合片段，所述抗体或片段包含：与氨基酸序列SEQ ID NO:44至少95％相同的VH区，及与氨基酸序列SEQ ID NO:46至少95％相同的VL区，其中所述VH区在Kabat位置108处包含亮氨酸。
26.特异性结合GDF-8的抗体，其包含由氨基酸序列SEQ ID NO:58限定的抗体重链及由氨基酸序列SEQ ID NO:59限定的抗体轻链。
27.权利要求26的抗体，其中所述抗体基本上由两条各自由氨基酸序列SEQ ID NO:58限定的抗体重链及两条各自由氨基酸序列SEQ ID NO:59限定的抗体轻链组成。
28.药物组合物，其包含权利要求1的抗体及药物学可接受的载体。
29.分离多核苷酸，其包含编码特异性结合GDF-8的抗体或其片段的至少一条多肽链的核酸序列，所述抗体或片段包含：
抗体重链可变(VH)区，其包含来自由氨基酸序列SEQ ID NO:44限定的所述VH区的第一、第二及第三互补决定区(CDR)，
其中所述VH区在对应于SEQ ID NO:44的残基编号111(Kabat位置108)的氨基酸位置处包含亮氨酸；及
抗体轻链可变(VL)区，其包含来自由氨基酸序列SEQ ID NO:46限定的所述VL区的第一、第二及第三互补决定区(CDR)，
其中所述VL区在对应于SEQ ID NO:46的残基编号100(Kabat位置100)的氨基酸位置处包含甘氨酸。
30.权利要求29的分离多核苷酸，其中编码所述VH区的核酸序列是核酸序列SEQ ID NO:43或SEQ ID NO:49，且其中编码所述VL区的核酸序列是核酸序列SEQ ID NO:45或SEQ ID NO:51。
31.权利要求29的分离多核苷酸，其进一步包含编码人类抗体CH区的核酸序列。
32.权利要求29的分离多核苷酸，其进一步包含编码人类抗体CL区的核酸序列。
33.权利要求32的分离多核苷酸，其中所述CL区由核酸序列SEQ ID NO:16编码。
34.表达载体，其包含权利要求29的多核苷酸。
35.宿主细胞，其包含可操作连接至调节序列的权利要求29的多核苷酸。
36.产生特异性结合GDF-8的抗体或其片段的方法，其包含培养权利要求35的宿主细胞及回收由此产生的所述抗体或片段的步骤。
37.增加哺乳动物的肌肉质量或强度的方法，其包含向哺乳动物施用有效增加所述哺乳动物的肌肉质量或强度的量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
38.权利要求37的方法，其中所述肌肉是骨骼肌或心肌。
39.权利要求37的方法，其中所述骨骼肌在呼吸中发挥作用。
40.治疗肌肉病症的方法，其包含向需要治疗肌肉病症的对象施用治疗有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
41.权利要求40的方法，其中所述肌肉病症选自肌营养不良、肌萎缩、少肌症、恶病质、肌肉耗损综合征、年龄相关性肌肉质量或强度损失及衰弱症。
42.权利要求41的方法，其中所述肌肉病症是肌营养不良。
43.权利要求42的方法，其中所述肌营养不良是杜兴肌营养不良(Duchenne muscular dystrophy)。
44.权利要求43的方法，其中治疗是有效提高所述对象在6分钟步行测试中的表现。
45.权利要求43的方法，其中所述抗体被施用给还也在用糖皮质素治疗的对象。
46.预防肌肉病症的方法，其包含向需要预防肌肉病症的对象施用有效预防所述肌肉病症的量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
47.权利要求46的方法，其中所述肌肉病症选自肌营养不良、肌萎缩、少肌症、恶病质、肌肉耗损综合征、年龄相关性肌肉质量或强度损失及衰弱症。
48.权利要求47的方法，其中所述肌肉病症是肌营养不良。
49.权利要求48的方法，其中所述肌营养不良是杜兴肌营养不良。
50.治疗或预防神经肌肉病症的方法，其包含向需要治疗神经肌肉病症的对象施用治疗有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
51.权利要求50的方法，其中所述神经肌肉病症是ALS。
52.治疗或预防代谢紊乱的方法，其包含向需要治疗代谢紊乱的对象施用治疗有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
53.权利要求52的方法，其中所述代谢紊乱选自2型糖尿病、代谢综合征、综合征X、胰岛素抵抗及葡萄糖耐量降低。
54.治疗或预防脂肪组织病症的方法，其包含向需要治疗脂肪组织病症的对象施用治疗有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
55.权利要求54的方法，其中所述脂肪组织病症是肥胖症。
56.治疗或预防骨丢失病症的方法，其包含向需要治疗骨丢失病症的对象施用治疗有效量的权利要求1的抗体或其抗原结合片段。
57.权利要求56的方法，其中所述骨丢失病症选自骨质疏松、骨质减少、骨关节炎及骨质疏松相关性骨折。
58.特异性结合GDF-8的抗体，其包含：
由SEQ ID NO:44组成的抗体VH区及由SEQ ID NO:46组成的抗体VL区，
其中所述抗体在类似条件下的表达水平高于包含由SEQ ID NO:7组成的VH区及由SEQ ID NO:9组成的VL区的其它方面均相同的第二抗体。
59.权利要求58的抗体，其中所述抗体的表达水平比所述第二抗体高至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、12倍、13倍、14倍、15倍、20倍或30倍的量。
60.权利要求59的抗体，其中当在COS细胞中表达时，所述抗体以所述第二抗体约12倍表达。
61.权利要求59的抗体，其中当在CHO细胞中表达时，所述抗体以所述第二抗体约6倍表达。
经改良的抗GDF-8的拮抗剂抗体及其用途
[0001] 相关申请的交叉引用
[0002] 本申请主张2012年6月15日申请的美国临时申请第61/660,232号的权益，所述申请的内容以引用方式全文并入本文中。
[0004] 在37CFR§1.821下以计算机可读取形式(CRF)经由EFS-Web以文件名PC071914_SEQLIST_ST25.txt同时提交的序列表以引用方式并入本文中。序列表的电子副本于2013
年5月14日创建，文件大小为71KB。
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[0005] 生物保藏
[0006] 本发明的代表性材料于2012年6月14日保藏于美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection，“ATCC”)，学院大道(University Boulevard)10801号，马纳萨斯，VA 20110-2209，美国。具有ATCC登录号PTA-12980的载体OGD1.0.0-HC是
编码OGD1.0.0重链可变区的多核苷酸，具有ATCC登录号PTA-12981的载体OGD1.0.0-LC
是编码OGD1.0.0轻链可变区的多核苷酸。
编码OGD1.0.0重链可变区的多核苷酸，具有ATCC登录号PTA-12981的载体OGD1.0.0-LC
是编码OGD1.0.0轻链可变区的多核苷酸。
[0007] 保藏物在国际承认用于专利程序的微生物保藏布达佩斯条约及其下条例(“布达佩斯条约”)的规定下制备。这保证可将保藏物的活培养物自保藏的日起维持30年。根据
布达佩斯条约条款将使保藏物可由ATCC获得且使其遵守Pfizer公司与ATCC之间的协议，
其保证公众可基于相关美国专利的发布或基于向公众公开任何美国或外国专利申请(以
先达到者为准)永久且不受限制地获得保藏培养物的后代，且保证由美国专利商标局根据
35U.S.C.§122和依据35U.S.C.§122的委员会规则(包括37CFR§1.14，尤其参照886 OG
638)确定授权者可获得所述后代。
布达佩斯条约条款将使保藏物可由ATCC获得且使其遵守Pfizer公司与ATCC之间的协议，
其保证公众可基于相关美国专利的发布或基于向公众公开任何美国或外国专利申请(以
先达到者为准)永久且不受限制地获得保藏培养物的后代，且保证由美国专利商标局根据
35U.S.C.§122和依据35U.S.C.§122的委员会规则(包括37CFR§1.14，尤其参照886 OG
638)确定授权者可获得所述后代。
[0008] 本申请的专利权人已同意，若所保藏材料的培养物当在适宜条件下培养时死亡或丢失或被破坏，则将迅速更换所述材料的另一培养物并作出通知。所保藏材料的可获得性
不应视为允许在违反任何政府机关根据其专利法授予的权利的情况下实践本发明。
不应视为允许在违反任何政府机关根据其专利法授予的权利的情况下实践本发明。
背景技术
[0009] 生长分化因子-8(GDF-8)也称作肌肉生长抑制素(myostatin)，是分泌蛋白及结构相关生长因子的转化生长因子-β(TGF-β)超家族的成员。该超家族的成员具有生长
调节及形态发生性质(Kingsley等人(1994)Genes Dev.8:133-46；Hoodless等人(1998)
Curr.Topics Microbiol.Immunol.228:235-72)。人类GDF-8是以375个氨基酸的前体蛋白
质来合成，其形成同型二聚体复合体。在处理期间，称为“阴性相关肽”(LAP)的氨基末端前肽被切割且可与所述同型二聚体保持非共价结合，从而形成名为“小潜伏复合体”的无活性复合体(Miyazono等人(1988)J.Biol.Chem.263:6407-15；Wakefield等人(1988)J.Biol.
Chem.263:7646-54；Brown等人(1999)Growth Factors3:35-43；Thies等人(2001)Growth
Factors 18:251-59；Gentry等人(1990)Biochemistry 29:6851-57；Derynck等人(1995)
Nature 316:701-05；Massague(1990)Ann.Rev.Cell Biol.12:597-641)。诸如促滤泡素抑
制素(follistatin)及其相关物的蛋白质也结合成熟GDF-8同型二聚体且抑制GDF-8生物
活性(Gamer等人(1999)Dev.Biol.208:222-32)。
调节及形态发生性质(Kingsley等人(1994)Genes Dev.8:133-46；Hoodless等人(1998)
Curr.Topics Microbiol.Immunol.228:235-72)。人类GDF-8是以375个氨基酸的前体蛋白
质来合成，其形成同型二聚体复合体。在处理期间，称为“阴性相关肽”(LAP)的氨基末端前肽被切割且可与所述同型二聚体保持非共价结合，从而形成名为“小潜伏复合体”的无活性复合体(Miyazono等人(1988)J.Biol.Chem.263:6407-15；Wakefield等人(1988)J.Biol.
Chem.263:7646-54；Brown等人(1999)Growth Factors3:35-43；Thies等人(2001)Growth
Factors 18:251-59；Gentry等人(1990)Biochemistry 29:6851-57；Derynck等人(1995)
Nature 316:701-05；Massague(1990)Ann.Rev.Cell Biol.12:597-641)。诸如促滤泡素抑
制素(follistatin)及其相关物的蛋白质也结合成熟GDF-8同型二聚体且抑制GDF-8生物
活性(Gamer等人(1999)Dev.Biol.208:222-32)。
[0010] 来自不同物种的推断GDF-8氨基酸序列的比对显示，GDF-8非常保守(McPherron等人(1997)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.94:12457-61)。人类、小鼠、大鼠、猪及鸡GDF-8的序列在C末端区100％相同，而狒狒、牛及羊GDF-8在C末端处仅相差3个氨基酸。GDF-8
在物种之间的高保守度表明，GDF-8具有必需的生理功能。
在物种之间的高保守度表明，GDF-8具有必需的生理功能。
[0011] 已显示GDF-8可通过抑制成肌细胞及卫星细胞的增殖及分化在肌肉发育调节及体内稳态中起重要作用(Lee and McPherron(1999)Curr.Opin.Genet.Dev.9:604-07；
McCroskery等人(2003)J.Cell.Biol.162:1135-47)。其早期在发育中的骨骼肌中表达，且
继续在成年骨骼肌中表达，优先在快缩类型中表达。另外，在成年小鼠中过表达的GDF-8造成显著肌肉损失(Zimmers等人(2002)Science 296:1486-88)。同样，已显示使GDF-8基因
无活性的天然突变在动物及人类中可引起肥大及增生(Lee及McPherron(1997)，见上文)。
例如，GDF-8敲除转基因小鼠的特征在于骨骼肌的显著肥大及增生以及改变的骨皮质结构
(McPherron等人(1997)Nature387:83-90；Hamrick等人(2000)Bone 27:343-49)。在天
然GDF-8突变的牛中显现类似的骨骼肌质量增加(Ashmore等人(1974)Growth 38:501-07；
Swatland等人(1994)J.Anim.Sci.38:752-57；McPherron等人，见上文；Kambadur等人
(1997)Genome Res.7:910-15)。另外，不同研究显示，增加的GDF-8表达与HIV诱导的肌
肉耗损有关(Gonzalez-Cadavid等人(1998)Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.95:14938-43)。
也已显示GDF-8参与肌肉特异性酶(例如，肌酸激酶)的产生及成肌细胞增殖(WO
00/43781)。
McCroskery等人(2003)J.Cell.Biol.162:1135-47)。其早期在发育中的骨骼肌中表达，且
继续在成年骨骼肌中表达，优先在快缩类型中表达。另外，在成年小鼠中过表达的GDF-8造成显著肌肉损失(Zimmers等人(2002)Science 296:1486-88)。同样，已显示使GDF-8基因
无活性的天然突变在动物及人类中可引起肥大及增生(Lee及McPherron(1997)，见上文)。
例如，GDF-8敲除转基因小鼠的特征在于骨骼肌的显著肥大及增生以及改变的骨皮质结构
(McPherron等人(1997)Nature387:83-90；Hamrick等人(2000)Bone 27:343-49)。在天
然GDF-8突变的牛中显现类似的骨骼肌质量增加(Ashmore等人(1974)Growth 38:501-07；
Swatland等人(1994)J.Anim.Sci.38:752-57；McPherron等人，见上文；Kambadur等人
(1997)Genome Res.7:910-15)。另外，不同研究显示，增加的GDF-8表达与HIV诱导的肌
肉耗损有关(Gonzalez-Cadavid等人(1998)Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.95:14938-43)。
也已显示GDF-8参与肌肉特异性酶(例如，肌酸激酶)的产生及成肌细胞增殖(WO
00/43781)。
[0012] 除了其生长调节及形态发生性质以外，GDF-8据信参与多种其它生理过程，包括在2型糖尿病发展期间的葡萄糖体内稳态、葡萄糖耐量降低、代谢综合征(即，例如综合征X的综合征，其涉及同时发生一组健康状况，所述状况可包括胰岛素抵抗、腹部肥胖症、血脂异常、高血压、慢性炎症、趋血栓阻塞性状态等，其使个人具有2型糖尿病和/或心脏病的高风险)、胰岛素抵抗(例如，由诸如创伤或氮失调症等创伤诱导的抗性)及脂肪组织病症(例
如，肥胖症、血脂异常、非酒精性脂肪肝疾病等)(Kim等人(2000)Biochem.Biophys.Res.
Comm.281:902-06)。
如，肥胖症、血脂异常、非酒精性脂肪肝疾病等)(Kim等人(2000)Biochem.Biophys.Res.
Comm.281:902-06)。
[0013] 多种人类及动物病症与肌肉组织功能受损有关，例如，肌萎缩侧索硬化症(“ALS”)、肌营养不良(“MD”；包括杜兴肌营养不良(Duchenne's muscular dystrophy))、肌萎缩、器官萎缩、衰弱症、充血阻塞性肺病(COPD)、少肌症、恶病质及由其它疾病及状况引起的肌肉耗损综合征。目前，几乎没有可靠或有效的疗法可治疗这些病症。这些疾病的病
理表明GDF-8信号传导在这些疾病的治疗中作为靶的潜在作用。
理表明GDF-8信号传导在这些疾病的治疗中作为靶的潜在作用。
[0014] ALS是迟发且致死的神经变性疾病，其特征在于中枢神经系统变性及肌萎缩。ALS通常始于步态异常及灵活性损失，然后进展至肢体及膈膜瘫痪。尽管大多数ALS病例是散
发性的且病因未知，但已显示5-10％病例源自显性家族性(FALS)遗传。约10-20％的FALS
病例归因于Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因中的突变(综述于Bruijn等人(2004)Ann.
Rev.Neurosci.27:723-49中)。SOD1是催化超氧化物变为过氧化氢及双原子氧的反应的异
二聚金属-蛋白质，且由于SOD1的损失不引起运动神经元疾病(Reaume等人(1996)Nat.
Genet.13:43-47)，人们相信毒性功能获得可诱导疾病(综述于Bruijn等人，见上文)。SOD1诱导的神经元细胞死亡的具体机制尚未明了，且可能涉及轴突运输的改变、对错误折叠蛋
白质的细胞反应、线粒体功能失调及兴奋性神经毒性(Bruijn等人，见上文)。
发性的且病因未知，但已显示5-10％病例源自显性家族性(FALS)遗传。约10-20％的FALS
病例归因于Cu/Zn超氧化物歧化酶(SOD1)基因中的突变(综述于Bruijn等人(2004)Ann.
Rev.Neurosci.27:723-49中)。SOD1是催化超氧化物变为过氧化氢及双原子氧的反应的异
二聚金属-蛋白质，且由于SOD1的损失不引起运动神经元疾病(Reaume等人(1996)Nat.
Genet.13:43-47)，人们相信毒性功能获得可诱导疾病(综述于Bruijn等人，见上文)。SOD1诱导的神经元细胞死亡的具体机制尚未明了，且可能涉及轴突运输的改变、对错误折叠蛋
白质的细胞反应、线粒体功能失调及兴奋性神经毒性(Bruijn等人，见上文)。
[0015] 在ALS中观察到的运动神经元变性可经由多种机制发生，包括运动神经元破坏营养因子的摄取或运输(综述于Holzbaur(2004)Trends Cell Biol.14:233-40中)。因
此，ALS可用通过提供最佳存活环境来使变性神经元恢复活力的疗法来治疗。神经环境包
括诸如神经胶质及肌肉细胞等受运动神经元支配的非神经元细胞。此环境提供由神经元
内吞并经由逆行轴突运输运输至细胞体的营养及生长因子(Chao(2003)Neuron 39:1-2；
Holzbaur，见上文)。
此，ALS可用通过提供最佳存活环境来使变性神经元恢复活力的疗法来治疗。神经环境包
括诸如神经胶质及肌肉细胞等受运动神经元支配的非神经元细胞。此环境提供由神经元
内吞并经由逆行轴突运输运输至细胞体的营养及生长因子(Chao(2003)Neuron 39:1-2；
Holzbaur，见上文)。
[0016] FALS已通过突变体SOD1的过表达在小鼠及大鼠二者中建模(Howland等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.U.S.A.99:1604-09)。过表达突变体SOD1的G93A形式的转基
因小鼠截至90至100日龄时显示肌肉无力及萎缩，且通常在接近130日龄时死亡(Gurney
等人(1994)Science 264:1772-75)。然而，潜在的SODG93A诱导的病理(其包括握力减弱
及神经肌肉接点损失)早在50日龄时即显著(Frey等人(2000)J.Neurosci.20:2534-42；
Fisher等人(2004)Exp.Neuro.185:232-40；Ligon等人(2005)NeuroReport 16:533-36；
Wooley等人(2005)Muscle Nerve 32:43-50)。表达SODG93A突变的转基因大鼠遵循类似
的变性时程(Howland等人，见上文)。近期研究已表明，病理的发展并非细胞自主性，此与以下假设相同：在ALS中观察到的运动神经元变性经由多种机制而发生，包括运动神经元
破坏营养因子的摄取及运输(见上文)。Clement及合作者使用嵌合小鼠显示，野生型非
神经元细胞可延长表达突变体SOD1的运动神经元的存活(Clement等人(2003)Science
302:113-17)。这些观察已促使人们研究可能通过提供最佳存活微环境来减慢神经元变性
的疗法。例如，经由直接肌内注射病毒表达的生长因子(包括IGF-1、GDNF及VEGF)治疗
SODG93A小鼠延长动物存活(Kaspar等人(2003)Science301:839-42；Azzouz等人(2004)
Nature 429:413-17；Wang等人(2002)J.Neurosci.22:6920-28)。另外，在SODG93A转基因
小鼠模型中，局部IGF-1特异性同种型(mIGF-1)的肌肉特异性表达稳定神经肌肉接点，促
进运动神经元存活且延迟疾病的发作及进展，表明在转基因SOD1动物中，对肌肉的直接效
应可影响疾病发作及进展(Dobrowolny等人(2005)J.Cell Biol.168:193-99)。也已在ALS
小鼠中报导肌肉高代谢与运动神经元易损性之间的关联，从而支持肌肉缺陷可促进疾病病
因的假设(Dupois等人(2004)Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.101:11159-64)。因此，促进肌
肉生长应可改良对运动神经元的局部支持，并因此产生治疗益处。
因小鼠截至90至100日龄时显示肌肉无力及萎缩，且通常在接近130日龄时死亡(Gurney
等人(1994)Science 264:1772-75)。然而，潜在的SODG93A诱导的病理(其包括握力减弱
及神经肌肉接点损失)早在50日龄时即显著(Frey等人(2000)J.Neurosci.20:2534-42；
Fisher等人(2004)Exp.Neuro.185:232-40；Ligon等人(2005)NeuroReport 16:533-36；
Wooley等人(2005)Muscle Nerve 32:43-50)。表达SODG93A突变的转基因大鼠遵循类似
的变性时程(Howland等人，见上文)。近期研究已表明，病理的发展并非细胞自主性，此与以下假设相同：在ALS中观察到的运动神经元变性经由多种机制而发生，包括运动神经元
破坏营养因子的摄取及运输(见上文)。Clement及合作者使用嵌合小鼠显示，野生型非
神经元细胞可延长表达突变体SOD1的运动神经元的存活(Clement等人(2003)Science
302:113-17)。这些观察已促使人们研究可能通过提供最佳存活微环境来减慢神经元变性
的疗法。例如，经由直接肌内注射病毒表达的生长因子(包括IGF-1、GDNF及VEGF)治疗
SODG93A小鼠延长动物存活(Kaspar等人(2003)Science301:839-42；Azzouz等人(2004)
Nature 429:413-17；Wang等人(2002)J.Neurosci.22:6920-28)。另外，在SODG93A转基因
小鼠模型中，局部IGF-1特异性同种型(mIGF-1)的肌肉特异性表达稳定神经肌肉接点，促
进运动神经元存活且延迟疾病的发作及进展，表明在转基因SOD1动物中，对肌肉的直接效
应可影响疾病发作及进展(Dobrowolny等人(2005)J.Cell Biol.168:193-99)。也已在ALS
小鼠中报导肌肉高代谢与运动神经元易损性之间的关联，从而支持肌肉缺陷可促进疾病病
因的假设(Dupois等人(2004)Proc.Natl.Acad Sci.U.S.A.101:11159-64)。因此，促进肌
肉生长应可改良对运动神经元的局部支持，并因此产生治疗益处。
[0017] 抑制肌肉生长抑制素表达导致肌肉肥大及增生(Lee及McPherron，见上文；McPherron等人，见上文)。肌肉生长抑制素负向调节损伤后的肌肉再生，且在GDF-8无
效小鼠中，缺少肌肉生长抑制素导致肌肉再生加速(McCroskery等人，(2005)J.Cell.
Sci.118:3531-41)。肌肉生长抑制素中和抗体增加野生型小鼠(Whittemore等人(2003)
Biochem.Biophys.Res.Commun.300:965-71)及mdx小鼠(肌营养不良模型，Bogdanovich
等人(2002)Nature420:418-21；Wagner等人(2002)Ann.Neurol.52:832-36)的体重、骨骼
肌质量以及骨骼肌的肌肉大小及强度。此外，在这些小鼠中，肌肉生长抑制素抗体降低对膈膜(在ALS发病期间也被靶向的肌肉)的损伤。有假设诸如HGF等生长因子对肌肉的作用
可以是由于抑制肌肉生长抑制素表达所致(McCroskery等人(2005)，见上文)，由此帮助
向上移动再生与变性之间的“推拉(push and pull)”或平衡。因此，GDF-8抑制作为治疗
ALS、肌营养不良(MD)及其它期望增加肌肉质量、强度、大小等的GDF-8相关病症(例如神
经肌肉病症)的潜在药理学靶存在。由于可获得ALS的多种动物模型(小鼠及大鼠)，可在
两种不同物种中测试治疗剂，由此提高人类体内治疗效果的可信度。
效小鼠中，缺少肌肉生长抑制素导致肌肉再生加速(McCroskery等人，(2005)J.Cell.
Sci.118:3531-41)。肌肉生长抑制素中和抗体增加野生型小鼠(Whittemore等人(2003)
Biochem.Biophys.Res.Commun.300:965-71)及mdx小鼠(肌营养不良模型，Bogdanovich
等人(2002)Nature420:418-21；Wagner等人(2002)Ann.Neurol.52:832-36)的体重、骨骼
肌质量以及骨骼肌的肌肉大小及强度。此外，在这些小鼠中，肌肉生长抑制素抗体降低对膈膜(在ALS发病期间也被靶向的肌肉)的损伤。有假设诸如HGF等生长因子对肌肉的作用
可以是由于抑制肌肉生长抑制素表达所致(McCroskery等人(2005)，见上文)，由此帮助
向上移动再生与变性之间的“推拉(push and pull)”或平衡。因此，GDF-8抑制作为治疗
ALS、肌营养不良(MD)及其它期望增加肌肉质量、强度、大小等的GDF-8相关病症(例如神
经肌肉病症)的潜在药理学靶存在。由于可获得ALS的多种动物模型(小鼠及大鼠)，可在
两种不同物种中测试治疗剂，由此提高人类体内治疗效果的可信度。
[0018] 除了人类的神经肌肉病症以外，还存在与骨丢失相关的生长因子相关状况，例如骨质疏松和骨关节炎，其主要影响老人和/或停经后女性。另外，代谢性骨疾病及病症包括由于长期糖皮质素疗法、性腺早衰、雄激素抑制、维生素D缺乏、继发性甲状旁腺功能亢进、营养缺乏及神经性厌食症所致的低骨量。尽管这些状况的多种当前疗法通过抑制骨再吸收
来发挥作用，但促进骨形成的疗法可以是有用的替代性治疗。由于GDF-8在骨发育以及肌
肉发育中起作用，GDF-8的调节也是治疗骨变性病症的极佳药理学靶。
来发挥作用，但促进骨形成的疗法可以是有用的替代性治疗。由于GDF-8在骨发育以及肌
肉发育中起作用，GDF-8的调节也是治疗骨变性病症的极佳药理学靶。
[0019] 除了其他生物效应，特异性拮抗GDF-8的鼠类单克隆抗体先前描述为在ALS的啮齿动物模型中增加肌肉质量及强度(Holzbaur,EL等人，Myostatin inhibition slows
muscle atrophy in rodent models of amyotrophic lateral sclerosis,Neurobiology
of Disease(2006)23(3):697-707)。因此预期在ALS患者以及在受其它特征为过量GDF-8
或由其介导的疾病及病症(例如上述的那些)影响的患者中，小鼠抗体及其人源化对应体
可有效增加肌肉质量及强度。
muscle atrophy in rodent models of amyotrophic lateral sclerosis,Neurobiology
of Disease(2006)23(3):697-707)。因此预期在ALS患者以及在受其它特征为过量GDF-8
或由其介导的疾病及病症(例如上述的那些)影响的患者中，小鼠抗体及其人源化对应体
可有效增加肌肉质量及强度。
[0020] 上文所提及的人源化版本的小鼠抗GDF-8抗体(如多种单克隆抗体及其它基于蛋白质的治疗剂)的制造困难且昂贵，因其制造通常需要在活哺乳动物细胞中进行生产。因
此，提高该抗体或其它具有类似特异性的抗体的产率允许以较少投入产生等量活性药物。
这将具有双重益处，即在降低制造成本的同时释放有限的制造设施用于生产其它生物药
物。两种益处均都会促进达成提高治疗性抗GDF-8抗体以及其它生物制剂对于患者的可用
性的目标。因此，本领域需要在哺乳动物细胞中具有较高产率的抗GDF-8抗体的改良形式。
此，提高该抗体或其它具有类似特异性的抗体的产率允许以较少投入产生等量活性药物。
这将具有双重益处，即在降低制造成本的同时释放有限的制造设施用于生产其它生物药
物。两种益处均都会促进达成提高治疗性抗GDF-8抗体以及其它生物制剂对于患者的可用
性的目标。因此，本领域需要在哺乳动物细胞中具有较高产率的抗GDF-8抗体的改良形式。
发明内容
[0022] 在某些实施方案中，这些抗体具有重链可变(VH)区，其中CDR1由氨基酸序列SEQID NO:10或SEQ ID NO:20限定，CDR2由氨基酸序列SEQ ID NO:11或SEQ ID NO:21限定，
CDR3由氨基酸序列SEQ ID NO:12限定，且其中VH区经修饰以使得在Kabat位置108的氨
基酸是亮氨酸而非甲硫氨酸。在其它实施方案中，这些抗体具有包含相同CDR的VH区，且
其中VH区的第四框架区包含SEQ ID NO:44的氨基酸106-116。在这些抗体的其它实施方
案中，CDR接枝至人类生殖细胞VH基因区段DP-47上然后与JH4人类重链J区段基因连接。
在其它实施方案中，这些抗体的VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:44。
CDR3由氨基酸序列SEQ ID NO:12限定，且其中VH区经修饰以使得在Kabat位置108的氨
基酸是亮氨酸而非甲硫氨酸。在其它实施方案中，这些抗体具有包含相同CDR的VH区，且
其中VH区的第四框架区包含SEQ ID NO:44的氨基酸106-116。在这些抗体的其它实施方
案中，CDR接枝至人类生殖细胞VH基因区段DP-47上然后与JH4人类重链J区段基因连接。
在其它实施方案中，这些抗体的VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:44。
[0023] 在Kabat位置108具有亮氨酸的本发明抗体(例如上文所例示的那些)的特征在于表达水平与在相同位置存在甲硫氨酸的形式相比有所提高。在某些实施方案中，前一形
式在类似条件下的表达水平比后一形式高大于约50％、100％、150％、200％、250％、300％、
400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、1200％、1400％、1600％、1800％或甚至
2000％的量。
式在类似条件下的表达水平比后一形式高大于约50％、100％、150％、200％、250％、300％、
400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、1200％、1400％、1600％、1800％或甚至
2000％的量。
[0024] 根据本发明抗体的其它实施方案，前一段落中描述的VH区可与轻链可变(VL)区配对，在所述轻链可变(VL)区中CDR1由氨基酸序列SEQ ID NO:13限定，CDR2由氨基酸
序列SEQ ID NO:14限定，CDR3由氨基酸序列SEQ ID NO:15限定，且其中VL区中Kabat位
置100的氨基酸是甘氨酸或谷氨酰胺。在其它实施方案中，VH区与VL区配对，在所述VL
区中轻链CDR接枝至人类生殖细胞VL基因区段DPK-9然后与JK4人类轻链J区段基因连
接。根据这些抗体的一些其它实施方案，先前所述的VH区与VL区配对，这些VL区具有先
前所述的VL区CDR且其中VL区的第四框架区包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:46的氨基
酸98-107。在其它实施方案中，先前所述的VH区与VL区配对，这些VL区包含氨基酸序列
SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:46。
序列SEQ ID NO:14限定，CDR3由氨基酸序列SEQ ID NO:15限定，且其中VL区中Kabat位
置100的氨基酸是甘氨酸或谷氨酰胺。在其它实施方案中，VH区与VL区配对，在所述VL
区中轻链CDR接枝至人类生殖细胞VL基因区段DPK-9然后与JK4人类轻链J区段基因连
接。根据这些抗体的一些其它实施方案，先前所述的VH区与VL区配对，这些VL区具有先
前所述的VL区CDR且其中VL区的第四框架区包含SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:46的氨基
酸98-107。在其它实施方案中，先前所述的VH区与VL区配对，这些VL区包含氨基酸序列
SEQ ID NO:9或SEQ ID NO:46。
[0025] 在一些其它实施方案中，上文所述VH区连接至来自人类抗体亚型(包括IgA、IgG、IgD、IgE或IgM)的重链恒定区。如果重链恒定区来自IgG，则在其它实施方案中，抗体重链恒定区来自IgG1、IgG2、IgG3或IgG4的IgG亚型。重链恒定区可经修饰以例如消除一或多种Fc结构域效应子功能，如SEQ ID NO:57中所例示。在其它实施方案中，上文所述VL区
连接至可以具有λ或κ亚型的轻链恒定区。
连接至可以具有λ或κ亚型的轻链恒定区。
[0026] 根据其它实施方案，SEQ ID NO:44的VH区与氨基酸序列SEQ ID NO:57的经修饰重链区连接以产生氨基酸序列SEQ ID NO:58的全长抗体重链。相反，在其它实施方案中，
SEQ ID NO:46的VL区可与氨基酸序列SEQ ID NO:17的κ恒定轻链连接以产生氨基酸序列
SEQ ID NO:59的全长抗体轻链。在其它实施方案中，每一全长抗体重链和轻链的两个继而
可组合以产生具有两个抗原结合位点的抗GDF-8抗体。在其它实施方案中，抗体可包含这
些全长大小的完整抗体的片段或衍生物，包括例如Fab、F(ab’)2、scFv、scFv-Fc、scFv-CH、scFab、scFv-拉链、双抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、Fv及双特异性抗体。
SEQ ID NO:46的VL区可与氨基酸序列SEQ ID NO:17的κ恒定轻链连接以产生氨基酸序列
SEQ ID NO:59的全长抗体轻链。在其它实施方案中，每一全长抗体重链和轻链的两个继而
可组合以产生具有两个抗原结合位点的抗GDF-8抗体。在其它实施方案中，抗体可包含这
些全长大小的完整抗体的片段或衍生物，包括例如Fab、F(ab’)2、scFv、scFv-Fc、scFv-CH、scFab、scFv-拉链、双抗体、三链抗体、四链抗体、微型抗体、Fv及双特异性抗体。
[0027] 本发明抗体可对GDF-8具有一定范围的结合亲和性，例如约5000nM或甚至更高，例如至少 约4000nM、3000nM、2000nM、1000nM、900nM、800nM、700nM、600nM、500nM、400nM、
300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、
6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM。
300nM、200nM、100nM、90nM、80nM、70nM、60nM、50nM、40nM、30nM、25nM、20nM、15nM、10nM、7nM、
6nM、5nM、4nM、3nM、2nM、1nM、0.1nM、0.01nM或0.001nM。
[0028] 本发明还提供编码抗GDF-8抗体的核酸，以及包含这些核酸序列的表达载体，以及用于表达这些抗体的宿主细胞。
[0029] 本发明还提供用于治疗或预防患者中特征为肌肉质量或强度减小的肌肉病症的方法。这些方法通过向需要治疗或预防这些病症的患者施用治疗或预防有效量的包含特异
性结合GDF-8的抗体或其抗原结合片段的组合物来实施。用于这些方法的抗体包括上文及
本发明全文中描述的那些抗体。
性结合GDF-8的抗体或其抗原结合片段的组合物来实施。用于这些方法的抗体包括上文及
本发明全文中描述的那些抗体。
[0030] 根据某些实施方案，本发明抗体组合物可以治疗或预防有效量施用给需要治疗或预防肌肉病症的患者，所述肌肉病症包括选自以下的病症：肌营养不良、肌萎缩、少肌症、恶病质、肌肉耗损综合征、年龄相关性肌肉质量或强度损失及衰弱症。在其它实施方案中，肌肉病症是由癌症引起的恶病质。在其它实施方案中，肌肉病症是杜兴肌营养不良。在后一
情况的某些实施方案中，施用抗GDF-8抗体可有效改良患者在6分钟步行测试中的表现。
情况的某些实施方案中，施用抗GDF-8抗体可有效改良患者在6分钟步行测试中的表现。
[0031] 在一些实施方案中，通过在有效治疗肌营养不良的另一药剂之前、同时或之后施用包含本发明抗体的组合物还可用于治疗患有肌营养不良(例如杜兴肌营养不良)的患
者。在某些实施方案中，该药剂是糖皮质素，例如强的松(prednisone)。
者。在某些实施方案中，该药剂是糖皮质素，例如强的松(prednisone)。
[0032] 还提供通过以有效增加哺乳动物的肌肉质量或强度的量向哺乳动物施用包含本发明抗GDF-8抗体的组合物来增加哺乳动物的肌肉质量或强度的方法。在多个实施方案
中，肌肉是骨骼肌(包括一或多种在呼吸中发挥作用的骨骼肌)或心肌。
中，肌肉是骨骼肌(包括一或多种在呼吸中发挥作用的骨骼肌)或心肌。
[0033] 还提供通过向需要治疗或预防神经肌肉病症的对象施用治疗或预防有效量的本发明抗GDF-8抗体来治疗或预防神经肌肉病症的方法。在某些实施方案中，欲治疗或预防
的神经肌肉病症是ALS。
的神经肌肉病症是ALS。
[0034] 还提供通过向需要治疗或预防代谢紊乱的对象施用治疗或预防有效量的本发明抗GDF-8抗体来治疗或预防代谢紊乱的方法。在多个实施方案中，欲治疗或预防的代谢紊
乱包括2型糖尿病、代谢综合征、综合征X、胰岛素抵抗及葡萄糖耐量降低。
乱包括2型糖尿病、代谢综合征、综合征X、胰岛素抵抗及葡萄糖耐量降低。
[0035] 还提供通过向需要治疗或预防脂肪组织病症的对象施用治疗或预防有效量的本发明抗GDF-8抗体来治疗或预防脂肪组织病症的方法。在多个实施方案中，欲治疗或预防
的脂肪组织病症包括肥胖症及异常高身体质量指数。
的脂肪组织病症包括肥胖症及异常高身体质量指数。
[0036] 还提供通过向需要治疗或预防骨丢失病症的对象施用治疗或预防有效量的本发明抗GDF-8抗体来治疗或预防骨丢失病症的方法。在多个实施方案中，欲治疗或预防的骨
丢失病症包括骨质疏松、骨质减少、骨关节炎及骨质疏松相关性骨折。
丢失病症包括骨质疏松、骨质减少、骨关节炎及骨质疏松相关性骨折。
[0037] 在一些其它实施方案中，可用于本发明方法中的抗GDF-8抗体包括与有用地改变其功能或特征(例如，但不限于增加血清半衰期)的部分缀合的抗体。在其它实施方案中，
可出于类似目的或其它目的来实现氨基酸变化。
可出于类似目的或其它目的来实现氨基酸变化。
[0038] 用于本发明方法中的抗体组合物可制备为不同剂型，包括但不限于水性悬浮液，用于通过多种途径施用，这些途径包括但不限于皮下施用、静脉内施用、肌内施用、腹膜内施用、输注施用或推注施用。
[0039] 在一些实施方案中，本发明抗GDF-8抗体的有效剂量在0.001mg/kg至约250mg/kg范围内，其可在一次施用中或在多次间隔施用中给予。
[0040] 本发明还提供由临床医师及其他人员用于帮助将抗GDF-8抗体组合物施用给患者的药物试剂盒。在一些实施方案中，试剂盒包括冻干形式或水溶液的本发明抗GDF-8抗
体、稀释剂(例如药物级水或缓冲液)及用于施用抗前胃泌素抗体的装置(例如注射器及
针)。在其它实施方案中，试剂盒可另外包括第二治疗剂。
体、稀释剂(例如药物级水或缓冲液)及用于施用抗前胃泌素抗体的装置(例如注射器及
针)。在其它实施方案中，试剂盒可另外包括第二治疗剂。
[0042] 图1A提供来自某些本发明抗GDF-8抗体的VH区的氨基酸序列的比对，这些VH区包括鼠类抗体VH区及通过将鼠类重链CDR接枝至人类生殖细胞系VH区DP-47中产生的两
个人源化抗体VH区(即，VH0和VH1)。另外提供进一步人源化VH区VH2-VH5的氨基酸序
列的比对。重链CDR的氨基酸序列使用粗体加下划线字型突出显示。在Kabat位置108的
氨基酸使用星号下方的粗体字型突出显示。
个人源化抗体VH区(即，VH0和VH1)。另外提供进一步人源化VH区VH2-VH5的氨基酸序
列的比对。重链CDR的氨基酸序列使用粗体加下划线字型突出显示。在Kabat位置108的
氨基酸使用星号下方的粗体字型突出显示。
[0043] 图1B提供来自某些本发明抗GDF-8抗体的VL区的氨基酸序列的比对，这些VL区包括鼠类抗体VL区及通过将鼠类轻链CDR接枝至人类生殖细胞系VL区DPK-9中产生的两
种人源化抗体VL区(即，VL0和VL1)。另外提供进一步人源化VL区VL2-VL5的氨基酸序
列的比对。轻链CDR的氨基酸序列使用粗体加下划线字型突出显示。在Kabat位置100的
氨基酸使用星号下方的粗体字型突出显示。
种人源化抗体VL区(即，VL0和VL1)。另外提供进一步人源化VL区VL2-VL5的氨基酸序
列的比对。轻链CDR的氨基酸序列使用粗体加下划线字型突出显示。在Kabat位置100的
氨基酸使用星号下方的粗体字型突出显示。
[0044] 图2A提供显示来自经10mg/kg OGD1.0.0抗体治疗两周的C57Bl/6小鼠的腓肠肌(GAS)及四头肌(QUAD)质量与媒介物对照相比的增加的图表。图2B以经OGD1.0.0抗体治
疗的小鼠的肌肉质量相对于对照的增加百分比报告图2A中的相同数据。图2B另外显示来
自同组抗体治疗小鼠及对照小鼠的趾长伸肌(EDL)的肌肉质量的增加百分比。
疗的小鼠的肌肉质量相对于对照的增加百分比报告图2A中的相同数据。图2B另外显示来
自同组抗体治疗小鼠及对照小鼠的趾长伸肌(EDL)的肌肉质量的增加百分比。
[0045] 图3提供显示由来自经10mg/kg OGD1.0.0抗体治疗两周的C57Bl/6小鼠的EDL肌肉生成的总强直性张力与媒介物对照相比的增加的图表。
[0046] 图4A提供显示来自经PBS媒介物和0.3、1、3、10及30mg/kg OGD1.0.0抗体每周一次治疗4周的C57Bl/6小鼠的腓肠肌(Gastroc)及四头肌(Quad)质量的剂量反应性增
加的图表。数据代表在4周结束时测量的肌肉质量。图4B以经OGD1.0.0抗体治疗的小鼠
的腓肠肌及四头肌质量相对于对照的增加百分比报告图4A中的相同数据。
加的图表。数据代表在4周结束时测量的肌肉质量。图4B以经OGD1.0.0抗体治疗的小鼠
的腓肠肌及四头肌质量相对于对照的增加百分比报告图4A中的相同数据。
[0047] 图5A提供显示经PBS媒介物和0.3、1、3、10及30mg/kg OGD1.0.0抗体每周一次治疗4周的C57Bl/6小鼠的全身瘦肉质量(lean mass)的剂量反应性增加的图表。数据代
表在4周中每周结束时测量的瘦肉质量。图5B提供显示经PBS媒介物和0.3、1、3、10及
30mg/kg OGD1.0.0抗体每周一次治疗4周的C57Bl/6小鼠在4周研究结束时全身瘦肉质量
的增加的图表。
表在4周中每周结束时测量的瘦肉质量。图5B提供显示经PBS媒介物和0.3、1、3、10及
30mg/kg OGD1.0.0抗体每周一次治疗4周的C57Bl/6小鼠在4周研究结束时全身瘦肉质量
的增加的图表。
[0048] 图6A提供显示经10mg/kg OGD1.0.0抗体每周一次治疗8周的mdx小鼠的全身瘦肉质量相对于施用PBS媒介物的对照mdx小鼠的增加的图表。图6B提供显示经10mg/kg
OGD1.0.0抗体每周一次治疗8周的mdx小鼠的最大峰值握力相对于施用PBS媒介物的对照
mdx小鼠的增加的图表。
OGD1.0.0抗体每周一次治疗8周的mdx小鼠的最大峰值握力相对于施用PBS媒介物的对照
mdx小鼠的增加的图表。
[0049] 图7A提供显示来自经10mg/kg OGD1.0.0抗体每周一次治疗8周的mdx小鼠及C57Bl/6小鼠的腓肠肌及四头肌质量相对于施用PBS媒介物的对照小鼠的增加的图表。数
据代表在8周结束时测量的肌肉质量。图7B以经OGD1.0.0抗体治疗的mdx小鼠的腓肠肌
及四头肌质量相对于对照的增加百分比报告图7A中的相同数据。
据代表在8周结束时测量的肌肉质量。图7B以经OGD1.0.0抗体治疗的mdx小鼠的腓肠肌
及四头肌质量相对于对照的增加百分比报告图7A中的相同数据。
[0050] 图8提供显示经0、3、10及30mg/kg OGD1.0.0抗体治疗的食蟹猴中全身瘦肉质量及腿部瘦肉质量的剂量反应性增加的图表。
[0051] 图9提供显示经10mg/kg及30mg/kg OGD1.0.0抗体治疗的食蟹猴的全身瘦肉质量的增加在抗体治疗中断后仍持续数周的图表。
[0052] 图10A提供显示经10mg/kg及30mg/kg OGD1.0.0抗体治疗8周的食蟹猴中覆盖L3-L5椎骨的轴上肌体积相对于施用PBS媒介物的对照动物有所增加的图表。
[0053] 图11提供在4周的OGD1.0.0抗体治疗之前及之后来自实例性动物对象的轴上肌的3D呈像。
[0054] 图12A提供含有在本文中称作VH0的重链可变区的实例性抗GDF-8抗体重链的氨基酸序列。
[0055] 图12B提供含有在本文中称作VL0的轻链可变区的实例性抗GDF-8抗体轻链的氨基酸序列。
[0056] 详细说明
[0057] 本发明提供人源化抗GDF-8抗体的改良形式，其能在细胞中以与所述抗体的先前形式相比显著较高的水平表达。因此，预期本文所述抗GDF-8抗体的改良形式与先前形式
相比能在相同投入下以更大量及更低商品成本来产生。本发明还描述使用改良抗体进行治
疗或预防的各种方法。因此，在某些实例性非限制性实施方案中，改良的抗GDF-8抗体可用于治疗肌营养不良、恶病质及其它病症，其中增加对象的肌肉质量或强度预期产生治疗益
处。
相比能在相同投入下以更大量及更低商品成本来产生。本发明还描述使用改良抗体进行治
疗或预防的各种方法。因此，在某些实例性非限制性实施方案中，改良的抗GDF-8抗体可用于治疗肌营养不良、恶病质及其它病症，其中增加对象的肌肉质量或强度预期产生治疗益
处。
[0058] 抗体结构及多样性
[0059] 如本文所用，术语抗体是指完整免疫球蛋白(Ig)或其任意抗原结合片段、部位(part)或部分(portion)，并尤其涵盖任何包含完整或部分抗原结合位点且保留至少一定
抗原结合特异性的多肽。抗体还可以指衍生自完整抗体的抗原结合片段、部位或部分与另
一分子(包括不同抗体、来自Ig超家族的蛋白质或并非源于免疫系统的蛋白质或其它类型
的分子)的组合。这些抗体衍生物可包括非蛋白质性部分(portion)或部分(moiety)。
抗原结合特异性的多肽。抗体还可以指衍生自完整抗体的抗原结合片段、部位或部分与另
一分子(包括不同抗体、来自Ig超家族的蛋白质或并非源于免疫系统的蛋白质或其它类型
的分子)的组合。这些抗体衍生物可包括非蛋白质性部分(portion)或部分(moiety)。
[0060] 抗原指能被抗体特异性结合的物质、蛋白质或其它。抗原可具有一个以上抗原决定簇或表位，其是抗原中被抗体结合的部分。
[0061] 免疫球蛋白(Ig)是异四聚蛋白质，其包含两条各自约50kDa的重链及两条各自约25kDa的轻链。每条链包含多个Ig结构域。自氨基末端开始，重链含有单一可变区(VH)，
根据Ig亚型，之后是三个或四个称作CH1、CH2、CH3及(在存在时)CH4的恒定区。类似地，
在轻链中，单一可变区(VL)位于多肽的氨基末端，之后是单一恒定区(CL)。在CH1与CH2
区之间是长度可变的铰链区，根据同种型，其给予分子挠性。CH1的重链羧基末端(包括铰
链)、CH2、CH3及(在存在时)CH4构成Fc区。每一可变区或恒定区包含单一Ig结构域。
根据Ig亚型，之后是三个或四个称作CH1、CH2、CH3及(在存在时)CH4的恒定区。类似地，
在轻链中，单一可变区(VL)位于多肽的氨基末端，之后是单一恒定区(CL)。在CH1与CH2
区之间是长度可变的铰链区，根据同种型，其给予分子挠性。CH1的重链羧基末端(包括铰
链)、CH2、CH3及(在存在时)CH4构成Fc区。每一可变区或恒定区包含单一Ig结构域。
[0062] Ig轻链经由二硫键结合至Ig重链，且Ig重链对经由二硫键彼此结合。非共价相互作用还可有助于稳定重链和轻链之间及配对重链之间的链间四级结构。在完整Ig分子
中，配对重链和轻链的VH及VL区的位置彼此相邻且相互作用并合作形成抗原结合位点。因
为完整Ig分子含有两对配对重链和轻链，即总计两条重链及两条轻链，Ig分子含有两个抗
原结合位点。铰链区的存在使抗原结合位点与分子的其余部分之间具有挠性。
中，配对重链和轻链的VH及VL区的位置彼此相邻且相互作用并合作形成抗原结合位点。因
为完整Ig分子含有两对配对重链和轻链，即总计两条重链及两条轻链，Ig分子含有两个抗
原结合位点。铰链区的存在使抗原结合位点与分子的其余部分之间具有挠性。
[0063] 重链和轻链恒定区不直接参与抗原识别。然而，重链尤其Fc区含有能与免疫系统的效应子分子及细胞相互作用的序列，从而使得重链恒定区介导Ig分子的重要的生物学
功能。
功能。
[0064] 重链和轻链的可变区含有三个氨基酸差异性增强的间隔区域(称作超变区或互补决定区(CDR))，其与CDR周围保守性更高的框架区(FR)相比在不同Ig分子之间广泛变
化。自可变区的氨基末端起，FR及CDR的连续顺序和编号是FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。框架区主要负责决定可变区Ig结构域的三级结构。与之相比，CDR形成自每一可
变区向外延伸的环。相邻VH及VL区的CDR合作形成抗原结合表面，其主要负责限定具体
Ig分子的抗原结合特异性。
化。自可变区的氨基末端起，FR及CDR的连续顺序和编号是FR1、CDR1、FR2、CDR2、FR3、CDR3及FR4。框架区主要负责决定可变区Ig结构域的三级结构。与之相比，CDR形成自每一可
变区向外延伸的环。相邻VH及VL区的CDR合作形成抗原结合表面，其主要负责限定具体
Ig分子的抗原结合特异性。
[0065] 研究抗体结构及功能的研究者已研发出不同方案来鉴别存于任何具体VH或VL区的氨基酸序列内的重链和轻链CDR。这些方案中的多者根据与重链和轻链可变区的周围框
架相关的不变或几乎不变的模式鉴别CDR。然后使用对应于其组成残基在VH及VL区范围
内的位置的数字范围来限定CDR。因为CDR、尤其第三CDR的长度可变，方案有时还使用字
母来限定组成残基。第一种这些方案中的一个称为Kabat编号系统，其基于比对随后已知
的VH及VL序列以确定可变CDR子序列在保守性更高的框架区范围内的位置。用于限定
CDR的其它方案包括AbM编号系统及Chothia编号系统。其它方案也有可能。例如，可将
CDR限定为那些接触抗原的可变区残基，即使这些残基不完全符合CDR的更正式的限定(例
如Kabat或Chothia编号方案)。例如，参见Y.Ofran等人，Automated identification
of complementarity determining regions(CDRs)reveals peculiar characteristics
of CDRs and B cell epitopes,J Immunol.2008年11月1日；181(9):6230-5，其以引用
方式并入。Kabat编号方案及某些其它抗体编号方案更详细地描述于(例如)Handbook
of Therapeutic Antibodies(2007)，Stefan Dubel 编 辑，Wiley-VCH Verlag GmbH &
Co.KgaA,Weinheim，其以引用方式并入。
架相关的不变或几乎不变的模式鉴别CDR。然后使用对应于其组成残基在VH及VL区范围
内的位置的数字范围来限定CDR。因为CDR、尤其第三CDR的长度可变，方案有时还使用字
母来限定组成残基。第一种这些方案中的一个称为Kabat编号系统，其基于比对随后已知
的VH及VL序列以确定可变CDR子序列在保守性更高的框架区范围内的位置。用于限定
CDR的其它方案包括AbM编号系统及Chothia编号系统。其它方案也有可能。例如，可将
CDR限定为那些接触抗原的可变区残基，即使这些残基不完全符合CDR的更正式的限定(例
如Kabat或Chothia编号方案)。例如，参见Y.Ofran等人，Automated identification
of complementarity determining regions(CDRs)reveals peculiar characteristics
of CDRs and B cell epitopes,J Immunol.2008年11月1日；181(9):6230-5，其以引用
方式并入。Kabat编号方案及某些其它抗体编号方案更详细地描述于(例如)Handbook
of Therapeutic Antibodies(2007)，Stefan Dubel 编 辑，Wiley-VCH Verlag GmbH &
Co.KgaA,Weinheim，其以引用方式并入。
[0066] 重链和轻链可变区的CDR内的氨基酸接触抗原中的残基且主要负责限定抗体对抗原的结合特异性。根据所研究的抗体-抗原对，所有或少于所有的CDR残基可直接接触
抗原。此外，某些接触可比其它接触更有助于限定特异性和/或亲和性。
抗原。此外，某些接触可比其它接触更有助于限定特异性和/或亲和性。
[0067] 抗体及抗原中的接触残基的身份可使用x射线结晶学或其它本领域技术人员已知的方法来测定。这些接触残基的突变通常(但并非总是)会对抗原结合特异性和/或亲
和性造成负面影响。相反，可能使非接触CDR残基以及FR残基突变且不显著影响抗原结合
特异性或亲和性。尽管预期保守氨基酸变化更可能保留抗原结合特异性及亲和性，但任何
具体CDR或框架突变的实际效果可使用本领域技术人员熟悉的技术根据经验来确定。
和性造成负面影响。相反，可能使非接触CDR残基以及FR残基突变且不显著影响抗原结合
特异性或亲和性。尽管预期保守氨基酸变化更可能保留抗原结合特异性及亲和性，但任何
具体CDR或框架突变的实际效果可使用本领域技术人员熟悉的技术根据经验来确定。
[0068] 尽管VH及VL区中通过其各自框架区支撑的CDR通常负责建立抗原结合特异性及亲和性，但可能有例外。例如，在某些Ig分子中，FR残基可能还有助于抗原结合，而在某些其它Ig分子中，一或多个CDR可能不直接接触抗原。此外，在其它Ig分子中，分离VH区及
VL区的CDR即使在不存在通常会与其配对的相应可变区时还可具有显著的抗原结合特异
性。某些分离Ig分子可变区特异性结合抗原的能力类似于鲨鱼或骆驼抗体的抗原结合特
异性，这些抗体包含配对重链，但不包含轻链。
VL区的CDR即使在不存在通常会与其配对的相应可变区时还可具有显著的抗原结合特异
性。某些分离Ig分子可变区特异性结合抗原的能力类似于鲨鱼或骆驼抗体的抗原结合特
异性，这些抗体包含配对重链，但不包含轻链。
[0069] 某些物种的Ig分子可根据不同同种型来分类。例如，在人类中，Ig同种型包括IgA、IgG、IgD、IgE及IgM。此外，IgA及IgG同种型可分类为多种亚型，其分别称作IgA1
及IgA2，以及IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。同种型及亚型依照重链恒定区氨基酸序列的差异
来限定。因此，不同同种型及亚型能与不同免疫细胞上的不同效应子分子相互作用，由此产生不同效应子功能。例如，IgA分子有助于黏膜免疫，而IgE分子有助于抗某些寄生虫的免
疫。IgM及IgE的重链含有四个串联排列的CH Ig结构域，其自氨基末端CH区开始编号为
CH1、CH2、CH3及CH4。然而，IgA、IgD及IgG仅含有三个串联排列的CH区。轻链恒定区包
含两个同种型(称作κ及λ)，其不具有已知生物学效应子功能。天然Ig分子将仅具有单
一轻链恒定区同种型。
及IgA2，以及IgG1、IgG2、IgG3及IgG4。同种型及亚型依照重链恒定区氨基酸序列的差异
来限定。因此，不同同种型及亚型能与不同免疫细胞上的不同效应子分子相互作用，由此产生不同效应子功能。例如，IgA分子有助于黏膜免疫，而IgE分子有助于抗某些寄生虫的免
疫。IgM及IgE的重链含有四个串联排列的CH Ig结构域，其自氨基末端CH区开始编号为
CH1、CH2、CH3及CH4。然而，IgA、IgD及IgG仅含有三个串联排列的CH区。轻链恒定区包
含两个同种型(称作κ及λ)，其不具有已知生物学效应子功能。天然Ig分子将仅具有单
一轻链恒定区同种型。
[0070] 表达抗体重链和轻链的基因在活体内经由称为V(D)J重组的多次基因重排来构建。此过程负责从位于基因组中的相当有限的基因序列库生成大型抗原结合蛋白质库。关
于此过程的更多信息描述于Abbas,A.K.、Lichtman,A.H.及Pillai,S.,2010,Cellular and Molecular Immunology，第6版，第8章，Saunders,Philadelphia,PA中，其全文以引用方
式并入。
于此过程的更多信息描述于Abbas,A.K.、Lichtman,A.H.及Pillai,S.,2010,Cellular and Molecular Immunology，第6版，第8章，Saunders,Philadelphia,PA中，其全文以引用方
式并入。
[0071] 在人类生殖细胞系DNA中，三个单独基因座编码构建免疫球蛋白重链、κ轻链及λ轻链所需的外显子。重链基因座位于染色体14上，κ链基因座位于染色体2上且λ链
基因座位于染色体22上。在每一基因座的5’端处具有多个可变(V)基因区段，每一区段
长约300个碱基对，其编码构成抗体重链和轻链可变区(包括第一及第二互补决定区(CDR1
及CDR2))的大部分氨基酸。在人类中，在重链基因座中有约100个V基因，在κ链基因座
中有约35个V基因，且在λ链基因座中有约30个V基因。V基因区段是通过内含子彼此
隔开。
基因座位于染色体22上。在每一基因座的5’端处具有多个可变(V)基因区段，每一区段
长约300个碱基对，其编码构成抗体重链和轻链可变区(包括第一及第二互补决定区(CDR1
及CDR2))的大部分氨基酸。在人类中，在重链基因座中有约100个V基因，在κ链基因座
中有约35个V基因，且在λ链基因座中有约30个V基因。V基因区段是通过内含子彼此
隔开。
[0072] 位于人类重链基因座及κ轻链基因座中的V区段下游及恒定(C)基因区段上游的是连接(J)区段的簇，其通常长约30-50个碱基对且彼此及与邻近V及C基因通过非编
码序列隔开。重链基因座在与不同Ig同种型相关的9个功能性C基因的上游含有6个功
能性J区段的簇，且κ轻链基因座在单一Cκ基因上游含有5个J区段的簇。人类λ轻链
基因座还含有4个功能性J区段，但各自定位于4个相应功能性Cλ基因中的一个的5’处。
人类重链基因座还含有定位于V基因下游及J区段簇上游的超过20个多样性(D)基因区
段的簇。两个轻链基因座均均不含D基因区段。
码序列隔开。重链基因座在与不同Ig同种型相关的9个功能性C基因的上游含有6个功
能性J区段的簇，且κ轻链基因座在单一Cκ基因上游含有5个J区段的簇。人类λ轻链
基因座还含有4个功能性J区段，但各自定位于4个相应功能性Cλ基因中的一个的5’处。
人类重链基因座还含有定位于V基因下游及J区段簇上游的超过20个多样性(D)基因区
段的簇。两个轻链基因座均均不含D基因区段。
[0073] 在成熟Ig轻链基因中，V区由V及J基因区段编码，而在Ig重链中，V区由V、J及D基因区段编码。重链和轻链中的CDR1及CDR2由V基因区段编码。然而，构建CDR3更复
杂。对于重链，CDR3由包括D及J区段及连接残基的VDJ接点编码。类似地，轻链的CDR3
由包括J区段及连接残基的VJ接点编码。
杂。对于重链，CDR3由包括D及J区段及连接残基的VDJ接点编码。类似地，轻链的CDR3
由包括J区段及连接残基的VJ接点编码。
[0074] 在不成熟B细胞中，所有V、D及J基因区段均单独位于生殖细胞系中且无法用于表达功能性Ig蛋白质。相反，随着B细胞成熟，这些基因区段经历称作V(D)J重组的复杂
的DNA重排过程，所述过程使随机选择的重链V、D及J基因区段或轻链V及J基因区段相
互接近。在V、D及J基因区段的连接期间，负责实施V(D)J重组的分子随机添加或移除区
段之间的核苷酸。以此方式，在成熟B细胞的基因组中生成完整可变区外显子，其随后与编码功能性Ig重链和轻链蛋白质的mRNA中的其它外显子(包括那些编码C区的外显子)组
合。
的DNA重排过程，所述过程使随机选择的重链V、D及J基因区段或轻链V及J基因区段相
互接近。在V、D及J基因区段的连接期间，负责实施V(D)J重组的分子随机添加或移除区
段之间的核苷酸。以此方式，在成熟B细胞的基因组中生成完整可变区外显子，其随后与编码功能性Ig重链和轻链蛋白质的mRNA中的其它外显子(包括那些编码C区的外显子)组
合。
[0075] 不同V、D及J基因区段随机组合构建V区外显子，以及在所连接基因区段之间随机添加或移除核苷酸是免疫系统生成高多样性抗原结合位点的两个重要机制。这些现象分
别称作组合多样性及连接多样性。因为CDR3自由V、D及J区段(对于重链)或V及J区
段(对于轻链)贡献的序列形成，连接多样性解释为何CDR3在三种CDR中可变性最高且通
常与抗原形成的接触最广泛。
别称作组合多样性及连接多样性。因为CDR3自由V、D及J区段(对于重链)或V及J区
段(对于轻链)贡献的序列形成，连接多样性解释为何CDR3在三种CDR中可变性最高且通
常与抗原形成的接触最广泛。
[0076] 由于Ig分子的结构基本上模块化，且不同区实施不同功能，因此可能制备保留GDF-8结合能力的抗GDF-8抗体的片段或衍生物。这些片段或衍生物涵盖于本文所用术语
抗体中。自Ig分子制备的抗原结合片段或衍生物的非限制性实例包括Fab片段，其是包含
VH、CH1、VL及CL区的单价片段；F(ab’)2，其是包含两个经由铰链区彼此连接的Fab的二
价片段；Fd片段，其包含VH及CH1区；Fv片段，其包含VL及VH区；dAb片段，其包含VH或
VL区。另一实例是单链Fv区(scFv)，其包含在单一多肽链中串联排列且通过允许可变区
结合并形成单价抗原结合位点的多肽接头间隔的VH及VL区。单链Fv区可经设计，其中VH
区在VL区之前，或另一选择为其中VL区在VH区之前。接头的非限制性实例是15个残基
(Gly4Ser)3的肽(SEQ ID NO:34)。其它接头也有可能。其它片段或衍生物包括Fab’、替代抗体(surrobody)、二硫键稳定的Fv抗体(dsFv)、双抗体、三链抗体及单结构域抗体(例如
鲨鱼抗体或骆驼化抗体或纳米抗体)。其它片段或衍生物也有可能。抗原结合片段、部位或部分(例如本文所述的那些)可以重组方式或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。
抗体中。自Ig分子制备的抗原结合片段或衍生物的非限制性实例包括Fab片段，其是包含
VH、CH1、VL及CL区的单价片段；F(ab’)2，其是包含两个经由铰链区彼此连接的Fab的二
价片段；Fd片段，其包含VH及CH1区；Fv片段，其包含VL及VH区；dAb片段，其包含VH或
VL区。另一实例是单链Fv区(scFv)，其包含在单一多肽链中串联排列且通过允许可变区
结合并形成单价抗原结合位点的多肽接头间隔的VH及VL区。单链Fv区可经设计，其中VH
区在VL区之前，或另一选择为其中VL区在VH区之前。接头的非限制性实例是15个残基
(Gly4Ser)3的肽(SEQ ID NO:34)。其它接头也有可能。其它片段或衍生物包括Fab’、替代抗体(surrobody)、二硫键稳定的Fv抗体(dsFv)、双抗体、三链抗体及单结构域抗体(例如
鲨鱼抗体或骆驼化抗体或纳米抗体)。其它片段或衍生物也有可能。抗原结合片段、部位或部分(例如本文所述的那些)可以重组方式或通过完整抗体的酶促或化学切割来产生。
[0077] 实例性抗GDF-8抗体
[0078] GDF-8指生长分化因子-8，其是TGF-β超家族的成员。成熟人类GDF-8的氨基酸序列如SEQ ID NO:1所示。
[0079] 先前研究鉴别能特异性结合GDF-8并中和其生物学活性的鼠类单克隆抗体。该抗体经证实在小鼠中，包括在肌萎缩侧索硬化症(ALS)的小鼠模型中增加肌肉质量及强度。
参见WO 2007/024535，其全文以引用方式并入。小鼠抗体的VH区具有氨基酸序列SEQ ID
NO:3且其VL区具有氨基酸序列SEQ ID NO:4。这些VH及VL区分别显示于图1A及图1B
中，其中VH及VL区CDR各自的氨基酸序列以粗体字型来描绘。在Kabat及AbM编号系统
中与每一VH及VL CDR相关的SEQ ID NO列于下文所示表1中。根据Kabat编号系统限
定的CDR H1、H2及H3分别被指定为SEQ ID NO:10、11及12，而CDR L1、L2及L3分别被指
定为SEQ ID NO:13、14及15。根据AbM编号系统，CDR H1、H2及H3分别被指定为SEQ ID
NO:20、21及22，而CDR L1、L2及L3分别被指定为SEQ ID NO:23、24及25。
参见WO 2007/024535，其全文以引用方式并入。小鼠抗体的VH区具有氨基酸序列SEQ ID
NO:3且其VL区具有氨基酸序列SEQ ID NO:4。这些VH及VL区分别显示于图1A及图1B
中，其中VH及VL区CDR各自的氨基酸序列以粗体字型来描绘。在Kabat及AbM编号系统
中与每一VH及VL CDR相关的SEQ ID NO列于下文所示表1中。根据Kabat编号系统限
定的CDR H1、H2及H3分别被指定为SEQ ID NO:10、11及12，而CDR L1、L2及L3分别被指
定为SEQ ID NO:13、14及15。根据AbM编号系统，CDR H1、H2及H3分别被指定为SEQ ID
NO:20、21及22，而CDR L1、L2及L3分别被指定为SEQ ID NO:23、24及25。
[0080] 表1：通过序列标识编号标识的本发明的核酸和氨基酸序列
[0081]
[0082]
[0083]
[0084]
[0085] 如在WO 2007/024535中进一步解释，鼠类抗体是通过CDR接枝人源化。具体地，鼠类VH区通过使用人类生殖细胞系重链可变(VH)基因DP47(VH3-23；基因库登录号
AB019439)作为将鼠类VH CDR接枝至其上的人类接受体(acceptor)框架来人源化。DP47
的氨基酸序列(SEQ ID NO:33)显示于图1A中。鼠类VL区使用人类生殖细胞系κ轻链可
变(VL)基因DPK9(O12m Vk1；基因库登录号X59315)作为将鼠类VL CDR接枝至其上的人
类接受体框架来人源化。DPK9的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)显示于图1B中。
AB019439)作为将鼠类VH CDR接枝至其上的人类接受体(acceptor)框架来人源化。DP47
的氨基酸序列(SEQ ID NO:33)显示于图1A中。鼠类VL区使用人类生殖细胞系κ轻链可
变(VL)基因DPK9(O12m Vk1；基因库登录号X59315)作为将鼠类VL CDR接枝至其上的人
类接受体框架来人源化。DPK9的氨基酸序列(SEQ ID NO:32)显示于图1B中。
[0086] 因为DP47及DPK9V区序列衍生自生殖细胞系而非重组V区基因，因此人源化过程还需要选择人类J基因区段以编码CDR3羧基末端的每一部分人源化VH及VL区的氨基酸
序列。如WO 2007/024535中所述，人源化使用JH3重链J区段(SEQ ID NO:35，对于VH区，
即DP47/JH3)及使用JK1轻链J区段(SEQ ID NO:39，对于VL区，即DPK9/JK1)来完成。在
图1A及图1B所示的序列比对中，由这些J区段基因编码的氨基酸序列分别直接出现在VH
CDR3及VL CDR3之后。
序列。如WO 2007/024535中所述，人源化使用JH3重链J区段(SEQ ID NO:35，对于VH区，
即DP47/JH3)及使用JK1轻链J区段(SEQ ID NO:39，对于VL区，即DPK9/JK1)来完成。在
图1A及图1B所示的序列比对中，由这些J区段基因编码的氨基酸序列分别直接出现在VH
CDR3及VL CDR3之后。
[0087] 如本文所用，在WO 2007/024535中描述的使用DP47及JH3构建的人源化抗GDF-8抗体VH区称作VH1(SEQ ID NO:7)，而使用DPK9及JK1构建的人源化抗GDF-8抗体VL区称作
VL1(SEQ ID NO:9)。还如本文所用，包含VH1及VL1的人源化抗GDF-8抗体称作OGD1.1.1。
在此命名法中，VH区编号紧跟在抗体名称”OGD1”之后且VL区编号紧跟在VH区编号之后。
因此，例如，抗体名称OGD1.0.1将是指具有VH0区及VL1区的抗体，而抗体名称OGD1.1.0
将是指具有VH1区及VL0区的抗体。在小鼠VH及VL区、人源化VH1及VL1区以及由DPK9
及DP47基因序列编码的氨基酸之间的比对图解说明于图1A及图1B中。
VL1(SEQ ID NO:9)。还如本文所用，包含VH1及VL1的人源化抗GDF-8抗体称作OGD1.1.1。
在此命名法中，VH区编号紧跟在抗体名称”OGD1”之后且VL区编号紧跟在VH区编号之后。
因此，例如，抗体名称OGD1.0.1将是指具有VH0区及VL1区的抗体，而抗体名称OGD1.1.0
将是指具有VH1区及VL0区的抗体。在小鼠VH及VL区、人源化VH1及VL1区以及由DPK9
及DP47基因序列编码的氨基酸之间的比对图解说明于图1A及图1B中。
[0088] 人源化抗GDF-8抗体的新颖形式描述于本文中，其具有以显著高于OGD1.1.1的水平由细胞表达同时保留以高亲和性特异性结合GDF-8并中和GDF-8活性的能力的惊人性
质。
质。
[0089] 在这些新颖抗体的某些实施方案中，在VH区中CDR3之后使用不同重链J区段即JH4(基因库登录号J00256，SEQ ID NO:37)。由于此变化，与VH1相比，在VH区的位置
108(使用Kabat编号方案)处，Leu(L)替代Met(M)。如本文所用，L出现在Kabat位置108
的该新颖人源化VH区称作VH0。VH0的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)图解说明于图1A的序
列比对中。
108(使用Kabat编号方案)处，Leu(L)替代Met(M)。如本文所用，L出现在Kabat位置108
的该新颖人源化VH区称作VH0。VH0的氨基酸序列(SEQ ID NO:44)图解说明于图1A的序
列比对中。
[0090] 因为Kabat编号方案使用附加至某些相同数字的字母来指示不同长度的CDR，因此残基的Kabat编号与其在多肽的残基序列中的物理位置之间不必一一对应。因此，VH区
的Kabat位置108相当于SEQ ID NO:44(即VH0)和本文所公开的其他人源化VH区的氨基
酸序列中的氨基酸编号111。
的Kabat位置108相当于SEQ ID NO:44(即VH0)和本文所公开的其他人源化VH区的氨基
酸序列中的氨基酸编号111。
[0091] 在本发明抗体的其它实施方案中，在VL区中CDR3之后使用不同轻链J区段即JK4(基因库登录号J00242，SEQ ID NO:41)。由于此变化，与VL1相比，在VL区的位置
100(使用Kabat编号方案)处，Gly(G)替代Gln(Q)。如本文所用，G出现在Kabat位置100
的该新颖人源化VL区称作VL0。VL0的氨基酸序列(SEQ ID NO:46)图解说明于图1B的序
列比对中。
100(使用Kabat编号方案)处，Gly(G)替代Gln(Q)。如本文所用，G出现在Kabat位置100
的该新颖人源化VL区称作VL0。VL0的氨基酸序列(SEQ ID NO:46)图解说明于图1B的序
列比对中。
[0092] 如本文所用，包含含有VH0的重链及含有VL0的轻链的人源化抗GDF-8抗体称作OGD1.0.0。
[0093] 与上述VH及VL实施方案相关的基因区段、序列及术语概述于下表2中。
[0094] 表2：人源化VH及VL区的概述
[0095]人源化可变区 人类接受体框架 人类J-区段
VH1(Seq ID No:7) DP47(Seq ID No:33) JH3(Seq ID No:36)
VH0(Seq ID No:44) DP47(Seq ID No:33) JH4(Seq ID No:38)
VL1(Seq ID No:9) DPK9(Seq ID No:32) JK1(Seq ID No:40)
VL0(Seq ID No:46) DPK9(Seq ID No:32) JK4(Seq ID No:42)
VH1(Seq ID No:7) DP47(Seq ID No:33) JH3(Seq ID No:36)
VH0(Seq ID No:44) DP47(Seq ID No:33) JH4(Seq ID No:38)
VL1(Seq ID No:9) DPK9(Seq ID No:32) JK1(Seq ID No:40)
VL0(Seq ID No:46) DPK9(Seq ID No:32) JK4(Seq ID No:42)
[0096] 如实施例中进一步描述，已令人惊讶地发现，包含VH0的抗GDF-8抗体以显著高于包含VH1的抗GDF-8抗体的水平由细胞表达。例如，在实施例1中所述的一个非限制性实
施方案中，令人惊讶地显示，包含VH0及VL0的完整免疫球蛋白(即OGD1.0.0)以包含VH1
及VL1的类似抗体(即OGD1.1.1)12倍的水平瞬时表达。如实施例2中所讨论，稳定表达
水平也显著较高。有趣的是，如在实施例3中所探究，发现增强的表达归因于VH0的存在，
因为不论VH0与VL0配对或与VL1配对均出现增强的表达，而仅在VL0与VH0而非VH1配
对时才出现增强的表达。
施方案中，令人惊讶地显示，包含VH0及VL0的完整免疫球蛋白(即OGD1.0.0)以包含VH1
及VL1的类似抗体(即OGD1.1.1)12倍的水平瞬时表达。如实施例2中所讨论，稳定表达
水平也显著较高。有趣的是，如在实施例3中所探究，发现增强的表达归因于VH0的存在，
因为不论VH0与VL0配对或与VL1配对均出现增强的表达，而仅在VL0与VH0而非VH1配
对时才出现增强的表达。
[0097] 在某些实施方案中，本发明抗体是包含全长重链和轻链的完整异四聚Ig分子，其中重链可变区是VH0且轻链可变区是VL0(OGD1.0.0)或VL1(OGD1.0.1)，而在其它实施方案
中，抗体是这些全长抗体的GDF-8特异性结合片段或衍生物。
中，抗体是这些全长抗体的GDF-8特异性结合片段或衍生物。
[0098] 根据一些实施方案，本发明抗体的VH区包含三个存于氨基酸序列SEQ ID NO:44或其小鼠对应体SEQ ID NO:3中的重链CDR(即CDRH1、CDRH2及CDRH3)，且其中在Kabat
位置108的氨基酸是亮氨酸。在其它实施方案中，VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:44(即
VH0)。在其它实施方案中，本发明抗体的VL区包含三个存于氨基酸序列SEQ ID NO:46或
其小鼠对应体SEQ ID NO:5中的轻链CDR(即CDRL1、CDRL2及CDRL3)，且其中在Kabat位
置100的氨基酸是甘氨酸或是谷氨酰胺。在其它实施方案中，VL区包含氨基酸序列SEQ ID
NO:46(即VL0)或SEQ ID NO:48(即VL1)。
位置108的氨基酸是亮氨酸。在其它实施方案中，VH区包含氨基酸序列SEQ ID NO:44(即
VH0)。在其它实施方案中，本发明抗体的VL区包含三个存于氨基酸序列SEQ ID NO:46或
其小鼠对应体SEQ ID NO:5中的轻链CDR(即CDRL1、CDRL2及CDRL3)，且其中在Kabat位
置100的氨基酸是甘氨酸或是谷氨酰胺。在其它实施方案中，VL区包含氨基酸序列SEQ ID
NO:46(即VL0)或SEQ ID NO:48(即VL1)。
[0099] 在本发明抗体中，抗体重链同种型可为任意人类Ig同种型或亚型，即IgA1、IgA2、IgD、IgE、IgG1、IgG2、IgG3、IgG4或IgM。抗体轻链同种型可为κ或λ。在特定非限制性实施方案中，抗体重链恒定区是氨基酸序列SEQ ID NO:19或SEQ ID NO:57，二者均是IgG1亚型。SEQ ID NO:19在铰链区中含有两个阻止结合免疫细胞上的Fc受体的取代突变，而
SEQ ID NO:57含有另一具有类似表型的铰链区突变(总计三个突变)。在另一特定非限制
性实施方案中，轻链CH区是氨基酸序列SEQ ID NO:17，其是κ同种型。
SEQ ID NO:57含有另一具有类似表型的铰链区突变(总计三个突变)。在另一特定非限制
性实施方案中，轻链CH区是氨基酸序列SEQ ID NO:17，其是κ同种型。
[0100] 在本发明的特定非限制性实施方案中，抗GDF-8抗体包含根据氨基酸序列SEQ IDNO:58的全长抗体重链及根据氨基酸序列SEQ ID NO:59的全长抗体轻链。前一序列包含
VH0及氨基酸序列SEQ ID NO:57的重链恒定区，而后一序列包含VL0及氨基酸序列SEQ ID
NO:17的轻链κ恒定区。根据另一实例性非限制性实施方案，本发明抗GDF-8抗体包含由
根据氨基酸序列SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59的两个抗体重链及两个抗体轻链组成的完
整异四聚抗体(即OGD1.0.0)。
VH0及氨基酸序列SEQ ID NO:57的重链恒定区，而后一序列包含VL0及氨基酸序列SEQ ID
NO:17的轻链κ恒定区。根据另一实例性非限制性实施方案，本发明抗GDF-8抗体包含由
根据氨基酸序列SEQ ID NO:58及SEQ ID NO:59的两个抗体重链及两个抗体轻链组成的完
整异四聚抗体(即OGD1.0.0)。
[0101] 如上所述，在其它实施方案中，本发明抗体包括包含VH0的抗GDF-8免疫球蛋白的抗原结合片段或衍生物。在这些片段或衍生物的某些实施方案中，VH0可与VL0或VL1配
对。本发明的非限制性实例片段或衍生物包括包含VH0的Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、dsFv、双抗体、三链抗体及单结构域抗体(例如鲨鱼抗体或骆驼化抗体或纳米抗体)。其它
片段或衍生物也有可能。本发明Ig衍生物的特定非限制性实例包括SEQ ID NO:63，其是
VL0串联排列于VH0的氨基末端的scFv。另一非限制性实例是SEQ ID NO:65，其是V区颠
倒且VH0串联排列于VL0的氨基末端的scFv。
对。本发明的非限制性实例片段或衍生物包括包含VH0的Fab’、F(ab’)2、Fab、Fv、scFv、dsFv、双抗体、三链抗体及单结构域抗体(例如鲨鱼抗体或骆驼化抗体或纳米抗体)。其它
片段或衍生物也有可能。本发明Ig衍生物的特定非限制性实例包括SEQ ID NO:63，其是
VL0串联排列于VH0的氨基末端的scFv。另一非限制性实例是SEQ ID NO:65，其是V区颠
倒且VH0串联排列于VL0的氨基末端的scFv。
[0102] 尽管本发明抗体例示为其中将鼠类抗GDF-8抗体的重链CDR接枝至人类生殖细胞系VH区DP47的免疫球蛋白，但本发明人源化抗GDF-8抗体并不限于仅使用所述可变区。因
此，例如，抗体还包括完整免疫球蛋白及其片段或衍生物，其中将鼠类重链CDR(即SEQ ID NO:10-12或20-22)接枝至不同于DP47的人类VH区，且经进一步修饰以使得所得VH区多
肽在Kabat位置108包括Leu(L)。其它人类生殖细胞系VH区的序列可通过搜索基因库
或各种可公开进入的因特网数据库(包括VBASE(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或
VBASE2(http://www.vbase2.org/))来发现。
此，例如，抗体还包括完整免疫球蛋白及其片段或衍生物，其中将鼠类重链CDR(即SEQ ID NO:10-12或20-22)接枝至不同于DP47的人类VH区，且经进一步修饰以使得所得VH区多
肽在Kabat位置108包括Leu(L)。其它人类生殖细胞系VH区的序列可通过搜索基因库
或各种可公开进入的因特网数据库(包括VBASE(http://vbase.mrc-cpe.cam.ac.uk/)或
VBASE2(http://www.vbase2.org/))来发现。
[0103] 如在实例10中进一步描述，解析分别结合GDF-8的OGD1.0.0及包含SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:5的鼠类VH及VL区的嵌合抗GDF-8抗体的共晶体结构并用于鉴别抗体中负
责抗原结合的接触残基。使用此信息并如实施例11中进一步解释，VH及VL区通过使CDR
中的非接触残基突变以匹配存于人类生殖细胞系可变序列中相同位置的残基来进一步人
源化。如图1A中所示，进一步人源化重链可变区称作VH2、VH3、VH4及VH5。且如图1B中
所示，进一步人源化轻链可变区称作VL2、VL3、VL4及VL5。
责抗原结合的接触残基。使用此信息并如实施例11中进一步解释，VH及VL区通过使CDR
中的非接触残基突变以匹配存于人类生殖细胞系可变序列中相同位置的残基来进一步人
源化。如图1A中所示，进一步人源化重链可变区称作VH2、VH3、VH4及VH5。且如图1B中
所示，进一步人源化轻链可变区称作VL2、VL3、VL4及VL5。
[0104] 在本发明抗体的某些实施方案中，任意人源化VH区可与任意人源化VL区配对以生成完整抗GDF-8抗体或其抗原结合片段或衍生物。例如，在某些实施方案中，VH0可与VL
区VL0、VL1、VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。在其它实施方案中，VH1可与VL区
VL0、VL1、VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。在其它实施方案中，VH2可与VL区VL0、VL1、VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。在其它实施方案中，VH3可与VL区VL0、VL1、VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。在其它实施方案中，VH4可与VL区VL0、VL1、VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。且在某些其它实施方案中，VH5可与VL区VL0、VL1、
VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。
区VL0、VL1、VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。在其它实施方案中，VH1可与VL区
VL0、VL1、VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。在其它实施方案中，VH2可与VL区VL0、VL1、VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。在其它实施方案中，VH3可与VL区VL0、VL1、VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。在其它实施方案中，VH4可与VL区VL0、VL1、VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。且在某些其它实施方案中，VH5可与VL区VL0、VL1、
VL2、VL3、VL4或VL5中的任意一个配对。
[0105] 如上文所解释，预期CDR及框架区内非接触残基的突变对GDF-8结合特异性和/或亲和性影响极小，而预期接触残基的突变具有较大效果。尽管突变、尤其接触残基的突变可降低结合特异性和/或亲和性，在一些情形中，将观察到突变提高对GDF-8的特异性和/
或亲和性。任何具体突变对特异性或亲和性的实际效果可使用本领域技术人员熟悉的技术
(例如表面等离子体共振或其它技术)来测定。
或亲和性。任何具体突变对特异性或亲和性的实际效果可使用本领域技术人员熟悉的技术
(例如表面等离子体共振或其它技术)来测定。
[0106] 根据上述原则，在某些实施方案中，本发明抗体的一或多个VH和/或VL CDR或框架区内的一个、两个、三个或更多个非接触残基可经不同氨基酸残基保守或非保守取代，并保留对GDF-8的显著特异性及结合亲和性。在其它实施方案中，一或多个VH和/或VL
CDR内的一个、两个、三个或更多个接触残基可经保守取代并保留显著GDF-8特异性及结合
亲和性。在其它实施方案中，非接触残基或接触残基的突变产生对GDF-8改良的特异性和
/或亲和性。
CDR内的一个、两个、三个或更多个接触残基可经保守取代并保留显著GDF-8特异性及结合
亲和性。在其它实施方案中，非接触残基或接触残基的突变产生对GDF-8改良的特异性和
/或亲和性。
[0107] 在本发明抗体的其它实施方案中，VH和/或VL区的氨基酸序列可与本文明确列举的序列相差不同百分比，并保留显著或甚至改良的对GDF-8的特异性和/或亲和性。因此，
在某些实施方案中，本发明抗GDF-8抗体的VH区可与VH0、VH1、VH2、VH3、VH4或VH5的氨
基酸序列相差80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在其它实施方案中，本发明抗GDF-8抗体的VL区可与VL0、VH1、VH2、VH3、VH4或VH5的氨基
酸序列相差80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。且在其它实施方案中，抗GDF-8抗体的VH及VL区可与本文明确列举的那些相差类似百分比，同
时保留显著或甚至改良的GDF-8特异性和/或结合亲和性。
在某些实施方案中，本发明抗GDF-8抗体的VH区可与VH0、VH1、VH2、VH3、VH4或VH5的氨
基酸序列相差80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。在其它实施方案中，本发明抗GDF-8抗体的VL区可与VL0、VH1、VH2、VH3、VH4或VH5的氨基
酸序列相差80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％。且在其它实施方案中，抗GDF-8抗体的VH及VL区可与本文明确列举的那些相差类似百分比，同
时保留显著或甚至改良的GDF-8特异性和/或结合亲和性。
[0108] 本发明抗体还可经衍生、经共价修饰或缀合至其它分子以改变其性质或改良其功能。例如，但并不限制，衍生抗体包括已通过例如以下方式修饰的抗体：糖基化、岩藻糖基化、乙酰化、聚乙二醇化、磷酸化、酰胺化、甲酰化、经已知保护/封闭基团衍生、连接至细胞配体或其它蛋白质等。
[0109] 在一些实施方案中，可切割并移除本发明抗GDF-8抗体重链的C末端赖氨酸。因此，例如，在本发明的某些实施方案中，抗GDF-8抗体包含缺少C末端赖氨酸的SEQ ID
NO:19或SEQ ID NO:57的重链恒定区，或可包含缺少C末端赖氨酸的SEQ ID NO:58的抗体
重链。
NO:19或SEQ ID NO:57的重链恒定区，或可包含缺少C末端赖氨酸的SEQ ID NO:58的抗体
重链。
[0110] 抗GDF-8抗体结构的某些修饰可因产生其的细胞的类型以天然方式发生。在非限制性实例中，抗体在哺乳动物细胞(例如CHO细胞)中的合成可在抗体链中的一或多个氨
基酸处引起糖基化。在抗GDF-8抗体的实例性非限制性实施方案中，重链中的氨基酸N296
被糖基化。其它位点也有可能糖基化。本领域技术人员可以理解，抗体在一些其它类型的
细胞(例如细菌细胞)中的产生可产生非糖基化抗体链。其它类型的抗体修饰可经由在抗
体纯化期间或之后进行的化学或酶促修饰以天然方式或非天然方式发生。
基酸处引起糖基化。在抗GDF-8抗体的实例性非限制性实施方案中，重链中的氨基酸N296
被糖基化。其它位点也有可能糖基化。本领域技术人员可以理解，抗体在一些其它类型的
细胞(例如细菌细胞)中的产生可产生非糖基化抗体链。其它类型的抗体修饰可经由在抗
体纯化期间或之后进行的化学或酶促修饰以天然方式或非天然方式发生。
[0111] 或者，可改变可变区或恒定区中的特定氨基酸以改变或改良功能。在一非限制性实例中，可改变抗体Fc区中的氨基酸残基以通过增强其与FcRn的结合来增加抗体的血清
半衰期。例如，参见WO 2000/009560，其以引用方式并入本文中。在其它非限制性实例中，可改变抗体氨基酸以降低与一或多种介导Ig生物效应子功能的Fc受体、补体或其它免疫受
体的结合。在另一非限制性实例中，可改变CDR、框架区或恒定区中的氨基酸以提高GDF-8
结合亲和性或降低免疫原性。在特定非限制性实例中，可将本发明抗体VH或VL区的某些人
类框架残基分别改变回如氨基酸序列SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27中的其鼠类对应体。
半衰期。例如，参见WO 2000/009560，其以引用方式并入本文中。在其它非限制性实例中，可改变抗体氨基酸以降低与一或多种介导Ig生物效应子功能的Fc受体、补体或其它免疫受
体的结合。在另一非限制性实例中，可改变CDR、框架区或恒定区中的氨基酸以提高GDF-8
结合亲和性或降低免疫原性。在特定非限制性实例中，可将本发明抗体VH或VL区的某些人
类框架残基分别改变回如氨基酸序列SEQ ID NO:26及SEQ ID NO:27中的其鼠类对应体。
[0112] 在其它实施方案中，可根据本领域技术人员熟悉的方法用可检测部分标记抗体并可根据本领域技术人员熟悉的方法来检测。这些标记可直接或间接缀合至本发明抗体。标
记可为自身可直接检测(例如，放射性核素或荧光标记)或可通过其生成可检测分子的能
力而间接检测(例如，催化底物产生可直接检测的产物的酶标记)。可检测标记的实例包括
酶(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等)、辅基(例如，生物素等)、荧光染料或部分(例如，FITC、玫瑰红(rhodamine)、镧系磷光体)、发光部分、生物
3 14 15 35 90 99 111 125 131
发光部分、放射性核素(例如，H、C、N、S、Y、Tc、In、 I、I等)、正电子发射原子或
离子、磁原子或离子、顺磁金属原子或离子或可由其它抗体特异性结合的肽表位。在一些实施方案中，标记可使用不同长度的间隔区连接以减小或防止与抗原结合位点的潜在位阻。
记可为自身可直接检测(例如，放射性核素或荧光标记)或可通过其生成可检测分子的能
力而间接检测(例如，催化底物产生可直接检测的产物的酶标记)。可检测标记的实例包括
酶(例如，辣根过氧化物酶、β-半乳糖苷酶、荧光素酶、碱性磷酸酶等)、辅基(例如，生物素等)、荧光染料或部分(例如，FITC、玫瑰红(rhodamine)、镧系磷光体)、发光部分、生物
3 14 15 35 90 99 111 125 131
发光部分、放射性核素(例如，H、C、N、S、Y、Tc、In、 I、I等)、正电子发射原子或
离子、磁原子或离子、顺磁金属原子或离子或可由其它抗体特异性结合的肽表位。在一些实施方案中，标记可使用不同长度的间隔区连接以减小或防止与抗原结合位点的潜在位阻。
[0113] 本发明抗体可在培养物或动物中由能持续表达哺乳动物蛋白质的任何细胞类型表达。非限制性实例包括人类细胞、小鼠、大鼠或其它啮齿动物细胞、其它哺乳动物细胞、CHO细胞、酵母细胞或其它真菌细胞、植物细胞或细菌细胞。可用于将编码Ig分子或其片段或衍生物的DNA克隆至表达载体中及随后用这些载体瞬时或稳定转染细胞的技术为本领
域所熟知。可改变培养条件以使抗体表达水平最大化。还可使用本领域技术人员熟悉的技
术在动物中表达抗体，然后从奶或其它体液纯化。抗体还可以是完全或部分合成的。
域所熟知。可改变培养条件以使抗体表达水平最大化。还可使用本领域技术人员熟悉的技
术在动物中表达抗体，然后从奶或其它体液纯化。抗体还可以是完全或部分合成的。
[0114] 本发明抗体以高亲和性结合GDF-8，例如平衡解离常数(KD)为至少约1×10-6M、-7 -8 -9 -10 -11
1×10 M、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 M或更高。抗GDF-8抗体对GDF-8的KD可根据
本领域技术人员熟悉的各种方法来测定。这些技术的非限制性实例包括表面等离子共振
(SPR)及ELISA。本领域技术人员熟知，由于亲合力效应，具有两个或更多个抗原结合位点
的抗GDF-8抗体的表观结合亲和性可大于具有单价抗原结合位点的抗体片段。
1×10 M、1×10 、1×10 、1×10 、1×10 M或更高。抗GDF-8抗体对GDF-8的KD可根据
本领域技术人员熟悉的各种方法来测定。这些技术的非限制性实例包括表面等离子共振
(SPR)及ELISA。本领域技术人员熟知，由于亲合力效应，具有两个或更多个抗原结合位点
的抗GDF-8抗体的表观结合亲和性可大于具有单价抗原结合位点的抗体片段。
[0115] 尽管本发明抗体对GDF-8具有特异性，但这些抗体可根据所识别表位还能以高亲和性结合密切相关的称为GDF-11的生长分化因子。因此，GDF-8特异性抗体不需要排除能
结合GDF-11分子的抗体。
结合GDF-11分子的抗体。
[0116] 如本文所用，中和性抗GDF-8抗体是与非特异性对照抗体或其它适宜对照相比降低GDF-8生物学活性的抗体。不期望受限于任何具体操作理论，一种至少抗GDF-8抗体
可中和由GDF-8介导的生物学功能的方式是防止成熟GDF-8结合其高亲和性受体(例如
ActRIIB)或一或多种其低亲和性受体。然而，抗GDF-8中和抗体可干扰GDF-8生物学活性
的其它机制是可能的。
可中和由GDF-8介导的生物学功能的方式是防止成熟GDF-8结合其高亲和性受体(例如
ActRIIB)或一或多种其低亲和性受体。然而，抗GDF-8中和抗体可干扰GDF-8生物学活性
的其它机制是可能的。
[0117] 可通过本发明中和抗体降低的由GDF-8介导的多种生物学活性为本领域已知。非限制性实例包括GDF-8与ActRIIB的结合，其可例如使用基于ELISA的测定来测量。另一
实例包括通过GDF-8活化其细胞信号传导途径，其可例如使用包括所谓CAGA元件的转染
的报告基因来检测。例如，参见Lee等人，Regulation of muscle growth by multiple
ligands signaling through activin type II receptors,PNAS(2005)102:18117-18122；
及Thies等人，GDF-8Propeptide Binds to GDF-8and Antagonizes Biological Activity by Inhibiting GDF-8 Receptor Binding,Growth Factors(2001)18:251-59，其以引用方
式并入。另一实例包括负责将GDF-8介导的信号从细胞表面的GDF-8受体转移至核中的
SMAD蛋白质的磷酸化。例如，参见Philip等人，Regulation of GDF-8 signaling by the p38MAPK,Cellular Signalling(2005)17:365–375，其以引用方式并入。SMAD蛋白质的磷
酸化可以用例如定量Western blotting使用抗磷酸-SMAD抗体来检测。还可检测通常通
过GDF-8活化或抑制的基因的下游基因表达的调节。可使用本发明中和抗体降低的GDF-8
介导活性的另一实例是对肌肉质量或强度的负向调节。其它活性也有可能。
实例包括通过GDF-8活化其细胞信号传导途径，其可例如使用包括所谓CAGA元件的转染
的报告基因来检测。例如，参见Lee等人，Regulation of muscle growth by multiple
ligands signaling through activin type II receptors,PNAS(2005)102:18117-18122；
及Thies等人，GDF-8Propeptide Binds to GDF-8and Antagonizes Biological Activity by Inhibiting GDF-8 Receptor Binding,Growth Factors(2001)18:251-59，其以引用方
式并入。另一实例包括负责将GDF-8介导的信号从细胞表面的GDF-8受体转移至核中的
SMAD蛋白质的磷酸化。例如，参见Philip等人，Regulation of GDF-8 signaling by the p38MAPK,Cellular Signalling(2005)17:365–375，其以引用方式并入。SMAD蛋白质的磷
酸化可以用例如定量Western blotting使用抗磷酸-SMAD抗体来检测。还可检测通常通
过GDF-8活化或抑制的基因的下游基因表达的调节。可使用本发明中和抗体降低的GDF-8
介导活性的另一实例是对肌肉质量或强度的负向调节。其它活性也有可能。
[0118] 本发明中和抗体可根据本领域技术人员熟悉的变量(例如抗体和抗原浓度及结合亲和性，以及其它变量)将由GDF-8介导的生物学活性降低至不同程度。由结合GDF-8
的抗体引起的GDF-8介导的生物学活性的实例性非限制性百分比降低包括与适宜对照相
比至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的降低。
的抗体引起的GDF-8介导的生物学活性的实例性非限制性百分比降低包括与适宜对照相
比至少约10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、95％、99％或更多的降低。
[0119] 抗GDF-8抗体对GDF-8介导的生物学活性的抑制可方便地表示为这些抗体在所选任何测定条件下能抑制50％生物学活性的浓度。此浓度也称作IC50。在某些实施方案中，
本发明抗GDF-8抗体的IC50值等于或小于约500nM、250nM、100nM、75nM、50nM、40nM、30nM、
20nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM或更小。
本发明抗GDF-8抗体的IC50值等于或小于约500nM、250nM、100nM、75nM、50nM、40nM、30nM、
20nM、10nM、5nM、1nM、0.5nM、0.1nM或更小。
[0120] 分泌前导序列
[0121] 根据某些实施方案，编码抗体重链和轻链的基因可提供有编码氨基末端分泌前导肽的序列，所述前导肽将刚合成的蛋白质引导至分泌区室。翻译后处理继而移除前导肽，之后从细胞分泌成熟抗体。在本发明抗体的特定非限制性实施方案中，VH0、VH1、VL0及VL1
区提供有长19个氨基酸的分泌前导肽。这些包括前导序列的V区被指定为以下序列标识编
号：VH0(SEQ ID NO:50)；VL0(SEQ ID NO:52)；VH1(SEQ ID NO:54)；及VL1(SEQ ID NO:56)。
还可使用其它分泌前导序列。非限制性实例包括鼠类VH区及其前导序列(SEQ ID NO:29)
的最初19个氨基酸以及鼠类VL区及其前导序列(SEQ ID NO:31)的最初20个氨基酸。
区提供有长19个氨基酸的分泌前导肽。这些包括前导序列的V区被指定为以下序列标识编
号：VH0(SEQ ID NO:50)；VL0(SEQ ID NO:52)；VH1(SEQ ID NO:54)；及VL1(SEQ ID NO:56)。
还可使用其它分泌前导序列。非限制性实例包括鼠类VH区及其前导序列(SEQ ID NO:29)
的最初19个氨基酸以及鼠类VL区及其前导序列(SEQ ID NO:31)的最初20个氨基酸。
[0122] 抗GDF-8抗体表达
[0123] 如实施例中更详细地解释，OGD1.0.0是以显著高于OGD1.1.1的水平在哺乳动物细胞中表达。例如，当在瞬时转染的COS细胞中表达OGD1.0.0及OGD1.1.1时，OGD1.0.0
以OGD1.1.1约12倍的水平表达。类似地，当在稳定转染的CHO细胞中表达这些抗体时，
OGD1.0.0以OGD1.1.1约6倍的水平表达。还如实例中所解释，表达水平的差异似乎主要归
因于抗体中VH0而非VH1的存在。
以OGD1.1.1约12倍的水平表达。类似地，当在稳定转染的CHO细胞中表达这些抗体时，
OGD1.0.0以OGD1.1.1约6倍的水平表达。还如实例中所解释，表达水平的差异似乎主要归
因于抗体中VH0而非VH1的存在。
[0124] 因此，当在类似条件下表达时，包含VH0的本发明抗体展现高于包含VH1的类似抗体的表达。例如，在某些实施方案中，包含VH0的抗体的表达水平比在类似条件下表达的含有VH1的类似抗体高至少约1.5倍、2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍、10倍、11倍、
12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍或更多倍的量。抗体表达水平之间的差异程度可取决于例如用于表达这些抗体的宿主细胞的类型(例如，COS细胞或CHO细胞)，或宿主细胞是
经瞬时转染还是经稳定转染。含有VH0或VH1重链可变区的抗体的比较表达水平可随其它
生长条件的变化而改变且可使用本领域技术人员熟悉的方法来测定。
12倍、13倍、14倍、15倍、20倍、30倍或更多倍的量。抗体表达水平之间的差异程度可取决于例如用于表达这些抗体的宿主细胞的类型(例如，COS细胞或CHO细胞)，或宿主细胞是
经瞬时转染还是经稳定转染。含有VH0或VH1重链可变区的抗体的比较表达水平可随其它
生长条件的变化而改变且可使用本领域技术人员熟悉的方法来测定。
[0125] 在其它实施方案中，VH0抗体的表达水平比在类似条件下表达的含有VH1的类似抗体高至少约10％、15％、20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、75％、100％、150％、
200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、1100％、1200％、
1300％、1400％、1500％、1600％、1700％、1800％、1900％、2000％、3000％、4000％、5000％或更大的量。表达水平的其它差异(例如介于本文所列举百分比之间的差异)也有可能。
200％、250％、300％、400％、500％、600％、700％、800％、900％、1000％、1100％、1200％、
1300％、1400％、1500％、1600％、1700％、1800％、1900％、2000％、3000％、4000％、5000％或更大的量。表达水平的其它差异(例如介于本文所列举百分比之间的差异)也有可能。
[0126] 抗体表达水平可使用本领域技术人员熟悉的技术来测量。在一非限制性实例中，抗体表达水平可使用定量ELISA测定来测量。还可根据本领域技术人员的知识使用其它定
量测定。
量测定。
[0127] 编码抗GDF-8抗体的核酸分子
[0128] 本发明还提供编码抗GDF-8抗体的核酸分子或多核苷酸。核酸可包含DNA或其中U替代DNA核碱基(nucleobase)序列中的T的RNA。核酸还可含有修饰，例如非标准核碱
基(例如，5甲基胞嘧啶)或经修饰的主链(例如，硫代磷酸酯)。其它修饰是可能的。核
酸可为单链的或双链的。核酸可得自天然来源，例如细胞或全生物体。天然来源核酸的非
限制性实例包括基因组DNA、扩增质粒DNA或mRNA。或者，核酸可以是合成核酸。合成核酸
的非限制性实例包括cDNA、PCR产物或在核酸合成机器上合成的核酸。
基(例如，5甲基胞嘧啶)或经修饰的主链(例如，硫代磷酸酯)。其它修饰是可能的。核
酸可为单链的或双链的。核酸可得自天然来源，例如细胞或全生物体。天然来源核酸的非
限制性实例包括基因组DNA、扩增质粒DNA或mRNA。或者，核酸可以是合成核酸。合成核酸
的非限制性实例包括cDNA、PCR产物或在核酸合成机器上合成的核酸。
[0129] 在某些实施方案中，本发明核酸编码包含VH0的抗体重链或其片段或衍生物的氨基酸序列。在其它实施方案中，核酸编码包含VL0的抗体轻链或其衍生物或片段的氨基酸
序列。在其它实施方案中，编码VH0及VL区(例如VL0或VL1)的核酸序列存于不同或相
同的分离多核苷酸中。
序列。在其它实施方案中，编码VH0及VL区(例如VL0或VL1)的核酸序列存于不同或相
同的分离多核苷酸中。
[0130] 尽管本发明提供编码抗GDF-8抗体或其片段或衍生物的特定核酸序列，本领域技术人员将了解，由于遗传密码的简并性，这些序列仅具实例性且不应视为限制性。因此，编码鼠类抗GDF-8抗体的VH及VL区的实例性核酸序列分别是SEQ ID NO:2及SEQ ID NO:4。
编码VH1的实例性核酸序列是SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:47。编码VL1的实例性核酸序列
是SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:48。编码VH0的实例性核酸序列是SEQ ID NO:43。编码VL0
的实例性核酸序列是SEQ ID NO:45。编码包含含有两个铰链区突变的IgG1的CH区的氨基
酸序列SEQ ID NO:19的实例性核酸序列是SEQ ID NO:18。编码包含人类κCL区的氨基
酸序列SEQ ID NO:17的实例性核酸序列是SEQ ID NO:16。编码鼠类抗GDF-8抗体的在前
导序列之后的VH及VL区的实例性核酸序列分别是SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:30。编码
在前导序列之后的VH0、VL0、VH1及VL1区的氨基酸序列的实例性核酸序列分别是SEQ ID
NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53及SEQ ID NO:55。
编码VH1的实例性核酸序列是SEQ ID NO:6及SEQ ID NO:47。编码VL1的实例性核酸序列
是SEQ ID NO:8及SEQ ID NO:48。编码VH0的实例性核酸序列是SEQ ID NO:43。编码VL0
的实例性核酸序列是SEQ ID NO:45。编码包含含有两个铰链区突变的IgG1的CH区的氨基
酸序列SEQ ID NO:19的实例性核酸序列是SEQ ID NO:18。编码包含人类κCL区的氨基
酸序列SEQ ID NO:17的实例性核酸序列是SEQ ID NO:16。编码鼠类抗GDF-8抗体的在前
导序列之后的VH及VL区的实例性核酸序列分别是SEQ ID NO:28及SEQ ID NO:30。编码
在前导序列之后的VH0、VL0、VH1及VL1区的氨基酸序列的实例性核酸序列分别是SEQ ID
NO:49、SEQ ID NO:51、SEQ ID NO:53及SEQ ID NO:55。
[0131] 根据某些实施方案，核酸分子包含编码以下SEQ ID NO中的任何氨基酸的核酸序列：7、9、10、11、12、13、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、36、38、40、42、44、46、50、
52、54、56、57、58、59、63或65。在其它实施方案中，核酸分子包含编码与以下SEQ ID NO至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的核酸序列：7、9、10、11、12、13、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、36、38、40、42、44、
46、50、52、54、56、57、58、59、63或65。在其它实施方案中，核酸分子包含编码与VH0(SEQ ID NO:44)至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同且其中Kabat位置108是亮氨酸的氨基酸序列的核酸序列。
52、54、56、57、58、59、63或65。在其它实施方案中，核酸分子包含编码与以下SEQ ID NO至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同的氨基酸序列的核酸序列：7、9、10、11、12、13、14、15、17、19、20、21、22、23、24、25、26、27、36、38、40、42、44、
46、50、52、54、56、57、58、59、63或65。在其它实施方案中，核酸分子包含编码与VH0(SEQ ID NO:44)至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％相同且其中Kabat位置108是亮氨酸的氨基酸序列的核酸序列。
[0132] 根据某些实施方案，核酸分子包含以下SEQ ID NO中的任意的核酸序列：6、8、16、18、35、37、39、41、43、45、47、48、49、51、53、55、62或64。在其它实施方案中，核酸分子包含与以下核酸序列SEQ ID NO至少80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％或99％相同的核酸序列：6、8、16、18、35、37、39、41、43、45、47、48、49、51、53、55、62或
64。在其它实施方案中，核酸分子包含在高严格性条件下与以下核酸序列SEQ ID NO杂交
的核酸序列：6、8、16、18、35、37、39、41、43、45、47、48、49、51、53、55、62或64。
98％或99％相同的核酸序列：6、8、16、18、35、37、39、41、43、45、47、48、49、51、53、55、62或
64。在其它实施方案中，核酸分子包含在高严格性条件下与以下核酸序列SEQ ID NO杂交
的核酸序列：6、8、16、18、35、37、39、41、43、45、47、48、49、51、53、55、62或64。
[0133] 高严格性杂交条件的非限制性实例是将杂交核酸在1×SSC中65℃下或在1×SSC及50％甲酰胺中42℃下温育，之后在0.3×SSC中65℃下洗涤。严格条件的其它实例提供
于Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第9及11章，Cold Spring
Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)中，其以引用方式并入本文中。
于Sambrook等人，Molecular Cloning:A Laboratory Manual，第9及11章，Cold Spring
Harbor Laboratory Press,Cold Spring Harbor,NY(1989)中，其以引用方式并入本文中。
[0134] 本领域技术人员可以理解，某些本发明核酸可框内连接在一起以产生复合核酸序列。例如，编码VH0的核酸可与编码CH区的核酸框内连接以产生编码完整重链的复合核
酸。在非限制性实例中，编码VH0的核酸序列SEQ ID NO:43可与编码氨基酸序列SEQ ID
NO:57(含有三个影响效应子功能的突变的人类IgG1重链的恒定部分)的核酸序列框内连
接。产生轻链的类似连接是可能的，产生本文所述核酸的其它复合物的其它连接也是可能
的。
酸。在非限制性实例中，编码VH0的核酸序列SEQ ID NO:43可与编码氨基酸序列SEQ ID
NO:57(含有三个影响效应子功能的突变的人类IgG1重链的恒定部分)的核酸序列框内连
接。产生轻链的类似连接是可能的，产生本文所述核酸的其它复合物的其它连接也是可能
的。
[0135] 载体
[0136] 可使用本领域技术人员熟知的技术将本发明核酸并入载体中。在某些实施方案中，载体包括质粒通常是细菌质粒、真核附加体、酵母人工染色体及病毒基因组。实例性非限制性病毒包括反转录病毒、腺病毒、腺病毒相关病毒(AAV)及植物病毒(例如花椰菜花叶
病毒及烟草花叶病毒)。其它类型的载体是可能的。在一些实施方案中，载体能在适宜宿
主中自主复制。在其它实施方案中，载体是以染色体外形式维持于宿主中，或可将其整合
至宿主基因组中以使得载体可与宿主基因组一起复制。包含基因及足以维持所述基因的
转录和翻译的控制序列的载体称作表达载体。本发明载体可根据本领域技术人员的知识经
选择或设计，以在能支持Ig基因表达的任何细胞类型中发挥功能，所述细胞类型包括细菌
细胞、其它原核细胞、酵母细胞、其它真菌细胞、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、CHO细胞及人类细胞或其它细胞。
病毒及烟草花叶病毒)。其它类型的载体是可能的。在一些实施方案中，载体能在适宜宿
主中自主复制。在其它实施方案中，载体是以染色体外形式维持于宿主中，或可将其整合
至宿主基因组中以使得载体可与宿主基因组一起复制。包含基因及足以维持所述基因的
转录和翻译的控制序列的载体称作表达载体。本发明载体可根据本领域技术人员的知识经
选择或设计，以在能支持Ig基因表达的任何细胞类型中发挥功能，所述细胞类型包括细菌
细胞、其它原核细胞、酵母细胞、其它真菌细胞、植物细胞、动物细胞、昆虫细胞、哺乳动物细胞、CHO细胞及人类细胞或其它细胞。
[0137] 载体可可选地含有一或多种控制序列。某些控制序列允许复制，例如复制起点。其它控制序列控制或调节转录，例如启动子、增强子及转录终止位点。启动子或增强子的非限制性实例是那些衍生自以下的启动子或增强子：反转录病毒LTR、巨细胞病毒(CMV)、猿猴病毒40(SV40)、腺病毒(例如，腺病毒主要晚期启动子(AdMLP))或多瘤病毒。其它实例包
括组织特异性启动子和增强子、组成型活性启动子及增强子、诱导型启动子及增强子、Ig基因启动子和增强子及肌动蛋白启动子和增强子。其它启动子和增强子也有可能。
括组织特异性启动子和增强子、组成型活性启动子及增强子、诱导型启动子及增强子、Ig基因启动子和增强子及肌动蛋白启动子和增强子。其它启动子和增强子也有可能。
[0138] 某些控制序列控制或调节转录后RNA加工，例如剪接和多腺苷酸化信号或提高或降低mRNA稳定性的信号。其它控制序列控制或调节蛋白质翻译(例如翻译起始序列(例
如，Kozak共有序列))、翻译后加工(例如引导基因产物分泌出宿主细胞的信号肽序列)或
蛋白质稳定性。信号肽序列可衍生自免疫球蛋白或并非Ig超家族的一部分的分泌蛋白质。
其它控制序列也有可能。
如，Kozak共有序列))、翻译后加工(例如引导基因产物分泌出宿主细胞的信号肽序列)或
蛋白质稳定性。信号肽序列可衍生自免疫球蛋白或并非Ig超家族的一部分的分泌蛋白质。
其它控制序列也有可能。
[0139] 载体还可包括可选择标记基因，其允许选择已吸收这些载体的宿主细胞。非限制性实例包括产生抗药性表型的可选择标记基因，例如二氢叶酸还原酶基因(DHFR)(用于
-
dhfr宿主细胞，允许使用甲氨蝶呤选择)、neo基因(允许用G418或类似药物选择)、hph
基因(允许用潮霉素B选择)及谷氨酸合成酶基因(允许用甲硫氨酸磺酰亚胺选择)。
-
dhfr宿主细胞，允许使用甲氨蝶呤选择)、neo基因(允许用G418或类似药物选择)、hph
基因(允许用潮霉素B选择)及谷氨酸合成酶基因(允许用甲硫氨酸磺酰亚胺选择)。
[0140] 在一些实施方案中，载体可包含编码单一Ig重链或轻链或其抗原结合片段的核酸序列，但同一载体中不包含两条链。通常，由这些载体表达完整抗体涉及将包含重链和轻链的单独载体引入同一细胞中。在其它实施方案中，载体可在同一载体中包含编码重链和
轻链Ig链或其抗原结合片段的核酸序列。
轻链Ig链或其抗原结合片段的核酸序列。
[0141] 可将本发明核酸分子或包含这些核酸的载体引入一或多种类型的能支持抗体表达的宿主细胞中。用于将核酸或载体引入适宜宿主细胞中的方法为本领域技术人员所熟
知。非限制性实例包括对靶宿主细胞的瞬时和稳定转染、转化、转导及病毒感染。其它实例包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封于脂质体中及将DNA直接显微注射至核中。实例性非限制性方法论述于例如美国专
利第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号及第4,959,455号中，其以引用方式
并入。用于转化植物细胞的方法也为本领域所熟知，包括例如农杆菌介导的转化、生物弹道转化、直接注射、电穿孔及病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也为本领域所熟知。
知。非限制性实例包括对靶宿主细胞的瞬时和稳定转染、转化、转导及病毒感染。其它实例包括葡聚糖介导的转染、磷酸钙沉淀、聚凝胺介导的转染、原生质体融合、电穿孔、将多核苷酸囊封于脂质体中及将DNA直接显微注射至核中。实例性非限制性方法论述于例如美国专
利第4,399,216号、第4,912,040号、第4,740,461号及第4,959,455号中，其以引用方式
并入。用于转化植物细胞的方法也为本领域所熟知，包括例如农杆菌介导的转化、生物弹道转化、直接注射、电穿孔及病毒转化。转化细菌和酵母细胞的方法也为本领域所熟知。
[0142] 宿主细胞
[0143] 在某些实施方案中，将编码本发明抗体或其片段或衍生物的核酸引入适宜宿主细胞中以达成表达目的。能表达抗体的细胞包括细菌、真菌、植物、动物及哺乳动物细胞。还可根据本领域技术人员的知识使用其它类型的细胞。
[0144] 适合作为抗体表达宿主的哺乳动物细胞是本领域已知的。实例性非限制性实例包括可自美国典型培养物保藏中心(ATCC)或其它来源获得的某些永生细胞系，包括中国仓
鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(例如，COS、CV-1或Vero细胞)、人类肝细胞癌细胞(例如，
HepG2)、A549细胞、A431细胞、HeLa细胞、L细胞、BHK21细胞、HL-60细胞、U937细胞、HaK细胞、Jurkat细胞及其它细胞。适合作为抗体表达宿主的其它动物、昆虫或哺乳动物细胞
是可能的。
鼠卵巢(CHO)细胞、NS0细胞、SP2细胞、HEK-293T细胞、NIH-3T3细胞、HeLa细胞、幼仓鼠肾(BHK)细胞、非洲绿猴肾细胞(例如，COS、CV-1或Vero细胞)、人类肝细胞癌细胞(例如，
HepG2)、A549细胞、A431细胞、HeLa细胞、L细胞、BHK21细胞、HL-60细胞、U937细胞、HaK细胞、Jurkat细胞及其它细胞。适合作为抗体表达宿主的其它动物、昆虫或哺乳动物细胞
是可能的。
[0145] 在其它实施方案中，可使用来自昆虫、植物、细菌或真菌的细胞系。实例性非限制性昆虫细胞包括Sf9或Sf21细胞，其通常结合杆状病毒载体表达系统来使用。实例性非限制性植物细胞包括来自烟草、拟南芥、浮萍、玉米、小麦及马铃薯种的那些。实例性非限制性细菌包括大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草杆菌(Bacillus subtilis)、鼠伤寒沙门菌
(Salmonella typhimurium)及链霉菌属(Streptomyces)菌株。实例性非限制性真菌包括
裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)酵母菌株及念珠菌属
(Candida)酵母菌株。其它昆虫、植物、细菌及真菌细胞是可能的。
(Salmonella typhimurium)及链霉菌属(Streptomyces)菌株。实例性非限制性真菌包括
裂殖酵母菌(Schizosaccharomyces pombe)、啤酒酵母菌(Saccharomyces cerevisiae)、巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)、克鲁维酵母属(Kluyveromyces)酵母菌株及念珠菌属
(Candida)酵母菌株。其它昆虫、植物、细菌及真菌细胞是可能的。
[0146] 在有助于抗体表达的条件下生长及维持不同类型的宿主细胞的方法为本领域所熟知。在抗体表达发生后，然后可根据本领域技术人员的知识从宿主细胞纯化如此表达的
抗体。例如，可从生长宿主细胞的培养基纯化分泌抗体。或者，在一些实施方案中，尤其在宿主细胞具有细胞壁时，可以机械方式、化学方式或酶促方式破开宿主细胞以释放隔绝于
细胞内的所表达的抗体。抗体纯化的实例性非限制性方法包括离子交换层析、盐沉淀及凝
胶过滤。在其它实施方案中，可使用亲和层析。例如，可将识别人类恒定区序列的小鼠抗体固定至纯化柱。或者，抗体可经表达融合至表位标签或较大亲和性标签(例如麦芽糖结合
蛋白质、谷胱甘肽S转移酶及硫氧还蛋白)，以用紧密结合亲和性标签的特定抗体或其它分
子来纯化。此后，可使用本领域技术人员熟悉的技术切割表位标签或亲和性标签并使用其
它技术(例如本文所揭示的那些)纯化抗体。从培养基及宿主细胞纯化抗体的其它技术也
有可能。根据良好作业规范或其它法规要求，抗体还可视情况经受其它处理步骤以进一步
纯化抗体。适宜的纯化及其实施步骤为本领域技术人员所习知。
抗体。例如，可从生长宿主细胞的培养基纯化分泌抗体。或者，在一些实施方案中，尤其在宿主细胞具有细胞壁时，可以机械方式、化学方式或酶促方式破开宿主细胞以释放隔绝于
细胞内的所表达的抗体。抗体纯化的实例性非限制性方法包括离子交换层析、盐沉淀及凝
胶过滤。在其它实施方案中，可使用亲和层析。例如，可将识别人类恒定区序列的小鼠抗体固定至纯化柱。或者，抗体可经表达融合至表位标签或较大亲和性标签(例如麦芽糖结合
蛋白质、谷胱甘肽S转移酶及硫氧还蛋白)，以用紧密结合亲和性标签的特定抗体或其它分
子来纯化。此后，可使用本领域技术人员熟悉的技术切割表位标签或亲和性标签并使用其
它技术(例如本文所揭示的那些)纯化抗体。从培养基及宿主细胞纯化抗体的其它技术也
有可能。根据良好作业规范或其它法规要求，抗体还可视情况经受其它处理步骤以进一步
纯化抗体。适宜的纯化及其实施步骤为本领域技术人员所习知。
[0147] 转基因动物及植物
[0148] 本发明抗体还可在经遗传修饰的非人类动物或植物中产生。抗体在这些生物体中的表达可是组成型或诱导型。然后可使用本领域技术人员已知的技术来分离在这些生物体
中表达的抗体。用于在转基因非人类生物体中表达抗体及其抗原结合片段的方法为本领
域所熟知。在非限制性实例中，本发明抗体可在山羊、牛或其它非人类哺乳动物的奶中产
生并自其回收。例如，参见美国专利第5,827,690号、第5,756,687号、第5,750,172号及
第5,741,957号，其以引用方式并入本文中。其中可表达抗体的转基因哺乳动物的其它非
限制性实例是小鼠、大鼠、绵羊、猪或马。可自其分离抗体的体液的另一非限制性实例是血液。其它体液也有可能。本发明抗体也可在植物中产生并自其回收。例如，参见美国专利
第6,417,429号、第6,046,037号及第5,959,177，其以引用方式并入本文中。
中表达的抗体。用于在转基因非人类生物体中表达抗体及其抗原结合片段的方法为本领
域所熟知。在非限制性实例中，本发明抗体可在山羊、牛或其它非人类哺乳动物的奶中产
生并自其回收。例如，参见美国专利第5,827,690号、第5,756,687号、第5,750,172号及
第5,741,957号，其以引用方式并入本文中。其中可表达抗体的转基因哺乳动物的其它非
限制性实例是小鼠、大鼠、绵羊、猪或马。可自其分离抗体的体液的另一非限制性实例是血液。其它体液也有可能。本发明抗体也可在植物中产生并自其回收。例如，参见美国专利
第6,417,429号、第6,046,037号及第5,959,177，其以引用方式并入本文中。
[0149] 药物组合物
[0150] 对于在本发明治疗及预防方法中的使用，可将本文所公开抗体调配为组合物。可选地，组合物可包含一或多种在治疗上或预防上有效对抗GDF-8介导病症的其它药剂，包
括与本文所公开的那些抗体结合不同GDF-8表位的抗体。组合物通常将作为无菌药物组合
物的一部分来供应，所述药物组合物通常将包括药物可接受的载体。该组合物可根据将其
施用给患者的所需方法呈任意适宜形式。
括与本文所公开的那些抗体结合不同GDF-8表位的抗体。组合物通常将作为无菌药物组合
物的一部分来供应，所述药物组合物通常将包括药物可接受的载体。该组合物可根据将其
施用给患者的所需方法呈任意适宜形式。
[0151] 可通过多种途径将本发明抗体施用给对象，通常非经肠，例如，经由皮下、静脉内、腹膜内或肌内注射。施用可以一或多次推注注射或以一或多次输注来实现。根据本领域技术人员的知识，其它施用途径也是可能的。在任意给定情形中最适宜的施用途径可取决于
欲施用的具体组合物及对象的特征，例如欲治疗的病症、年龄或性别。
欲施用的具体组合物及对象的特征，例如欲治疗的病症、年龄或性别。
[0152] 药物组合物可方便地存于每剂量含有预定量抗体的单位剂型中。该单位可含有例如，但不限于5mg至5g、10mg至1g或20至50mg。用于本发明的药物可接受的载体可根据
例如施用途径呈众多种形式。
例如施用途径呈众多种形式。
[0153] 本发明药物组合物可通过将具有所需纯度的抗体与可选的本领域通常采用的药物可接受的载体、赋形剂或稳定剂(其在本文中均称作”载体”，即缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子型去污剂、抗氧化剂及其它各种添加剂)混合制备为冻干制剂或水溶液以
供储存。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版(Osol编辑1980)。这些
添加剂在所采用剂量及浓度下必须对接受者无毒。
供储存。参见Remington’s Pharmaceutical Sciences，第16版(Osol编辑1980)。这些
添加剂在所采用剂量及浓度下必须对接受者无毒。
[0154] 缓冲剂有助于将pH保持在接近生理条件的范围内。其可以介于约2mM至约50mM范围内的浓度存在。适用于本发明的缓冲剂包括有机酸及无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓
冲液(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬
酸单钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠
混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸-酒石酸钠混合
物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲液(例如，富马
酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)，
葡萄糖酸盐缓冲液(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡
萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲液(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化
钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲液(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢
氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)及乙酸盐缓冲液(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙
酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液及三甲胺盐(例如
Tris)。
冲液(例如，柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬
酸单钠混合物等)，琥珀酸盐缓冲液(例如，琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠
混合物、琥珀酸-琥珀酸二钠混合物等)，酒石酸盐缓冲液(例如，酒石酸-酒石酸钠混合
物、酒石酸-酒石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等)，富马酸盐缓冲液(例如，富马
酸-富马酸单钠混合物、富马酸-富马酸二钠混合物、富马酸单钠-富马酸二钠混合物等)，
葡萄糖酸盐缓冲液(例如，葡萄糖酸-葡萄糖酸钠混合物、葡萄糖酸-氢氧化钠混合物、葡
萄糖酸-葡萄糖酸钾混合物等)，草酸盐缓冲液(例如，草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化
钠混合物、草酸-草酸钾混合物等)，乳酸盐缓冲液(例如，乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢
氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等)及乙酸盐缓冲液(例如，乙酸-乙酸钠混合物、乙
酸-氢氧化钠混合物等)。另外，可使用磷酸盐缓冲液、组氨酸缓冲液及三甲胺盐(例如
Tris)。
[0155] 可添加防腐剂以减缓微生物生长，且其可以介于0.2％-4％(w/v)范围内的量添加。适用于本发明的防腐剂包括酚、苄醇、间甲酚、对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苄基氯化铵、苯扎卤铵(benzalconium halide，例如，苯扎氯铵、苯扎溴铵及苯扎碘铵)、氯化六甲双铵及对羟基苯甲酸烷基酯(例如对羟基苯甲酸甲酯或对羟基苯
甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇及3-戊醇。可添加有时称为”稳定剂”的等渗剂以确保本发明液体组合物的等渗性，且其包括多元糖醇，例如三元糖醇或高级糖醇，例如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。稳定剂是指一大类赋形剂，其功能可在自膨胀剂至可溶解治疗剂或有助于防止变性或防止黏附至容器壁的添加剂范围内。典型稳
定剂可为多元糖醇(上文所列举)；氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油及诸如此类，包括环多醇，例如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、a-单硫代甘油及硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个残基或更小的肽)；蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖；以及三糖，例如棉子糖；及多糖，例如葡聚糖。稳定剂可以0.1重量份数/重量份数活性蛋白质至10,000重量份数/重量份数的范围存在。
甲酸丙酯)、儿茶酚、间苯二酚、环己醇及3-戊醇。可添加有时称为”稳定剂”的等渗剂以确保本发明液体组合物的等渗性，且其包括多元糖醇，例如三元糖醇或高级糖醇，例如甘油、赤藓醇、阿拉伯糖醇、木糖醇、山梨糖醇及甘露糖醇。稳定剂是指一大类赋形剂，其功能可在自膨胀剂至可溶解治疗剂或有助于防止变性或防止黏附至容器壁的添加剂范围内。典型稳
定剂可为多元糖醇(上文所列举)；氨基酸，例如精氨酸、赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯丙氨酸、谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，例如乳糖、海藻糖、水苏糖、甘露糖醇、山梨糖醇、木糖醇、核糖醇、肌醇(myoinisitol)、半乳糖醇、甘油及诸如此类，包括环多醇，例如肌醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原剂，例如尿素、谷胱甘肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、a-单硫代甘油及硫代硫酸钠；低分子量多肽(例如，10个残基或更小的肽)；蛋白质，例如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋白；亲水性聚合物，例如聚乙烯吡咯烷酮单糖，例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖；二糖，例如乳糖、麦芽糖、蔗糖；以及三糖，例如棉子糖；及多糖，例如葡聚糖。稳定剂可以0.1重量份数/重量份数活性蛋白质至10,000重量份数/重量份数的范围存在。
[0156] 可添加非离子型表面活性剂或去污剂(也称作”润湿剂”)以对抗搅动诱导的聚集来帮助溶解抗体及可包括的任何其它治疗剂，其还允许组合物暴露于剪切表面应力
中而不引起蛋白质变性。适宜的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊
洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、多聚醇(Pluronic polyol)、聚氧乙烯山梨聚糖单
醚( 等)。非离子型表面活性剂可以约0.05mg/ml至约
1.0mg/ml、例如约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
中而不引起蛋白质变性。适宜的非离子型表面活性剂包括聚山梨醇酯(20、80等)、泊
洛沙姆(polyoxamer)(184、188等)、多聚醇(Pluronic polyol)、聚氧乙烯山梨聚糖单
醚( 等)。非离子型表面活性剂可以约0.05mg/ml至约
1.0mg/ml、例如约0.07mg/ml至约0.2mg/ml的范围存在。
[0158] 在实例性非限制性实施方案中，将本发明抗体调配于包含20mM L-组氨酸、85mg/ml蔗糖、0.2mg/ml PS-80、0.05mg/ml EDTA的溶液(pH 5.8)中。在其它实施方案中，抗体
在该制剂中的浓度为100mg/ml。且在其它实施方案中，该制剂中的抗体经冻干。
在该制剂中的浓度为100mg/ml。且在其它实施方案中，该制剂中的抗体经冻干。
[0159] 药物试剂盒
[0160] 在某些实施方案中，本发明提供供临床医师或其它人员使用的药物试剂盒。药物试剂盒是包含本发明抗GDF-8抗体(例如，呈冻干形式或呈水溶液形式)及以下中的一或
多个的包装：至少一种如本发明中其它地方所述的第二治疗剂；用于施用抗体的装置，例
如针和/或注射器；及若抗体呈冻干或浓缩形式用于再悬浮或稀释抗体的药物级水或缓冲
液。试剂盒还可包括用于制备抗体组合物和/或将组合物施用给患者的说明书。
多个的包装：至少一种如本发明中其它地方所述的第二治疗剂；用于施用抗体的装置，例
如针和/或注射器；及若抗体呈冻干或浓缩形式用于再悬浮或稀释抗体的药物级水或缓冲
液。试剂盒还可包括用于制备抗体组合物和/或将组合物施用给患者的说明书。
[0161] 每一单位剂量的抗GDF-8抗体组合物可单独包装，且试剂盒可含有一或多个单位剂量(例如，2个单位剂量、3个单位剂量、4个单位剂量、5个单位剂量、7个单位剂量、8个单位剂量、10个单位剂量或更多)。在一个实施方案中，一或多个单位剂量各自容纳于注射器中，且在另一实施方案中，一或多个单位剂量各自含于袋或适于连接至静脉内管线的类
似容器中。
似容器中。
[0162] 治疗及预防方法
[0163] 本发明提供治疗及预防状况及病症的方法，其中降低GDF-8活性直接或间接产生治疗益处。这些方法包含向对象施用有效量的包含抗GDF-8抗体的组合物。在某些这些实
施方案中，抗体是OGD1.0.0或其GDF-8结合片段、部位、部分或衍生物。
施方案中，抗体是OGD1.0.0或其GDF-8结合片段、部位、部分或衍生物。
[0164] 可向其施用抗GDF-8抗体组合物的对象可为哺乳动物，例如非灵长类动物(例如，牛、猪、马、猫、狗、大鼠等)或灵长类动物(例如，猴子、黑猩猩、猿或人类)。对象可为人类，例如成年患者或儿科患者。
[0165] 可使用本发明抗体组合物治疗的状况及病症是那些至少部分由GDF-8介导或存在科学原理表明降低对象的GDF-8活性会产生治疗益处者。
[0166] 尽管治疗益处部分取决于具体状况或病症，但在降低对象的GDF-8活性导致状况或病症的症状、体征或严重性出现任何改善，或停止或减慢这些症状、体征或严重性的逐渐恶化时，存在治疗益处。若降低GDF-8活性提供对象的预期寿命、舒适性或生活质量，则进一步存在治疗益处。若降低GDF-8活性改良或停止或减慢对象的一或多种机体或生理功
能，或对象在反映这些功能的测试中的表现的劣化，则也存在治疗益处。
能，或对象在反映这些功能的测试中的表现的劣化，则也存在治疗益处。
[0167] 治疗益处可通过以下方式来推断：观察对象执行某些任务，询问对象关于其感觉的问题，或在床边对对象进行一或多种测试，或在实验室中对从对象获得的样品进行一或
多种测试。治疗益处还可通过GDF-8抑制的标记来证明。例如，但不限于，可对所治疗对象的肌肉进行活组织检查并测试与通过GDF-8刺激的信号传导途径的下调相关的标记(例如
磷酸化SMAD2或SMAD3蛋白质含量的降低)存在或不存在。适于检测用包含本发明抗体的
组合物治疗的对象的治疗益处的其它测试为本领域技术人员所习知。尽管期望所治疗或预
防的状况或病症完全治愈或逆转，但其并非治疗益处存在所需要的。
多种测试。治疗益处还可通过GDF-8抑制的标记来证明。例如，但不限于，可对所治疗对象的肌肉进行活组织检查并测试与通过GDF-8刺激的信号传导途径的下调相关的标记(例如
磷酸化SMAD2或SMAD3蛋白质含量的降低)存在或不存在。适于检测用包含本发明抗体的
组合物治疗的对象的治疗益处的其它测试为本领域技术人员所习知。尽管期望所治疗或预
防的状况或病症完全治愈或逆转，但其并非治疗益处存在所需要的。
[0168] 在某些实施方案中，可使用包含本发明抗体的组合物来治疗或预防特征为骨骼肌质量和/或强度损失，或其中增加所述肌肉质量和/或强度产生治疗益处的状况或病症。在
某些这些实施方案中，抗体是OGD1.0.0或其GDF-8结合片段或衍生物。
某些这些实施方案中，抗体是OGD1.0.0或其GDF-8结合片段或衍生物。
[0169] 可通过施用本文所公开的抗体来治疗或预防的与肌肉质量和/或强度减少有关的状况或病症包括，但不限于年龄相关性肌肉质量或强度损失、衰弱症、少肌症及由肌萎
缩、固定或失用(例如损伤后、去神经或持续暴露于零重力环境)引起的肌肉质量或强度损
失。在其它实施方案中，可治疗或预防的状况或病症包括骨折，尤其在老人或其它易发生骨折(例如髋部骨折或其它骨的骨折)或对稳定关节置换术敏感者中。在一些其它实施方案
中，可治疗或预防的状况或病症是肌肉耗损综合征，包括那些归因于原发性疾病过程者。肌肉耗损综合征的非限制性实例包括恶病质，例如由癌症、厌食或其它类型的营养不良引起
的；及由以下引起的肌肉耗损：AIDS、败血症、烧伤、慢性肾衰竭、充血性心脏衰竭(CHF)及慢性阻塞性肺病(COPD)。
缩、固定或失用(例如损伤后、去神经或持续暴露于零重力环境)引起的肌肉质量或强度损
失。在其它实施方案中，可治疗或预防的状况或病症包括骨折，尤其在老人或其它易发生骨折(例如髋部骨折或其它骨的骨折)或对稳定关节置换术敏感者中。在一些其它实施方案
中，可治疗或预防的状况或病症是肌肉耗损综合征，包括那些归因于原发性疾病过程者。肌肉耗损综合征的非限制性实例包括恶病质，例如由癌症、厌食或其它类型的营养不良引起
的；及由以下引起的肌肉耗损：AIDS、败血症、烧伤、慢性肾衰竭、充血性心脏衰竭(CHF)及慢性阻塞性肺病(COPD)。
[0170] 施用包含本发明抗体的组合物的对象的治疗益处可例如，但不限于经由一般性或特定肌肉的肌肉质量或强度的增加来显示。其质量和/或强度可通过用抗GDF-8抗体治
疗来增加的肌肉的非限制性实例包括骨骼肌及心肌。其它实例包括控制呼吸的肌肉，包括
膈膜肌及肋间肌；以及吸气的辅助肌肉，包括胸锁乳头肌、斜角肌及其它肌肉。骨骼肌的其它实例包括腓肠肌、胫骨后肌、比目鱼肌、胫骨前肌、长肌、短肌、臀大肌、股二头肌、半腱肌、半膜肌、髂腰肌、股四头肌、髋部内收肌、提肩胛肌、斜方肌、腹直肌、腹横肌、腹外斜肌、腹内斜肌、竖脊肌、胸大肌、肱二头肌、肱三头肌、肱肌、圆旋前肌、肱桡肌、菱形肌、三角肌及背阔肌。其质量和/或强度可通过用本发明抗GDF-8抗体治疗来增加的其它骨骼肌也有可能。
疗来增加的肌肉的非限制性实例包括骨骼肌及心肌。其它实例包括控制呼吸的肌肉，包括
膈膜肌及肋间肌；以及吸气的辅助肌肉，包括胸锁乳头肌、斜角肌及其它肌肉。骨骼肌的其它实例包括腓肠肌、胫骨后肌、比目鱼肌、胫骨前肌、长肌、短肌、臀大肌、股二头肌、半腱肌、半膜肌、髂腰肌、股四头肌、髋部内收肌、提肩胛肌、斜方肌、腹直肌、腹横肌、腹外斜肌、腹内斜肌、竖脊肌、胸大肌、肱二头肌、肱三头肌、肱肌、圆旋前肌、肱桡肌、菱形肌、三角肌及背阔肌。其质量和/或强度可通过用本发明抗GDF-8抗体治疗来增加的其它骨骼肌也有可能。
[0172] 或者，治疗益处可由原本会逐渐恶化的症状的严重性的降低来推断。益处还可使用肌肉功能的生理学测试(例如肌电描记术)、所活组织检查肌肉结构的组织病理学测试
及生物化学测试(例如血清肌酸激酶(受损肌肉释放的酶)的存在)来显示。可用于检测
治疗益处的肌肉结构及功能的其它测试也有可能。
及生物化学测试(例如血清肌酸激酶(受损肌肉释放的酶)的存在)来显示。可用于检测
治疗益处的肌肉结构及功能的其它测试也有可能。
[0173] 在与肌肉质量和/或强度有关的其它实施方案中，本发明提供通过向需要治疗或预防肌营养不良(“MD”)的患者施用包含抗GDF-8抗体的组合物来治疗和预防这些疾病的
方法。在这些方法的一些实施方案中，抗体是OGD1.0.0或其抗GDF-8结合片段或衍生物。
根据某些实施方案，对象是患有肌营养不良的人类儿科患者，且在其它实施方案中，对象是患有肌营养不良的人类成年患者。
方法。在这些方法的一些实施方案中，抗体是OGD1.0.0或其抗GDF-8结合片段或衍生物。
根据某些实施方案，对象是患有肌营养不良的人类儿科患者，且在其它实施方案中，对象是患有肌营养不良的人类成年患者。
[0174] 如本领域已知，存在不同类型的肌营养不良，其引起疾病的遗传损害的性质不同，且潜在遗传缺陷产生的表型不同。可通过施用包含本发明抗体的组合物治疗或预防的肌营养不良类型的非限制性实例包括杜兴肌营养不良(DMD)(也称作假肥大性MD)、贝克型肌
营养不良(Becker Muscular Dystrophy，BMD)、埃-德二氏肌营养不良(Emery-Dreifuss
Muscular Dystrophy，EDMD)、肢带型营养肌不良(LGMD)、面、肩、肱肌营养不良(FSH或
FSHD)(也称作兰代营养不良(Landouzy-Dejerine MD))、肌强直性营养不良(MMD)(也称作
DM或斯坦纳特病(Steinert Disease))、眼咽型肌营养不良(OPMD)、远端肌营养不良(DD)
(也称作三吉MD(Miyoshi MD))及先天性肌营养不良(CMD)。
营养不良(Becker Muscular Dystrophy，BMD)、埃-德二氏肌营养不良(Emery-Dreifuss
Muscular Dystrophy，EDMD)、肢带型营养肌不良(LGMD)、面、肩、肱肌营养不良(FSH或
FSHD)(也称作兰代营养不良(Landouzy-Dejerine MD))、肌强直性营养不良(MMD)(也称作
DM或斯坦纳特病(Steinert Disease))、眼咽型肌营养不良(OPMD)、远端肌营养不良(DD)
(也称作三吉MD(Miyoshi MD))及先天性肌营养不良(CMD)。
[0175] 除了上文所述那些用于评价肌肉质量和/或强度的改良的技术以外，将包含本发明抗体的组合物施用给患有MD的对象的治疗益处可使用6分钟步行测试(“6MWT”)来量
化。例如，参见McDonald等人，The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy,Muscle Nerve(2010)41:500-510，其以引用方式并入本文
中。
化。例如，参见McDonald等人，The 6-minute walk test as a new outcome measure in Duchenne muscular dystrophy,Muscle Nerve(2010)41:500-510，其以引用方式并入本文
中。
[0176] 在6MWT中，测试对象以确定其能在6分钟内沿预设路线步行多远。通常会在开始治疗之前测试对象以建立基线，然后随着治疗进展以一定间隔进行测试。当MD对象在
6MWT中的表现随着治疗保持恒定或实际上改良时，或者，当对象的表现下降的慢于平均未
治疗对象时，观察到治疗益处。在6MWT中的表现的实例性非限制性改良包括与未治疗或经
安慰剂治疗的对照相比约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、
20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的改良百分比。6MWT还可用于检测针对除了MD以外影响离床活动的状况或病症进行治疗的对象的治
疗益处。
6MWT中的表现随着治疗保持恒定或实际上改良时，或者，当对象的表现下降的慢于平均未
治疗对象时，观察到治疗益处。在6MWT中的表现的实例性非限制性改良包括与未治疗或经
安慰剂治疗的对照相比约4％、5％、6％、7％、8％、9％、10％、11％、12％、13％、14％、15％、
20％、25％、30％、35％、40％、45％、50％、60％、70％、80％、90％、100％或更大的改良百分比。6MWT还可用于检测针对除了MD以外影响离床活动的状况或病症进行治疗的对象的治
疗益处。
[0177] 在其它实施方案中，本发明提供通过向需要治疗或预防运动神经元疾病的患者施用包含抗GDF-8抗体的组合物来治疗及预防这些疾病的方法。在这些方法的一些实施
方案中，抗体是OGD1.0.0或其抗GDF-8结合片段或衍生物。可通过施用包含本发明抗
体的组合物治疗或预防的运动神经元疾病类型的非限制性实例包括肌萎缩侧索硬化症
(ALS)(也称作LouGehrig's病)、1型脊髓性肌萎缩(SMA1)(也称作韦尼印-霍夫曼病
(Werdnig-Hoffmann Disease))、2型脊髓性肌萎缩(SMA2)、3型脊髓性肌萎缩(SMA3)(也称
作库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-Welander Disease))及脊髓延髓肌肉萎缩(SBMA)
(也称作肯尼迪氏病(Kennedy Disease))。
方案中，抗体是OGD1.0.0或其抗GDF-8结合片段或衍生物。可通过施用包含本发明抗
体的组合物治疗或预防的运动神经元疾病类型的非限制性实例包括肌萎缩侧索硬化症
(ALS)(也称作LouGehrig's病)、1型脊髓性肌萎缩(SMA1)(也称作韦尼印-霍夫曼病
(Werdnig-Hoffmann Disease))、2型脊髓性肌萎缩(SMA2)、3型脊髓性肌萎缩(SMA3)(也称
作库格尔贝格-韦兰德病(Kugelberg-Welander Disease))及脊髓延髓肌肉萎缩(SBMA)
(也称作肯尼迪氏病(Kennedy Disease))。
[0178] 在先前工作中已证实，鼠类抗GDF-8抗体可有效增加SOD1小鼠及大鼠(其是人类ALS的小型动物模型)的肌肉质量及强度。参见WO2007/024535及Holzbauer等
人，Myostatin inhibition slows muscle atrophy in rodent models of amyotrophic
lateral sclerosis,Neurobiology of Disease(2006)23:697-707，其以引用方式并入本文中。如所报导，与PBS治疗对照相比，用鼠类抗体治疗增加SOD1小鼠及大鼠的膈膜及骨骼
肌的肌肉质量。类似地，与接受PBS的对照相比，抗体治疗降低SOD1小鼠的腓肠肌及膈膜
的肌萎缩。抗体治疗的营养效果主要在疾病过程的早期阶段而非末期阶段期间显现，但对
膈膜萎缩的抑制在两个时期均显现。与仅经媒介物治疗的对照动物相比，还观察到抗体治
疗可增加SOD1小鼠及大鼠的肢体肌肉强度以及总体重，但抗体不延长存活。因为本发明人
源化抗GDF-8抗体(例如OGD1.0.0)与上文所论述鼠类抗体共享相同的抗原结合决定簇，
预期其还可有效治疗或预防人类的ALS。
人，Myostatin inhibition slows muscle atrophy in rodent models of amyotrophic
lateral sclerosis,Neurobiology of Disease(2006)23:697-707，其以引用方式并入本文中。如所报导，与PBS治疗对照相比，用鼠类抗体治疗增加SOD1小鼠及大鼠的膈膜及骨骼
肌的肌肉质量。类似地，与接受PBS的对照相比，抗体治疗降低SOD1小鼠的腓肠肌及膈膜
的肌萎缩。抗体治疗的营养效果主要在疾病过程的早期阶段而非末期阶段期间显现，但对
膈膜萎缩的抑制在两个时期均显现。与仅经媒介物治疗的对照动物相比，还观察到抗体治
疗可增加SOD1小鼠及大鼠的肢体肌肉强度以及总体重，但抗体不延长存活。因为本发明人
源化抗GDF-8抗体(例如OGD1.0.0)与上文所论述鼠类抗体共享相同的抗原结合决定簇，
预期其还可有效治疗或预防人类的ALS。
[0179] 肌肉、中枢神经系统及周围神经系统的影响肌肉质量、功能和/或强度的其它先天性或获得性疾病及病症还可通过向有需要的对象施用包含本发明抗体的组合物来治疗
或预防。
或预防。
[0180] 本发明还提供通过向需要治疗代谢紊乱的患者施用包含抗GDF-8抗体的组合物来治疗和预防代谢紊乱的方法。在某些这些实施方案中，抗体是OGD1.0.0或其GDF-8结合
片段或衍生物。
片段或衍生物。
[0181] 可通过施用本发明的抗体治疗或预防的代谢紊乱的非限制性实例包括2型糖尿病、代谢综合征(例如综合征X)、胰岛素抵抗及葡萄糖耐量降低。
[0182] 在其它实施方案中，本发明提供通过向需要治疗脂肪组织病症的患者施用包含抗GDF-8抗体的组合物来治疗和预防这些病症的方法。在某些这些实施方案中，抗体是
OGD1.0.0或其GDF-8结合片段或衍生物。
OGD1.0.0或其GDF-8结合片段或衍生物。
[0183] 可通过施用本发明的抗体治疗或预防的脂肪组织病症的非限制性实例包括肥胖症和对于具体对象的性别、年龄及身高高于正常身体质量指数(BMI)。
[0184] 在其它实施方案中，本发明提供通过向需要治疗骨丢失病症的患者施用包含抗GDF-8抗体的组合物来治疗和预防这些病症的方法。在某些这些实施方案中，抗体是
OGD1.0.0或其GDF-8结合片段或衍生物。
OGD1.0.0或其GDF-8结合片段或衍生物。
[0185] 可通过施用本发明的抗体治疗或预防的骨丢失病症的非限制性实例包括骨质疏松、激素相关性骨质疏松、骨质减少、骨关节炎及骨质疏松相关性骨折。
[0186] 组合疗法
[0187] 根据本发明方法的某些实施方案，抗GDF-8抗体可在组合物中作为单一疗法或作为与至少一种第二治疗剂的组合疗法来施用。通常，但并非在所有情形中，选择第二治疗剂治疗或预防抗GDF-8抗体所靶向的相同状况或病症。然而，在其它实施方案中，可选择第二药剂治疗或预防不同状况或病症。用于组合疗法中的抗体及第二治疗剂的剂量根据本领域
技术人员的知识经选择以使效力最大化且使副作用最小化。
技术人员的知识经选择以使效力最大化且使副作用最小化。
[0188] 本发明抗GDF-8抗体组合物可使用与第二治疗剂相同或不同的施用模式来施用给对象。根据抗GDF-8抗体及第二治疗剂的化学及物理特征，可将其组合至同一组合物中。
在替代性实施方案中，其作为单独组合物施用。抗体与第二治疗剂的组合物可方便地包括
在本发明试剂盒中。
在替代性实施方案中，其作为单独组合物施用。抗体与第二治疗剂的组合物可方便地包括
在本发明试剂盒中。
[0189] 若作为组合疗法来施用，抗体和第二治疗剂可同时、相继或单独施用。
[0190] 当在相同时间施用两种或更多种药剂时，即使各别施用重迭，但在不同时间开始或结束，同时施用发生。当在同一天(例如在同一次临床就诊期间)但并非同时将两种或
更多种药剂施用给对象时，相继施用发生。
更多种药剂施用给对象时，相继施用发生。
[0191] 相继施用可间隔1、2、3、4、5、6、7、8小时或更长时间进行。可首先施用抗GDF-8抗体组合物，之后施用第二药剂，或反之亦然。
[0192] 当在不同日期将药剂施用给对象时，单独施用发生。单独施用药剂的实例性间隔可为1天、2天、3天、4天、5天、6天、1周、2周、3周或1个月或更长时间。如同相继施用一般，可在单独施用第二药剂之前或之后施用抗GDF-8抗体组合物。
[0193] 在本发明的某些其它实施方案中，不论是相继或单独施用，抗GDF-8抗体组合物及第二治疗剂可以交替模式重复施用。
[0194] 在用于治疗或预防代谢紊乱的方法中，本发明抗GDF-8抗体可与有效治疗或预防这些病症的第二药剂组合。有效用于此目的的第二药剂的非限制性实例包括二
甲双胍(metformin)、磺酰脲、胰岛素、普兰林肽(pramlintide)、噻唑二酮(例如罗格
列酮(rosiglitazone)及吡格列酮(pioglitazone))、GLP-1类似物(例如艾塞那肽
(exenitide))及DPP-IV抑制剂(例如维达列汀(vildagliptin))。
甲双胍(metformin)、磺酰脲、胰岛素、普兰林肽(pramlintide)、噻唑二酮(例如罗格
列酮(rosiglitazone)及吡格列酮(pioglitazone))、GLP-1类似物(例如艾塞那肽
(exenitide))及DPP-IV抑制剂(例如维达列汀(vildagliptin))。
[0195] 在用于治疗或预防骨丢失病症的方法中，本发明的抗GDF-8抗体可与有效治疗或预防这些病症的第二药剂组合。有效用于此目的的第二药剂的非限制性实例包括双磷酸盐
(例如阿屈膦酸盐(alendronate)及利塞膦酸盐(risedronate))、降钙素(calcitonin)、雷
洛昔芬(raloxifene)及激素类药剂(例如雌激素或副甲状腺素(PTH))。
(例如阿屈膦酸盐(alendronate)及利塞膦酸盐(risedronate))、降钙素(calcitonin)、雷
洛昔芬(raloxifene)及激素类药剂(例如雌激素或副甲状腺素(PTH))。
[0196] 在用于治疗或预防肌营养不良的方法中，本发明的抗GDF-8抗体可与有效治疗或预防肌营养不良的第二药剂(例如皮质类固醇)组合。有效治疗或预防肌营养不良的
其它药剂为本领域已知。有效治疗肌营养不良的皮质类固醇的非限制性实例包括甲泼
尼龙(methylprednisolone)、地夫可特(deflazacort)、倍他米松(betamethasone)、泼
尼松龙(prednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、可的松(cortisone)、倍氯米松
(beclomethasone)、布地奈德(budesonide)、皮质醇、地塞米松(dexamethasone)、氟替卡松(fluticason)、强的松、莫米松(mometasone)、曲安西龙(triamcinolone)及其衍生物。
在其它实施方案中，抗GDF-8抗体可与用于治疗在DMD患者、尤其老年DMD患者中经常发生
的心肌病的药剂一起施用。这些药剂包括，但不必限于β肾上腺素阻断剂及血管紧张素转
化酶抑制剂。
其它药剂为本领域已知。有效治疗肌营养不良的皮质类固醇的非限制性实例包括甲泼
尼龙(methylprednisolone)、地夫可特(deflazacort)、倍他米松(betamethasone)、泼
尼松龙(prednisolone)、氢化可的松(hydrocortisone)、可的松(cortisone)、倍氯米松
(beclomethasone)、布地奈德(budesonide)、皮质醇、地塞米松(dexamethasone)、氟替卡松(fluticason)、强的松、莫米松(mometasone)、曲安西龙(triamcinolone)及其衍生物。
在其它实施方案中，抗GDF-8抗体可与用于治疗在DMD患者、尤其老年DMD患者中经常发生
的心肌病的药剂一起施用。这些药剂包括，但不必限于β肾上腺素阻断剂及血管紧张素转
化酶抑制剂。
[0197] 在用于治疗或预防ALS的方法中，本发明的抗GDF-8抗体可与有效治疗或预防ALS的第二药剂组合，所述第二药剂包括，但不必限于利鲁唑(riluzole)、他仑帕
奈(talampanel)、格隆溴铵(glycopyrrolate)、苯扎托品(benztropine)、东莨菪碱
(scopolamine)、阿托品(atropine)、盐酸苯海索(trihexyphenidyl hydrochloride)、
阿米替林(amitriptyline)、氟伏沙明(fluvoxamine)、巴氯芬(baclofen)、替扎尼
定(tizanidine)、丹曲林(dantrolene)、地西泮(diazepam)、奎宁(quinine)、苯妥英
(phenytoin)、苯二氮杂(benzodiazepine)、加巴喷丁(gabapentin)、镇痉剂、抗抑郁药及吗啡(morphine)或其它止痛药。
奈(talampanel)、格隆溴铵(glycopyrrolate)、苯扎托品(benztropine)、东莨菪碱
(scopolamine)、阿托品(atropine)、盐酸苯海索(trihexyphenidyl hydrochloride)、
阿米替林(amitriptyline)、氟伏沙明(fluvoxamine)、巴氯芬(baclofen)、替扎尼
定(tizanidine)、丹曲林(dantrolene)、地西泮(diazepam)、奎宁(quinine)、苯妥英
(phenytoin)、苯二氮杂(benzodiazepine)、加巴喷丁(gabapentin)、镇痉剂、抗抑郁药及吗啡(morphine)或其它止痛药。
[0198] 根据其它实施方案，包含本发明抗GDF-8抗体的组合物可与并非基于药物的疗法协作施用，包括例如，但不限于运动、物理疗法、呼吸疗法、通气支持、心脏病疗法及营养补充。
[0199] 有效剂量
[0200] 如上文所述，可将包含本发明的抗GDF-8抗体的组合物以有效地至少部分达成所需治疗益处的剂量施用给需要治疗或预防某些状况或病症的对象。
[0201] 达成治疗效力并不一定需要结合所有GDF-8。相反，降低成熟活性GDF-8在体液(例如血液或血清)内或在身体组织(例如肌肉或其它身体组织或器官)内的浓度也可有
效。
效。
[0202] 根据本领域技术人员的知识，抗GDF-8抗体组合物的剂量可在患者中逐步增加，以在施用后的预定时间将活性GDF-8在感兴趣的组织或体液中的浓度降低至少约
10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％或约5％-10％、约10％-45％、约15％-20％、约20％-25％、约
25％-30％、约30％-35％、约35％-40％、约40％-45％、约45％-50％、约50％-55％、约
55％-60％、约60％-65％、约65％-70％、约70％-75％、约75％-80％、约80％-85％、约
85％-90％、约90％-95％、约95％-99％，或活性GDF-8浓度的降低百分比介于任何上述值
之间。
10％、20％、30％、40％、50％、60％、70％、80％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、
97％、98％、99％或100％或约5％-10％、约10％-45％、约15％-20％、约20％-25％、约
25％-30％、约30％-35％、约35％-40％、约40％-45％、约45％-50％、约50％-55％、约
55％-60％、约60％-65％、约65％-70％、约70％-75％、约75％-80％、约80％-85％、约
85％-90％、约90％-95％、约95％-99％，或活性GDF-8浓度的降低百分比介于任何上述值
之间。
[0203] 施用给对象的抗GDF-8抗体的量将取决于多种因素，包括欲治疗或预防的状况或病症、对象的大小及重量、施用形式、途径及位点、治疗方案(例如，是否使用第二治疗剂)、具体对象的年龄及状况、在开始治疗之前在所述对象的感兴趣的组织或体液中检测到的活
性GDF-8的含量及对象对抗体组合物的效应的反应性或敏感性。适宜剂量可由本领域技术
人员容易地确定。最后，临床医师或类似照护提供者将确定所使用的适宜剂量。此剂量可以适宜频率重复施用。若出现副作用，则剂量的量和/或频率可根据正常临床实践而改变或
降低。可通过使用本领域技术人员已知的方法监测治疗进展来确立适当剂量及治疗方案。
性GDF-8的含量及对象对抗体组合物的效应的反应性或敏感性。适宜剂量可由本领域技术
人员容易地确定。最后，临床医师或类似照护提供者将确定所使用的适宜剂量。此剂量可以适宜频率重复施用。若出现副作用，则剂量的量和/或频率可根据正常临床实践而改变或
降低。可通过使用本领域技术人员已知的方法监测治疗进展来确立适当剂量及治疗方案。
[0204] 有效剂量最初可根据体外测定来估计。例如，用于动物中的初始剂量可经调配以实现抗GDF-8抗体的循环血液或血清浓度，其等于或高于如在体外所测量的所述抗体对
GDF-8的结合亲和性。本领域技术人员可熟练地在计算实现这些循环血液或血清浓度的
剂量时虑及具体抗体的生物利用度。作为指导，向读者提及Part 1:General Principles
in“Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第11版，
Hardman,J.G.等人编辑，McGraw-Hill Professional，及其中所引用的参考文献。还可由
体内数据(例如动物模型)来估计初始剂量。本领域技术人员可以常规方式调整所述信息
以确定适于人类施用的剂量。
GDF-8的结合亲和性。本领域技术人员可熟练地在计算实现这些循环血液或血清浓度的
剂量时虑及具体抗体的生物利用度。作为指导，向读者提及Part 1:General Principles
in“Goodman and Gilman's The Pharmacological Basis of Therapeutics”，第11版，
Hardman,J.G.等人编辑，McGraw-Hill Professional，及其中所引用的参考文献。还可由
体内数据(例如动物模型)来估计初始剂量。本领域技术人员可以常规方式调整所述信息
以确定适于人类施用的剂量。
[0205] 在某些实施方案中，可通过在施用抗体组合物之前数天至数周中多次测量活性GDF-8在血清、肌肉或其它感兴趣的体液或组织中的浓度，以计算抗GDF-8抗体可饱和的量
(即可足以结合基本上所有活性GDF-8的量)，来确定用于个别对象的剂量。本领域技术人
员可以理解，对于血清、肌肉或其它位置中的给定量的GDF-8，任意特异性抗体达成饱和所需的量将部分取决于具体抗体对GDF-8的亲和性。用于计算特异性抗GDF-8抗体的饱和量
的方法(在需要时虑及具体抗体的药物动力学性质及生物利用度)为本领域所熟知。为确
保饱和，可施用大于所计算饱和量的量，例如，可施用所计算饱和量的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或甚至10倍的量。
(即可足以结合基本上所有活性GDF-8的量)，来确定用于个别对象的剂量。本领域技术人
员可以理解，对于血清、肌肉或其它位置中的给定量的GDF-8，任意特异性抗体达成饱和所需的量将部分取决于具体抗体对GDF-8的亲和性。用于计算特异性抗GDF-8抗体的饱和量
的方法(在需要时虑及具体抗体的药物动力学性质及生物利用度)为本领域所熟知。为确
保饱和，可施用大于所计算饱和量的量，例如，可施用所计算饱和量的至少2倍、3倍、4倍、5倍、6倍、7倍、8倍、9倍或甚至10倍的量。
[0206] 根据上文所论述的因素(例如，欲治疗或预防的状况或病症等)，抗GDF-8抗体组合物的有效剂量可介于每单一(例如，推注)施用、多次施用或连续(例如，输注)施用约
0.01mg/kg至约250mg/kg范围内或其中的任意有效范围或值。
0.01mg/kg至约250mg/kg范围内或其中的任意有效范围或值。
[0207] 在某些实施方案中，每一剂量可介于以下范围内：约0.1mg/kg至约0.5mg/kg；约0.25mg/kg至约0.75mg/kg；约0.5mg/kg至约1mg/kg；约2mg/kg；约1.5mg/kg至约2.5mg/
kg；约2mg/kg至约3mg/kg；约2.5mg/kg至约3.5mg/kg；约3mg/kg至约4mg/kg；约3.5mg/
kg至约4.5mg/kg；约4mg/kg至约5mg/kg；约5mg/kg至约7mg/kg；约6mg/kg至约8mg/kg；
约7mg/kg至约9mg/kg；约8mg/kg至约10mg/kg；约10mg/kg至约15mg/kg；约12.5mg/kg
至约17.5mg/kg；约15mg/kg至约20mg/kg；约17.5mg/kg至约22.5mg/kg；约20mg/kg至约
25mg/kg；约22.5mg/kg至约27.5mg/kg；约25mg/kg至约30mg/kg；约30mg/kg至约40mg/
kg；约35mg/kg至约45mg/kg；约40mg/kg至约50mg/kg；约45mg/kg至约55mg/kg；约50mg/
kg至约60mg/kg；约55mg/kg至约65mg/kg；约60mg/kg至约70mg/kg；约65mg/kg至约
75mg/kg；约70mg/kg至约80mg/kg；约75mg/kg至约85mg/kg；约80mg/kg至约90mg/kg；约
85mg/kg至约95mg/kg；约90mg/kg至约100mg/kg；约95mg/kg至约105mg/kg；约100mg/kg
至约150mg/kg；约125mg/kg至约175mg/kg；约150mg/kg至约200mg/kg；约175mg/kg至约
225mg/kg；约200mg/kg至约250mg/kg。其它剂量范围也有可能。
kg；约2mg/kg至约3mg/kg；约2.5mg/kg至约3.5mg/kg；约3mg/kg至约4mg/kg；约3.5mg/
kg至约4.5mg/kg；约4mg/kg至约5mg/kg；约5mg/kg至约7mg/kg；约6mg/kg至约8mg/kg；
约7mg/kg至约9mg/kg；约8mg/kg至约10mg/kg；约10mg/kg至约15mg/kg；约12.5mg/kg
至约17.5mg/kg；约15mg/kg至约20mg/kg；约17.5mg/kg至约22.5mg/kg；约20mg/kg至约
25mg/kg；约22.5mg/kg至约27.5mg/kg；约25mg/kg至约30mg/kg；约30mg/kg至约40mg/
kg；约35mg/kg至约45mg/kg；约40mg/kg至约50mg/kg；约45mg/kg至约55mg/kg；约50mg/
kg至约60mg/kg；约55mg/kg至约65mg/kg；约60mg/kg至约70mg/kg；约65mg/kg至约
75mg/kg；约70mg/kg至约80mg/kg；约75mg/kg至约85mg/kg；约80mg/kg至约90mg/kg；约
85mg/kg至约95mg/kg；约90mg/kg至约100mg/kg；约95mg/kg至约105mg/kg；约100mg/kg
至约150mg/kg；约125mg/kg至约175mg/kg；约150mg/kg至约200mg/kg；约175mg/kg至约
225mg/kg；约200mg/kg至约250mg/kg。其它剂量范围也有可能。
[0208] 施用的量、频率及持续时间将取决于多种因素，例如对象的年龄、体重及疾病状况。因此，在非限制性实例中，施用的治疗方案可持续1天或更长时间、2天或更长时间、3天或更长时间、4天或更长时间、5天或更长时间、6天或更长时间、1周或更长时间、2周至不确定时间，持续2周至6个月、3个月至5年、6个月至1或2年、8个月至18个月或诸如
此类。可选地，治疗方案提供重复施用，例如每天两次、每天一次、每2天、3天、4天、5天、6天一次、每周一次、每两周一次或每个月一次。可以相同剂量或以不同剂量重复施用。施用可重复1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。抗GDF-8抗体组合物的治疗有效量可作为单一剂量或在治疗方案过程期间(例如在1周、2周、3周、1个月、3
个月、6个月、1年或更长时间的过程期间)施用。在具体对象中构成抗GDF-8抗体组合物
的有效剂量者可随时间、随对象状况的变化或其它健康问题的出现而变化。
实施例
此类。可选地，治疗方案提供重复施用，例如每天两次、每天一次、每2天、3天、4天、5天、6天一次、每周一次、每两周一次或每个月一次。可以相同剂量或以不同剂量重复施用。施用可重复1次、2次、3次、4次、5次、6次、7次、8次、9次、10次或更多次。抗GDF-8抗体组合物的治疗有效量可作为单一剂量或在治疗方案过程期间(例如在1周、2周、3周、1个月、3
个月、6个月、1年或更长时间的过程期间)施用。在具体对象中构成抗GDF-8抗体组合物
的有效剂量者可随时间、随对象状况的变化或其它健康问题的出现而变化。
实施例
[0209] 实施例1
[0210] OGD1.0.0及OGD1.1.1的瞬时表达分析
[0211] 在COS-1M6细胞中测试完整异四聚OGD1.1.1及OGD1.0.0的瞬时表达，并显示OGD1.0.0以显著较高的水平表达。
[0212] 简言之，将编码VH0及VH1的DNA(分别是SEQ ID NO:49及53)克隆至哺乳动物IgG表达载体中，以使得VH区各自与编码包括三个消除效应子功能的突变的人类IgG1的重
链恒定区(SEQ ID NO:57)的核酸序列框内连接，以表达包括VH0或VH1的全长抗体重链。
类似地，将编码VL0及VL1的DNA(分别是SEQ ID NO:51及55)克隆至哺乳动物IgG表达
载体中，以使得VL区各自与编码人类κ轻链恒定区SEQ ID NO:17的核酸序列框内连接，
以表达包括VL0或VL1的全长抗体轻链。
链恒定区(SEQ ID NO:57)的核酸序列框内连接，以表达包括VH0或VH1的全长抗体重链。
类似地，将编码VL0及VL1的DNA(分别是SEQ ID NO:51及55)克隆至哺乳动物IgG表达
载体中，以使得VL区各自与编码人类κ轻链恒定区SEQ ID NO:17的核酸序列框内连接，
以表达包括VL0或VL1的全长抗体轻链。
[0213] 在产生表达载体后，使用标准技术大量制备DNA。将细胞平铺至100mm组织培养皿上且随后用重链和轻链表达载体瞬时共转染(即在一个板中组合VH0及VL0，在另一板中
组合VH1及VL1)。在室温下将TransIT(Mirus MIR2306)转染试剂(40μl)添加至加谷氨
酰胺(2mM终浓度)的2mlOptiMEM生长培养基中，通过涡旋混合，然后在室温下温育15分
钟。将大量制备的DNA(重链和轻链DNA各8μg)添加至混合物中，并在室温下温育15分
钟。然后将转染溶液添加至含有8ml生长培养基(DMEM、HIFBS、青霉素、链霉素、谷氨酰胺)的组织培养皿中。在37℃、10％CO2下温育24小时后，用R1CD1无血清生长培养基洗涤细
胞，然后使其在37℃、10％CO2下于10ml R1CD1(添加有青霉素、链霉素、谷氨酰胺)中生长
48小时。从细胞移除条件化培养基，离心以沉淀任何碎片，并将上清液移至新管中。
组合VH1及VL1)。在室温下将TransIT(Mirus MIR2306)转染试剂(40μl)添加至加谷氨
酰胺(2mM终浓度)的2mlOptiMEM生长培养基中，通过涡旋混合，然后在室温下温育15分
钟。将大量制备的DNA(重链和轻链DNA各8μg)添加至混合物中，并在室温下温育15分
钟。然后将转染溶液添加至含有8ml生长培养基(DMEM、HIFBS、青霉素、链霉素、谷氨酰胺)的组织培养皿中。在37℃、10％CO2下温育24小时后，用R1CD1无血清生长培养基洗涤细
胞，然后使其在37℃、10％CO2下于10ml R1CD1(添加有青霉素、链霉素、谷氨酰胺)中生长
48小时。从细胞移除条件化培养基，离心以沉淀任何碎片，并将上清液移至新管中。
[0214] 通过瞬时转染的COS-1细胞产生的抗体的浓度使用总人类IgG-Fc特异性ELISA来定量。简言之，通过将100μl于PBS中的抗体(1μg/ml)添加至每孔并在室温下温育过
夜，用山羊抗人类IgG(Pierce 31125)包被平底ELISA板。在室温下用100μl/孔的0.02％
酪蛋白PBS溶液将板封闭3至24小时然后洗涤。将标准品和样品在测定缓冲液(0.5％
BSA、0.02％Tween-20于PBS中)中连续稀释，将其分配至ELISA板(100μl/孔)并在室
温下温育3至24小时。在洗涤后，分配(100μl/孔)在测定缓冲液中以1:5000稀释的山
羊抗人类IgG(Pierce 31413)，然后将板在室温下温育15分钟。在洗涤后，通过添加BioFX TMB(TMBW-0100-01)(100μl/孔)使板显影。在用0.18N H2SO4(100μl/孔)停止反应后，
在450nm下使用Molecular Devices vMax读板器读板。使用由标准品的稀释系列确定的
曲线的线性范围来计算样品浓度。
夜，用山羊抗人类IgG(Pierce 31125)包被平底ELISA板。在室温下用100μl/孔的0.02％
酪蛋白PBS溶液将板封闭3至24小时然后洗涤。将标准品和样品在测定缓冲液(0.5％
BSA、0.02％Tween-20于PBS中)中连续稀释，将其分配至ELISA板(100μl/孔)并在室
温下温育3至24小时。在洗涤后，分配(100μl/孔)在测定缓冲液中以1:5000稀释的山
羊抗人类IgG(Pierce 31413)，然后将板在室温下温育15分钟。在洗涤后，通过添加BioFX TMB(TMBW-0100-01)(100μl/孔)使板显影。在用0.18N H2SO4(100μl/孔)停止反应后，
在450nm下使用Molecular Devices vMax读板器读板。使用由标准品的稀释系列确定的
曲线的线性范围来计算样品浓度。
[0215] 瞬时转染实验的结果显示于下表中，其中POI代表在蛋白质A纯化后通过大小排阻层析(SEC)的感兴趣的峰。POI代表细胞表达的完整全长抗体的比例，与高分子量聚集物
或降解产物相对。
或降解产物相对。
[0216] 意外的是，在瞬时转染后相同条件下OGD1.0.0抗体以显著高于OGD1.1.1抗体的水平(即超过10倍)表达。重要的是，如POI值所指示，所观察到的显著提高的表达水平
几乎完全与完整全长抗体而非高分子量复合体或降解产物相关。鉴于以下事实，此表达差
异甚至更加惊人：如在OGD1.0.0与OGD1.1.1之间，仅有在VH区的Kabat位置108处的一
个氨基酸差异(即SEQ ID NO:44及7的残基编号111)及在VL区的Kabat位置100处的
一个氨基酸差异(即SEQ ID NO:46及9的残基编号100)。参见图1A及图1B。
几乎完全与完整全长抗体而非高分子量复合体或降解产物相关。鉴于以下事实，此表达差
异甚至更加惊人：如在OGD1.0.0与OGD1.1.1之间，仅有在VH区的Kabat位置108处的一
个氨基酸差异(即SEQ ID NO:44及7的残基编号111)及在VL区的Kabat位置100处的
一个氨基酸差异(即SEQ ID NO:46及9的残基编号100)。参见图1A及图1B。
[0217] 如上文所解释，这些结构及功能差异归因于在VH0及VL0中与VH1及VL1相比分别使用不同J区段。如下文所解释，最重要的差异似乎是VH区的变化。值得注意的是，人们相信这是用于构建人源化抗体的J区段的选择可全面影响抗体表达水平的第一证明，更不必
说此处所观察到的显著提高的程度。该发现尤其重要，因为其预期显著降低生产OGD1.0.0
所需的商品成本。若无此发现，将无法经济地以使其上市所需的量生产此抗体，从而对可受益于用所述抗体治疗的患者群体不利。
说此处所观察到的显著提高的程度。该发现尤其重要，因为其预期显著降低生产OGD1.0.0
所需的商品成本。若无此发现，将无法经济地以使其上市所需的量生产此抗体，从而对可受益于用所述抗体治疗的患者群体不利。
[0218] 表3：在COS细胞中瞬时表达的OGD1.0.0及OGD1.1.1的比较.
[0219]抗体 COS-1细胞中的瞬时表达 POI
OGD1.0.0 28.45μg/ml >99％
OGD1.1.1 2.35μg/ml >99％
OGD1.0.0 28.45μg/ml >99％
OGD1.1.1 2.35μg/ml >99％
[0220] 实施例2
[0221] OGD1.0.0及OGD1.1.1的稳定表达分析
[0222] 在CHO-DUKX细胞中测试OGD1.0.0及OGD1.1.1的稳定表达。简言之，使细胞生长至80％汇合，然后使用lipofectamine转染试剂用各自25μg之前实例中所述的重链和轻
链表达载体(总计50μg)共转染(即VH0及VL0用于一组细胞，VH1及VL1用于另一组细
胞)。在转染后，每3至4天用加10％FBS的新鲜R1CD1培养基更换用过的培养基，同时建
立稳定池(stable pool)。
链表达载体(总计50μg)共转染(即VH0及VL0用于一组细胞，VH1及VL1用于另一组细
胞)。在转染后，每3至4天用加10％FBS的新鲜R1CD1培养基更换用过的培养基，同时建
立稳定池(stable pool)。
[0223] 在建立稳定转染子后，测试细胞在作为附着细胞于无血清R5CD1培养基中生长时表达抗GDF-8抗体的能力。在这些条件下，表达OGD1.0.0的细胞在生长96小时后表达
47.3mg/L抗体，而表达OGD1.1.1的细胞在生长72小时后表达41mg/L抗体。使用1mL蛋白
质A柱纯化抗体，然后使用HPLC定量浓度。
47.3mg/L抗体，而表达OGD1.1.1的细胞在生长72小时后表达41mg/L抗体。使用1mL蛋白
质A柱纯化抗体，然后使用HPLC定量浓度。
[0224] 在附着细胞适应在无血清培养基中的悬浮生长后，再次测定OGD1.0.0及5
OGD1.1.1抗体的表达。在AS1无血清培养基中接种3.0×10个活细胞/mL并在37℃下温
育。在第4天，将pH调节至7.3，添加浓缩进料，且将温育温度降低至31℃，再生长3天。
使OGD1.0.0表达细胞在100L培养体积中生长，而使OGD1.1.1表达细胞在50mL培养体积
中生长。细胞之间所有其它生长条件均相同。在第7天，如通过蛋白质A纯化及HPLC定量
所测定，表达OGD1.0.0的细胞表达66.12mg/L抗体，而表达OGD1.1.1的细胞表达10.6mg/L
抗体。在通过使细胞在100L培养中生长9天(包括在31℃下5天)来重复使用OGD1.0.0
细胞的实验时，抗体浓度增加至207.2mg/L。在使OGD1.0.0表达细胞在25L培养中生长11
天(包括在31℃下7天)的另一实验中，抗体浓度是145mg/L。在使OGD1.1.1表达细胞于
50mL培养中在无血清R5CD1培养基中生长7天(包括在31℃下3天)的单独实验中，抗体
浓度是39.3mg/L。
OGD1.1.1抗体的表达。在AS1无血清培养基中接种3.0×10个活细胞/mL并在37℃下温
育。在第4天，将pH调节至7.3，添加浓缩进料，且将温育温度降低至31℃，再生长3天。
使OGD1.0.0表达细胞在100L培养体积中生长，而使OGD1.1.1表达细胞在50mL培养体积
中生长。细胞之间所有其它生长条件均相同。在第7天，如通过蛋白质A纯化及HPLC定量
所测定，表达OGD1.0.0的细胞表达66.12mg/L抗体，而表达OGD1.1.1的细胞表达10.6mg/L
抗体。在通过使细胞在100L培养中生长9天(包括在31℃下5天)来重复使用OGD1.0.0
细胞的实验时，抗体浓度增加至207.2mg/L。在使OGD1.0.0表达细胞在25L培养中生长11
天(包括在31℃下7天)的另一实验中，抗体浓度是145mg/L。在使OGD1.1.1表达细胞于
50mL培养中在无血清R5CD1培养基中生长7天(包括在31℃下3天)的单独实验中，抗体
浓度是39.3mg/L。
[0225] 稳定转染实验的结果显示于下表中，其中POI代表在蛋白质A纯化后通过大小排阻层析(SEC)的感兴趣的峰。与在瞬时转染的COS-1细胞中表达OGD1.0.0及OGD1.1.1时
获得的结果一致，在类似条件下，在稳定转染的CHO细胞中OGD1.0.0抗体的表达水平显著
高于OGD1.1.1的表达。此惊人结果与在上文瞬时转染实验中观察到的表达水平的提高一
致。该结果也表明，培养表达细胞的方式(附着或悬浮)及细胞类型均不显著影响OGD1.0.0
抗体相对于OGD1.1.1的表达提高。
获得的结果一致，在类似条件下，在稳定转染的CHO细胞中OGD1.0.0抗体的表达水平显著
高于OGD1.1.1的表达。此惊人结果与在上文瞬时转染实验中观察到的表达水平的提高一
致。该结果也表明，培养表达细胞的方式(附着或悬浮)及细胞类型均不显著影响OGD1.0.0
抗体相对于OGD1.1.1的表达提高。
[0226] 表4：在CHO细胞中稳定表达的OGD1.0.0及OGD1.1.1的表达水平的比较.
[0227]抗体 CHO稳定池
OGD1.0.0 66.1mg/L
OGD1.1.1 10.6mg/L
OGD1.0.0 66.1mg/L
OGD1.1.1 10.6mg/L
[0228] 实施例3
[0229] OGD1.0.1及OGD1.1.0的瞬时表达分析
[0230] 因为重链和轻链可变区中每一个的J区段均发生变化，不清楚是否单独的变化即可足以引起观察到的OGD1.0.0的显著较高的表达水平，或可能两个变化均有助于提高抗
体表达。
体表达。
[0231] 为研究此问题，申请人重复上述瞬时转染实验，但另外在一个板中组合VH0及VL1构建体，并在另一板中组合VH1及VL0构建体，然后使用ELISA定量抗体表达水平。实验结
果显示于下表中，其表明在VH区中用JH4取代JH3J区段足以产生申请人所观察到的抗体
表达的巨大提高。相反，改变κJ区段(即用JK4取代JK1)似乎不显著影响表达水平。
果显示于下表中，其表明在VH区中用JH4取代JH3J区段足以产生申请人所观察到的抗体
表达的巨大提高。相反，改变κJ区段(即用JK4取代JK1)似乎不显著影响表达水平。
[0232] 表5：组合VH1与VL0及组合VH0与VL1对抗体表达的效果
[0233]抗体 表达
OGD1.0.0 28.5μg/ml
OGD1.0.1 27.6μg/ml
OGD1.1.0 1.9μg/ml
OGD1.1.1 2.4μg/ml
OGD1.0.0 28.5μg/ml
OGD1.0.1 27.6μg/ml
OGD1.1.0 1.9μg/ml
OGD1.1.1 2.4μg/ml
[0234]
[0235] 实施例4
[0236] 抗GDF-8抗体的GDF-8结合
[0237] 使用定量ELISA及表面等离子共振(SPR)分析亲代鼠类抗体、嵌合小鼠-人类抗体(鼠类可变结构域和人类恒定结构域)及人源化抗体OGD1.0.0及OGD1.1.1的GDF-8
结合。在ELISA实验中，通过计算IC50值来确定抗体抑制GDF-8结合其同源高亲和性受体
ActRIIB的能力。使用SPR分析来计算表观KD值。结果显示于表6中。
结合。在ELISA实验中，通过计算IC50值来确定抗体抑制GDF-8结合其同源高亲和性受体
ActRIIB的能力。使用SPR分析来计算表观KD值。结果显示于表6中。
[0238] 对于ELISA，将ActRIIB-Fc融合蛋白质(1μg/ml，于0.2M碳酸钠缓冲液中)包被于96孔平底测定板上，4℃过夜。然后用于PBS 0.1％Tween中的1mg/ml BSA(200μl/孔)
将包被板在室温下封闭1小时或在4℃下封闭过夜，然后洗涤。将不同浓度的抗体与10ng/
ml缀合至生物素的GDF-8组合并在室温下温育45分钟。在温育后，将测试溶液添加至经封
闭的ELISA板(100μl/孔)，并在室温下再温育1小时。在洗涤各孔后，相对于对照用链
霉亲和素-辣根过氧化物酶(温育30分钟)及TMB检测GDF-8结合至固定ActRIIB-Fc的
量。在微量培养板读板器中记录在450nm下的比色测量。将使用鼠类抗体及嵌合抗体的实
验各重复四次并取平均值。
将包被板在室温下封闭1小时或在4℃下封闭过夜，然后洗涤。将不同浓度的抗体与10ng/
ml缀合至生物素的GDF-8组合并在室温下温育45分钟。在温育后，将测试溶液添加至经封
闭的ELISA板(100μl/孔)，并在室温下再温育1小时。在洗涤各孔后，相对于对照用链
霉亲和素-辣根过氧化物酶(温育30分钟)及TMB检测GDF-8结合至固定ActRIIB-Fc的
量。在微量培养板读板器中记录在450nm下的比色测量。将使用鼠类抗体及嵌合抗体的实
验各重复四次并取平均值。
[0239] 在25℃下使用BIACORE 3000(GE Healthcare)机器实施SPR。使用抗小鼠IgG抗体捕获鼠类抗体，而使用蛋白质A捕获人源化抗体。使用氨基偶联化学法将蛋白质A固定
在CM5传感器芯片的所有四个流动室上。通过注射0.2M N-乙基-N-二甲基-氨基-丙
基-碳二亚胺(EDC)及50mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液7分钟来活化表面。将蛋白
质A在10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中稀释至50μg/ml并以10μl/分钟的流速注射3分
钟。然后用1M乙醇胺(ETH)将表面封闭7分钟。蛋白质A的最终固定水平介于1000-1200
反应单位(RU)之间。在固定程序后用运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM
EDTA,0.005％P20)洗涤若干次以平衡表面。将抗体在HBS-EP缓冲液中稀释至0.25μg/ml。
将每种抗体的溶液(5μl)以10μl/min的速率注射经过由蛋白质A包被的流动室2、3或4，
从而产生约200RU的捕获抗体。在0.01M乙酸钠(pH 5.0,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％
P20)中制备GDF-8滴定系列(自4.0nM至0.125nM的2倍稀释物)。所述乙酸钠溶液还用
作运行缓冲液。以50μl/min的流速经2分钟将GDF-8溶液注射经过被捕获抗体，并使其解
离30min。在每一注射及捕获循环后，用30μl 10mM NaPO4,0.5M NaCl(pH 2.5)以50μl/
min的流速使传感器芯片表面再生。使用BIA评估软件(4.1.1版，GE Healthcare)进行数
据分析。通过减去缓冲液及参照表面贡献的信号对数据进行双重参照。使用Langmuir 1:1
模型整体拟合传感图数据并计算KD值。将使用OGD1.0.0的实验各重复三次并取平均值。
在CM5传感器芯片的所有四个流动室上。通过注射0.2M N-乙基-N-二甲基-氨基-丙
基-碳二亚胺(EDC)及50mM N-羟基琥珀酰亚胺(NHS)的溶液7分钟来活化表面。将蛋白
质A在10mM乙酸钠缓冲液(pH 5.0)中稀释至50μg/ml并以10μl/分钟的流速注射3分
钟。然后用1M乙醇胺(ETH)将表面封闭7分钟。蛋白质A的最终固定水平介于1000-1200
反应单位(RU)之间。在固定程序后用运行缓冲液(0.01M HEPES pH 7.4,0.15M NaCl,3mM
EDTA,0.005％P20)洗涤若干次以平衡表面。将抗体在HBS-EP缓冲液中稀释至0.25μg/ml。
将每种抗体的溶液(5μl)以10μl/min的速率注射经过由蛋白质A包被的流动室2、3或4，
从而产生约200RU的捕获抗体。在0.01M乙酸钠(pH 5.0,0.15M NaCl,3mM EDTA,0.005％
P20)中制备GDF-8滴定系列(自4.0nM至0.125nM的2倍稀释物)。所述乙酸钠溶液还用
作运行缓冲液。以50μl/min的流速经2分钟将GDF-8溶液注射经过被捕获抗体，并使其解
离30min。在每一注射及捕获循环后，用30μl 10mM NaPO4,0.5M NaCl(pH 2.5)以50μl/
min的流速使传感器芯片表面再生。使用BIA评估软件(4.1.1版，GE Healthcare)进行数
据分析。通过减去缓冲液及参照表面贡献的信号对数据进行双重参照。使用Langmuir 1:1
模型整体拟合传感图数据并计算KD值。将使用OGD1.0.0的实验各重复三次并取平均值。
[0240] 在所测试的抗体形式之间，使用ELISA测定的IC50值相当。在更精确的SPR测定中，OGD1.0.0与OGD1.1.1相比对GDF-8具有显著较大的结合亲和性。
[0241] 表6：抗GDF-8抗体的GDF-8结合
[0242]抗体 通过ELISA获得的IC50(nM) 通过Biacore获得的KD
鼠类抗体 0.165nM 21.83pM
嵌合抗体 0.165nM 2.99pM
OGD1.0.0 0.140nM 2.59pM
OGD1.1.1 0.140nM 7.25pM
鼠类抗体 0.165nM 21.83pM
嵌合抗体 0.165nM 2.99pM
OGD1.0.0 0.140nM 2.59pM
OGD1.1.1 0.140nM 7.25pM
[0243] 实施例5
[0244] OGD1.0.0抗体的GDF-8中和能力
[0245] 使用报告基因测定来确认抗GDF-8抗体中和GDF-8介导的信号传导的能力。称作pGL3(CAGA)12的报告基因构建体通过在荧光素酶报告基因载体pGL3(Promega)中将12个
CAGA盒置于来自腺病毒主要晚期启动子的TATA盒及转录起始位点上游来构建。在PAI-1
基因启动子中发现的CAGA盒是也对GDF-8反应的TGFβ反应元件。用pGL3(CAGA)12瞬时
转染人类横纹肌肉瘤细胞系A204(ATCC HTB-82)，并在96孔板中在补加有2mM谷氨酰胺、
100U/ml链霉素、100μg/ml青霉素及10％胎牛血清的McCoy’s5A培养基中培养16hr。在室
温下将抗体与GDF-8(10ng/ml)在补加有1mg/ml BSA的培养基中预温育1hr。然后在37℃
下用测试样品和不包括GDF-8及包括GDF-8(10ng/ml)但不添加抗体的对照处理细胞6hr。
使用荧光素酶测定系统(Promega)测量荧光素酶活性。将使用鼠类抗体及嵌合抗体的实验
各重复两次并取平均值，而将使用OGD1.0.0的实验重复三次并取平均值。在所测试的抗体
形式之间，使用报告基因测定确定的EC50值相当。
CAGA盒置于来自腺病毒主要晚期启动子的TATA盒及转录起始位点上游来构建。在PAI-1
基因启动子中发现的CAGA盒是也对GDF-8反应的TGFβ反应元件。用pGL3(CAGA)12瞬时
转染人类横纹肌肉瘤细胞系A204(ATCC HTB-82)，并在96孔板中在补加有2mM谷氨酰胺、
100U/ml链霉素、100μg/ml青霉素及10％胎牛血清的McCoy’s5A培养基中培养16hr。在室
温下将抗体与GDF-8(10ng/ml)在补加有1mg/ml BSA的培养基中预温育1hr。然后在37℃
下用测试样品和不包括GDF-8及包括GDF-8(10ng/ml)但不添加抗体的对照处理细胞6hr。
使用荧光素酶测定系统(Promega)测量荧光素酶活性。将使用鼠类抗体及嵌合抗体的实验
各重复两次并取平均值，而将使用OGD1.0.0的实验重复三次并取平均值。在所测试的抗体
形式之间，使用报告基因测定确定的EC50值相当。
[0246] 表7：抗GDF-8抗体的GDF-8中和活性
[0247]抗体 CAGA EC50nM
鼠类抗体 33.50nM
嵌合抗体 24.25nM
OGD1.0.0 27.30nM
OGD1.1.1 26.00nM
鼠类抗体 33.50nM
嵌合抗体 24.25nM
OGD1.0.0 27.30nM
OGD1.1.1 26.00nM
[0248] 实施例6
[0249] OGD1.0.0抗体增加小鼠的肌肉质量、肌力及瘦肉质量
[0250] 经两周每周一次腹膜内(IP)给予8周龄雄性C57Bl/6小鼠OGD1.0.0(10mg/kg)或媒介物对照(PBS)。每组使用总计8只小鼠。在第14天，通过小型动物NMR成像测定全
身瘦肉质量。在测定瘦肉质量后，将动物安乐死，解剖腓肠肌、四头肌及趾长伸肌(EDL)并称重。还测试EDL肌肉离体产生力的能力。
身瘦肉质量。在测定瘦肉质量后，将动物安乐死，解剖腓肠肌、四头肌及趾长伸肌(EDL)并称重。还测试EDL肌肉离体产生力的能力。
[0251] 在治疗两周后，对照动物的瘦肉质量增加1.66±0.56g，而经OGD1.0.0治疗的动物的瘦肉质量增加3.36±0.62g，这代表相对于对照增加102％。
[0252] 如图2A及图2B中所示，在经OGD1.0.0抗体治疗的动物中，四头肌质量相对于对照增加14.8％，腓肠肌质量相对于对照增加10.3％，EDL肌肉质量相对于对照增加10.8％。
如图3中所示，在经OGD1.0.0抗体治疗的动物中，EDL肌肉施加的总强直性张力相对于经
媒介物对照治疗的小鼠的EDL肌肉产生的力增加14.8％。数据显示为平均值±SEM。
如图3中所示，在经OGD1.0.0抗体治疗的动物中，EDL肌肉施加的总强直性张力相对于经
媒介物对照治疗的小鼠的EDL肌肉产生的力增加14.8％。数据显示为平均值±SEM。
[0253] 还测定全身瘦肉质量和四头肌及腓肠肌的肌肉质量应对OGD1.0.0治疗的剂量反应性。在这些实验中，将12周龄雌性C57Bl/6小鼠分为数组(n＝6)且经4周每周以0.3、
1、3、10或30mg/kg媒介物或OGD1.0.0治疗。在治疗阶段的7、14、21及28天时，使用NMR
成像测定瘦肉质量。在研究阶段结束时，在将测试动物安乐死后，解剖四头肌及腓肠肌并称重。如图4A及图4B中所示，四头肌及腓肠肌的肌肉质量随抗体剂量升高而增加，直至抗体
剂量为约10mg/kg。类似地，如图5A及图5B中所示，全身瘦肉质量随抗体剂量升高而增加，直至抗体剂量为约10mg/kg。数据显示为平均值±SEM。
1、3、10或30mg/kg媒介物或OGD1.0.0治疗。在治疗阶段的7、14、21及28天时，使用NMR
成像测定瘦肉质量。在研究阶段结束时，在将测试动物安乐死后，解剖四头肌及腓肠肌并称重。如图4A及图4B中所示，四头肌及腓肠肌的肌肉质量随抗体剂量升高而增加，直至抗体
剂量为约10mg/kg。类似地，如图5A及图5B中所示，全身瘦肉质量随抗体剂量升高而增加，直至抗体剂量为约10mg/kg。数据显示为平均值±SEM。
[0254] 实施例7
[0255] OGD1.0.0抗体增加mdx小鼠的肌肉质量及瘦肉质量
[0256] 在C57BL/10ScSn小鼠中自发出现X-连接肌养蛋白(dystrophin)基因(Dmd)的mdx突变且在基因位置3185处的外显子内造成点突变，从而将谷氨酰胺密码子转化为终止
密码子并导致肌养蛋白的提前终止。因此，mdx小鼠缺少功能性肌养蛋白并用作人类杜兴
肌营养不良的小型动物模型。在约3周时开始出现肌肉坏死并伴随某种明显的肌肉无力。
尽管肢体骨骼肌的特征在于持续和进行性的变性及坏死，但这可通过卫星细胞活化的再生
性反应及肌肉肥大来补偿。mdx突变体的肌肉弹性整体降低，从而使其更易因延长活化而受伤。突变体小鼠的腿部肌肉最初正常发育，但再生肌管向快纤维和慢纤维类型的分化受到
显著抑制。mdx小鼠的比较温和的表型可部分归因于肌养蛋白相关蛋白质肌营养相关蛋白
(utrophin)的补偿功能，所述蛋白质在成年mdx突变体的再生肌肉纤维中显著上调。与肢
体肌肉相比，mdx小鼠的膈膜肌肉不经历显著再生期，由此连续的营养不良随着年龄减弱这些肌肉。在mdx突变体膈膜中，比颤搐张力、比强直性张力及最大功率均有所降低。
密码子并导致肌养蛋白的提前终止。因此，mdx小鼠缺少功能性肌养蛋白并用作人类杜兴
肌营养不良的小型动物模型。在约3周时开始出现肌肉坏死并伴随某种明显的肌肉无力。
尽管肢体骨骼肌的特征在于持续和进行性的变性及坏死，但这可通过卫星细胞活化的再生
性反应及肌肉肥大来补偿。mdx突变体的肌肉弹性整体降低，从而使其更易因延长活化而受伤。突变体小鼠的腿部肌肉最初正常发育，但再生肌管向快纤维和慢纤维类型的分化受到
显著抑制。mdx小鼠的比较温和的表型可部分归因于肌养蛋白相关蛋白质肌营养相关蛋白
(utrophin)的补偿功能，所述蛋白质在成年mdx突变体的再生肌肉纤维中显著上调。与肢
体肌肉相比，mdx小鼠的膈膜肌肉不经历显著再生期，由此连续的营养不良随着年龄减弱这些肌肉。在mdx突变体膈膜中，比颤搐张力、比强直性张力及最大功率均有所降低。
[0257] 经8周每周一次腹膜内(IP)给予8周龄雄性mdx及对照C57Bl/6小鼠OGD1.0.0(10mg/kg)或媒介物对照(PBS)。在这些实验中，10只mdx小鼠经抗体治疗，8只
小鼠施用媒介物对照，6只C57Bl/6小鼠各自经抗体或PBS治疗。在治疗阶段结束时，测量
全身瘦肉质量、握力及肌肉质量。全身瘦肉质量通过小型动物NMR成像来测定。握力通过
以下方式来测试：将测试动物置于线栅上，使其用所有肢体抓握网目，然后牵拉尾部并测量在动物松开抓握时的最大峰值力。对每只动物的数据从3-5次试验取平均值。在测量身体
瘦肉质量及握力后，将小鼠安乐死，解剖四头肌及腓肠肌并称重。
小鼠施用媒介物对照，6只C57Bl/6小鼠各自经抗体或PBS治疗。在治疗阶段结束时，测量
全身瘦肉质量、握力及肌肉质量。全身瘦肉质量通过小型动物NMR成像来测定。握力通过
以下方式来测试：将测试动物置于线栅上，使其用所有肢体抓握网目，然后牵拉尾部并测量在动物松开抓握时的最大峰值力。对每只动物的数据从3-5次试验取平均值。在测量身体
瘦肉质量及握力后，将小鼠安乐死，解剖四头肌及腓肠肌并称重。
[0258] 如图6A中所示，与经PBS治疗的mdx小鼠的平均4.83±0.4g相比，经OGD1.0.0抗体治疗使mdx小鼠的瘦肉质量增加平均7.28±0.4g。差异在统计学上显著(p<0.05)。因
此，在8周研究中，相对于媒介物治疗对照，mdx小鼠的瘦肉质量增加50％±8.2％。如图
6B中所示，与媒介物治疗的对照相比，抗体治疗还增加mdx小鼠的握力。差异在统计学上显著(p<0.05)。
此，在8周研究中，相对于媒介物治疗对照，mdx小鼠的瘦肉质量增加50％±8.2％。如图
6B中所示，与媒介物治疗的对照相比，抗体治疗还增加mdx小鼠的握力。差异在统计学上显著(p<0.05)。
[0259] 如图7A中所示，与经PBS治疗的相同类型的小鼠相比，抗体治疗增加mdx小鼠及C57Bl/6小鼠的腓肠肌及四头肌的质量。这些增加在统计学上显著(分别对于mdx四头肌
及腓肠肌，p＝0.005和p＝0.002；分别对于C57Bl/6四头肌及腓肠肌，p＝0.001和p＝
0.003)。如图7B中所示，与媒介物治疗的对照小鼠相比，来自抗体治疗的mdx小鼠的腓肠
肌及四头肌的质量分别增加12.2％及12.1％。在经抗体治疗后，与媒介物治疗的对照相比
(未显示)，来自C57Bl/6小鼠的相同类型的肌肉的质量也增加15.2％及12.8％。
及腓肠肌，p＝0.005和p＝0.002；分别对于C57Bl/6四头肌及腓肠肌，p＝0.001和p＝
0.003)。如图7B中所示，与媒介物治疗的对照小鼠相比，来自抗体治疗的mdx小鼠的腓肠
肌及四头肌的质量分别增加12.2％及12.1％。在经抗体治疗后，与媒介物治疗的对照相比
(未显示)，来自C57Bl/6小鼠的相同类型的肌肉的质量也增加15.2％及12.8％。
[0260] 实施例8
[0261] OGD1.0.0抗体增加非人类灵长类动物的肌肉体积和瘦肉质量
[0262] 设计并实施两个研究来调查在食蟹猴中施用OGD1.0.0抗体对身体瘦肉质量及肌肉体积的效果。
[0263] 每一研究持续8周，其中每周通过静脉内施用给予动物抗体且提供过量食物以确保正氮平衡。在第一研究中，以3.0mg/kg、10mg/kg及30mg/kg的剂量向三只雄性及三只雌
性对象中的每一个施用PBS媒介物或OGD1.0.0抗体。在第一次治疗之前且随后在第4周
及第8周时，麻醉动物且随后使用双能X射线吸光测定法(DEXA)、计算机化x射线断层扫描
(CT)及磁共振成像(MRI)来成像以检测并测量身体组成，包括瘦肉质量及脂肪含量。然后
将研究1的对象动物安乐死并进行尸检。在第二研究中，仅使用雄性对象且其仅以10mg/
kg及30mg/kg的剂量(分别地，n＝5个对象和n＝3个对象)接受媒介物(n＝5)或
OGD1.0.0抗体。在8周时如第一研究中一般将对象动物成像。此后，用补充饮食维持动物
且在12、17及26周时再次成像。
性对象中的每一个施用PBS媒介物或OGD1.0.0抗体。在第一次治疗之前且随后在第4周
及第8周时，麻醉动物且随后使用双能X射线吸光测定法(DEXA)、计算机化x射线断层扫描
(CT)及磁共振成像(MRI)来成像以检测并测量身体组成，包括瘦肉质量及脂肪含量。然后
将研究1的对象动物安乐死并进行尸检。在第二研究中，仅使用雄性对象且其仅以10mg/
kg及30mg/kg的剂量(分别地，n＝5个对象和n＝3个对象)接受媒介物(n＝5)或
OGD1.0.0抗体。在8周时如第一研究中一般将对象动物成像。此后，用补充饮食维持动物
且在12、17及26周时再次成像。
[0264] 组合并分析通过DEXA自两个研究测量的身体瘦肉质量的8周数据。结果显示于图8中，其显示在用OGD1.0.0抗体治疗8周后，全身瘦肉质量及腿部瘦肉质量出现剂量反
应性增加。数据表示为平均值±SEM。研究中包括的对象数目为(对于仅施用媒介物)n＝
11、(对于3mg/kg抗体)n＝6、(对于10mg/kg)n＝10及(对于30mg/kg)n＝8。在所测
试的所有抗体剂量下，全身瘦肉质量及腿部瘦肉质量相对于媒介物治疗对照的增加均在统
计学上显著(p<0.05)。此外，发现经30mg/kg治疗的对象的腿部瘦肉质量相对于10mg/kg
的增加也具有统计学显著性(p<0.05)。
应性增加。数据表示为平均值±SEM。研究中包括的对象数目为(对于仅施用媒介物)n＝
11、(对于3mg/kg抗体)n＝6、(对于10mg/kg)n＝10及(对于30mg/kg)n＝8。在所测
试的所有抗体剂量下，全身瘦肉质量及腿部瘦肉质量相对于媒介物治疗对照的增加均在统
计学上显著(p<0.05)。此外，发现经30mg/kg治疗的对象的腿部瘦肉质量相对于10mg/kg
的增加也具有统计学显著性(p<0.05)。
[0265] 有趣的是，如图9中所示，在第二研究中经10mg/kg及30mg/kgOGD1.0.0抗体治疗的对象之间，身体瘦肉质量的增加在第7周最后一次抗体剂量后仍持续数周时间。数据显
示为在每一时间点与PBS媒介物相比的差异。在所示所有周数时，在较高剂量下相对于对
照的增加均在统计学上显著(p<0.05)。在第4周及第8周时，在较低剂量下的增加在统计
学上显著(p<0.09)。
示为在每一时间点与PBS媒介物相比的差异。在所示所有周数时，在较高剂量下相对于对
照的增加均在统计学上显著(p<0.05)。在第4周及第8周时，在较低剂量下的增加在统计
学上显著(p<0.09)。
[0266] 通过CT扫描来测量OGD1.0.0抗体治疗对位于腰椎L3-L5的脊柱背侧的轴上肌体积的效果。如图10A及图10B中所示，与施用PBS的对照相比，在经10mg/kg(n＝5)及
30mg/kg(n＝3)OGD1.0.0抗体治疗8周的对象动物中，轴上肌体积显著增加。肌肉体积的
增加在统计学上显著(p<0.05)。
30mg/kg(n＝3)OGD1.0.0抗体治疗8周的对象动物中，轴上肌体积显著增加。肌肉体积的
增加在统计学上显著(p<0.05)。
[0267] 图11是在经30mg/kg OGD1.0.0抗体治疗4周后来自实例性测试对象的轴上肌的3D呈像。与基线(左图)相比，所得肌肉体积增加22％，其在视觉上明显(右图)。
[0268] 实施例9
[0269] OGD1.0.0抗体缺少Fc结构域效应子功能
[0270] 使用表面等离子共振测试在Fc区中包括三个突变的OGD1.0.0抗体的结合，已知这些突变可消除Fcγ受体(FcγR)与一组Fcγ受体的结合。所有实验均是使用Biacore
T200仪器(GE HealthCare)来实施。简言之，在传感器芯片-SA上经由捕获有约100RU的
OGD1.0.0抗体的生物素标签捕获100RU的GDF-8，之后流过在0-21μM(对于CD32a-131H、
CD16a-158V、CD32b)及0-270nM(对于CD64)浓度范围内的FcγR。对于每一FcγR结合实
验，使用单循环动力学模式连续实施注射。结合及解离期各自持续120s。在解离期结束时，在最后一次注射后，使用0.1％TFA溶液的20s脉冲使含有GDF-8的表面再生。
T200仪器(GE HealthCare)来实施。简言之，在传感器芯片-SA上经由捕获有约100RU的
OGD1.0.0抗体的生物素标签捕获100RU的GDF-8，之后流过在0-21μM(对于CD32a-131H、
CD16a-158V、CD32b)及0-270nM(对于CD64)浓度范围内的FcγR。对于每一FcγR结合实
验，使用单循环动力学模式连续实施注射。结合及解离期各自持续120s。在解离期结束时，在最后一次注射后，使用0.1％TFA溶液的20s脉冲使含有GDF-8的表面再生。
[0271] 未观察到与CD16、CD32a及CD64结合。与之相比，观察到与CD32b的结合，但仅在所测试最高浓度(21μM)下观察到。由于缺少21μM以上的数据点，未测定准确Kd，但可假
定其高于21μM，此与野生型IgG1分子的Kd(即2-4μM)相比视为极弱。这些结果表明，
OGD1.0.0抗体将不具有或具有显著降低的诱导效应子功能的能力。
定其高于21μM，此与野生型IgG1分子的Kd(即2-4μM)相比视为极弱。这些结果表明，
OGD1.0.0抗体将不具有或具有显著降低的诱导效应子功能的能力。
[0272] 实施例10
[0273] 与GDF-8结合的抗GDF-8抗体的晶体结构
[0274] 如此实施例中所解释，解析与人类GDF-8结合的嵌合小鼠及人源化抗GDF-8抗体的晶体结构并使用其来确定抗体及GDF-8内彼此接触的氨基酸的身份。
[0275] 自含有与人类IgG1恒定区连接的鼠类VH及VL区(分别是SEQ ID NO:3及SEQID NO:5)的嵌合抗GDF-8抗体制备Fab片段。然后将Fab片段与人类GDF-8蛋白质混合以
形成结合复合体。在50mM tris盐酸盐(pH7.5)及100mM氯化钠中将蛋白质复合体浓缩至
10.75mg/mL。使用在18℃下针对含有20％PEG MME 5000及100mM双tris(pH 6.5)的溶
液平衡的悬滴法来形成晶体。以类似方式制备含有自人源化抗GDF-8抗体OGD1.0.0制备
的Fab及GDF-8的晶体，只是针对含有20％PEG 3350及200mM氯化钠的无缓冲溶液平衡蛋
白质溶液。
形成结合复合体。在50mM tris盐酸盐(pH7.5)及100mM氯化钠中将蛋白质复合体浓缩至
10.75mg/mL。使用在18℃下针对含有20％PEG MME 5000及100mM双tris(pH 6.5)的溶
液平衡的悬滴法来形成晶体。以类似方式制备含有自人源化抗GDF-8抗体OGD1.0.0制备
的Fab及GDF-8的晶体，只是针对含有20％PEG 3350及200mM氯化钠的无缓冲溶液平衡蛋
白质溶液。
[0276] 在SER-CAT,Advanced Photon Source,Argonne National Laboratory的ID光束在线收集每一晶体的单波长 数据。每一数据集使用冷却至-180℃的单晶。使
用DENZO及Scalepack处理数据 (Z.Otwinowski及W.Minor,“Processing of X-ray
Diffraction Data Collected in Oscillation Mode”,Methods in Enzymology，第276
卷：Macromolecular Crystallography，部 分A，第 307-326 页，1997，C.W.Carter,Jr.及R.M.Sweet编辑，Academic Press(New York))(以引用方式并入)。通过分子
置换使用程序AMORE来解析与GDF-8复合的嵌合抗体的结构(Navaza,J.(2001).
Implementation of molecular replacement in AMoRe.Acta Crystallogr.,Sect.
D:Biol.Crystallogr.57,1367–1372)(以引用方式并入)。用于分子置换搜索中的探针
是PDB条目1HZH。在精修之前，随机选择5％的数据并命名为R自由测试集以监测精修进展。
然后在Coot内利用一系列约缺图重新构建每一复合体的结构(Emsley,P.及Cowtan,K.
(2004)Coot:model-building tools for molecular graphics.Acta Crystallogr.,Sect.
D:Biol.Crystallogr.60,2126–2132)(以引用方式并入)。精修统计学列示于表8中。以
类似方式解析与GDF-8复合的人源化OGD1.0.0的结构，只是所用探针是嵌合抗体的结构。
用DENZO及Scalepack处理数据 (Z.Otwinowski及W.Minor,“Processing of X-ray
Diffraction Data Collected in Oscillation Mode”,Methods in Enzymology，第276
卷：Macromolecular Crystallography，部 分A，第 307-326 页，1997，C.W.Carter,Jr.及R.M.Sweet编辑，Academic Press(New York))(以引用方式并入)。通过分子
置换使用程序AMORE来解析与GDF-8复合的嵌合抗体的结构(Navaza,J.(2001).
Implementation of molecular replacement in AMoRe.Acta Crystallogr.,Sect.
D:Biol.Crystallogr.57,1367–1372)(以引用方式并入)。用于分子置换搜索中的探针
是PDB条目1HZH。在精修之前，随机选择5％的数据并命名为R自由测试集以监测精修进展。
然后在Coot内利用一系列约缺图重新构建每一复合体的结构(Emsley,P.及Cowtan,K.
(2004)Coot:model-building tools for molecular graphics.Acta Crystallogr.,Sect.
D:Biol.Crystallogr.60,2126–2132)(以引用方式并入)。精修统计学列示于表8中。以
类似方式解析与GDF-8复合的人源化OGD1.0.0的结构，只是所用探针是嵌合抗体的结构。
[0277] 表8：抗体:GDF-8共晶体结构的精修统计学
[0278]
[0279] 基于共晶体结构推断的抗体及GDF-8中彼此接触的残基列示于表9中，其中在来自VH链的抗体残基之前具有“H”且参照SEQ ID NO:3进行编号。来自VL链的残基位于“L”之后且参照SEQ ID NO:5来编号。来自成熟人类GDF-8的编号参照SEQ ID NO:1进行编号。
若残基含有至少一对接触原子，则将这些残基限定为彼此接触。若原子的接触比C<1.3，则将这些原子限定为接触原子，其中C＝D12÷(R1+R2)，D12是原子之间的距离，R1是原子1的
vdW半径且R2是原子2的vdW半径。在实践中，接触原子之间的平均距离是约 但在
任意具体情形中，实际距离根据所论述原子的类型而变化。
若残基含有至少一对接触原子，则将这些残基限定为彼此接触。若原子的接触比C<1.3，则将这些原子限定为接触原子，其中C＝D12÷(R1+R2)，D12是原子之间的距离，R1是原子1的
vdW半径且R2是原子2的vdW半径。在实践中，接触原子之间的平均距离是约 但在
任意具体情形中，实际距离根据所论述原子的类型而变化。
[0280] 表9：在共晶体结构中观察到的抗体与GDF-8之间的残基接触
[0281]
[0282]
[0283] 实施例11
[0284] 抗体VH及VL区的进一步人源化
[0285] 基于与GDF-8共结晶的抗GDF-8抗体的序列分析及结构，修饰抗体VH及VL区以尝试使其序列进一步人源化。进一步人源化VH区的序列比对显示于图1A中。进一步人源
化VL区的序列比对显示于图1B中。在产生含有新VH及VL区的表达构建体后，在瞬时转
染的COS-1细胞中产生抗体并使用标准技术来纯化。然后如本文所述来测试抗体对GDF-8
的结合亲和性及中和活性。结果报告于表10中。
化VL区的序列比对显示于图1B中。在产生含有新VH及VL区的表达构建体后，在瞬时转
染的COS-1细胞中产生抗体并使用标准技术来纯化。然后如本文所述来测试抗体对GDF-8
的结合亲和性及中和活性。结果报告于表10中。
[0286] 将来自人源化VH0及VL0区(其源自鼠类抗体)的CDR2氨基酸序列分别与来自人类生殖细胞系VH区DP-47及VL区DPK-9的CDR2序列进行比较。将VH0及VL0CDR2序
列中所有不同于人类序列的残基均变为人类残基。将新VH及VL区分别命名为VH2(SEQ ID
NO:66)及VL2(SEQ ID NO:67)。在竞争性ELISA实验中测试使用VH2与VL0区以及VH0与
VL2区产生的完整抗体与GDF-8的结合。结果显示，完全人源化的VH CDR2显著降低GDF-8
结合，而完全人源化的VL CDR2不降低抗原结合。
列中所有不同于人类序列的残基均变为人类残基。将新VH及VL区分别命名为VH2(SEQ ID
NO:66)及VL2(SEQ ID NO:67)。在竞争性ELISA实验中测试使用VH2与VL0区以及VH0与
VL2区产生的完整抗体与GDF-8的结合。结果显示，完全人源化的VH CDR2显著降低GDF-8
结合，而完全人源化的VL CDR2不降低抗原结合。
[0287] VH及VL区的进一步人源化是基于共晶体结构。在此处，VH及VL区的CDR中的小鼠源残基仅在共晶体结构中观察到其接触GDF-8残基时才予以保留。否则，所有VH及
VL CDR残基均分别变为DP-47及DPK9中的相应的人类残基，以生成VH3(SEQ ID NO:68)及
VL3(SEQ ID NO:69)。在竞争性ELISA实验中，包含VH3及VL0的抗体(即OGD1.3.0)显示
活性显著损失，而包含VH0及VL3的抗体(即OGD1.0.3)似乎保留全部活性。
VL CDR残基均分别变为DP-47及DPK9中的相应的人类残基，以生成VH3(SEQ ID NO:68)及
VL3(SEQ ID NO:69)。在竞争性ELISA实验中，包含VH3及VL0的抗体(即OGD1.3.0)显示
活性显著损失，而包含VH0及VL3的抗体(即OGD1.0.3)似乎保留全部活性。
[0288] 基于VL2中CDR2的序列，VL3的位置50经丙氨酸取代(即S50A)以产生VL4(SEQID NO:71)。使用此VL区制备的包含VH0及VL4的抗体(即OGD1.0.4)保留实质活性。将
不同突变W96L引入VL3的CDR3中以产生VL5(SEQ ID NO:73)。然而，使用此VL区制备的
包含VH0及VL5的抗体(即OGD1.0.5)显示与OGD1.0.0相比降低的活性。
不同突变W96L引入VL3的CDR3中以产生VL5(SEQ ID NO:73)。然而，使用此VL区制备的
包含VH0及VL5的抗体(即OGD1.0.5)显示与OGD1.0.0相比降低的活性。
[0289] 还将新突变引入重链可变区中。将两个取代(即M99F及N101D)引入CDR3中，以形成VH4(SEQ ID NO:70)。使用此VH区制备的包含VH4及VL0的抗体(即OGD1.4.0)具有
显著降低的活性，这与降低的对GDF-8的结合亲和性相关。在CDR2中，实施G53S取代以产
生VH5(SEQ ID NO:72)。使用该VH区制备的包含VH5及VL0的抗体(即OGD1.5.0)保留实
质活性。
显著降低的活性，这与降低的对GDF-8的结合亲和性相关。在CDR2中，实施G53S取代以产
生VH5(SEQ ID NO:72)。使用该VH区制备的包含VH5及VL0的抗体(即OGD1.5.0)保留实
质活性。
[0290] 表10：进一步人源化抗体VH及VL区的表达及活性
[0291]
[0292] 出于所有目的，本申请中所引用的所有出版物、专利、专利申请及其它文件均是全文以引用方式并入本文中，并入程度如同分别表明每一个别出版物、专利、专利申请或其它文件均出于所有目的以引用方式并入一般。
[0293] 尽管已阐释并描述多个特定实施方案，但应了解，可在不背离本发明精神及范畴的情形下作出各种改变。
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