一种北极拟诺卡氏菌及其发酵产物优化方法
阅读：7发布：2020-05-17
专利汇可以提供一种北极拟诺卡氏菌及其发酵产物优化方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了北极拟诺卡氏菌Nocardiopsis sp.Y469及其 发酵 培养方法，属于 生物 技术领域。所述北极拟诺卡氏菌Nocardiopsis sp.Y469分离自北 冰 洋3700米海底的 沉积物 ，该菌株已于2018年8月13日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M 2018536。本发明还提供了北极拟诺卡氏菌Nocardiopsis sp.Y469的发酵培养方法，通过对比不同发酵培养基等发酵条件，优化能够显著提高 次级代谢产物 多样性的发酵条件，有助于充分发掘该菌株产生新的次级代谢产物的潜能。，下面是一种北极拟诺卡氏菌及其发酵产物优化方法专利的具体信息内容。
1.一种北极拟诺卡氏菌，其特征在于，所述北极拟诺卡氏菌命名为Nocardiopsis sp.Y469，其保藏号为CCTCC NO：M 2018536。
2.一种如权利要求1所述的北极拟诺卡氏菌Nocardiopsis sp.Y469的发酵培养方法，其特征在于，包括以下步骤：
(1)将活化的北极拟诺卡氏菌Nocardiopsis sp.Y469菌株接种于种子培养基中，培养得到种子液；
(2)将种子液接种于发酵培养基中发酵培养，获得发酵液；
所述发酵培养基以陈海水为溶剂，每升培养基中包括：酵母提取物4g、麦芽提取物10g、葡萄糖4g，PH为7.5；
或者酵母提取4g、麦芽提取物5g、葡萄糖4g、氯化钠50g、苯丙氨酸1mg、丙氨酸0.3g、FeSO4.7H2O 2mg、ZnSO4.7H2O 1mg、MnCl2.4H2O 1mg，以及维生素B1、核黄素、烟酸、维生素B6、泛酸钙、肌醇、β-氨基苯甲酸、生物素各0.5mg，PH为7.5；
或者大豆粉20g、蛋白胨2g、葡萄糖20g、淀粉5g、酵母提取物2g、氯化钠4g、K2HPO40.5g、CaCO3 2g，PH为7.5；
或者蛋白胨5g、葡萄糖10g、蔗糖340g、酵母提取物3g、麦芽提取物3g、MgCl2.6H2O 2ml、甘氨酸25ml，PH为7.5；
或者酪蛋白水解物2g、TES5.73g、NaH2PO4 0.16g、K2HPO4 0.23g、MgSO4 1.23g、葡萄糖
9g、微量元素0.2ml，PH为7.5，其中微量元素溶液的配置方法：ZnSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，MnC12·4H2O，CaC12·6H2O和NaCl各0.1g，ddH2O定容至1L，0.2μm滤头过滤除菌。
3.如权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述种子培养基为TSB培养基。
4.如权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(1)中，种子液培养的条件为20～30℃，150～200rpm培养至OD600值为0.6～0.8。
5.如权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(1)中，所述活化采用的培养基为2216E培养基，活化的温度为20～30℃。
6.如权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(2)中，种子液在发酵培养基中的接种量以体积百分比计为1-3％。
7.如权利要求2所述的发酵培养方法，其特征在于，步骤(2)中，发酵培养的条件为20～
30℃，以转速为150～200rpm振荡培养7～10天。
一种北极拟诺卡氏菌及其发酵产物优化方法
技术领域
背景技术
[0002] 极地拥有极端低温、干燥、强紫外辐射、高盐度等极端环境要素，且因生物地理隔离而形成特有的生态系统。极地微生物具备适应极端环境的生理、生化、遗传与代谢特征，是产生新颖活性物质的重要来源。其中，极地海洋放线菌是挖掘新药先导化合物和新型抗生素的重要资源。
[0003] 拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)是放线菌门放线菌纲放线菌目拟诺卡氏菌科的一个属，由于其生态多样性和能够产生丰富的具有生物活性的次级代谢产物而受到广泛关注。拟诺卡氏菌广泛分布于土壤、海洋环境或高盐地区，能产生多种酶、相容性溶质、表面活性剂、以及具有多种生物活性的天然产物。目前从拟诺卡氏菌属获得的抗菌化合物包括聚酮化合物、苯嗪、奎林生物碱、三联苯、硫肽和胺等，并能合成抗癌化合物、肿瘤促进剂、P-糖蛋白抑制剂、免疫调节剂和蛋白激酶抑制剂等化合物。目前已经在市场上销售的拟诺卡氏菌属来源的化合物有Apoptolidin和K-252a。因此拟诺卡氏菌具有巨大的活性产物合成潜力与挖掘前景。
[0004] 微生物合成次级代谢产物受到多种因素的影响，例如培养基组成、发酵温度、发酵时间、发酵方式等，在不同培养条件下可能发酵产物差异很大，其中培养基的影响尤为突出。因此，如何使菌株的产物在类型、多样性和产量上最大化，需要对发酵条件进行探索和优化，尤其针对培养基的优化很关键。
[0005] HPLC-TOF MS(高效液相色谱/电喷雾飞行时间质谱联用)技术可以用于快速检测发酵产物中化合物丰富程度，并便于进行横向比较。HPLC-TOF MS结合了液相色谱仪有效分离热不稳性及高沸点化合物的分离能力与质谱仪很强的组分鉴定能力，是一种分离分析复杂有机混合物的有效手段。质谱能逐个分析高效液相色谱分离开的有机物，获得分子量，结合数据库搜索，可以获得一些化合物的分子式，为推断可能的产物提供信息。因此，基于发酵产物粗提物进行HPLC-TOF MS分析，可以直观比较不同条件下产物丰富程度，有利于寻找最优发酵条件，并最终获得最丰富的天然产物，最大程度地挖掘极地放线菌天然产物合成潜力。
发明内容
[0006] 本发明的目的在于提供一种新的北极拟诺卡氏菌，并优化其发酵培养条件提高该菌株次级代谢产物多样性，有助于充分发掘该菌株产生新的次级代谢产物的潜能。
[0007] 为实现上述目的，本发明采用如下技术方案：
[0008] 本发明提供了一种北极拟诺卡氏菌，命名为Nocardiopsis sp.Y469，该菌株已于2018年8月13日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，其保藏号为CCTCC NO：M2018536。
[0009] 北极拟诺卡氏菌Nocardiopsis sp.Y469是从北冰洋3700米海底的沉积物中分离得到，该菌株的主要形态和生物学特征如下：该菌株菌落形态见附图1，在20℃下2216E平板培养2～3天，菌落由起始的圆滑、无色变成白色绒状，形成孢子，菌落边缘开始呈现不整齐。在液体培养基中，菌株呈颗粒状沉淀生长。该菌株革兰氏染色呈紫色，属于革兰氏阳性菌。
该菌株为适冷菌，能在4℃以下低温生长，最适生长温度范围在25～30℃。该菌株耐盐，能在
0％-12％的盐度范围生长。
该菌株为适冷菌，能在4℃以下低温生长，最适生长温度范围在25～30℃。该菌株耐盐，能在
0％-12％的盐度范围生长。
[0010] 将上述菌株进行序列测定，其16S rRNA基因序列如SEQ ID NO.1所示。将测序结果与已知序列进行同源性比较，该菌株的分子鉴定进化树见图2。结合该菌的培养特征、细胞形态等，鉴定该菌株属于拟诺卡氏菌属(Nocardiopsis)的一个新菌株，并命名为Nocardiopsissp.Y469。
[0011] 全基因组测序表明该菌株具有多个跟次级代谢产物合成相关的基因簇，如lantipeptide(羊毛硫肽化合物)、吩嗪、四氢嘧啶、嗜铁素、萜类细菌素、聚酮类、非核糖体多肽类、套索肽等生物合成基因簇。因此，该菌株具有良好的天然产物挖掘潜力。
[0012] 本发明提供了上述北极拟诺卡氏菌Nocardiopsis sp.Y469的发酵培养方法，包括以下步骤：
[0014] (2)将种子液接种于发酵培养基中进行摇瓶发酵培养，获得发酵液；
[0016] 或者酵母提取物4g、麦芽提取物5g、葡萄糖4g、氯化钠50g、苯丙氨酸1mg、丙氨酸0.3g、FeSO4.7H2O 2mg、ZnSO4.7H2O 1mg、MnCl2.4H2O 1mg，以及维生素B1、核黄素、烟酸、维生素B6、泛酸钙、肌醇、β-氨基苯甲酸、生物素各0.5mg，PH为7.5(改良ISP2液体培养基)；
[0018] 或者蛋白胨5g、葡萄糖10g、蔗糖340g、酵母提取物3g、麦芽提取物3g、MgCl2.6H2O2ml(2.5M)、甘氨酸(20％)25ml，PH为7.5(YEME液体培养基)；
[0019] 或者酪蛋白水解物2g、TES 5.73g、NaH2PO4 0.16g、K2HPO4 0.23g、MgSO4 1.23g、葡萄糖9g、微量元素0.2ml，PH为7.5(SMMS液体培养基)，其中微量元素溶液的配置方法如下：ZnSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，MnC12·4H2O，CaC12·6H2O和NaCl各0.1g，ddH2O定容至1L，过滤除菌。
[0020] 所述陈海水取自极地，也可用人工海水代替，人工海水参照国际标准ASTM D1141-98配制。
[0021] 本发明针对菌株培养基的类型进行发酵产物的HPLC和HPLC-TOF MS分析，初步获得该菌株的产物表达情况。HPLC光谱结果反映发酵产物中化合物的丰富程度，HPLC-TOF MS可以检测发酵混合产物的各分子量。研究表明，北极拟诺卡氏菌Nocardiopsis sp.Y469在上述五种培养基中均能进行发酵培养，生成次级代谢产物，但是产物种类、产物分子量各异，例如S3培养基发酵条件下得到的产物峰比其他条件的多；相比其他发酵条件，SMMS培养基发酵的产物分子量比较大。
[0022] 步骤(1)中，所述种子培养基为TSB培养基。
[0023] 种子液培养的条件为20～30℃，150～200rpm培养至OD600值为0.6～0.8。所述活化采用的培养基为2216E培养基，活化的温度为20～30℃。经研究，该菌株最适生长温度在该温度范围，且培养到该阶段菌株活力最佳，适合活化与后续扩大培养。
[0024] 步骤(2)中，种子液在发酵培养基中的接种量以体积百分比计为1～3％。
[0025] 发酵培养的条件为20～30℃，以转速为150～200rpm振荡培养7～10天。在该发酵条件下，菌株前期生长较快，能达到足够的菌体量，延长培养时间有利于后期合成次级代谢产物。
[0026] 本发明具备的有益效果：
[0027] 本发明从北冰洋3700米海底的沉积物中分离得到一株新的北极拟诺卡氏菌Nocardiopsissp.Y469，通过对比不同发酵培养基等发酵条件，优化能够显著提高次级代谢产物多样性的发酵条件，有助于充分发掘该菌株产生新的次级代谢产物的潜能。
附图说明
[0028] 图1为Nocardiopsis sp.Y469菌株形态。
[0029] 图2为基于16S rRNA构建Nocardiopsis sp.Y469系统发育树。
[0030] 图3为Nocardiopsis sp.Y469发酵液抑菌圈实验结果代表性图示，其中(A)为立枯丝核菌，(B)为枯草芽孢杆菌的抑菌圈，图中C为甲醇浸润的试纸对照，1～4分别为实验组平行重复。
[0031] 图4为Nocardiopsis sp.Y469五种培养基的发酵工艺操作流程。
[0032] 图5为Nocardiopsis sp.Y469在五种培养基条件下甲醇提取物的HPLC光谱图。
[0033] 图6为Nocardiopsis sp.Y469在五种培养基条件下丙酮提取物的HPLC光谱图。
具体实施方式
[0035] 下面实施例中涉及的培养基配方和配置方法，以及大孔树脂的预处理方法如下：
[0036] (一)用于活化菌株的培养基成分以及配置方法：
[0037] 2216E液体培养基：
[0038] 现成培养基混合物 37.4g
[0039] 称量后加入1L ddH2O，调节PH为7.5左右，120℃高压灭菌20min。
[0040] 2216E平板培养基:
[0041] 现成培养基混合物 37.4g
[0042] 琼脂粉 15g
[0043] 称量后加入1L ddH2O，调节PH为7.5左右，120℃高压灭菌20min。冷却至[0044] 55-60℃左右，倒平板。
[0045] (二)用于培养种子液的培养基成分以及配置方法：
[0046] TSB液体培养基：
[0047] 胰蛋白胨大豆肉汤 30g
[0048] 酵母提取物 5g
[0049] 蔗糖 340g
[0050] 称量后加入1L ddH2O，调节PH为7.5左右，120℃高压灭菌20min。
[0051] (三)用于发酵培养的五种不同培养基的成分以及配置方法：
[0052] ISP 2液体培养基：
[0053] 酵母提取物 4g
[0054] 麦芽提取物 10g
[0055] 葡萄糖 4g
[0056] 称量后加入1L陈海水，调节PH为7.5左右，120℃高压灭菌20min。
[0057] 改良ISP2液体培养基：
[0058]
[0060] 称量后加入1L陈海水，调节PH为7.5左右，120℃高压灭菌20min。
[0061] S3液体培养基：
[0062]
[0063] 称量后加入1L陈海水，调节PH为7.5左右，120℃高压灭菌20min。
[0064] YEME液体培养基：
[0065]
[0066] 称量后加入1L陈海水，调节PH为7.5左右，120℃高压灭菌20min。高压灭菌后加入2ml MgCl.6H2O(2.5M)；25ml Glycine(20％)。
[0067] SMMS液体培养基：
[0068]
[0069] Trace elements溶液的配置方法：ZnSO4·7H2O，FeSO4·7H2O，MnC12·4H2O，CaC12·6H2O和NaCl各0.1g，ddH2O定容至1L，过滤除菌。
[0070] 称量完成后溶于1L ddH2O并调节PH值7.5。120℃高压灭菌20分钟。
[0071] (四)XAD-16非离子型大孔树脂的预处理：
[0072] ①将250g XAD160树脂悬浮在1.5L去离子水中，调pH为7.0-7.5；
[0073] ②倒去上清，用2L去离子水冲洗3-4次(冲洗时先进行短暂的搅拌，待树脂沉降至底部后，倒出上清，最后一次清洗后去除尽可能多的水)；
[0074] ③将XAD悬浮在索氏提取器中(80％体积)，在冷水中进行冷却，用100ml丙酮进行冲洗，即100ml丙酮浸泡1h后倒掉，重复三次；
[0075] ④将树脂在甲醇中浸泡3h；
[0076] ⑤倒出甲醇，用去离子水冲洗3-4次，最终保存在约600ml的去离子水中，用小瓶分装，200ml蓝盖试剂瓶，每瓶装150ml，灭菌备用。
[0077] 实施例1
[0078] 1、菌株的分离与鉴定
[0079] 菌株Y469分离自北冰洋3700米海底的沉积物样品，经梯度稀释法从2216E平板上分离纯化。该菌株菌落形态见附图1，在20℃下2216E平板培养2～3天，菌落由起始的圆滑、无色变成白色绒状，形成孢子，菌落边缘开始呈现不整齐。
[0080] 无菌操作挑取平板上单菌落，接种到2216E液体培养基中扩大培养，经QIAGEN试剂盒(Cat.No.51304)抽提基因组DNA，用引物对27F/1492R进行PCR扩增16S rRNA基因序列并测序，所得核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。提交NCBI数据库以及EzBioCloud平台进行鉴定，比对结果显示与之最相似的为Nocardiopsis属的菌株，最近缘的标准菌株为Nocardiopsisdassonvillei subsp.albirubida NBRC 13392T(16S rRNA基因序列相似性为99.7％)。基于近缘的标准菌株16S rRNA基因序列，采用MEGA V6.0软件的邻接法构建系统发育树，见附图2。与上述比对结果一致，Y469与Nocardiopsis dassonvillei subsp.albirubida NBRC 13392T在进化树上同一个分支，表明二者亲缘关系最近。
[0081] 由于放线菌往往存在16S序列相似性极高，但仍然为不同种的现象，即16S在种的划分上分辨率不够，因此进一步比较分析了二者的全基因组序列，基于全基因组序列的DDH(DNA-DNA杂交)值为50.3％，低于属于同种的标准值70％，表明二者可能属于不同种，Y469可能代表Nocardiopsis属的一个新种。因此Y469初步鉴定为放线菌门放线菌纲放线菌目拟诺卡氏菌科拟诺卡氏菌属的一个新菌株，命名为Nocardiopsis sp.Y469。
[0082] 2、菌株合成天然产物的潜力分析
[0083] 菌株Nocardiopsis sp.Y469经在S3和SMMS培养基中初步发酵，分别用甲醇和丙酮提取发酵粗提物，溶解于甲醇中进行抗菌实验初筛，发现甲醇提取物部分均具备抑制枯草芽孢杆菌、立枯丝核菌、串珠镰孢的活性，其中抗串珠镰孢活性最强，其次是立枯丝核菌、枯草芽孢杆菌，并且S3培养菌株的甲醇提取物的抑菌活性最明显。因此体现出合成活性产物的潜力。代表性抑菌圈结果如图3所示，分别为Nocardiopsis sp.Y469经S3培养基发酵后甲醇粗提物对立枯丝核菌(A)与枯草芽孢杆菌(B)的抑菌圈，其中C为甲醇浸润的试纸对照，1～4分别为实验组平行重复。
[0084] 而且，基于该菌株全基因组序列的生物信息学分析，发现该菌株基因组中编码至少16个天然产物合成基因簇，详见附表1。其中包括lantipeptide、吩嗪、四氢嘧啶、聚酮、非核糖体多肽、嗜铁素、细菌素、萜类、套索肽、寡糖等多种类型的合成基因簇，并且多数合成基因簇与已知的基因簇差异很大，甚至没有相似的基因簇，表明菌株Y469能合成丰富且新颖的天然产物。
[0085] 表1 Nocardiopsis sp.Y469基因组中编码的次级代谢产物合成基因簇[0086]
[0087] 3、菌种保藏
[0088] 将上述菌株命名为Nocardiopsis sp.Y469，于2018年8月13日保藏于中国武汉、武汉大学的中国典型培养物保藏中心，保藏号为CCTCC NO：M 2018536，于2018年8月28日鉴定存活。
[0089] 实施例2
[0090] 1、种子液的制备
[0091] 挑取实施例1中已经验证好的Nocardiopsis sp.Y469单菌落于含250ml TSB培养基的1L锥形瓶中，30℃，200rpm培养2～3天，OD600值约为0.6～0.8，种子液制备完成。
[0092] 2、摇瓶发酵培养
[0093] 上述种子液按照1％(V/V)的接种量分别接种配置好的2L ISP2培养基、改良ISP2培养基、S3培养基、YEME培养基、SMMS培养基，置30℃，200rpm摇床培养，发酵3～4天时加入2～4％预处理过的XAD-16非离子型大孔树脂，继续发酵3～4天。
[0094] 3、发酵产物的提取
[0095] 用500ml离心管，8000rpm离心15～20min收集细胞和大孔吸附树脂，纱网过滤去除上清；然后置-80℃冰箱冰冻过夜后解冻破壁。用300ml甲醇提取，超声30min后再摇床震荡30～60min，进一步提高提取效果；重复以上步骤4次；用真空泵抽滤得到甲醇与产物的混合溶液，旋转蒸发去除甲醇，并称量记录粗提物重量；溶于2ml甲醇中。再以相同体积丙酮溶液同样操作，重复提取4次，溶于2ml甲醇中。具体操作流程见附图4。
[0096] 4、HPLC和LC/MS分析
[0097] 将溶于甲醇的粗提物用0.22μm滤膜过滤之后用于HPLC和LC/MS分析。本发明中使用的HPLC分析仪器为Waters e2695HPLC，LC/MS分析仪器为Agilent 6224TOF LC/MS，使用的参数如下：
[0098] (1)HPLC分析
[0099] 使用的色谱柱为C18柱(4.6×150mm，3.5μm)；流动相：水相A：H2O+0.1％三氟乙酸(TFA)和有机相B：CH3CN+0.1％TFA；流速：1ml/min；进样量：10μl
[0100] 梯度洗脱条件：
[0101]
[0102] (2)LC/MS分析
[0103] 使用的色谱柱为C18柱(4.6×75mm，3.5μm)；流动相：水相A：H2O+0.1％HCOOH和有机相B：CH3CN+0.1％HCOOH；流速：0.4ml/min；进样量：10μl
[0104] 梯度洗脱条件：
[0105]
[0106] 5、结果分析
[0107] 甲醇提取其发酵产物的HPLC光谱图见附图5。丙酮提取其发酵产物的HPLC光谱图见附图6。从HPLC光谱图比较可知，Nocardiopsis sp.Y469在S3培养基发酵条件下得到的产物峰比其他条件的多，且产物量较高，表明该条件下发酵所得化合物相比其他条件更丰富。LC/MS结果中提取峰高大于等于1000点的分子量，结果如附表2所示。
[0108] 表2发酵产物LC/MS提取分子量列表。
[0109]
[0110]
[0111]
[0112] 从上表中可知，S3培养基发酵产物甲醇提取部分所检测出的分子量最多，远远超过其他几种培养基，在丙酮提取部分检测出分子量最多的为SMMS培养基，但丙酮提取部分各培养基所检测得到的分子量数目差异不大。综合分析，S3培养基发酵产物所获得分子量最丰富，但分子量相对较小(从102.04到764.15)，而SMMS培养基发酵所得分子量覆盖范围较大，且包含高达1270.55的大分子量化合物。该结果表明，不同培养基发酵产物从丰度、多样性到类型都有差异，通过结合HPLC、LC/MS等多谱学分析，可以为最大程度获得丰富的产物、或者获得特定分子量范围的产物提供判断依据，有利于进一步深入挖掘该菌株合成的天然产物。
| 标题 | 发布/更新时间 | 阅读量 |
|---|---|---|
| 一种筛选高表达外源蛋白的非整合减毒李斯特菌菌株的方法 | 2020-05-13 | 894 |
| 种植用半基质覆盖物的原菌液配方 | 2020-05-16 | 231 |
| 一种吲哚二萜类化合物及其制备方法和用途 | 2020-05-08 | 420 |
| 复方苦参注射液1H-NMR指纹图谱的构建方法及应用 | 2020-05-16 | 959 |
| 磷光体和组合物 | 2020-05-08 | 425 |
| 适用于链霉菌的T7RNA聚合酶表达盒PhT7及其表达载体和应用 | 2020-05-15 | 254 |
| 聚糖聚合物及其相关方法 | 2020-05-16 | 692 |
| 紫色红曲菌comp51725_c0基因过表达菌株的构建方法 | 2020-05-12 | 863 |
| 一种天然Rakicidins类化合物Rakicidin B1-2及其发酵提取方法 | 2020-05-12 | 730 |
| 一种硼替佐米诱导海洋真菌合成次级代谢产物的方法 | 2020-05-16 | 142 |
高效检索全球专利专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台，是提供专利分析，专利查询，专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。
我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据，免费查、免费专利分析。
分析报告
专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析，涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度，系统通过AI智能系统对图表进行解读，只需1分钟，一键生成行业专利分析报告。
次级代谢产物热门专利
QQ群二维码
意见反馈
意见反馈