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利用混合的多官能性表面降低蛋白制剂中聚集物含量的方法

阅读:699发布:2024-01-07

专利汇可以提供利用混合的多官能性表面降低蛋白制剂中聚集物含量的方法专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且降低 抗体 和其他蛋白制剂的聚集物 水 平的方法,包括如下步骤:用有机多价阳离子(例如,依沙吖啶、氯己定或聚乙烯亚胺)处理,以及用包含具有负电性化学部分的表面和具有正电性化学部分的表面的组合的组合物处理。,下面是利用混合的多官能性表面降低蛋白制剂中聚集物含量的方法专利的具体信息内容。

1.降低含有所需蛋白的样品的聚集物含量的方法,其中所述方法包括如下步骤:(i)提供第一组件,其为具有负电性表面的第一固相基底;(ii)提供第二组件,其为具有正电性表面的第二固相基底;(iii)将所述样品与所述第一组件和第二组件接触,其中所述第一组件和第二组件经配置使得所述样品可同时接触两个组件,其中操作条件基本上阻止所述所需蛋白与所述第一组件或第二组件的结合;以及(iv)从所述第一组件和第二组件分离所得样品,所述所得样品含有所需蛋白并具有降低的聚集物含量。
2.如权利要求1所述的方法,其中在接触所述样品之前将所述第一组件和第二组件组合。
3.如权利要求1-2所述的方法,其中在将所述样品与所述具有负电性表面的第一基底接触之前将所述样品与具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触。
4.如权利要求3所述的方法,其中在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触之前将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子孵育一段合适的时间。
5.如权利要求1-4所述的方法,其中将所述样品与所述第一组件和第二组件孵育一段合适的时间。
6.如权利要求3-5所述的方法,其中在从所述第一组件和第二组件分离所述具有降低的聚集物含量的样品的步骤中,从所述样品中将所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子去除至这样的程度,其使得所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子与所述第一组件或第二组件的基底结合。
7.如权利要求1-6所述的方法,其中所述第一基底为颗粒。
8.如权利要求1-6所述的方法,其中所述第二基底为颗粒。
9.如权利要求7-8所述的方法,其中一个或多个颗粒基底各自被提供为多个颗粒。
10.如权利要求7-9所述的方法,其中所述第一基底、所述第二基底或二者的颗粒为无孔的。
11.如权利要求7-9所述的方法,其中所述第一基底、所述第二基底或二者的颗粒为多孔的。
12.如权利要求11所述的方法,其中所述多孔的颗粒的孔径足够大,从而允许蛋白制剂中的蛋白进入。
13.如权利要求11所述的方法,其中所述多孔的颗粒的孔径太小,从而不能允许蛋白制剂中的蛋白进入。
14.如权利要求11所述的方法,其中所述多孔的颗粒的平均孔径为约10nm至约
100nm。
15.如权利要求7-14所述的方法,其中所述颗粒被夹在多孔的膜或整体材料之间。
16.如权利要求7-14所述的方法,其中所述颗粒被夹在织物或无定形纤维过滤器之间。
17.如权利要求7-14所述的方法,其中所述颗粒被夹在晶状熔之间。
18.如权利要求7-14所述的方法,其中所述颗粒被包埋在网状聚合物网络中。
19.如权利要求3-18所述的方法,其中所述样品的电导率处于足够高的平,从而当样品接触所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子时,基本上避免所述所需蛋白从所述样品沉淀。
20.如权利要求19所述的方法,其中所述样品的电导率大于20mS/cm。
21.如权利要求20所述的方法,其中所述样品的电导率大于30mS/cm。
22.如权利要求20所述的方法,其中所述样品的电导率大于约40mS/cm。
23.如权利要求20所述的方法,其中所述样品的电导率大于约100mS/cm。
24.如权利要求19所述的方法,其中相比当样品接触所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子时足以基本上避免所述所需蛋白从所述样品沉淀的电导率,所述样品的电导率高出至少5%、10%、20%、50%、100%或200%。
25.如权利要求1-24所述的方法,其中所述聚集物包含所述所需蛋白的均质聚集物。
26.如权利要求25所述的方法,其中基本上清除存在的所述所需蛋白的均质聚集物。
27.如权利要求1-26所述的方法,其中所述聚集物包含所述所需蛋白与污染物的异质聚集物。
28.如权利要求27所述的方法,其中所述异质聚集物具有与所述所需蛋白基本上相同的流体学尺寸。
29.如权利要求27所述的方法,其中所述污染物为核酸、核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白、脂质或细胞培养基组分。
30.如权利要求27-29所述的方法,其中基本上清除存在的所述所需蛋白与污染物的异质聚集物。
31.如权利要求1-30所述的方法,其中所述所需蛋白为抗体或抗体片段
32.如权利要求1-30所述的方法,其中所述所需蛋白为重组蛋白。
33.如权利要求1-30所述的方法,其中所述所需蛋白为凝血因子。
34.如权利要求33所述的方法,其中所述凝血因子为因子VIII。
35.如权利要求32所述的方法,其中所述所需蛋白为生长激素
36.如权利要求31所述的方法,其中所述样品为细胞培养收获物、细胞培养物上清液、来源于细胞培养物的含有抗体的溶液、或来自先前的蛋白纯化阶段的含有抗体的溶液。
37.如权利要求31所述的方法,其中所述培养的细胞为哺乳动物细胞、细菌细胞或酵母细胞。
38.如权利要求35所述的方法,其中所述样品为来自先前的蛋白纯化阶段的含有抗体的溶液。
39.如权利要求38所述的方法,其中所述样品为来自层析柱的洗脱物。
40.如权利要求1-39所述的方法,其中所述样品可为未纯化的、处于中等纯化水平、或高度纯化的。
41.如权利要求1-40所述的方法,其中通过使制剂流过所述第一组件和第二组件来将所述样品与所述第一组件和第二组件接触。
42.如权利要求1-41所述的方法,其中所述第一组件的表面的负电性通过如下物质赋予:表现多种化学官能性的一种或多种复合化学部分,或在所述表面上混合的单种化学基团和复合化学基团的组合,或具有不同化学组分的表面的组合。
43.如权利要求1-42所述的方法,其中所述第一组件的表面的负电性部分地由来自以下的部分赋予:亚基二乙酸、乙二醇(氨基乙基醚)二乙酸、次氮基乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、羧酸、亚硫酸、磺酸盐和磷酸
44.如权利要求1-41所述的方法,其中所述第二组件的表面的正电性通过如下物质赋予:表现多种化学官能性的一种或多种复合化学基团,或在所述表面上混合的单种化学基团和复合化学基团的组合,或具有不同化学组分的表面的组合。
45.如权利要求1-44所述的方法,其中所述第二组件的表面的正电性部分地由来自以下的部分赋予:三(2-氨基乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树状物(乙二胺核)、去胺、伯胺、仲胺、叔胺和季胺。
46.如权利要求1-45所述的方法,其中第一组件的表面的负电性部分地由亚氨基二乙酸赋予,并且所述第二组件的表面的正电性部分地由三(2-氨基乙基)胺赋予。
47.如权利要求1-46所述的方法,其中所述第一组件具有结合表面的化学部分,所述化学部分具有金属亲和官能性。
48.如权利要求1-46所述的方法,其中所述第二组件的正电性表面包含结合表面的化学部分,所述化学部分具有金属亲和官能性。
49.如权利要求47-48所述的方法,其中所述基底中的至少一个具有除所述具有金属亲和官能性的、结合表面的化学部分之外的一个或多个化学部分,其中此类其他的化学部分增强所述组件中的一个或多个参与与所述蛋白制剂的蛋白氢键结合、疏水相互作用或π-π结合的能力。
50.如权利要求47-48所述的方法,其中所述具有金属亲和官能性的、结合表面的化学部分为多配位基金属螯合性部分。
51.如权利要求1-50所述的方法,其中所述第一组件的正电性表面包含具有金属亲和官能性的、结合表面的化学部分,所述第二组件的负电性表面包含具有金属亲和官能性的、结合表面的化学部分,并且另一表面包含具有增加的疏水官能性的、结合表面的化学部分。
52.如权利要求3-50所述的方法,其中所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子选自:依沙吖啶、9-氨基吖啶(氨吖啶)、3,6吖啶二胺(原黄素)、吖啶琐辛、吖啶氯(酚吖啶)、吖啶橙、奎吖因、乐杀螨、吖啶、吖啶-9-羧酸、氯甲吖啶(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、酚藏花红、吩噁嗪、吩噻嗪、吖啶黄(氯化3,6-二氨基-10-甲基吖啶和3,6-吖啶二胺)、聚乙烯亚胺、氯己定和聚氨基酸。
53.如权利要求51所述的方法,其中所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子为依沙吖啶、聚乙烯亚胺、或氯己定、或以上的盐。
54.如权利要求52所述的方法,其中所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子为依沙吖啶或其盐。
55.如权利要求51-53所述的方法,其中所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量为约0.01%至约0.05%。
56.如权利要求51-53所述的方法,其中所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量小于约0.01%。
57.如权利要求51-53所述的方法,其中所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量小于约0.005%。
58.如权利要求51-53所述的方法,其中所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量小于约0.001%。
59.如权利要求51-53所述的方法,其中所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量为约0.020%至约0.025%。
60.如权利要求3-50所述的方法,其中在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤前,用选自以下的多种有机多价阳离子处理所述样品:聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺、依沙吖啶和氯己定,和以上的盐。
61.如权利要求60所述的方法,其中用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的所述有机多价阳离子以小于1%的浓度提供。
62.如权利要求60所述的方法,其中用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的所述有机多价阳离子以约0.01%至约0.05%的浓度提供。
63.如权利要求60所述的方法,其中用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的所述有机多价阳离子以小于约0.01%的浓度提供。
64.如权利要求60所述的方法,其中用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的所述有机多价阳离子以小于约0.005%的浓度提供。
65.如权利要求60所述的方法,其中用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触步骤之前处理所述样品的所述有机多价阳离子以小于约0.001%的浓度提供。
66.如权利要求60所述的方法,其中用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的所述有机多价阳离子以约0.020%至至约0.025%的浓度提供。
67.如权利要求1-66所述的方法,其中在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前,还将所述样品与选自如下的可溶性有机调节剂接触:非离子型有机聚合物、有机溶剂表面活性剂和酰脲。
68.如权利要求1-67所述的方法,其中在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前,还将所述样品与抗病毒剂接触。
69.如权利要求68所述的方法,其中所述抗病毒剂为非多价的有机阳离子。
70.如权利要求68所述的方法,其中所述抗病毒剂选自:苯扎氯铵、亚甲蓝和三(正丁基)磷酸盐
71.如权利要求65-70所述的方法,其中所述抗病毒剂存在的量小于约1%(w/v)。
72.如权利要求68所述的方法,其中所述抗病毒剂存在的量小于约0.1%(w/v)。
73.如权利要求72所述的方法,其中所述抗病毒剂存在的量小于约0.01%(w/v)。
74.如权利要求73所述的方法,其中所述抗病毒剂存在的量小于约0.001%(w/v)。
75.如权利要求1-74所述的方法,还包括在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前的另外的步骤,即将所述样品与足够让酰脲在所述蛋白制剂中过饱和的量的酰脲接触,以及使含有所述所需蛋白的上清液与所述样品的固相或未溶解部分分离。
76.如权利要求75所述的方法,其中将所述样品与所述酰脲接触的步骤在将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤之前发生。
77.如权利要求75所述的方法,其中将所述样品与所述酰脲接触的步骤与将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤基本上同时发生。
78.如权利要求75所述的方法,其中将所述样品与所述酰脲接触的步骤在将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤之后发生。
79.如权利要求75-78所述的方法,其中所述酰脲选自:尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素、尿囊素氯羟、尿囊素羟铝、hemocane、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧-4-咪唑烷基脲和嘌呤。
80.如权利要求79所述的方法,其中所述酰脲为尿囊素。
81.如权利要求79所述的方法,其中所述酰脲为尿酸。
82.如权利要求80所述的方法,其中所述尿囊素存在的量大于0.5%(w/v)。
83.如权利要求82所述的方法,其中所述尿囊素存在的量大于约1%(w/v)。
84.如权利要求81所述的方法,其中所述尿酸存在的量大于0.0025%(w/v)。
85.如权利要求83所述的方法,其中所述尿囊素存在的量大于约2%(w/v)。
86.如权利要求83所述的方法,其中所述尿囊素存在的量大于约5%(w/v)。
87.如权利要求83所述的方法,其中所述尿囊素存在的量大于约10%(w/v)。
88.如权利要求67所述的方法,其中将所述样品与所述有机调节剂接触的步骤在将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤之前发生。
89.如权利要求67所述的方法,其中将所述样品与所述有机调节剂接触的步骤与将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤基本上同时发生。
90.如权利要求67所述的方法,其中将所述样品与所述有机调节剂接触的步骤在将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤之后发生。
91.如权利要求88-90所述的方法,其中所述有机调节剂为选自如下的非离子型有机聚合物:甘油、聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇。
92.如权利要求91所述的方法,其中所述非离子型有机聚合物具有约500D或更小的平均分子量。
93.如权利要求88-90所述的方法,其中所述有机调节剂为选自如下的有机溶剂:乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲亚砜、乙醇、异丙醇和苯氧乙醇。
94.如权利要求88-93所述的方法,其中所述有机调节剂以约1%(w/v)或更大的浓度提供。
95.如权利要求88-90所述的方法,其中所述有机调节剂为选自以下的表面活性剂:
Tween、triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡萄糖苷。
96.如权利要求95所述的方法,其中所述表面活性剂以约1%(w/v)或更小的浓度提供。
97.如权利要求95所述的方法,其中所述表面活性剂以约0.1%(w/v)或更小的浓度提供。
98.如权利要求91-93所述的方法,其中所述有机调节剂为以亚饱和量提供的酰脲。
99.如权利要求98所述的方法,其中所述酰脲选自:尿素、乙内酰脲和尿囊素。
100.为方便实施权利要求1-99中任一项所述的方法而提供的试剂盒。

说明书全文

利用混合的多官能性表面降低蛋白制剂中聚集物含量的方

技术领域

[0001] 本发明涉及用于纯化蛋白尤其是抗体的材料。其具体涉及用于降低蛋白聚集物含量的材料。其还涉及将这些能与其他纯化方法整合以实现蛋白的期望平的最终纯化。
[0002] 发明背景
[0003] 已证明宿主细胞来源的污染物与通过体外细胞培养方法产生的重组蛋白间自发形成非天然的异源聚集物(Shukla et al.,Biotechnol.Progr.(2008)24:1115-1121;Luhrs et al.,J.Chromatogr.B(2009)877:1543-1552;Mechetner et al.,J.Chromatogr.B(2011)879:2583-2594;Gagnon et al.,J.Chromatogr.A,(2011)1218:2405-2412;
Gagnon,Bioprocessing J.(2010)9(4):14-24)。这些异源聚集物在两个方面可被认为是非天然的:1)组成性污染物常常为非人来源的,由活的非人宿主细胞分泌,或在非人的宿主细胞死亡裂解后释放至培养基中。在活的人体中,不存在此类非人的污染物;以及2)相比人体内系统(其中死细胞组分被快速清除),组成性污染物积累至较高浓度。因此,组成性产物以在生命系统中通常不会出现的浓度暴露于高水平的强相互作用的污染物。同时,高表达水平的重组蛋白使得其成为适于与这些非人的污染物非特异性结合的底物,从而促进不同组分的非期望异源聚集物的形成。
[0004] 异源聚集物的污染蛋白含量在某种程度上通过直接靶向污染蛋白(Shukla et al.和Gagnon et al.,同上)和间接通过靶向针对污染蛋白的对应的DNA组分(Luhrs et al.和Gagnon,同上)进行处理。已证明在一些复合物解离时出现了抗体聚集物水平的降低(Shukla et al.,Mechetner et al.和Gagnon,同上)。已公开了阴离子交换剂降低抗体-污染物复合物水平的能力(Luhrs et al.和Gagnon et al.,同上),但还未证明存在能够完全清除异源聚集物的阴离子交换处理。尺寸排阻、阳离子交换和疏水相互作用层析法也被用于尝试降低异源聚集物,但这些技术通常不如阴离子交换(Gagnon et al.,同上)。
[0005] 与抗体形成稳定结合物的污染物的具体来源并非总是已知的(参见,例如Shukla et al.同上)。一些努力聚焦于DNA污染物,而很少注意到其他可能的污染物的具体来源(Gagnon et al.和Gagnon,同上)。一些证明宿主污染物与抗体制备中的聚集物关联性的努力特别地聚焦于包含核染色质降解产物的污染物(Luhrs et al.和Mechetner et al.同上)。在这些实例中,聚合可直接通过抗体对核染色质代谢产物如组蛋白和DNA的免疫特异性介导。还证明核染色质代谢产物能够通过非特异性相互作用与抗体形成稳定复合物。因此,对不包含核染色质代谢产物的抗原具有已知免疫特异性的单克隆抗体,可与来源于死的宿主细胞的细胞核的核小体、组蛋白和DNA形成具有不同类型的高度稳定的聚集物。特别地,已证明核染色质代谢产物在高分子量(HMW)聚集物中有高度代表性。HMW聚集物特别值得关注,因为其疑似参与促进治疗中和性抗体的形成。HMW聚集物通常被定义为大小比目标抗体的较小倍数更大的聚合物。例如,2-抗体结合物不被认为是HMW聚集物,大多数4-抗体聚集物也不是。然而,大小大得多的聚集物如对应于约8至约10或更多的抗体的聚集物通常可被归类为HMW聚集物。
[0006] 用预期可能解离异源聚集物的试剂处理抗体制剂证明通常是无效的。例如,采用高浓度的尿素、盐或二者的组合不会大幅解离IgM-污染物异源聚集物(Gagnon et al.同上)。以尿素、乙醇表面活性剂在洗脱前洗涤的蛋白A亲和层析被证明相比无洗涤能够更有效地降低异源聚集物水平(Shukla et al.同上),其与将尿素、盐和EDTA与蛋白G亲和层析结合的洗脱前洗涤一样(Mechetner et al.同上)。以尿素在洗脱前洗涤的阴离子交换层析被证明相比无尿素洗涤能够更有效地降低异源聚集物(Gagnon et al.同上)。具有洗脱前的EDTA洗涤的阳离子交换层析也被证明相比无洗涤能够更有效地降低异源聚集物(Gagnon et al.同上)。最后,具有尿素和/或盐的洗脱前洗涤的羟磷灰石相比无此类洗涤也能够更有效地降低异源聚集物(Gagnon同上)。尽管存在这些观察结果,一般而言,将解离剂用于与层析柱结合的抗体的洗脱前洗涤仅存在适度的成功。
[0007] 有机多价阳离子已被证明能够用于沉淀酸性蛋白(Farhner et al.,美国专利 申 请 第20080193981 号;Ma et al.,J.Chromatogr.B(2010)878:798-806;Peram et al.,Biotechnol.Progr.,(2010)26:1322-1326;Glynn,U.Gottschalk(ed.),Process Scale Purification of Antibodies,J.T.Wiley and Sons,(2009)Hoboken,309-324),和 用 于 沉 淀 DNA 和 内 毒 素 (Glynn 同 上;Cordes et al.,Biotechnol.Progr.,(1990)6:283-285;Dissing et al.,Bioseparation,(1999)7221:9-11), 以 及使病毒失活(Bernhardt,美国专利5,559,250)。还证明多价金属阳离子能够从一些蛋白制剂去除DNA和内毒素(Akcasu et al.,Nature,(1960)187:323-324;Matsuzawa et al.,Nucl.Acids Res.,(2003)3(3):163-164;Christensen et al.,Prot.Expr.Purif.,(2004)37:468-471;Kejnovsky et al.,Nucl.Acids Res.,(1997)25:1870-1871;Ongkudon et al.,Anal.Chem.,(2011)83391:13-17)。
[0008] 发明概述
[0009] 在某些实施方案中,本发明提供了降低样品如含有期望蛋白的蛋白制剂的聚集物含量的方法;某些方法包括如下步骤:(i)提供第一组件,其为具有负电性表面的第一固相基底;(ii)提供第二组件,其为具有正电性表面的第二固相基底;(iii)将所述样品与所述第一组件和第二组件接触,其中所述第一组件和第二组件经配置使得所述样品可同时接触两个组件,操作条件基本上阻止所述所需蛋白与所述第一组件或第二组件结合;以及(iv)从所述第一组件和第二组件分离所得样品,所述所得样品含有所述所需蛋白并具有降低的聚集物含量。附图说明
[0010] 图1显示了在纯化接受了尿囊素-依沙吖啶批次颗粒处理的IgM-529中以所示的间隔采集的图谱的尺寸交换色谱(SEC)的时间进程图。Aggr:聚集物。HCP:宿主细胞蛋白。实线:280nm。虚线:254nm。所有时间标度与中间图的相同。
[0011] 图2A显示了滤除了IgM-84的细胞培养物上清液(CCS)的SEC图谱。Aggr:聚集物。HMW:高分子量聚集物。HCP:宿主细胞蛋白。LMW:低分子量细胞培养基组分。实线:280nm。虚线:254nm。
[0012] 图2B显示了尿囊素-依沙吖啶和过柱处理之后图2A的滤除了IgM-84的CCS的SEC图谱。Aggr:聚集物。HCP:宿主细胞蛋白。实线:280nm。虚线:254nm。
[0013] 图3显示了以尿囊素-依沙吖啶处理和过柱处理之前(左图)和之后(右图)的单克隆IgG HER2CCS的SEC图谱。Aggr:聚集物。HCP:宿主细胞蛋白。LMW:低分子量细胞培养基组分。LC:轻链。实线:280nm。虚线:254nm。
[0014] 发明详述
[0015] 令人吃惊地,发现了在本发明的某些实施方案中,相比仅依赖阴离子交换剂或阳离子交换剂的材料,包含具有负电性表面的固体物质与具有正电性表面的固体物质的组合的物质的组合能够更有效地降低蛋白制剂中高分子量(HMW)聚集物和异源聚集物的含量。在某些实施方案中,所述组合尤其能够降低包含核染色质残留物如核小体和/或组蛋白和/或DNA的聚集物的含量。在某些实施方案中,本发明还额外具有清除可能已被添加至蛋白制剂的试剂如多价离子和抗病毒化合物的能力。
[0016] 令人吃惊地,发现了在本发明的某些实施方案中,蛋白制剂的聚集物水平可通过如下组合极大地降低,即向此类制剂中添加具有混合的化学特性的可溶性多价阳离子以及随后添加具有混合的化学特性的不可溶的颗粒或其他底物。实验结果证明相比使用盐和/或离液剂(chaotrope)的液相处理、单一机制的固相方法或固相方法与预期的解离聚集物的洗涤的组合,该处理允许明显更大的高分子量(HMW)聚集物含量降低和异源聚集物解离。该方法的一个有价值的优势在于所述可溶性试剂本身被从所述蛋白制剂清除,产生基本上无聚集物的蛋白制剂,其也基本上无多价阳离子。令人吃惊地,这甚至可在多价阳离子和不可溶的颗粒以非常低的量存在如分别为约0.02%至约0.025%和约2%至约5%时,在1小时或更少的时间段内发生。实验证据还证明在本发明的某些实施方案中,提前以有机多价阳离子处理样品能够改善通过负电性和正电性颗粒的组合获得的结果。
[0017] 在某些实施方案中,本发明提供了降低重组蛋白制剂,特别是包含抗体、凝血因子如因子VIII的蛋白质及以及重组蛋白的聚集物含量的方法。不受任何具体理论的束缚,出乎意料地发现,聚集物通过与外来物质的相互作用来稳定。将抗体制剂与相比抗体对外来物质具有更高亲和力的多官能性表面接触(所述外来物质随后可通过简单地去除与外来物质结合的多官能性表面加以清除),具有替换外来物质的效果。在某些实施方案中,聚集物水平被大幅降低,并且抗体回收有时增加至超过据信存在的量,表明了该方法解离聚集物并将解离的抗体恢复至可纯化的产物类群的能力。在某些实施方案中,所述方法还可解离单种抗体与污染物的复合物。除了产生具有较低聚集物类群的抗体制剂外,在某些实施方案中,处理的抗体还展现较低的宿主蛋白、DNA、内毒素和病毒污染物。
[0018] 在某些实施方案中,本发明的方法包括将包含所需抗体的样品与至少两个表面(一个主要带负电,另一个主要带正电)同时接触。每个表面可包含另外的化学官能性。另外的化学官能性可包含疏水性结合、π-π结合、氢键结合或金属亲和官能性等。在某些实施方案中,负电性表面和正电性表面提供了不同程度的功效,明显地表明它们各自有利于与外来物质的不同子集的相互作用。某些实施方案的该特征通过如下观察得到进一步的证明,即负电性表面和正电性表面在一起使用时比单独使用更为有效。
[0019] 在某些实施方案中,所述表面可包含分布于整个蛋白制剂,或包装于柱子中,或开始分散然后包装于柱子中的多孔的或无孔的颗粒。
[0020] 在某些实施方案中,可通过单独或组合其他试剂以可溶性有机多价阳离子预处理所述样品来促进聚集物去除,在这种情况下所述方法具有去除有机多价阳离子以及潜在地去除其他试剂的额外功效。在其他情况下,所述方法的效用可通过单独地或在多价阳离子的存在下包含抗病毒剂来增强。
[0021] 在某些实施方案中,本发明提供了降低包含所需蛋白的样品如蛋白制剂的聚集物含量的方法;某些方法包括如下步骤:(i)提供第一组件,其为具有负电性表面的第一固相基底;(ii)提供第二组件,其为具有正电性表面的第二固相基底;(iii)将所述样品与所述第一组件和第二组件接触,其中所述第一组件和第二组件经配置使得所述样品可在能够基本上防止所述所需蛋白与所述第一组件或第二组件结合的操作条件下同时与两个组件接触;以及(iv)从所述第一组件和第二组件分离所得样品,所述所得样品含有所需蛋白并具有降低的聚集物含量。
[0022] 在一些实施方案中,将所述第一组件和第二组件在接触所述样品之前组合。
[0023] 在一些实施方案中,可将所述第一组件和第二组件与其他组件接触,所述其他组件具有带电的或不带电的化学表面,并且可以具有能够参与与所述样品的组分的氢键结合、疏水相互作用、金属亲和力或其他分子间相互作用的其他化学部分。
[0024] 在前述实施方案的一个或多个中,在所述样品接触具有负电性表面的第一基底之前将所述样品与具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触。
[0025] 在前述实施方案的一个或多个中,在所述样品接触所述第一组件和第二组件之前将所述样品与具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子孵育一段合适的时间。
[0026] 在前述实施方案的一个或多个中,将所述样品与所述第一组件和第二组件孵育一段合适的时间。
[0027] 在前述实施方案的一个或多个中,在从所述第一组件和第二组件分离具有降低的聚集物含量的样品的步骤中,从所述样品去除具有混合的化学特性的有机多价阳离子。在某些实施方案中,在从所述第一组件和第二组件分离具有降低的聚集物含量的样品的步骤中,从所述样品将具有混合的化学特性的有机多价阳离子去除至这样的程度,其使得具有混合的化学特性的有机多价阳离子与第一组件或第二组件或除所述第一组件和第二组件外的另外的组件的基底结合,所述第三组件联合第一组件和第二组件与所述样品接触。例如,此类第三组件可为具有疏水官能性的物质。
[0028] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第一基底为颗粒。
[0029] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第二基底为颗粒。
[0030] 在前述实施方案的一个或多个中,所述颗粒基底或基底各自提供为多个颗粒。
[0031] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第一基底、所述第二基底或二者的颗粒为无孔的。
[0032] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第一基底、所述第二基底或二者的颗粒为多孔的。
[0033] 在前述实施方案的一个或多个中,所述多孔的颗粒的孔径足够大,从而能够允许蛋白制剂中的蛋白进入。
[0034] 在前述实施方案的一个或多个中,所述多孔的颗粒的孔径太小,从而不能允许蛋白制剂中的蛋白进入。
[0035] 在前述实施方案的一个或多个中,所述多孔的颗粒的平均孔径为约10nm至约100nm。
[0036] 在前述实施方案的一个或多个中,所述颗粒被夹在多孔的膜或整体材料之间。
[0037] 在前述实施方案的一个或多个中,所述颗粒被夹在织物或无定形纤维过滤器之间。
[0038] 在前述实施方案的一个或多个中,所述颗粒被夹在晶状熔之间。
[0039] 在前述实施方案的一个或多个中,所述颗粒被包埋在网状聚合物网络中。
[0040] 在某些实施方案中,所述第一和/或第二和/或其他组件/基底为非颗粒。在某些此类实施方案中,所述第一和/或第二组件的固相基底独立地为纤维、中空纤维、膜或整体材料。
[0041] 在前述实施方案的一个或多个中,所述操作条件具有这样的特性,其能够基本上防止所述所需蛋白与所述第一组件和第二组件的结合。在某些这类实施方案中,所述操作条件还能防止所需蛋白通过与所述第一组件或第二组件或其他基底的相互作用而大量损失。此类条件可包括足够高的电导率值,从而能够中止所述所需蛋白与第一组件和第二组件之间的强电荷相互作用。这类条件还可中止所述所需蛋白与多价阳离子或颗粒之间的强电荷相互作用。这类操作条件可包括接触所述样品的除所述第一组件和第二组件外的其他添加剂的存在,从而适应所述所需蛋白与所述第一组件或第二组件之间的其他类型的化学相互作用。
[0042] 在前述实施方案的一个或多个中,所述样品的电导率处于足够高的水平,从而当样品接触具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子时,基本上避免所需蛋白从所述样品沉淀。
[0043] 在一个或多个实施方案中,本发明的方法展现出耐受可通过电导率测得的高盐浓度的能力。例如,在一些实施方案中,可利用具有约15mS/cm的电导率的洗脱液纯化样品。在一个或多个实施方案中,电导率可为至少13mS/cm。在一些实施方案中,对于一些蛋白,电导率可以更低,限制条件是盐浓度足以防止所需的蛋白与所述第一组件和第二组件结合。
因此,在一些实施方案中,电导率可低至约5mS/cm至约10mS/cm。
[0044] 在前述实施方案的一个或多个中,所述样品的电导率大于20mS/cm。
[0045] 在前述实施方案的一个或多个中,所述样品的电导率大于30mS/cm。
[0046] 在前述实施方案的一个或多个中,所述样品的电导率大于约40mS/cm。
[0047] 在前述实施方案的一个或多个中,所述样品的电导率大于约100mS/cm。
[0048] 在前述实施方案的一个或多个中,相比当样品接触所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子时足以基本上避免所述所需蛋白从所述样品沉淀的电导率,所述样品的电导率高出至少5%、10%、20%、50%、100%或200%。在前述实施方案的一个或多个中,相比足以基本上避免所述所需蛋白与所述第一组件或第二组件结合的电导率,所述样品的电导率要高至少5%、10%、20%、50%、100%或200%。
[0049] 在前述实施方案的一个或多个中,所述聚集物包含所述所需蛋白的均质聚集物。
[0050] 在前述实施方案的一个或多个中,基本上清除存在的所述所需蛋白的均质聚集物。
[0051] 在前述实施方案的一个或多个中,所述聚集物包含所述所需蛋白与污染物的异源聚集物。
[0052] 在前述实施方案的一个或多个中,所述异源聚集物与所述所需蛋白具有基本上相同的流体动力学尺寸。
[0053] 在前述实施方案的一个或多个中,污染物可为核酸、核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白、脂质或细胞培养基组分。
[0054] 在前述实施方案的一个或多个中,基本上清除存在的所述所需蛋白与污染物的异源聚集物。
[0055] 在前述实施方案的一个或多个中,所述所需蛋白为抗体或抗体片段或者抗体或抗体片段的缀合物。在某些实施方案中,所述抗体为IgG、IgM、IgD、IgE或IgA。在某些实施方案中,所述抗体片段为Fc融合蛋白或免疫缀合物。
[0056] 在前述实施方案的一个或多个中,所述所需蛋白为重组蛋白。
[0057] 在前述实施方案的一个或多个中,所述所需蛋白为凝血因子。
[0058] 在前述实施方案的一个或多个中,所述凝血因子为因子VIII。
[0059] 在前述实施方案的一个或多个中,所述所需蛋白为生长激素。在某些这类实施方案中,所述生长激素为人生长激素。
[0060] 在前述实施方案的一个或多个中,所述样品为细胞培养收获物、细胞培养物上清液、来源于细胞培养物的含有抗体的溶液或来自先前的蛋白纯化阶段的含有抗体的溶液。在一些这类实施方案中,所述培养的细胞为哺乳动物细胞。在某些这类实施方案中,所述培养的细胞为细菌细胞。在一些这类实施方案中,所述培养的细胞为酵母细胞。
[0061] 在前述实施方案的一个或多个中,所述样品为来自先前的蛋白纯化阶段的含有抗体的溶液。
[0062] 在前述实施方案的一个或多个中,所述样品为来自层析柱的洗脱液。
[0063] 在前述实施方案的一个或多个中,所述样品可为纯化的、处于中等纯化水平、或高度纯化的。
[0064] 在前述实施方案的一个或多个中,通过将所述制剂流过所述第一组件和第二组件来将所述样品与所述第一组件和第二组件接触。
[0065] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第一组件的表面的负电性通过如下物质赋予:表现多种化学官能性的一种或多种复合化学部分,或在所述表面上混合的单种化学基团和复合化学基团的组合,或具有不同化学组分的表面的组合。
[0066] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第一组分的表面的负电性部分地由来自如下物质的部分赋予:亚基二乙酸、乙二醇(氨基乙基醚)二乙酸、次氮基乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、羧酸、亚硫酸、磺酸盐和磷酸
[0067] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第二组件的表面的正电性通过如下物质赋予:表现多种化学官能性的一种或多种复合化学基团,或在所述表面上混合的单种化学基团和复合化学基团的组合,或具有不同化学组分的表面的组合。
[0068] 在前述实施方案的一个或多个中,其他的固体组件/基底的表面可具有另外的正电性和/或负电性和/或不带电的化学基团,如可能能够参与氢键结合、疏水相互作用、金属亲和力或其他化学相互作用的那些。在具体的实施方案中,金属亲和力可包括对金属离子、零价金属或其组合的亲和力。
[0069] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第二组件的表面的正电性部分地由选自如下物质的部分赋予:三(2-氨基乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树状物(乙二胺核)、去胺、伯胺、仲胺、叔胺、季胺及其组合。
[0070] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第一组件的表面的负电性部分地由亚氨基二乙酸赋予,并且所述第二组件的表面的正电性部分地由三(2-氨基乙基)胺赋予。
[0071] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第一组件具有结合表面的化学部分,其具有金属亲和官能性。
[0072] 在前述实施方案的一个或多个中,所述第二组件的正电性表面包含结合表面的化学部分,其具有金属亲和官能性。
[0073] 在前述实施方案的一个或多个中,所述基底中的至少一个具有除所述具有金属亲和官能性的、结合表面的化学部分外的一种或多种化学部分,其中这类其他的化学部分增强所述组件中的一个或多个参与与蛋白制剂的蛋白的氢键结合、疏水相互作用或π-π结合的能力。
[0074] 在前述实施方案的一个或多个中,所述具有金属亲和官能性的、结合表面的化学部分为多配位基金属螯合部分。
[0075] 在前述实施方案的一个或多个中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子选自:依沙吖啶、9-氨基吖啶(氨吖啶)、3,6吖啶二胺(原黄素)、吖啶琐辛、吖啶氯(酚吖啶)、吖啶橙、奎吖因、乐杀螨、吖啶、吖啶-9-羧酸、氯甲吖啶(acranil)(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、酚藏花红、吩噁嗪、吩噻嗪、吖啶黄(氯化3,6-二氨基-10-甲基吖啶和3,6-吖啶二胺)、聚乙烯亚胺、氯己定和聚氨基酸。
[0076] 在前述实施方案的一个或多个中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子为依沙吖啶、聚乙烯亚胺、或氯己定,或者以上的盐。
[0077] 在前述实施方案的一个或多个中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子为依沙吖啶或其盐。
[0078] 在前述实施方案的一个或多个中,其中所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量为约0.01%至约0.05%。
[0079] 在前述实施方案的一个或多个中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量小于约0.01%。
[0080] 在前述实施方案的一个或多个中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量小于约0.005%。
[0081] 在前述实施方案的一个或多个中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量小于约0.001%。
[0082] 在前述实施方案的一个或多个中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量为约0.020%至约0.025%。
[0083] 在前述实施方案的一个或多个中,在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前,用选自以下的多种有机多价阳离子处理所述样品:聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺、依沙吖啶和氯己定,和以上的盐。
[0084] 在前述实施方案的一个或多个中,以小于1%的浓度或小于0.1%的浓度提供用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理样品的有机多价阳离子。
[0085] 在前述实施方案的一个或多个中,以约0.01%至约0.05%的浓度提供用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的有机多价阳离子。
[0086] 在前述实施方案的一个或多个中,以小于约0.01%的浓度提供用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的有机多价阳离子。
[0087] 在前述实施方案的一个或多个中,以小于约0.005%的浓度提供用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的有机多价阳离子。
[0088] 在前述实施方案的一个或多个中,以小于约0.001%的浓度提供用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的有机多价阳离子。
[0089] 在前述实施方案的一个或多个中,以约0.020%至约0.025%的浓度提供用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的有机多价阳离子。
[0090] 在前述实施方案的一个或多个中,在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前,还另外将所述样品与选自如下物质的可溶性有机调节剂接触:非离子型有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂和酰脲。
[0091] 在前述实施方案的一个或多个中,在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前,还将所述样品与抗病毒剂接触。
[0092] 在前述实施方案的一个或多个中,所述抗病毒剂为非多价的有机阳离子。
[0093] 在前述实施方案的一个或多个中,所述抗病毒剂选自:苯扎氯铵、亚甲蓝和三(正丁基)磷酸盐
[0094] 在前述实施方案的一个或多个中,所述抗病毒剂存在的量小于约1%(w/v)。
[0095] 在前述实施方案的一个或多个中,所述抗病毒剂存在的量小于约0.1%(w/v)。
[0096] 在前述实施方案的一个或多个中,所述抗病毒剂存在的量小于约0.01%(w/v)。
[0097] 在前述实施方案的一个或多个中,所述抗病毒剂存在的量小于约0.001%(w/v)。
[0098] 在前述实施方案的一个或多个中,方法包括在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前的额外的步骤,即将所述样品与足够让酰脲在所述蛋白制剂中为过饱和的量的酰脲接触,以及使含有所述所需蛋白的上清液与所述样品的固相或未溶解部分分离。
[0099] 在前述实施方案的一个或多个中,将所述样品与所述酰脲接触的步骤在将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤之前发生。
[0100] 在前述实施方案的一个或多个中,将所述样品与所述酰脲接触的步骤与将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤基本上同时发生。
[0101] 在前述实施方案的一个或多个中,将所述样品与所述酰脲接触的步骤在将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤之后发生。
[0102] 在前述实施方案的一个或多个中,所述酰脲选自:尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素、尿囊素氯羟、尿囊素羟铝、hemocane、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧-4-咪唑烷基脲和嘌呤。
[0103] 在前述实施方案的一个或多个中,所述酰脲为尿囊素。
[0104] 在前述实施方案的一个或多个中,所述酰脲为尿酸。
[0105] 在前述实施方案的一个或多个中,所述尿囊素存在的量大于0.5%(w/v)。
[0106] 在前述实施方案的一个或多个中,所述尿囊素存在的量大于约1%(w/v),或存在的量大于约2%(w/v),或存在的量大于约5%(w/v),或存在的量大于约10%(w/v)。
[0107] 在前述实施方案的一个或多个中,所述尿酸存在的量大于0.0025%(w/v)。
[0108] 在前述实施方案的一个或多个中,所述尿酸存在的量大于约0.01%(w/v)。
[0109] 在前述实施方案的一个或多个中,所述尿酸存在的量大于约0.1%(w/v)。
[0110] 在前述实施方案的一个或多个中,所述尿酸存在的量大于约1%(w/v)。
[0111] 在前述实施方案的一个或多个中,将所述样品与所述有机调节剂接触的步骤在将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤之前发生。
[0112] 在前述实施方案的一个或多个中,将所述样品与所述有机调节剂接触的步骤与将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤基本上同时发生。
[0113] 在前述实施方案的一个或多个中,将所述样品与所述有机调节剂接触的步骤在将所述样品与所述具有混合的化学特性的可溶性有机多价阳离子接触的步骤之后发生。
[0114] 在前述实施方案的一个或多个中,所述有机调节剂为选自如下的非离子型有机聚合物:甘油、聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇。
[0115] 在前述实施方案的一个或多个中,所述非离子型有机聚合物具有约500D或更小的平均分子量。
[0116] 在前述实施方案的一个或多个中,所述有机调节剂为选自如下的有机溶剂:乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲亚砜、乙醇、异丙醇和苯氧乙醇。
[0117] 在前述实施方案的一个或多个中,所述有机调节剂以约1%(w/v)或更大的浓度提供。在前述实施方案的一个或多个中,其中所述有机调节剂为乙醇或异丙醇,所述有机调节剂以约1%(w/v)或更小的浓度提供。
[0118] 在前述实施方案的一个或多个中,所述有机调节剂为选自如下的表面活性剂:Tween、triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡萄糖苷。
[0119] 在前述实施方案的一个或多个中,所述表面活性剂以约1%(w/v)或更小的浓度提供。
[0120] 在前述实施方案的一个或多个中,所述表面活性剂以约0.1%(w/v)或更小的浓度提供。
[0121] 在前述实施方案的一个或多个中,所述有机调节剂为以亚饱和量提供的酰脲。
[0122] 在前述实施方案的一个或多个中,所述酰脲选自:尿素、乙内酰脲和尿囊素。
[0123] 在一些实施方案中,本发明提供了方面实施任何前述实施方案的方法的试剂盒
[0124] 在某些实施方案中,本发明提供了降低含有所需蛋白的样品的聚集物含量的方法;某些方法包括如下步骤:(i)提供第一组件,其为具有负电性表面的第一基底;(ii)提供第二组件,其为具有正电性表面的第二基底;(iii)将所述样品与所述第一组件和第二组件接触,其中所述第一组件和第二组件经配置使得样品中的至少一些聚集物可同时接触两个组件;以及(iv)从所述第一组件和第二组件分离含有所述所需蛋白的样品,其具有降低的聚集物含量。
[0125] 在某些实施方案中,在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触之前,将具有混合的化学特性的有机多价阳离子与所述样品合并。在某些实施方案中,在接触所述蛋白制剂之前将所述第一组件和第二组件组合。在某些实施方案中,在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触之前,将所述样品与具有混合的化学特性的有机多价阳离子孵育一段合适的时间。在某些实施方案中,将所述样品与所述第一组件和第二组件孵育一段合适的时间。在某些实施方案中,在从所述第一组件和第二组件分离具有降低的聚集物含量的样品的步骤中,从所述样品将具有混合的化学特性的有机多价阳离子去除至这样的程度,其使得具有混合的化学特性的有机多价阳离子与所述第一组件或第二组件的基底结合。
[0126] 在某些实施方案中,所述第一基底为颗粒。在某些实施方案中,所述第二基底为颗粒。所述颗粒基底或基底可各自提供为多个颗粒。在某些实施方案中,所述第一基底和所述第二基底的颗粒中的一者或二者可为无孔的或多孔的。这类多孔的颗粒可具有这样的平均孔径,其足够大从而能够允许蛋白制剂中的蛋白进入,或者太小从而不能允许蛋白制剂中的蛋白进入,或者为约10nm至约100nm。在其中基底为颗粒的某些实施方案中,所述颗粒被夹在多孔的膜或整体材料之间。在某些实施方案中,所述颗粒被夹在织物或无定形纤维过滤器之间。在某些实施方案中,所述颗粒被夹在晶状熔块之间。在某些实施方案中,所述颗粒被包埋在网状聚合物网络中。
[0127] 在某些实施方案中,所述样品的电导率处于足够高的水平,从而当样品接触所述第一和第二基底时,基本上避免从所述样品沉淀所述所需蛋白。在某些实施方案中,所述样品的电导率大于20mS/cm。在其他实施方案中,所述样品大于30mS/cm、大于约40mS/cm或大于约100mS/cm。在某些实施方案中,相比在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前,当样品接触所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子时足以基本上避免从所述样品沉淀所述所需蛋白的电导率,所述样品的电导率要高出至少5%、10%、20%、50%、100%或200%。
[0128] 在某些实施方案中,所述聚集物包含所述所需蛋白的均质聚集物。在某些这类实施方案中,基本上清除存在的所述所需蛋白的均质聚集物。在某些实施方案中,所述聚集物包含所述所需蛋白与污染物或多种污染物的异源聚集物。在某些这类实施方案中,所述异源聚集物与所述所需蛋白具有基本上相同的流体动力学尺寸。在某些实施方案中,所述污染物为核酸、核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白、脂质或细胞培养基组分。在某些这类实施方案中,基本上清除存在的所述所需蛋白与污染物的异源聚集物。在某些实施方案中,所述样品中的聚集物包括均质聚集物和异源聚集物。在某些实施方案中,所述所需蛋白为抗体或抗体片段。在某些这类实施方案中,所述样品为蛋白制剂,如细胞培养收获物、细胞培养物上清液、来源于细胞培养物的含有抗体的溶液或来自先前的蛋白纯化阶段的含有抗体的溶液。在某些这类实施方案中,所述蛋白制剂为来自先前的蛋白纯化阶段的含有抗体的溶液。在某些这类实施方案中,所述蛋白制剂为来自层析柱的洗脱物。
[0129] 在某些实施方案中,所述蛋白制剂可为纯化的、处于中等纯化水平、或高度纯化的。在一些实施方案中,所述样品的中等纯化水平可为约40%至约90%的纯度范围。在一些实施方案中,所述样品的高度纯化水平可为约90%或更大的范围。
[0130] 在某些实施方案中,通过使所述制剂流过所述第一组件和第二组件来将所述蛋白制剂与所述第一组件和第二组件接触。
[0131] 在某些实施方案中,所述第一组件的表面的负电性通过如下物质赋予:表现多种化学官能性的一种或多种复合化学部分,或在所述表面上混合的单种化学基团和复合化学基团的组合,或具有不同化学组分的表面的组合。在某些实施方案中,所述第一组件的表面的负电性部分地由来自如下物质的部分赋予:亚氨基二乙酸、乙二醇(氨基乙基醚)二乙酸、次氮基乙酸、天冬氨酸、谷氨酸、羧酸、亚硫酸、磺酸盐或磷酸。在某些实施方案中,所述第二组件的表面的正电性通过如下物质赋予:表现多种化学官能性的一种或多种复合化学基团,或在所述表面上混合的单种化学基团和复合化学基团的组合,或具有不同化学组分的表面的组合。在某些这类实施方案中,所述第二组件的表面的正电性部分地由选自如下的部分赋予:三(2-氨基乙级)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树状物(乙二胺核)、去铁胺、伯胺、仲胺、叔胺和季胺。在某些实施方案中,所述第一组件的表面的负电性部分地由亚氨基二乙酸赋予,并且所述第二组件的表面的正电性部分地由来自三(2-氨基乙级)胺的部分赋予。在某些实施方案中,所述第一组件具有结合表面的化学部分,其具有金属亲和官能性,并且所述第二组件为第二基底,其具有正电性表面。在某些实施方案中,所述第二组件为第二基底,其具有正电性表面,并且所述正电性表面包含具有金属亲和官能性的、结合表面的化学部分。在某些这类实施方案中,所述基底中的至少一个具有除所述具有金属亲和官能性的、结合表面的化学部分外的一个或多个化学部分,其中此类其他的化学部分能够增强所述组件中的一个或多个参与与所述蛋白制剂的蛋白的氢键、疏水相互作用或π-π结合的能力。在某些实施方案中,所述具有金属亲和官能性的、结合表面的化学部分为多配位基金属螯合部分。
[0132] 在某些实施方案中,在暴露于所述第一组件和第二组件的表面之前,用具有混合的化学特性的有机多价阳离子处理所述样品。此类有机多价阳离子可包括依沙吖啶、9-氨基吖啶(氨吖啶)、3,6吖啶二胺(原黄素)、吖啶琐辛、吖啶氯(酚吖啶)、吖啶橙、奎吖因、乐杀螨、吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖啶(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、酚藏花红、吩噁嗪、吩噻嗪、吖啶黄(氯化3,6-二氨基-10-甲基吖啶和3,6-吖啶二胺)、聚乙烯亚胺、氯己定或聚氨基酸。在某些实施方案中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子为依沙吖啶、聚乙烯亚胺或氯己定,或者其盐。在某些实施方案中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子为依沙吖啶或其盐。在某些这类实施方案中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量为约0.01%至约0.05%。在某些实施方案中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量小于约0.01%。在某些实施方案中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量小于约0.005%。在某些实施方案中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量小于约0.001%。在某些实施方案中,所述具有混合的化学特性的有机多价阳离子存在的量为约0.020%至约0.025%。
[0133] 在某些实施方案中,在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前,以一种或多种有机多价阳离子如聚乙烯亚胺、聚烯丙基胺、依沙吖啶或氯己定以及其盐处理所述样品。在某些这类实施方案中,用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的所述有机多价阳离子以小于1%的浓度提供。在某些实施方案中,用于在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前处理所述样品的所述有机多价阳离子以如下浓度浓度提供:约0.01%至约0.05%,或小于约0.01%的浓度,或小于约0.005%的浓度,或小于约0.001%的浓度,或约0.020至约0.025%的浓度。
[0134] 在某些实施方案中,还将所述样品与选自如下的可溶性有机调节剂接触:非离子型有机聚合物、有机溶剂、表面活性剂和酰脲,其中这类将所述样品与可溶性有机调节剂接触的步骤在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前发生。
[0135] 在某些实施方案中,还另外将所述样品与抗病毒剂接触,其中此类将所述样品与抗病毒剂接触的步骤在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前发生。在某些这类实施方案中,所述抗病毒剂为非多价有机阳离子如苯扎氯铵、亚甲蓝或三(正丁基)磷酸盐。在某些这类实施方案中,所述抗病毒剂存在的量小于约1%(w/v),或存在的量小于约0.1%(w/v),或存在的量小于约0.01%(w/v),或存在的量小于约0.001%(w/v)。
[0136] 在某些实施方案中,本发明提供了如下另外的步骤:将所述样品与足够让酰脲在所述蛋白制剂中为过饱和的量的酰脲接触,以及使含有所述所需蛋白的上清液与所述蛋白制剂的部分分离,其中此类将所述样品与此类酰脲接触的步骤在将所述样品与所述第一组件和第二组件接触的步骤之前发生。在某些这类实施方案中,所述酰脲为尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素、尿囊素氯羟铝、尿囊素羟铝、hemocane、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧-4-咪唑烷基脲或嘌呤。在某些这类实施方案中,所述酰脲为尿囊素。在其他实施方案中,所述酰脲为尿酸。在某些实施方案中,所述尿囊素存在的量大于0.5%(w/v),或存在的量大于约1%(w/v)。在某些实施方案中,所述尿酸存在的量大于0.0025%(w/v),或存在的量大于约0.01%(w/v),或存在的量大于约0.1%(w/v),或存在的量大于约1%(w/v)。
[0137] 在某些实施方案中,所述有机调节剂为选自如下的非离子型有机聚合物:聚乙二醇、聚丙二醇和聚丁二醇。在某些实施方案中,所述非离子型有机聚合物具有约500D或更小的平均分子量。在某些实施方案中,所述有机调节剂为有机溶剂,如乙二醇、丙二醇、丁二醇、二甲亚砜、乙醇或苯氧乙醇。在某些实施方案中,所述有机调节剂以约1%(w/v)或更大的浓度提供。在某些实施方案中,所述有机调节剂为选自如下的表面活性剂:Tween、triton、CHAPS、CHAPSO和辛基葡萄糖苷。在某些这类实施方案中,所述表面活性剂以约1%(w/v)或更小的浓度或约0.1%(w/v)或更小的浓度提供。在某些实施方案中,所述有机调节剂为以亚饱和量提供的酰脲。在某些这类实施方案中,所述酰脲选自尿素、乙内酰脲和尿囊素。
[0138] 在某些实施方案中,本发明提供了方便实施本发明的方法的试剂盒,包含进行本发明所需的一些或所有物质,优选包含便于进行本发明的方法的量和浓度的物质。
[0139] 定义了术语以便可以更容易地理解本发明。其他的定义在整个详细描述中有陈述。
[0140] “聚集物”是指生理条件下稳定且可在较广的pH范围和电导率条件下保持稳定的两个或更多个分子的结合物。聚集物通常包含至少一个生物分子如蛋白、核酸或脂质,以及另一个分子或金属离子。该结合作用可通过任何类型的化学相互作用或其任意组合发生。抗体的聚集物可分为两类:“均质聚集物”是指两个或更多个抗体分子的稳定结合物;“异源聚集物”是指一个或多个抗体分子与一个或多个非抗体分子的稳定结合物。所述非抗体组分可由来自如下的一种或多种实体组成:核苷酸、内毒素、金属离子、蛋白、脂质或细胞培养基组分。
[0141] “抗体”是指免疫球蛋白、其复合形式或片段形式。该术语可包括但不限于来源于人或其他哺乳动物细胞系的IgA、IgD、IgE、IgG和IgM类型的多克隆或单克隆抗体,包括天然的或遗传改良的形式如人源化的、人的、单链的、嵌合的、合成的、重组的、杂合的、突变的、移植的和体外产生的抗体。“抗体”还可包括复合形式,包括但不限于含有免疫球蛋白部分的融合蛋白。“抗体”还可包括抗体片段,如Fab、F(ab')2、Fv、scFv、Fd、dAb、Fc和其他组分,不论其是否保留抗原结合功能。
[0142] “正电性表面”是指主要带正电荷的基底或固相物质表面。表面的正电性可由如下的化学基团赋予,包括但不限于弱阴离子交换基团,如氨基、乙二胺、二乙基氨基乙基、聚丙烯胺、聚乙烯亚胺;强阴离子交换基团,如季胺基;组合的弱-强交换剂,如聚赖氨酸、聚精氨酸或三(2-氨基乙基)胺、二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺、PAMAM树状物(乙二胺核)、去铁胺或上述分子的任意组合。在带正电荷的表面上产生混合的化学特性的第二官能性可由带负电荷的或带正电荷的基团、疏水基团、π-π结合基团、氢键结合基团或金属螯合基团组成。第二官能性可存在于正电性表面上作为合成颗粒的生产材料或工艺的偶然的副产物,或者其可通过有意的设计存在。第二官能性的浓度范围可为小于每毫升颗粒1毫当量至每毫升大于100毫当量。
[0143] “负电性表面”是指主要带负电荷的基底或固相物质表面。表面的负电性可由如下的化学基团赋予:包括但不限于所谓的弱阳离子交换剂,如羧基、氨基羧基(亚胺二乙酸或-次氮基乙酸)或磷酰基;或者强交换剂,如磺基或硫酸盐部分SO3。在带负电荷的表面上产生混合的化学特性的第二官能性可由带负电荷的或带正电荷的基团、疏水基团、π-π结合基团、氢键结合基团或金属螯合基团组成。第二官能性可存在于负电性表面上作为合成颗粒的生产工艺的偶然的副产物,或者其可通过有意的涉及存在。第二官能性的浓度范围可为小于每毫升颗粒1毫当量至大于每毫升100毫当量。
[0144] “内毒素”是指存在于革兰氏阴性菌外膜中的、裂解后从细胞释放的有毒的、热稳定的脂多糖物质。由于内毒素的高含量的磷酸盐和羧基残基,其通常可为酸性的,并且由于脂质-A区域的脂肪酸含量,其可为高度疏水性的。内毒素可提供大量的氢键结合机会。
[0145] “金属亲和官能性”是指可固定于表面上的化学部分优选以1:1形式结合金属离子的能力。此类部分可具有与金属离子形成配位键的能力,并且某些这类部分可为二配位基或多配位基特征。具有该能力的带负电部分的非限制性实例包括亚氨基二乙酸(2-(羧甲基氨基)乙酸)和次氮基乙酸(2,2',2″-次氮基三乙酸)。具有该能力的正电性化合物的实例包括但不限于三(2-氨基乙基)胺或二亚乙基三胺、三亚乙基四胺、四亚乙基五胺、聚丙烯亚胺四胺和去铁胺。
[0146] “非离子型有机聚合物”是指天然存在的或合成的氢化合物,其由连接的缺少带电基团的重复有机亚基组成。其可为线性的、主要为线性但具有一些分枝,或者主要为分枝的。适于实施本发明的实例包括但不限于聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮(PVP)。PEG具有结构式HO-(CH2-CH2-O)n-H。实例包括但不限于平均聚合物分子量范围为小于100道尔顿至大于1000道尔顿的组分。
[0147] “有机多价阳离子”是指有机分子、阳离子或者天然或合成来源的盐,其包含至少一个带正电荷的化学官能性和至少一个另外的化学官能性,从而使得其为多价的。在某些实施方案中,所述有机多价阳离子包含的至少一个另外的化学官能性为另外的正电荷,使得所述有机多价阳离子带有两个或更多个正电荷。所述有机多价阳离子(或OMC)还可带有负电荷,使得其具有净正电荷或净中性电荷。若OMC为带净正电荷的,其可与如下的阴离子一起提供,如氯化物、溴化物、硫酸盐、有机酸、乳酸盐、葡萄酸盐,以及不会与所述方法不相容的任何其他的阴离子。在某些实施方案中,OMC的某些正电荷由胺、亚胺或其他含氮部分提供。所述OMC可另外具有混合的化学特性,并且包括疏水残基、其他官能性部分,和/或其可具有参与其他类型的化学相互作用的能力,包括,例如参与氢键、疏水相互作用、π-π结合、金属配位和插层反应的能力。在某些实施方案中,OMC的实例包括但不限于二氨基酸,二聚、三聚或更大的同型肽或杂肽,如聚赖氨酸、聚精氨酸、聚组氨酸、聚氨酸;聚乙烯亚胺;聚丙烯胺;聚苄菊酯(polydimethrine)、聚甲基丙烯酰基氨基丙基三甲基氨;聚二烯丙基二甲基氨;聚乙烯基苄基三甲基氨;聚乙烯基胍;聚(N-乙基-4-乙烯基吡啶;DEAE-葡聚糖;DEAE-纤维素;依沙吖啶(CAS号442-16-0;7-乙氧基吖啶-3,9-二胺);三(2-氨基乙基)胺;胍;氯己定;阿来西定;citricidal、鱼精蛋白;精胺;亚精胺;鲑精蛋白;壳聚糖;以及上述的变体和衍生物。例如,依沙吖啶的变体和衍生物被理解为包括9-氨基吖啶(氨吖啶)、3,6吖啶二胺(原黄素)、吖啶琐辛、吖啶氯(酚吖啶)、吖啶橙、奎吖因、乐杀螨、吖啶酮、吖啶-9-羧酸、氯甲氧吖啶(1-[(6-氯-2-甲氧基-9-吖啶基)氨基]-3-(二乙基氨基)-2-丙醇二盐酸盐)、酚藏花红、吩噁嗪、吩噻嗪、吖啶黄(氯化3,6-二氨基-10-甲基吖啶和3,6-吖啶二胺),以及其盐(例如,氯化物、溴化物、硫酸盐、乳酸盐、葡糖酸盐)。
[0148] “有机溶剂”是指以液体状态存在的天然存在的或合成的有机化合物。适于实施本发明的实例包括但不限于乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、乙醇和苯氧乙醇。
[0149] “多核苷酸”是指由链中共价结合的多个核苷酸单体组成的物聚合物。DNA(脱氧核糖核酸)和RNA(核糖核酸)是多核苷酸的实例。多核苷酸可具有形成氢键的高倾向性。
[0150] “蛋白”是指任何含有碳、氢、氧、氮和通常地硫的复杂的有机大分子组群,并且主要由一个或多个通过肽键连接的氨基酸链组成。蛋白可为天然或重组来源的。可以用非氨基酸部分改性蛋白,如通过糖基化、聚乙二醇化或与其他化学部分缀合。蛋白的实例包括但不限于抗体、凝血因子、酶和肽类激素。
[0151] “蛋白制剂”是指任何含有目标蛋白的水性或主要为水性的溶液,如含有细胞的细胞培养收获物、(基本上)无细胞的细胞培养物上清液或含有来自纯化阶段的目标蛋白的溶液。
[0152] “基底”或“固相物质”是指不可溶的有机固体,其性质可为颗粒、晶状、聚合物、纤维、多孔的中空纤维、整体材料、膜状的。其可由无孔或多孔的颗粒、多孔的膜、多孔的过滤器或多孔的整体材料组成。如果为颗粒,所述颗粒可为大致球形的或非球形的,并且尺寸范围可为小于100nm至大于100微米。多孔颗粒的平均孔径范围可为小于10nm(微孔的)至大于100nm(大孔的)。膜的平均孔径范围可为小于100nm至大于1微米。膜或整体材料的平均通道尺寸范围可为小于1微米至大于10微米。固体材料还可由化合物结构组成,例如,其中颗粒被包埋在网状基质中、被夹在膜之间,或二者均有。
[0153] “过饱和酰脲”是指在特定蛋白制剂通常所用的条件下,含有的酰脲量超过其最大溶解度的溶液。在某些实施方案中,本发明提供了这样的样品,在该样品的条件下,其具有的酰脲存在的量大于该酰脲在该样品中的溶解度,使得该酰脲的一些部分在该样品中以非溶解形式存在。
[0154] “表面活性剂”包括“具有表面活性的试剂”,如这样的有机分子类型,其通常包含疏水部分和亲水部分,使得其被称为两亲性的。在水溶液为足够浓度时,表面活性剂可自身结合成簇,其疏水部分集中于中心以将与水的接触最小化,并且其亲水部分向外辐射以将与水的接触最大化。在生物制剂,特别是含有具疏水特性或具疏水特性区域的材料的那些存在下,表面活性剂的疏水部分倾向于与疏水物质的一些部分自发结合,并通过表面活性剂的亲水部分的影响增加它们的溶解度。其也可用于调节均溶解于水溶剂中的不同疏水物质之间发生的疏水相互作用。适于实施本发明的某些实施方案的表面活性剂的实例包括但不限于非离子型表面活性剂,如聚山梨醇酯表面活性剂(例如,Tween 20、聚乙二醇(20)脱水山梨醇单月桂酸酯和Tween 80、聚氧化乙烯(20)脱水山梨醇单月桂酸酯)和Triton(例如,聚乙二醇对(1,1,3,3-四甲基丁基)-苯基醚),以及两性离子表面活性剂,如CHAPS(3-[(3-胆酰氨丙基)二甲基胺基]-1-丙烷磺酸盐)、CHAPSO(3-[(3-胆酰氨丙基)二甲基胺基]-2-羟基-1-丙烷磺酸盐),以及辛基葡萄糖苷(例如,(2R,3S,4S,5R,6R)-2-(羟甲基)-6-辛氧基环氧乙烷-3,4,5-三醇)。
[0155] “酰脲”是指包含一个或多个尿素部分的天然或合成来源的环状或无环有机分子,或者其衍生物。在某些实施方案中,本发明提供了酰脲,如尿素、尿酸、乙内酰脲、尿囊素(CAS号97-59-6;尿囊素氯羟铝、尿囊素羟铝、hemocane、脲基乙内酰脲、5-脲基乙内酰脲、乙醛酰基酰脲、乙醛酸二酰脲、2,5-二氧-4-咪唑烷基脲)、嘌呤以及其衍生物。在某些实施方案中,本发明提供了式R-CO-NH-CO-NH2或R-CO-NH-CO-NH-CO-R'或R'R″NH-CO-NR″'R″″的有机分子,其中相关的“R基团”可为H或任何有机部分。
[0156] “病毒”或“病毒颗粒”是指仅在活的宿主(主要是细菌、植物和动物)细胞中复制的超显微的(直径大致为20-300nm)、代谢惰性的感染剂:其由RNA或DNA核、蛋白衣壳以及在更复杂类型中,环绕的包衣组成。
[0157] 用于实施本发明的固体材料可包括天然或合成来源的不可溶的颗粒,诸如但不限于通常用于进行色谱分析的多孔微颗粒。此类颗粒可采用大孔来允许诸如但不限于抗体的蛋白扩散进入;或者其可采用小孔来允许诸如盐、糖和解离异质聚集物的试剂的小化学物质扩散进入,但这些小孔太小,从而不能允许诸如抗体的蛋白进入。
[0158] 固体材料可可选地包含无孔的颗粒、膜或整体材料、纤维(包括壁上多孔的中空纤维)、多孔的膜,和/或采用上述元件的组合的化合物结构。
[0159] 用于具体实施本发明的某些实施方案的、具有混合的化学特性的颗粒包括不可溶的有机颗粒。此类颗粒可为无孔的或多孔的。如果为多孔的,其可包含打孔从而允许诸如但不限于抗体的蛋白扩散进入;或者其可包含小孔从而允许诸如盐、糖和解离异质聚集物的试剂的小化学物质扩散进入,但这些小孔太小从而不能允许诸如抗体的蛋白进入。此类颗粒包含的混合的化学特性可包括清除具有混合的化学特性的可溶性多价阳离子试剂的负电性官能性,并且还可包括可增强其降低聚集物含量和/或促进可溶性试剂清除的能力的一种或多种化学官能性,包括但不限于正电性、氢键结合、疏水相互作用、π-π结合和金属配位。
[0160] 正电性基团可包括所谓的强阴离子交换基团和/或所谓的弱阴离子交换基团。具有弱的或混合的强-弱阴离子交换能力的正电性基团可能是优选的,因为其能够参与与溶解的金属离子的配位相互作用,产生所需的从所应用的生物样品清除污染性金属离子的结果。此类具有金属配位能力的混合的弱-强阴离子交换基团的非限制性实例为三(2-氨基乙基)胺(TREN)。混合的化学特性可存在于单类表面上、不同表面上的单个的复合化学基团、具有不同特征的单独的化学基团,或上述的任意组合。
[0161] 负电性基团可包括所谓的强阳离子交换基团或所谓的弱阳离子交换基团。具有弱的或混合的强-弱阳离子交换能力的负电性基团可能是优选的,因为其能够参与与溶解的金属离子的配位相互作用,产生所需的从所应用的生物样品清除污染性金属离子的结果。具有金属配位能力的阳离子交换基团的非限制性实例包括羧基、磷酰基、亚氨基二乙酸(IDA)和次氮基乙酸(NTA)基团。弱离子交换基团为优选的原因也可能是因为其相比强离子交换基团具有改善的形成氢键的能力。就所述颗粒包含一个或多个正电性官能性而言,其可由所谓的强阴离子交换基团和/或所谓的弱阴离子交换基团赋予。
[0162] 在某些实施方案中,正电性或负电性材料的表面也可包含具有脂肪族和/或芳香族特性的疏水基团,其中后者可能是优选的,因为其能够参与所谓的π-π结合。混合的化学特性可存在于单类表面上、不同表面上的单个的复合化学基团、具有不同特性的单独的化学基团,或上述的任意组合。
[0163] 在某些实施方案中,可同时采用一个或多个负电性和/或一个或多个正电性表面组分,并且它们可就其化学组成和/或其物理形态存在差异。正电性官能性可由与负电性颗粒不同且分离的颗粒介导。所述颗粒可包括多孔的或无孔的颗粒,其分散于整个蛋白制剂中,或包装在柱子中,或最初分散然后包装在柱子中。
[0164] 具有不同个体特征的化学官能性可以针对特定样品组分的需求定制的不同比率使用。例如,期望用于处理澄清的细胞培养物上清液的组分可包含过量的正电性表面,而期望用于处理已用正电性解离异质聚集物的试剂如依沙吖啶或聚乙烯亚胺处理过的上清液的组分可包含过量的负电性表面。
[0165] 用于实施本发明的某些实施方案的、具有混合的化学特性的可溶性多价阳离子可包含具有至少一个正电荷两个正电荷和赋予混合的化学特性的其他的特征的有机分子,如提供参与氢键结合、疏水相互作用、π-π结合、金属配位和嵌入的能力的部分。包含这些特性的多价阳离子的实例包括聚乙烯亚胺、依沙吖啶、氯己定和许多其他的类型。此类试剂可以0.001%-1.0%的浓度范围施用,但通常会在以0.01%-0.10%,且特别是0.02%-0.06%或0.02%-0.05%的浓度范围使用时提供聚集物减少和蛋白产物回收的最佳平衡。
[0166] 在某些实施方案中,可通过同时添加独立使用时缺少足以实现与本发明的其他实施方案相同水平的聚集物减少的化学影响的可溶性有机试剂,来提高所述方法减少聚集物的性能和/或所需蛋白的回收。此类其他的试剂的实例可包括但不限于:非离子型或两性离子型表面活性剂,如Tween、Triton、Brij、CHAPS、CHAPSO和辛基葡萄糖苷;有机聚合物,如聚乙二醇(PEG)、聚丙二醇和聚乙烯吡咯烷酮,优选分子量小于1000道尔顿的;有机溶剂,如乙二醇、丙二醇、二甲亚砜、乙醇、丙醇、异丙醇、苯氧乙醇;碳水化合物;以及酰脲,包括尿素、乙内酰脲和尿囊素。实例还可包括为另外目的(诸如但不限于失活病毒)添加的可溶性非多价阳离子试剂,包括苯扎氯铵、亚甲蓝和三(正丁基)磷酸盐等。在某些实施方案中,实例包括过饱和量的酰脲,如大于0.0025%量的尿酸,以及大于0.56%量的尿囊素。
[0167] 排序。在某些实施方案中,具有混合的化学特性的多价阳离子和颗粒必须一起存在足以实现聚集物减少的时间段。它们可以一起添加,或者提前不确定的时间段添加至可溶性试剂。在一些实施方案中,提前添加多价阳离子可产生较好的结果,但其他形式会产生对许多应用足够的结果。实施本发明所需的时间将直接取决于所述多价阳离子的浓度、颗粒的比例,以及在较小程度上取决于所述蛋白制剂的聚集物含量。
[0168] 在某些实施方案中,本发明提供了准备所述样品以添加具有所述第一组件和第二组件的混合的化学特性的可溶性的和固体试剂的方法步骤。条件应当具有防止目标蛋白通过与所述多价阳离子或颗粒的相互作用而大量损失的性质。此类条件包括能够中止目标蛋白与所述多价阳离子或颗粒之间的强电荷相互作用的足够高的电导率值,并且可包括并入其他添加剂以适应其他类型的化学相互作用。
[0169] 在某些实施方案中,本发明提供了在大幅提高的电导率(盐浓度)下的有效的聚集物减少和可溶性试剂清除。带电荷的颗粒尤其以其性能对具有低电导率(通常小于10mS/cm,且最经常小于5mS/cm)的水环境的依赖性而为人所知。这些值大致分别相当于
100mM NaCl和50mM NaCl。在某些实施方案中,本发明支持在20-30mS,通常高达40mS/cm,并且有时高达100mS/cm或更高值的电导率下,有效的聚集物减少和可溶性试剂清除。确实,在某些实施方案中,在较高的盐浓度下,异源聚集物的解离增加。
[0170] 在某些实施方案中,本发明提供了可能会堵塞用于随后的纯化方法的层析柱的样品组分的清除。例如,IgG抗体经常通过使用固定的蛋白A的亲和层析进行纯化。尽管有效,用于实施该方法的层析分析介质相当昂贵,并且其有效使用周期可被使用未加工样品显著减少。在某些实施方案中,通过本发明处理的样品在光学上相当清澈,并且没有可能损害蛋白A或其他层析介质的功能的悬浮碎片。在某些实施方案中,根据本发明方法纯化样品会将蛋白A的IgG结合能力增加多达10%或更多,并提供对其他捕获或随后的层析方法的类似的有益效果。在某些实施方案中,本发明的使用会允许蛋白A将污染性宿主蛋白含量降低5的系数或更多。
[0171] 在某些实施方案中,本发明提供了可允许进行随后的纯化方法的方法,所述纯化方法在其他情况下会受到样品组分的损害,甚至达到不能实施最初的从未纯化来源捕获抗体的程度。例如,宿主细胞DNA相比IgG或IgM抗体能更强烈地结合阴离子交换剂和羟磷灰石介质。这降低了它们的抗体结合能力和纯化性能,并损害了它们作为最初的捕获方法的适用性。在某些实施方案中,本发明促进了在将样品施用于这些随后的方法前去除大多数的DNA,使得阴离子交换剂和羟磷灰石介质均成为用于最初的抗体捕获/纯化的实用工具。
[0172] 在某些实施方案中,在准备使用本发明中,可取的是评估待处理的样品的组分。第一主要变量是所述样品的聚集物含量。这可使用通过尺寸排阻色谱,且特别是通过同时在254-260nm和280nm波长处监测级份的分析容易地测定。甚至当其流体动力学尺寸非常接近纯化的抗体时,该方法也便于检测包含抗体-DNA复合物的异源聚集物。含有高聚集物水平,或含有显示0.5或更大的254/280比率的聚集物,或含有254/280比率增加的抗体-DNA异源聚集物的样品,是处理包含具有混合的化学特性的可溶性试剂(诸如但不限于依沙吖啶和/或聚乙烯亚胺)的样品的有利的候选物,以促进在将所述样品暴露于具有混合的化学特性的表面之前解离聚集物。术语“高聚集物水平”应理解为相对的,因为其将取决于样品所来源的总体纯化过程。细胞培养物上清液中的“高”聚集物水平相比所述抗体可多达
50%或更高,而初始纯化后的“高”聚集物水平可包括超过5%的任何水平,或甚至更小。
[0173] 在某些实施方案中,可取的是评估待纯化的蛋白的天然化学特性。IgG抗体倾向于具有电荷中性至性特性,其具有弱的或没有结合正电性表面的倾向,但具有轻微至中等的结合负电性表面的倾向。IgM抗体特性范围为碱性至酸性,通常具有强的结合正电性表面的倾向,并且具有轻微至中等的结合负电性表面的倾向。抗体表面特性的实际测定可通过一对简单的实验完成,其中将所述抗体于pH 7.0下施用于阳离子交换剂,并用线性盐梯度洗脱,并在相同的条件下施用于阴离子交换剂并从中洗脱。将抗体从每种交换剂洗脱的盐浓度提供了抗体结合负电性或正电性表面的相对趋势,以及控制此类相互作用所需的盐浓度的方便的指数。此类特性表征可在多个pH值下进行,以获得对特定目标蛋白的电荷特性更完全的理解。
[0174] 在某些实施方案中,可取的是挑选具有混合的化学特性的一种或多种多价阳离子。实验数据揭示出在一般情况下,多价阳离子疏水性越少,目标蛋白的回收率越高。另外,疏水性越少,可以应用多价阳离子而不显著损失蛋白的浓度范围越广和越高。因此,相比更具疏水性的依沙吖啶,或疏水性高得多的氯己定,较弱疏水性的PEI可被认为是更好的候选物。然而除了产物回收,还可能需要考虑其他问题。PEI包含熟知的细胞毒性特性,并且其难于以足以容易地评估其通过纯化处理过程从样品的清除的灵敏度进行检测。依沙吖啶可能是优选的,因为其具有在血浆蛋白分级和作为抗病毒剂领域中的较长的历史。另外,其亮黄色的颜色和固有荧光有助于灵敏地测量其在给定样品中的含量,从而有助于记录其在实施所述方法后的清除。除此之外,不同的多价阳离子可包含不同的第二化学官能性,其与它们介导所需效应的能力有关。例如,PEI被理解为主要通过静电相互作用和氢键结合来结合DNA。依沙吖啶提供了针对两种相互作用的较少的机会,但已知能够嵌入DNA。其通常还支持更有效的聚集物减少。
[0175] 在某些实施方案中,诸如依沙吖啶、氯己定和聚乙烯亚胺的试剂可以小于0.001%-1%范围的浓度有效施用,这取决于抗体的特性和样品的组分。最低有效浓度在大多数情况下是优选的,因为高浓度可增加去除可溶性试剂所需的、具有混合的化学特性的负电性固体的量。实验数据揭示0.01-0.1的浓度,且特别是0.02%-0.06%或
0.02%-0.05%范围的浓度满足该设想。可针对每种具体情况确定和定制最有效的试剂和工作浓度。对本领域技术人员显而易见的是上述试剂中的某些因其失活病毒的能力而为人所知,并且具有增加DNA和内毒素清除的额外优势。可采用多种多价阳离子。在一些实施方案中,以多价阳离子预处理样品可增加本发明实现低聚集物水平的能力。
[0176] 在某些实施方案中,可取的是评估具有不同特性的正电性和/或负电性基底,以最佳地适应所需蛋白和其所位于的原料流的特性。例如,在一些情况下,具有季胺官能团的正电性物质可具有较少的减少聚集物和/或其他污染物的能力,但支持所需蛋白的较高回收,而TREN形式的正电性物质可支持相反的结果。在一些情况下,对于一种所需蛋白为优选的正电性表面,可能被评价为不如另一种。例如,TREN对IgG可为优选的;而季胺对IgM可为优选的。基底上的配体的密度还可影响本发明的某些实施方案的性能,例如通过样品组分和化学表面之间的次级相互作用。例如,实验数据记录了在某些实施方案中,具有较高密度的TREN的基底可胜过具有较低密度的TREN的基底。
[0177] 在某些实施方案中,以固体与样品的组合体积比为5%的、具有混合的化学特性的颗粒的同等平衡的混合物开始可能是方便的。通过优化系统以最佳地适应特定样品的需求的过程,可减少固体与样品的体积比以确定该特定样品/处理系统的有效性阈值。负电性官能性与正电性官能性的比率也可发生改变,其可为选择所述表面上包含的第二化学官能性。评估这些变化的实验工作量可通过使用基于统计学的实验设计(所谓的DoE)大幅减少。具有混合的化学特性的方便的颗粒可包括商业化的阴离子交换剂和阳离子交换剂、螯合树脂、疏水性树脂以及市售的进行所谓的混合模式的色谱分析的产品。
[0178] 在某些实施方案中,用于评估的初始条件应当在防止抗体通过结合不同表面而损失的pH和电导率值下进行,但除此之外,实验应当具体评估较高的电导率水平,因为其将支持增加的聚集物和/或抗体-污染物复合物的解离。为方便起见,使用IgG抗体的初始实验可在6.5-7.5的pH和10-15mS/cm的电导率下进行。使用IgM抗体的初始实验可在相同的pH但在20-30mS/cm的电导率下进行。随后的实验中的每个可以较高的或较低的电导率,和/或较高的或较低的pH值进行,以确定支持聚集物减少和抗体回收的最佳组合的条件。尽管本发明的主要目标不是降低宿主细胞蛋白污染物的水平,其可提供与此相关,特别是与高碱性和/或高酸性宿主蛋白含量相关的显著的贡献。
[0179] 在某些实施方案中,具有混合的化学特性的可溶性的和固体试剂应当存在的时间段可通过简单的实验确定,其中通过SEC,在一定时间过程,例如在一小时内每10分钟,或者来自如下所述的实施例的数据所示的其他增加量和持续时间,对样品进行分析。
[0180] 对本领域技术人员显而易见的是,除了降低均质聚集物和异源聚集物的含量,本发明的某些实施方案还可同时降低宿主细胞蛋白、DNA、内毒素和病毒的含量。
[0181] 在某些实施方案中,所述第一组件和第二组件的固体材料可在使用后进行清洁和回收。在其他实施方案中,它们可在使用后丢弃。
[0182] 在某些实施方案中,本发明的方法可在其他层析分析方法步骤之前实施,其中该实施具有保护层析介质免受细胞培养基组分污染和通过将靶标产物置于比其在未处理样品中更均质的状态而改善纯化质量的双重益处。
[0183] 在某些实施方案中,本发明可提供使用通过中性材料混合并包裹、包埋于中性材料中,或者通过本身带负电荷和/或正电性材料包裹或包埋于其中的负电性颗粒和正电性颗粒的方法。在某些实施方案中,负电性和/或正电性表面可包含另外的化学官能性,包括但不限于参与疏水相互作用、π-π结合、氢键结合和金属亲和的能力。
[0184] 本发明的其他目标和优势部分地将在随后的描述中陈述,并且部分地将从所述描述变得显而易见,或者可以通过实施本发明学得。本发明的目标和优势将凭借权利要求中明确的元素和组合实现和获得。
[0185] 应当理解,如同所声明的,上述的一般描述和下文的详细描述均仅为示例性和说明性的,并且不限制本发明。实施例
[0186] 以下实施例说明了展示本发明的某些实施方案的功效的原型
[0187] 实施例1
[0188] 通过使用正电性和负电性表面的原型混合物处理,具有整合的DNA去除的DNA-抗体异源聚集物解离。将200mM终浓度的氯化钠(NaCl)添加至100mL含有单克隆IgM克隆85(电导率21mS/cm)的澄清的细胞培养物上清液。将2.5mL的正电性大孔颗粒物质(Nuvia Q)与2.5mL的负电性大孔颗粒物质(Nuvia S)混合,然后夹在聚偏二氟乙烯(PVDF)过滤器之间。将颗粒用50mM Hepes、200mM NaCl,pH 7.0平衡。使样品流过颗粒,然后用平衡缓冲液追赶。用3M胍洗涤颗粒。将未处理和处理的样品施加至分析性尺寸排阻色谱(SEC)柱,在254nm和280nm UV处监测。未处理样品的IgM峰的254/280比率为0.546,表明大量的DNA与IgM结合。处理后IgM峰的254/280比率为0.449,表明低得多的DNA含量。聚集物含量从约3%被降低至小于1%。本实验和随后的描述使用IgM单克隆抗体的结果的实验使用生长至80-100%死亡率的细胞培养物进行,这为本领域有经验的人员所理解,其代表样品中聚集物和污染物含量最坏情况下的情形。因此,显而易见的是,在较高水平的细胞生活力下(这在大多数的商业应用是常见的)收获的细胞培养物,可以适于低得多的体积和可能不同的具有混合的化学成分的组分。在使用不同的IgM克隆(IgM-529)的平行实验中,需要将电导率提升至25mS/cm以避免颗粒上的抗体损失。
[0189] 实施例2
[0190] 增加的NaCl浓度下的异质聚集物解离和污染物从IgM制剂的去除。使含有IgM85并加入了盐以达到约25mS/cm的电导率的100mL的细胞培养物上清液通过夹在PVDF过滤器之间的、0.25mL大孔的负电性固相(Nuvia S)、大孔的正电性固相(Nuvia Q)、微孔的正电性固相(Q Sephadex A25)和微孔的负电性固相(CM-Sephadex C25)中的每种的原型混合物,并用50mM Hepes、250mM NaCl,pH 7.0平衡。收集级份以确定功效。在样品载荷多达约20倍混合颗粒体积下,基本上没有HMW聚集物和异源聚集物。甚至在样品载荷多达100倍颗粒体积下,仍有多于90%的DNA被去除。这些结果证明了本发明在比避免IgM损失所需的最小值高出多于30%的电导率值下的有效应用。IgM回收率为98%。
[0191] 实施例3
[0192] 增加的NaCl浓度下的异质聚集物解离和从IgG制剂去除污染物。发现单克隆IgG——克隆Her2甚至在小于1mS/cm的电导率下不结合正电性介质(Nuvia Q)。发现其在大于12mS(pH 7.0)的电导率下不结合负电性介质(Nuvia S)。将样品增加至15mS的电导率,并使其通过与实施例2中描述的相同的原型混合物。清除DNA,以及约一半的宿主蛋白污染物。HMW聚集物从大于10%被减少至小于0.2%。如通过254/280比率所测得,异源聚集物基本上被清除。该实验和随后的描述使用IgG单克隆抗体的结果的实验,使用培养至50-80%死亡率的细胞培养物进行,这为本领域有经验的人员所理解,其代表样品中聚集物和污染物含量最坏情况下的情形。因此,显而易见的是,在较高水平的细胞生活力下(这在大多数的商业应用是常见的)收获的细胞培养物,可以适于低得多的体积和可能不同的具有混合的化学成分的组分。
[0193] 实施例4
[0194] 将10mL的实施例2中描述的固体材料的相同混合物夹在圆柱型玻璃构件中的织物尼龙保持器(孔隙度为约5μm)之间。用50mM Hepes、150mM NaCl,pH 7.0平衡颗粒。使含有单克隆IgG的500mL的细胞培养物上清液流过颗粒并收集。用平衡缓冲液追赶样品以使得能够收集经处理的样品。流过液含有HMW聚集物含量小于0.2%的单克隆IgG,且没有明显的异源聚集物。用50mM Hepes、2M NaCl洗脱颗粒,产生颜色强烈的亮黄色洗脱物。
[0195] 实施例5
[0196] 在搅拌下向含有IgG单克隆抗体的1L细胞培养基中添加100mg的依沙吖啶,并孵育15分钟,然后通过离心去除黄色沉淀。将80mL实施例2中描述的固体材料的相同混合物夹在玻璃构件中的织物尼龙保持器之间。使来自依沙吖啶处理的黄色-黄褐色的但光学澄清的上清液流过颗粒并收集。用平衡缓冲液追赶样品,以使得能够收集经处理的样品。用50mM Hepes、2M NaCl,pH 7.0的步骤洗脱柱子。由于通过依沙吖啶处理清除了DNA,盐洗脱峰大致为以未处理样品获得的大小的一半。计算了每个样品的280和254nm处的UV吸收的比率。未处理的样品给出2.06的280/254比率。依沙吖啶处理的样品给出2.33的比率,表明了大量降低的异质聚集物含量。流过的样品给出2.39的比率,表明了DNA去除的又一增量。HMW聚集物被减少至小于0.1%。先前的使用相当于2%的所施用样品体积的混合介质体积的实验不足以完全去除依沙吖啶。平行实验表明至少5cm的床高给出最佳的结果,其具有最小体积的混合介质。
[0197] 实施例6
[0198] 从0.5mL的螯合性多孔颗粒(Chelex-100)和0.5mL正电性多孔颗粒(Macroprep High-Q)制备了原型颗粒混合物,将其混合并夹在玻璃构件中的纤维素过滤器之间。在接近生理条件:pH 7.0,10mS/cm下,使IgG单克隆抗体(Her2)的纯化样品通过颗粒,其没有损失。使用未纯化的抗体的实验在25mS/cm、20mS/cm和30mS/cm下进行。在所有情况下均去除了异源聚集物和HMW聚集物。使用含有0.02%依沙吖啶的未纯化的抗体的实验在相同的电导率下进行。在所有情况下均去除了异源聚集物和HMW聚集物,并且如通过缺少365nm处的UV吸收所证明的,流过液没有依沙吖啶。
[0199] 实施例7
[0200] 在与实施例6平行的一组实验中,在增加的盐条件:pH 7.0,200mS/cm下,使IgM单克隆抗体(克隆529)的纯化的样品通过颗粒,其没有损失。在20、30和40mS/cm下施加未纯化的抗体和未纯化的含有0.02%依沙吖啶的抗体。在所有条件下均去除了异源聚集物和HMW聚集物,并且如通过缺少365nm处的UV吸收所证明的,流过液没有依沙吖啶。用0.2%依沙吖啶重复这些实验。在所有情况下均去除了异源聚集物和HMW聚集物,并且流过液没有依沙吖啶。
[0201] 实施例8
[0202] 通过由Chelex-100和MacroPrep High Q的等体积混合物组成的填充床时的从单克隆IgM培养物上清液去除DNA和聚集物的能力研究。将每种0.5mL的Chelex-100和MacroPrep High Q夹在PVDF膜之间。以1mL/min加载M529培养物上清液,并在25、50采集流过液样品。并通过分析性SEC分析100mL。即使在最大荷载下,254种主要的异源聚集物基本上被从流过液清除。不同荷载(低至高)的IgM回收率分别为58%、73%和85%。通过添加NaCl产生25mS/cm的电导率来重复实验。异质聚集物减少未受影响,但回收率分别增加至约85%、90%和95%。
[0203] 实施例9
[0204] 重复实施例8的实验,但组合了微孔和大孔的正电性和负电性介质,加上等体积的微孔的亲脂性颗粒:QAE Sephadex A-25、SP Sephadex C-25、Nuvia Q、Nuvia S和Sephadex LH-20。将尿囊素和依沙吖啶添加至5%的补充了血清的单克隆IgM上清液,至终浓度分别为1%(过饱和)和0.02%。通过离心将上清液澄清,然后使其流过床(每毫升填充床20mL上清液)。然后在阳离子交换剂上捕获IgM。在两步法中IgM回收率为80%,且通过分析性SEC测得纯度大于90%,没有明显的聚集物。
[0205] 实施例10
[0206] 将每种0.6mL的负电性、金属配位性多孔颗粒(Chelex-100)和正电性多孔颗粒(Macroprep High Q)加入至45mL的M529IgM澄清的培养物上清液,然后立即加入依沙吖啶至终浓度为0.02%,电导率为25mS/cm,并在旋转振荡器上连续混合。在1小时内每隔10分钟提取样品。分析性SEC显示了HMW和异源聚集物的渐进性减少,在50分钟时几乎达到完成,但在另外的10分钟稍微改善。如365nm处的图谱所示,依沙吖啶也被去除。
[0207] 实施例11
[0208] 用1%尿囊素和0.02%依沙吖啶将1升含有单克隆IgG的细胞培养物上清液处理15分钟。通过膜过滤去除黄色沉淀,并将光学闪亮的清澈亮黄色沉淀施加至填充有Chelex
100和Macroprep High Q的等量混合物的10mL柱。然后将经处理的物质施加至蛋白A柱,荷载量为20mg/mL,洗涤10倍柱体积,并洗脱IgG。洗脱的IgG与从装载了未处理的细胞培养物上清液的蛋白A洗脱的抗体的比较包括大约5倍低的宿主细胞蛋白污染物。设立了平行实验以确定装载了处理的和未处理的样品的蛋白A柱的动态结合能力。装载了处理的样品的柱的动态能力比装载量未处理样品的柱高约10%。
[0209] 实施例12
[0210] 将具有亚氨基二乙酸基团(Chelex 100)的微孔苯乙烯二乙烯基苯颗粒和具有三(2-氨基乙基)胺(BioWorks TREN,hi-sub)的大孔琼脂糖颗粒的等量混合物夹在聚乙烯熔块之间,并用50mM Hepes、100mM NaCl,pH 7.0平衡。使经过滤的含有IgG(克隆HER2)的哺乳动物细胞培养物上清液通过配件,并通过尺寸排阻色谱进行分析。未处理的样品含有约10%的聚集物。处理的样品含有少于0.2%的聚集物。AccuBlue测试揭示出处理还去除了约95%的DNA。
[0211] 实施例13
[0212] 将实施例12的颗粒混合物以50mM Hepes、100mM NaCl,pH 7.0平衡,并直接添加至含有IgG(克隆HER2)的经过滤的哺乳动物细胞培养物上清液,在搅拌下孵育1小时,然后通过膜过滤去除。分析揭示出实施例12的大约一半的聚集物减少和DNA去除。搅拌下于4下孵育16小时展示实施例12的约80%的功效。
[0213] 实施例14
[0214] 将带负电荷的金属螯合性苯乙烯二乙烯基苯颗粒(Chelex 100)、带正电荷的聚甲基丙烯酸酯多孔颗粒(Macroprep Hi-Q)和带负电荷的聚甲基丙烯酸酯颗粒(Macropre Hi-S)的等量混合物,与先前已用终电导率为20mS/cm的NaCl、1%尿囊素和0.025%依沙吖啶处理过IgM-529的样品混合。颗粒与样品的体积比为1:20。在10分钟、20分钟、40分钟和60分钟采集样品,并通过微滤去除颗粒。图1显示了所有时间点的高分子量聚集物的显著减少,但所有聚集物随着时间呈渐进增大式减少,随后宿主细胞蛋白污染物也明显大幅减少。随后的分析表明聚集物和宿主蛋白的减少均反映了从样品的组合的染色质残留物减少。在所有时间点依沙吖啶也被从样品清除。
[0215] 实施例15
[0216] 图2A和2B显示了如下的处理之前和之后的尺寸排阻色谱图谱:如同实施例7中的,以NaCl、尿囊素和依沙吖啶处理IgM-84,然后以与实施例7中的相同的介质混合物处理,但为通过使样品通过这样的装置来进行处理,在该装置中混合介质被夹在具有足够窄的网格来保持颗粒的织物聚合物保持器之间。HMW聚集物以及大多数较小的聚集物被完全清除。下表1显示DNA和组蛋白最初分布于所有具有IgG部分的聚集物部分之间,以及所有含有蛋白的部分之间。
[0217] 表1.SEC部分的IgM和污染物含量。
[0218]ElT,min [IgM] DNA大小 [DNA] [His] 254:280
9 0.31 bld 10 0.13 1.31
10 0.09 bld 10 0.11 1.30
11 0.42 bld 10 0.13 1.03
12 0.68 (150-1000) 12 0.13 0.98
13 20.29 bld 44 0.21 0.49
14 21.08 (660) 236 0.76 0.89
15 2.33 445/(660) 459 1.87 0.97
16 0.30 316/445 435 0.82 1.59
17 0.51 316 796 1.09 1.45
18 0.38 155/316 314 0.96 1.60
19 0.31 90/155 339 0.33 1.40
20 0.09 90 684 0.86 1.56
21 bld 58 123 1.33 0.90
22 bld bld 23 0.54 1.21
23 bld bld 13 bld 3.67
24 bld bld 3 bld 15.86
[0219] ElT:洗脱时间,分钟。[IgM]:浓度,微克/毫升。DNA大小为碱基对(bp)。括号中的值来自离子交换实验中检测到的DNA。[DNA]浓度,ng/mL。[His]:总组蛋白浓度,微克/毫升。bld:低于检测下限。
[0220] 实施例16
[0221] 表1还显示了DNA的大小分布,其引起了意料不到的发现,即除DNA和组蛋白之外,一些聚集物类群还包含含有不同数目的核小体的核小体系列。来自该处理的IgM回收率为98%。
[0222] 实施例17
[0223] 图3显示了实施例16的抗HER2单克隆IgG抗体的相同程序之前和之后的尺寸排阻色谱图谱。相比实施例8,结果在类型上相同,但在程度上有所改善,这可能(至少部分地)是因为原始细胞培养物上清液中的抗体浓度为约10倍高。
[0224] 实施例18
[0225] 通过添加1%尿囊素和0.025%依沙吖啶处理1L细胞培养物收获物,并在搅拌下孵育15分钟,然后通过离心去除细胞和其他颗粒。使上清液通过含有等比例的以亚氨基二乙酸取代的苯乙烯二乙烯基苯颗粒(Chelex100)、以TREN取代的琼脂糖颗粒(BioWorks TREN,hi-sub)和以丁基残基取代的丙烯酸酯颗粒(Macroprep T-丁基)的构件,其总体积为50mL,尺寸为2.6×10cm,且流速为25mL/min。大于12%的初始聚集物含量被减少至小于0.1%。去除了过量的依沙吖啶。宿主蛋白污染物被减少了60%,从240,000ppm减少至142,0000ppm。如通过qPCR所测得的,DNA被减少了6个log。抗体回收率为99%。浊度为2.0NTU(比浊法浊度单位)。分析性SEC显示了2个非常后期的洗脱组分,其被理解为代表了极度疏水的细胞培养基添加剂。
[0226] 实施例19
[0227] 通过添加1%尿囊素和0.025%依沙吖啶处理1L细胞培养收获物,并在搅拌下孵育15分钟,然后通过离心去除细胞和其他颗粒。使上清液通过含有等比例的以亚氨基二乙酸取代的苯乙烯二乙烯基苯颗粒(Chelex100)、以氨基取代的苯乙烯二乙烯基苯颗粒(Dowex AG1x8)和以丁基残基取代的丙烯酸酯颗粒(Macroprep T-丁基)的构件,其总体积为50mL,尺寸为2.6×10cm,且流速为25mL/min。大于12%的初始聚集物含量被降低至小于0.1%。抗体回收率为95%。结果在其他方面与实施例18相同。
[0228] 实施例20
[0229] 通过添加1%尿囊素和0.025%依沙吖啶来处理1L的细胞培养物收获物,并在搅拌下孵育15分钟,然后通过离心去除细胞和其他颗粒。使上清液通过含有等比例的以亚氨基二乙酸取代的苯乙烯二乙烯基苯颗粒(Chelex 100)、以氨基取代的苯乙烯二乙烯基苯颗粒(Dowex AG1x2)和以TREN取代的琼脂糖颗粒(BioWorks TREN,hi-sub)的构件,其总体积为50mL,尺寸为2.6×10cm,且流速为25mL/min。大于12%的初始聚集物含量被降低至小于0.1%。抗体回收率为95%。分析性SEC表明没有实施例18中观察到的非常后期的洗脱组分。结果在其他方面与实施例18相同。
[0230] 实施例21
[0231] 重复实施例20的实验,除了将Dowex AG1x2的比例减半,并添加相同增量的T-丁基从而产生Chelex、BioWorks TREN、Dowex和T-丁基的2:2:1:1混合物。抗体回收率为98%,且SEC表明去除了后期洗脱的组分。本实施例,联合实施例18-20,强调了可以如何调节表面化学成分的选择以及它们的比例来适应特定样品,以靶向特定污染物或污染物类型。
[0232] 实施例22
[0233] 将1L的在大肠杆菌(Escherichia.coli)中产生,通过使用蔗糖渗透压休克回收,然后过滤去除了细胞碎片的Fab片段,与1%尿囊素、0.025%依沙吖啶合并,并在搅拌下孵育15分钟,然后使其通过50mL的夹在聚乙烯熔块之间的Macroprep Hi-S(负电性)和Macroprep Hi-Q(正电性)的等量混合物。柱子中的条件为20mM磷酸钠、150mM NaCl,pH6.7。将样品电导率和pH调节至相同条件。如通过AccuBlue所测得的,DNA被减少了99%。
如通过ELISA所测得的,宿主蛋白被减少了约65%。Fab回收率为97%,并且经处理的样品为光学透明的。
[0234] 对本领域技术人员显而易见的是,考虑到细胞、细胞培养物制剂、产物特性和表达水平以及收获时的相对细胞死亡率的广泛差异,为了最佳地适应任何在给定细胞培养基中产生的并且在特定细胞死亡率范围内收获的任何给定蛋白,将需要:基于单个的基础经实验研制特定类型的颗粒、它们的相对体积以及具体条件。另外显而易见的是,基于本文提供的实例和指导,确定材料和条件的最佳组合所需的实验处于本领域技术人员的知识围内。
[0235] 在使用后,固相的带电材料可任选地丢弃或回收。
[0236] 本发明可与各种纯化方法组合以实现所需纯化水平。实例包括但不限于,通常用于诸如蛋白A的抗体的其他纯化方法,以及其他形式的亲和层析、阴离子交换色谱、阳离子交换色谱、疏水相互作用色谱法、固相金属亲和色谱和其他混合模式的色谱方法。发展用于各种方法的合适的条件并将其与本文的发明整合以实现特定抗体的必要纯化,处于本领域技术人员的范围内。
[0237] 本文所引用的所有参考文献均通过引用整体并入本文并用于所有目的,其程度与就像每个单个的出版物或专利或专利申请被明确地并单独地指出通过引用整体并入本文用于所有目的相同。当通过引用并入的出版物和专利或专利申请与说明书中包含的公开内容相冲突时,说明书预期替代和/或优先于任何这类相冲突的材料。
[0238] 用于说明书和权利要求中的表达成分的量、层析条件等的所有数字应当理解为在所有情况下被术语“约”修饰。因此,除非另有所指,说明书和所附权利要求书中陈述的数字参数为近似值,其可根据本发明试图获得的所需性能而改变。
[0239] 如对本领域技术人员所显而易见的,可进行本发明的许多修饰和改变,而不脱离其精神和范围。本文描述的具体实施方案仅通过实例的方式提供,并且不试图以任何方式具有限制意义。预期,说明书和实例仅被认为是示例性的,本发明的真实范围和精神由如下权利要求所指明。
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