具有编码突变的乙酰羟酸合成酶蛋白大亚基的突变的多核苷酸且除草剂抗性增强的高粱植物专利检索-非选择性除草剂农用化学品和农药专利检索查询-专利查询网

具有编码突变的乙酰羟酸合成酶蛋白大亚基的突变的多核苷酸且 除草剂抗性增强的 高粱 植物

阅读：94发布：2020-05-14

专利汇可以提供具有编码突变的乙酰羟酸合成酶蛋白大亚基的突变的多核苷酸且除草剂抗性增强的高粱植物专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一种在其基因组中包括至少一种多核苷酸的高粱种子，该多核苷酸编码多肽，该多肽在高粱AHAS蛋白大亚基的第93位上的丙氨酸被替换为苏氨酸。该植物相比于野生型高粱植物对一种或多种除草剂具有增强的抗性，其中除草剂例如为来自咪唑啉酮组的除草剂。高粱植物在其基因组中可以包括一个、两个、三个或更多个拷贝的多核苷酸，该多核苷酸编码高粱AHAS的突变的大亚基，或本发明的高粱AHAS多肽。在此上下文中，高粱植物可以对能够抑制AHAS酶活性的任何除草剂都有耐受性。例如，高粱植物可以对咪唑啉酮类型的除草剂(诸如，咪草烟、灭草烟和甲基咪草烟)有耐受性，或者对磺酰脲组的除草剂有耐受性。，下面是具有编码突变的乙酰羟酸合成酶蛋白大亚基的突变的多核苷酸且除草剂抗性增强的高粱植物专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种高梁植物，在所述高梁植物的基因组中包括至少一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码多肽，所述多肽在高粱AHAS蛋白的大亚基的第93位上的丙氨酸被替换成苏氨酸，所述植物相比于野生型高粱植物对一种或多种除草剂具有增强的抗性。
2.根据权利要求1所述的高粱植物，其中，所述除草剂选自由咪唑啉酮和磺酰脲组成的组。
3.根据权利要求2所述的高粱植物，其中，所述咪唑啉酮除草剂选自由咪草烟、灭草烟和甲基咪草烟组成的组。
4.根据权利要求1所述的高粱植物，其中，至少一种多核苷酸包括SEQ ID NO.1。
5.根据权利要求1所述的高粱植物，其中，经编码的所述多肽包括SEQ ID NO.2。
6.根据权利要求1所述的高粱植物，其中，包括如在NCIMB 41870中所示的AHAS基因中的突变。
7.根据权利要求1所述的高粱植物，其中，所述高粱植物对咪唑啉酮组中的一种或多种除草剂具有增强的抗性性状，该增强的抗性性状如NCIMB 41870所示的抗性。
8.根据权利要求6和7中任意一项所述的高粱植物，其中，对一种或多种除草剂具有增强的抗性的所述高粱植物对于通过基因渗入将所述抗性性状引入到另一高粱植物中是有用的。
9.根据权利要求1所述的高粱植物，其中，所述植物是转基因的。
10.根据权利要求1所述的高粱植物，其中，所述植物是非转基因的。
11.一种抗除草剂的高粱植物，包括NCIMB 41870的抗性性状，其中，所述高粱植物选自由以下植物组成的组：诸如，NCIMB 41870，NCIMB 41870植物的后代，NCIMB 41870的突变体植物，以及NCIMB 41870突变体的后代。
12.根据权利要求11所述的高粱植物，其中，所述除草剂属于咪唑啉酮的组。
13.根据权利要求11所述的高粱植物，其中，所述植物是转基因的。
14.根据权利要求11所述的高粱植物，其中，所述植物是非转基因的。
15.一种高梁种子，在所述高梁种子的基因组中包括至少一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码多肽，所述多肽在高粱AHAS蛋白的大亚基的第93位上的丙氨酸被替换成苏氨酸。
16.根据权利要求15所述的种子，其中，所述种子生成植物，所述植物相比于野生型高粱植物对来自咪唑啉酮的组中的一种或多种除草剂具有增强的抗性。
17.根据权利要求15所述的种子，其中，所述种子包括如在保藏的种子NCIMB 41870中所示的AHAS基因中的突变。
18.一种根据权利要求1至10中任意一项所述的植物的种子。
19.一种根据权利要求11至14中任意一项所述的植物的种子。
20.一种用于识别抗除草剂的植物的方法，包括：
a)提供来自高粱植物的核酸样本；
b)扩增如下区域，该区域对应于来自高粱植物的所述核酸样本中存在的AHAS基因；
c)基于在经扩增的核酸样本中存在的至少一种突变，来识别抗除草剂的植物，其中所述突变赋予对来自咪唑啉酮的组的除草剂的抗性。
21.根据权利要求20所述的方法，其中，所述核酸样本包括至少一种突变，诸如在NCIMB
41870中存在的突变。
22.根据权利要求20所述的方法，其中，所述至少一种突变包括在经编码的多肽中的Ala93Thr替换，其中，所述多肽具有乙酰羟酸合成酶的活性。
23.根据权利要求20所述的方法，其中，所述核酸样本包括SEQ ID NO.1。
24.根据权利要求22所述的方法，其中，所述多肽包括SEQ ID NO.2。
25.根据权利要求20所述的方法，其中，所述植物是单子叶植物。
26.根据权利要求20所述的方法，其中，所述植物是双子叶植物。
27.根据权利要求20所述的方法，其中，所述植物是转基因植物。
28.根据权利要求20所述的方法，其中，所述植物是非转基因植物。
29.根据权利要求20所述的方法，其中，所述除草剂选自由咪唑啉酮和磺酰脲组成的组。
30.一种控制杂草的方法，所述杂草紧邻作物，所述方法包括将有效量的来自咪唑啉酮或磺酰脲的组中的除草剂施加至杂草和作物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中，所述咪唑啉酮除草剂选自由咪草烟、甲基咪草烟和灭草烟组成的组。
32.根据权利要求30所述的方法，其中，所述作物选自由以下植物组成的组：
a)基因组中包括至少一种多核苷酸的高粱植物，其中所述多核苷酸编码多肽，所述多肽在高粱AHAS蛋白的第93位上的丙氨酸被替换成苏氨酸，其中，所述植物相比于野生型高粱植物对来自咪唑啉酮或磺酰脲的组的一种或多种除草剂具有增强的抗性；
b)包括AHAS基因中的突变的高粱植物，所述突变诸如为在NCIMB 41870中的AHAS基因中的突变；
c)包括对来自咪唑啉酮或磺酰脲的组中的一种或多种除草剂具有增强的抗性性状的高粱植物，所述增强的抗性性状诸如为NCIMB 41870所示出的抗性。
d)高粱植物a)至c)的植物、后代、衍生物或突变体。
33.一种多核苷酸，包括选自由以下核苷酸序列组成的组中的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，
b)编码SEQ ID NO.2所示的多肽的核苷酸序列；
c)编码与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少95％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中，该多肽具有抗除草剂的AHAS活性；
d)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中，该核苷酸序列编码包括AHAS的大亚基的多肽，并且显示出抗除草剂的AHAS活性；
e)与核苷酸序列a)至d)中的一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。
34.根据权利要求33所述的多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码多肽，该多肽包括在AHAS的大亚基中的Ala93Thr替换。
35.一种表达盒，包括可操作地连接在其中的根据权利要求33所述的核苷酸序列，所述核苷酸序列可操作地连接在所述表达盒中。
36.根据权利要求35所述的表达盒，进一步包括至少一种启动子，所述启动子驱动所述多核苷酸的表达。
37.根据权利要求36所述的表达盒，其中，所述启动子选自包括用于在植物、细菌、真菌、动物细胞和原生动物中进行表达的启动子的组。
38.一种经根据权利要求35所述的表达盒转化的细胞。
39.根据权利要求38所述的细胞，其中，所述细胞选自由细菌、真菌、酵母、植物细胞和动物细胞组成的组。
40.一种具有多核苷酸的转化载体，所述多核苷酸包括选自以下组中的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，
b)编码SEQ ID NO.2所示的多肽的核苷酸序列；
c)编码与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少95％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中，该多肽显示出抗除草剂的AHAS活性；
d)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中，该核苷酸序列编码包括AHAS的大亚基的多肽，并且显示出抗除草剂的AHAS活性；
e)与核苷酸序列a)至d)中的一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；
其中，所述载体进一步包括选择性基因、至少一种启动子，所述至少一种启动子可操作地连接至所述核苷酸序列，能够驱动所述核苷酸序列的表达。
41.根据权利要求40所述的载体的应用，用于转化细胞，所述细胞选自包括细菌、真菌、酵母、植物细胞和动物细胞的组。
42.一种经转化的植物，其中，所述植物包括整合在所述植物的基因组中的至少一种启动子，所述启动子可操作地连接至多核苷酸，所述多核苷酸选自包括以下核苷酸序列的组：
a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，
b)编码SEQ ID NO.2所示的多肽的核苷酸序列；
c)编码与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少95％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中，所述多肽显示出抗除草剂的AHAS活性；
d)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中，所述核苷酸序列编码包括AHAS的大亚基的多肽，并且显示出抗除草剂的AHAS活性；
e)与核苷酸序列a)至d)中的一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；
其中，所述载体进一步包括选择性基因、至少一种启动子，所述至少一种启动子可操作地连接至所述核苷酸序列，能够驱动所述核苷酸序列的表达。
43.根据权利要求42所述的植物，其中，所述启动子选自由组织特异性启动子和叶绿体特异性启动子组成的组。
44.根据权利要求42所述的植物，其中，所述植物是单子叶植物。
45.根据权利要求42所述的植物，其中，所述植物是双子叶植物。
46.根据权利要求44所述的植物，其中，所述植物选自由高粱、玉米、稻和小麦组成的组。
47.根据权利要求45所述的植物，其中，所述植物选自由大豆和油菜组成的组。
48.根据权利要求42所述的植物，其中，所述植物相比于非转化的植物包括增强的除草剂抗性。
49.根据权利要求42所述的植物，其中，所述除草剂选自由咪唑啉酮和磺酰脲组成的组。
50.一种获得抗除草剂的植物或具有增强的除草剂抗性的植物的方法，其中，所述方法包括：
i)用表达盒或载体转化植物细胞，所述表达盒或载体包括多核苷酸，所述多核苷酸具有选自以下组中的核苷酸序列：
a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，
b)编码SEQ ID NO.2所示的多肽的核苷酸序列；
c)编码与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少95％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中，该多肽显示出抗除草剂的AHAS活性；
d)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中，该核苷酸序列编码包括AHAS的大亚基的多肽，并且显示出抗除草剂的AHAS活性；以及e)与核苷酸序列a)至d)中的一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列；
其中，所述表达盒进一步包括至少一种启动子，所述至少一种启动子可操作地连接至所述多核苷酸，其中所述启动子驱动所述多核苷酸的表达；
ii)使所述植物细胞再生，以获得抗除草剂的植物。
51.根据权利要求50所述的方法，其中，所述启动子包括植物组织特异性的启动子。
52.根据权利要求50所述的方法，其中，所述启动子包括叶绿体特异性的启动子。
53.根据权利要求50所述的方法，其中，所述除草剂选自由咪唑啉酮和磺酰脲组成的组。
54.根据权利要求53所述的方法，其中，咪唑啉酮除草剂选自包括咪草烟、甲基咪草烟和灭草烟的组。
55.根据权利要求50所述的方法，其中，所述植物是单子叶植物。
56.根据权利要求50所述的方法，其中，所述植物是双子叶植物。
57.根据权利要求55所述的方法，其中，所述植物选自由高粱、玉米、稻和小麦组成的组。
58.根据权利要求56所述的方法，其中，所述植物选自由大豆和油菜组成的组。
59.根据权利要求50所述的方法，其中，所述植物相比于非转化的植物包括增强的除草剂抗性。
60.根据权利要求50所述的方法，其中，所述植物包括AHAS的大亚基，并且显示出抗除草剂的AHAS活性。

说明书全文

具有编码突变的乙酰羟酸合成酶蛋白大亚基的突变的多核苷

酸且除草剂抗性增强的高粱植物

背景技术

[0001] 高粱(Sorghum spp.)是包括约20种草类植物的植物属。高粱原产于东非的热带和亚热带地区，并且作为人类和动物食用的谷物在每一个大洲都有种植。高粱也用作饲料，并且用于制造酒精饮料。由于高粱是无麸质的，因此适合患乳糜泻疾病的个体食用。

[0002] 与大部分谷类作物相比，高粱对干旱和过多的土壤含水量具有更高的耐受性。高粱能够在不同的土壤和气候条件下正常生长。同样地，高粱有利地响应灌溉，在其生命周期中最少需要250mm的灌溉，且最佳灌溉范围为400～550mm。

[0003] 为了实现快速且均匀的出苗，从而实现良好的作物培植，土壤在种植时必须具有适当的含水量。对水的最大需求开始于出苗后的30天并且一直持续到谷物饱满，最关键的阶段是穗形成和开花的阶段，因为此时缺水会导致产量降低。

[0004] 而且，高粱具有在干旱时期保持休眠并且在有利时期恢复生长的能力，但是这些压力状态可影响特性。

[0005] 高粱的正常发育需要高温，并因此它比其它作物对低温更敏感。不小于18℃的土壤温度是发芽所需要的；并且，直到温度达到15℃才会实现植物的实际活跃生长，最佳温度为约32℃。

[0006] 乙酰羟酸合成酶(AHAS)是催化支链氨基酸缬氨酸、亮氨酸和异亮氨酸的合成的第一酶。AHAS是一些除草剂，诸如，磺酰脲类、咪唑啉酮类、三唑并嘧啶类和嘧啶氧基苯甲酸盐类(pyrimidyloxybenzoates)的靶标。前两个除草剂种类由于其毒性低且对杂草具有高功效而被广泛用于现代农业。

[0007] 除草剂的咪唑啉酮种类包括：咪草烟(imazethapyr)、灭草喹(imazaquin)和灭草烟(imazapir)。

[0008] 市场中存在的一些磺酰脲类是：甲磺隆(甲酯)(metsulfuron-methyl)、氯磺隆(chlorosulfuron)、烟嘧磺隆(nicosulfuron)、醚磺隆(cinosulfuron)、酰亚磺隆(imidasulfuron)，氯吡嘧磺隆(halosulfuron)、玉嘧磺隆(rimsulfuron)、醚磺酰胺(trisulfuron-methyl)和苯磺隆(甲酯)(tribenuron-methyl)。

[0009] 但是，存在对咪唑啉酮和/或磺酰脲种类的除草剂有抗性的植物；例如，诸如玉米(Zea mays)、拟南芥(Arabidopsis thaliana)、欧洲油菜(Brassica napus)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)和稻(Oryza sativa)(Sebastian等人,(1989)Crop Sci.,29:1403-1408；Swanson等人,1989Theor.Appl.Genet.78:525-530；Newhouse等人,(1991)Theor.Appl.Genet.,83:65-70；Sathasivan等人,(1991)Plant Physiol.,97:1044-1050；
Mourand等人,(1993)J.Heredity 84:91-96；U.S.Patent No.5,545,822)的物种。已描述了在向日葵中的AHAS的大亚基中的点突变，该点突变赋予了对咪唑啉酮类型的除草剂的抗性(WO 2007/0118920)。

[0010] 也已检测到了对咪唑啉酮或磺酰脲类型的除草剂有抗性的植物。这些植物已经自然地获得了抗性，并且已经用于杂交育种以产生抗除草剂的品种。通过对抗性植物的分析，确定了向日葵AHAS蛋白中的点突变，该点突变使氨基酸Ala被Val替换(White等人,(2003)Weed Sci.,51:845-853)。

[0011] 此外，美国专利号4,761,373、5,331,107、5,304,732、6,211,438、6,211,439和6,222,100都公开了对咪唑啉酮除草剂有抗性的植物。所有这些专利都笼统地描述了改变的AHAS基因在植物中引发除草剂抗性的应用，并且具体公开了一些咪唑啉酮抗性的玉米品系。美国专利号5,731,180和美国专利号5,767,361讨论了在野生型单子叶植物AHAS氨基酸序列中具有单个氨基酸替换的分离的基因，该分离的基因产生了对咪唑啉酮类特异性的抗性。

[0012] 专利文件WO 2006/007373和WO 2006/060634公开了一些突变，该突变在小麦植物中赋予了对咪唑啉酮类型的除草剂的抗性。

[0013] 出版物“Amino acids conferring herbicide resistance in tobacco acetohydroxyacid synthase(在烟草乙酰羟酸合成酶中赋予除草剂抗性的氨基酸)”描述了在AHAS中赋予除草剂抗性的不同的点突变(GM Crops 1:2,62-67；2010年2月16日)。

[0014] 专利文件US 20100115663提及了通过改变乙酰辅酶A羧化酶基因来获得抗除草剂的高粱植物。还公开了对除草剂二硝基苯胺有抗性的高粱植物(US 20100205686)和对除草剂乙酰乳酸合成酶有抗性的高粱植物(WO2008/073800)。发明内容

[0015] 与野生型高粱植物相比，本发明的高粱植物示出对除草剂，例如靶向AHAS酶的除草剂(即，咪唑啉酮类和磺酰脲类)的增强的抗性。具体地，本发明的高粱植物(Sorghum bicolor)在其基因组中包括至少一种多核苷酸。所述多核苷酸编码AHAS的大亚基，该AHAS的大亚基在高粱AHAS大亚基的第93位或等效位置处的丙氨酸被替换成苏氨酸，其中，所述植物相比于野生型高粱植物具有对一种或多种除草剂(诸如选自唑啉酮类的组的除草剂)的增强的抗性。高粱植物在其基因组中可以包括一个、两个、三个或更多拷贝的多核苷酸，该多核苷酸编码高粱AHAS的突变的大亚基或本发明的高粱AHAS多肽。由于这个原因，高粱植物可以对能够抑制AHAS酶活性的任何除草剂都有耐受性，即，高粱植物可以对以下除草剂有耐受性：咪唑啉酮类型的除草剂，诸如，但不限于咪草烟、灭草烟和甲基咪草烟；或者，磺酰脲类的组的除草剂，诸如，但不限于氯磺隆、甲磺隆(甲酯)、嘧磺隆(甲酯)(sulfometuron methyl)、氯嘧磺隆(乙酯)(chlorimuron ethyl)、噻吩磺隆(甲酯)(thiofensulfuron methyl)、苯磺隆(甲酯)、苄嘧磺隆(甲酯)(bensulfuron methyl)、烟嘧磺隆、胺苯磺隆(甲酯)(ethametsulfuron methyl)、玉嘧磺隆、氟胺磺隆(甲酯)
(triflusulfuron methyl)、醚苯磺隆(triasulfuron)、氟嘧磺隆(甲酯)(primisulfuron methyl)、醚磺隆、酰嘧磺隆(amidosulfuron)、啶嘧磺隆(fluzasulfuron)、唑吡嘧磺隆(imazosulfuron)、吡嘧磺隆(乙酯)(pyrazosulfuron ethyl)以及氯吡嘧磺隆
(halosulfuron)。

[0016] 在优选的实施方式中，本发明的对属于咪唑啉酮类或磺酰脲类的组中的除草剂有抗性的高粱植物是指定为VT11-11331-BK的高粱品系，该指定为VT11-11331-BK的高粱品系的种子根据布达佩斯条约的条款于2011年10月12日被保藏在NCIMB收集(collection)中，登记号为NCIMB 41870。突变的VT11-11331-BK植物、其部分及其种子包括：在其基因组中的包括一多核苷酸的突变的AHAS基因，该多核苷酸具有编码多肽的SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；或者，具有SEQ ID NO.2所示的序列的AHAS大亚基。与AHAS大亚基对应的SEQ ID NO.2的氨基酸序列与高粱AHAS大亚基的野生型氨基酸序列(SEQ ID NO.3)具有一个氨基酸的差异，所述差异包括在高粱AHAS大亚基第93位或等同位置处的丙氨酸被替换成苏氨酸。

[0017] 本发明的耐除草剂的高粱植物种质(germoplasm)对于通过基因渗入将耐受性状引入到其它高粱品种中是有用的。本发明的高粱植物包括含多核苷酸的植物的后代和种子，其中该多核苷酸编码AHAS大亚基并且在高粱AHAS的所述大亚基的第93位或等效位置处的丙氨酸被替换成苏氨酸，其中，所述植物相比于野生型高粱植物示出对一种或多种咪唑啉酮和/或磺酰脲除草剂的增强的抗性。

[0018] 在优选的实施方式中，抗除草剂的高粱植物包括NCIMB 41870的抗性性状，并且可以是如NCIMB 41870所述的植物、NCIMB 41870植物的后代、NCIMB 41870植物的突变体和NCIMB 41870突变体的后代。植物可以是转基因或非转基因的植物，并且属于适合于农艺应用或其它应用(诸如作为观赏植物)的任何植物物种。

[0019] 进一步提供的是高梁种子，该高梁种子在其基因组中包括至少一种多核苷酸，其中，所述多核苷酸编码一多肽，该多肽在高粱AHAS蛋白大亚基的第93位的丙氨酸被替换成苏氨酸。种子发芽，并且产生相比于野生型高粱植物对一种或多种咪唑啉酮组的除草剂具有增强的抗性的植物。在优选的实施方式中，所述种子是作为NCIMB 41870保藏的种子。

[0020] 进一步提供的是一种用于识别对除草剂有抗性的植物的方法，该除草剂来自咪唑啉酮类或磺酰脲类的组，该方法包括：

[0021] a)提供来自高粱植物的核酸样本；

[0022] b)扩增与核酸样本中存在的高粱植物的AHAS基因对应的区域；

[0023] c)基于在所述扩增的核酸样本中至少一种突变的存在，来识别对咪唑啉酮组的除草剂有抗性的高粱植物，该突变赋予对咪唑啉酮除草剂的抗性。在优选的实施方式中，选择包括AHAS中的至少一种突变(诸如NCIMB 41870中的突变)的植物，其中AHAS基因中的所述至少一种突变编码AHAS的多肽或大亚基，该AHAS的多肽或大亚基相比于野生型的高粱AHAS氨基酸序列包括Ala93Thr的替换。植物可以是单子叶植物或双子叶植物。植物优选是农艺学感兴趣的植物，诸如，高粱、稻、玉米、大豆、小麦、燕麦、大麦、黑麦、亚麻、棉花、甘蔗、向日葵等。识别方法可以利用特异性的点突变SNP标记物。

[0024] 本发明提供了一种用于控制与农艺植物(例如高粱植物)紧邻的杂草的方法，其中所述高粱植物对除草剂有抗性，该除草剂诸如为选自咪唑啉酮类和/或磺酰脲类的组的除草剂。在优选的实施方式中，除草剂是咪唑啉酮。咪唑啉酮除草剂可以是咪草烟、甲基咪草烟或灭草烟。植物可以表现出如NCIMB 41870的抗性性状，并且它可以是其衍生物、突变体或后代植物。

[0025] 本发明提供了一种多肽，该多肽包括，但不限于以下核苷酸序列中的一种或多种：

[0026] -SEQ ID NO.1所示的序列，

[0027] -编码SEQ ID No.2的多肽的核苷酸序列，

[0028] -编码与SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中，该多肽显示出抗除草剂的AHAS活性；

[0029] -与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中，该核苷酸序列编码包括AHAS大亚基的多肽并且显示出抗除草剂的AHAS活性；

[0030] 或者与其互补的序列。多核苷酸优选编码包括Ala93Thr替换的AHAS大亚基的多肽。

[0031] 本发明也提供了一种表达盒，该表达盒包括具有以下核苷酸序列的至少一种多核苷酸：SEQ ID NO.1；编码SEQ ID NO.2所示的多肽的核苷酸序列；编码与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少95％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中多肽显示出抗除草剂的AHAS活性；与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中核苷酸序列编码包括AHAS大亚基的多肽并且显示出抗除草剂的AHAS活性；或者与其互补的序列。多核苷酸优选编码包括Ala93Thr替换的AHAS大亚基的多肽；所述序列可操作地连接至用于进行表达的核苷酸序列，例如一种或多种启动子、增强子或其它已知的调控序列。启动子可以是用于在植物、植物组织、叶绿体、动物、细菌、真菌或酵母细胞中表达的启动子。

[0032] 本发明提供了一种转化载体，转化载体包括具有以下核苷酸序列中一种的至少一种多核苷酸：a)SEQ ID NO.1所示的序列；b)编码SEQ ID No.2的多肽的核苷酸序列；c)编码与SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中多肽显示出抗除草剂的AHAS活性；d)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中，核苷酸序列编码包括AHAS大亚基的多肽并且显示出抗除草剂的AHAS活性；进一步包括可操作地连接的序列，以驱动核苷酸序列和选择性标记物的表达。载体适应于每种特定的情况下可用于转化细菌、真菌、酵母、植物细胞或动物细胞。

[0033] 本发明提供了一种经转化的植物，该转化的植物包括整合在其基因组中的与多核苷酸可操作地连接的至少一种启动子，该多核苷酸选自：a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列；b)编码SEQ ID NO.2所示的多肽的核苷酸序列；c)编码与SEQ ID NO.2的氨基酸序列具有至少95％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中多肽显示出抗除草剂的AHAS活性；d)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中核苷酸序列编码包括AHAS大亚基并且具有抗除草剂的AHAS活性的多肽；e)与核苷酸序列a)至d)中的一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列，其中载体进一步包括选择性基因和至少一种启动子，该至少一种启动子可操作地连接至核苷酸序列以驱动该核苷酸序列的表达。启动子是驱动植物中(例如，在植物组织或叶绿体中)的多肽表达的启动子。经转化的植物可以是：单子叶植物，例如，高粱、玉米、稻或小麦；或者双子叶植物，例如，向日葵、拟南芥、烟草或油菜。当将等量的除草剂(咪唑啉酮类和磺酰脲类)施用至经转化的植物和相同的野生型植物时，经转化的植物对所述除草剂的抗性高于相同的野生型植物。

[0034] 本发明也提供了一种用于获得抗除草剂的植物或对除草剂抗性增强的植物的方法，所述方法包括以下步骤：i)用包括多核苷酸的表达盒转化植物细胞，ii)使植物细胞再生以获得抗除草剂的植物，所述多核苷酸具有以下核苷酸序列中的至少一种：a)SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列，b)编码SEQ ID NO.2所示的多肽的核苷酸序列，c)编码与氨基酸序列SEQ ID NO.2具有至少95％序列同一性的多肽的核苷酸序列，其中多肽显示出抗除草剂的AHAS活性，d)与SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列具有至少85％同一性的核苷酸序列，其中核苷酸序列编码包括AHAS大亚基的多肽并且具有抗除草剂的AHAS活性，以及e)与核苷酸序列a)至d)中的一种核苷酸序列完全互补的核苷酸序列。DNA表达盒包括至少一种启动子，用于驱动多肽在植物中(例如，在植物组织或叶绿体中)的表达。经转化的植物可以是：单子叶植物，例如，高粱、玉米、稻或小麦；或双子叶植物，例如，向日葵、拟南芥、烟草、大豆或油菜。当将等量的除草剂(咪唑啉酮类和磺酰脲类)施用至经转化的植物和野生型植物时，经转化的植物相比于野生型植物对所述除草剂有抗性。植物包括对除草剂有抗性的AHAS的大亚基。
附图说明

[0035] 图1示出了抗咪唑啉酮的突变体高粱品系(ADV-IMI-R)，和原始的同系交配的高粱品系80237或野生型品系的剂量-反应曲线。检测的除草剂是：比率为0(对照)、1X、2X、3X和4X的咪草烟、灭草烟和甲基咪草烟。以地上组织(aerial tissue)的干物质(DM)相对于未处理的对照的百分比来测量除草效果；每个值均是三次检测的平均值。

[0036] 图2示出了突变体ADV-IMI-R AHAS核苷酸序列与原始的同系交配的高粱品系80237或野生型品系的比对。在第+277位指出核苷酸G被替换成A，以区别两种序列。在用于扩增重叠的扩增子序列的不同引物下面画有下划线。

[0037] 图3示出了对高粱AHAS基因的密码子93处的SNP G/A的基因分型检测。在来自ADV-IMI-R×F2 90523的177株F2后代植物的基因型中，分析特异性的SNP-SbAHAS标记物。清楚地界定并且识别了三个集群：圆点(●)，对应于突变等位基因的纯合植物(A/A)；三角形(▲)，对应于突变等位基因的杂合植物(A/G)；以及菱形(◆)，野生型等位基因的纯合植物(G/G)。

[0038] 图4示出了通过将高粱AHAS基因的核苷酸序列(登记号GM663363.1)与Phytozome核苷酸序列数据库(http://www.phytozome.net/search.php)中保藏的高粱(Sorghum bicolor)基因组序列进行匹配而获得的结果。这种匹配示出了：AHAS GM663363.1 序列表现出与位于高粱基因组染色体4上的AHAS序列具有高度显著的同源性(值e＝0)，表明感兴趣的基因存在于这个连锁群中。

[0039] 图5示出了S.bicolor染色体4的连锁图谱。相邻标记物之间的距离以厘摩(cM)给出。示出：在177株F2植物的基因型的染色体4中，SNP-SbAHAS和对咪草烟的抗性相对于7个SSR的染色体位置。使用JoinMap 软件，使用LOD＝3且最大Kosambi距离为50cM的默认参数来建立图谱。

具体实施方式

[0040] 为了获得耐除草剂的植物，用甲磺酸乙酯(EMS)的水溶液处理同系交配的高粱(Sorghum bicolor)品系80237的植物。种植经处理的种子并进行自由授粉。选择两百七十三株M1植物并且将每株植物的两粒种子种植在苗圃中，从而获得总共546株M2植物。从每对植物中的一株植物收集花粉，并且将收集的花粉用于对该对植物中的另一株植物进行授粉。收获由273株经授粉的M2植物中的每一株植物得到的M3种子。将M3后代种植在总共273个垄沟中。用100ml L a.i./ha的咪草烟喷洒每一M3垄沟的五十株植物。在用除草剂处理后，垄沟中的六十八株植物示出了正常生长并且没有症状，因此认为这六十八株植物对除草剂有抗性并且识别它们为VT09-9754。识别垄沟中的抗性植物的系谱，并将它们命名为80237EMS2-192(下文称为ADV-IMI-R)。获得选自原始ADV-IMI-R突变体(命名为VT11-
11331-BK)的耐除草剂的M7突变体植物和种子，并根据布达佩斯条约的条款于2011年10月
12日将其保藏于NCIMB(地址：苏格兰阿伯丁郡AB21 9YA)收集且登记号为NCIMB 41870。

[0041] 本发明不限于用EMS进行突变的高粱植物。通过其它突变方法，例如通过辐射和化学突变剂的突变方法，所获得的高粱植物也在本发明的范围内。抗除草剂的突变体植物也可以是通过如下方式获得：对用除草剂培养的细胞施加选择压力并且选择抗性细胞，以产生抗除草剂的植物。突变和育种方法的细节可以见于“Principles of Cultivar Development(栽培品种发展的原理”)”Fehr,1993,Macmillan Publishing Company(麦克米伦出版社)，其公开内容通过引用而纳入本文。

[0042] 随后，对抗咪唑啉酮的突变体植物ADV-IMI-R(原始突变)喷洒除草剂的效果与同系交配的高粱品系80237(安地(Advanta)专有的优秀品系)的反应进行比较。为了实现这一目标，植物在田间经三种属于咪唑啉酮系列的除草剂(咪草烟、灭草烟和甲基咪草烟)进行处理。对于每种除草剂，检测四种不同的比率：1X、2X、3X和4X。对于每种除草剂，推荐的田间施用比率(1X)示于表1中。

[0043] 表1

[0044] 对于各种除草剂，推荐的田间施用比率

[0045]

[0046] 喷洒后十天，检测所有植物地上组织中的干物质(DM)。结果示于图1中。

[0047] 将本发明的ADV-IMI-R突变体的反应与同系交配的品系80237的反应进行比较。表2示出了不同比率的咪草烟、灭草烟和甲基咪草烟的效果，以干物质相比于未经处理的对照的百分比(DM％对照)来表示。所公开的值是三次实验的平均值。

[0048] 表2

[0049]

[0050] 这些结果示出了：甚至在4X的比率，本发明的ADV-IMI-R突变体也对咪唑啉酮组的三种测试的除草剂有抗性。与此相反，甚至以推荐的比率(1X)施用时，原始同系交配的品系80237对所有除草剂也是明显敏感的。

[0051] 可见，本发明的抗除草剂的高粱植物对咪唑啉酮组的除草剂有抗性，其中咪唑啉酮组的除草剂诸如为咪草烟、甲基咪草烟或灭草烟。

[0052] 可以以已知的咪唑啉酮除草剂组中的任一种的推荐使用量4倍的量来喷洒抗咪唑啉酮的高粱植物。抗性植物可以具有例如在来自NCIMB 41870种子的植物中所观察到的抗性性状，或者抗性植物可以是由其衍生的植物、后代或其它植物，该其它植物在其基因组中包括编码一多肽的至少一种多核苷酸，该多肽在高粱AHAS蛋白的第93位或者等效位置处的丙氨酸被替换成苏氨酸。所述植物相比于野生型高粱植物对来自咪唑啉酮组的一种或多种除草剂具有增强的抗性。

[0053] 另外，本领域普通技术人员将意识到：这样的氨基酸位置会根据是否添加或去除氨基酸而不同，例如，会根据从氨基酸序列的N末端是否添加或去除氨基酸而不同。“等效位置”意指在与所例示的氨基酸位置相同的保守区内的位置。

[0054] 在本发明中，当在涉及诸如咪唑啉酮类或磺酰脲类的除草剂使用时，术语对除草剂有“耐受性”和对除草剂有“抗性”具有相同的含义和等效的范围。

[0055] 本发明提供了对有效量的除草剂示出抗性的植物、植物细胞、植物组织。“有效量”是指能够抑制野生型的植物、植物细胞或组织的生长，但对有抗性的植物、植物细胞或植物组织不产生严重影响的除草剂的量。除草剂的有效量是用于消除杂草的推荐量。野生型的植物、细胞或组织是对除草剂不显示出抗性性状的植物、细胞或组织，其中除草剂例如为属于咪唑啉酮类或磺酰脲类的组的除草剂。术语“植物”包含处于任何阶段的植物，或植物部分，其中所述植物部分可以是技术熟练的植物研究人员所公知的种子、叶、花、茎、组织或器官。

[0056] 为了检测突变，对本发明的突变的高粱AHAS基因进行测序，本发明的突变的高粱AHAS基因编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽，其中，所述AHAS多肽或大亚基是抗除草剂的。

[0057] 通过突变植物的AHAS基因的DNA序列与野生型高粱植物的AHAS基因的DNA序列进行比较，识别出核苷酸第+277位的G核苷酸变为A的点突变，该点突变使原始高粱80237品系(野生型)与本发明的ADV-IMI-R突变体区分开。当推断突变体和野生型品系的AHAS氨基酸序列时，观察到：核苷酸的替换(SEQ ID NO.1的GCG被ACG替换)编码了密码子93存在突变的多肽，并且产生了在多肽(SEQ ID NO.2)中的丙氨酸至苏氨酸(Ala93Thr)的替换，该多肽(SEQ ID NO.2)显示出乙酰羟酸合成酶的活性且对应于突变的ADV-IMI-R品系的高粱AHAS蛋白的大亚基。

[0058] 在本发明范围内的是：包括一多核苷酸的植物、植物部分、种子、其后代、转基因植物或诸如此类，该多核苷酸编码一多肽，该多肽在其第93位或者属于不同物种的另一AHAS酶的等效位置处具有丙氨酸至苏氨酸(Ala93Thr)的替换。

[0059] 在本发明范围内的是：具有至少85％、95％或98％的序列同一性的多核苷酸或多肽。通过两条氨基酸序列或两条核苷酸序列的比对来确定序列同一性的百分比。例如，使用下面的公式可以计算两条序列之间的比对百分比：

[0060] (相同位置的量/重叠位置的总量)x 100

[0061] 使用不同的数学算法，例如在Altschul等人,(1990)J.Mol.Biol.215:403的NBLAST和XBLAST程序中包含的算法，来确定两条序列之间的比对百分比。当利用BLAST、Gapped BLAST(有缺口的BLAST)和PSI-Blast程序时，可以使用各程序的默认参数(例如，XBLAST和NBLAST)。参见http://www.ncbi.nlm.nih.gov。用于序列比较的数学算法的另一个优选的非限制性实例是Myers和Miller(1988年)CABIOS 4:11-17的算法。这种算法被并入ALIGN程序(版本2.0)中，ALIGN程序(版本2.0)是GCG序列比对软件包的一部分。当利用ALIGN程序来比较氨基酸序列时，可以使用PAM120重量残基表(weight residue table)、12的缺口长度罚分(gap length penalty)以及4的缺口罚分(gap penalty)。也可以通过人工检查来进行比对。

[0062] 本发明包括赋予除草剂抗性的多核苷酸和蛋白。应理解的是，当提到抗除草剂的多核苷酸时，它是指编码抗除草剂的AHAS蛋白的多核苷酸。抗除草剂的AHAS蛋白可以是天然的或突变的，并且它们赋予对属于咪唑啉酮类或磺酰脲类的组的除草剂的抗性。

[0063] 咪草烟敏感品系与ADV-IMI-R突变体杂交产生F2高粱种群，在分离的F2高粱种群中，检测对咪唑啉酮类(例如咪草烟)的抗性的遗传。在出苗后阶段V6中的20天，以3X的比率将咪草烟( BASF)喷洒至由此得到的F2植物，并且在处理后的10天检测表型症状。结果被提供于表3中。

[0064] 表3

[0065] 基于表型评级的植物的分布

[0066]

[0067] 结果示出了：能够基于按照表型评分得到的视觉上的症状对F2植物种群进行分类，从而将个体分组成三种表型类别：无损伤的植物、患萎黄病的植物和死亡的植物。

[0068] 测序示出了：本发明的耐受除草剂的高粱突变体在具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽或AHAS蛋白的大亚基中具有点突变。SEQ ID NO.1所示的核苷酸序列示出在核苷酸第+277位(对应于密码子93)处的核苷酸G变成A，这使高粱原同系交配的品系80237(对除草剂敏感)与本发明的诱导的ADV-IMI-R突变体区分开。此分子标记物被命名为SNP-SbAHAS。

[0069] 为了确定SNP-SbAHAS标记物在检测潜在的抗除草剂的植物、植物部分或种子中的有效性，对来自F2种群(本文指定为种群ADV-IMI-R×90523F2)的177株植物进行了测试，其中F2种群是抗除草剂的ADV-IMI-R突变体(选择VT09-9754-48-6-BK)与除草剂敏感的同系交配的品系90523杂交产生的。图3作为实例示出了：来自F2种群的一些植物的等位基因分型。将两种经测试的对照分类在预期的集群(分别为，ADV-IMI-R突变体和野生型90523，纯合抗性和纯合敏感)中。这些数据证实了分子标记物SNP-SbAHAS对区分多核苷酸的核苷酸第277位处的三种等位基因组合是有用的，该多核苷酸编码具有乙酰羟酸合成酶活性的多肽或高粱AHAS蛋白的大亚基。

[0070] 鉴于SNP-SbAHAS标记物及其应用的公开内容，本领域技术人员可以识别抗除草剂的植物，其中除草剂例如为属于咪唑啉酮类和/或磺酰脲类的组的除草剂(例如，咪草烟、甲基咪草烟，或诸如此类的)。除了本文所描述的方法之外，识别方法还可以是其它已知的任何方法，参见例如ASA(Soleimani等人，(2003)Plant Mol Biol Rep 21:281-288)、PAMSA(Gaudet等人,(2007)Plant Mol Biol Rep 25:1-9)、SSCP(Germano和Klein(1999)Theor Appl Genet 99:37-49)，或者 (Jones等人,(2008)Pest Management Science 64:12–15)。

[0071] 使用SNP-SbAHAS标记物，分析抗性表型与突变体等位基因的数目之间的相关性。为了这一目标，在用咪草烟喷洒之后，研究了来自F2后代(ADV-IMI-R×90523)的个体植物的萎黄病和死亡的表型。同时，研究了SNP-SbAHAS标记物的基因型。结果示于表4中。使用卡方独立性检验(Chi-square Independence test)，测定了分子标记物SNP-SbAHAS和对咪草烟的抗性之间的相关性(测量为表型的评级)。该测试产生了概率p＝1.948e-46，这表明：根据表型和基因型的共分离，AHAS基因中的诱导突变(使用特异性SNP-SbAHAS标记物进行基因分型)和对咪草烟的抗性之间存在高度显著的相关性。

[0072] 表4

[0073] 基于SNP-SbAHAS分析的，ADV-IMI-R×90523F2后代的表型和对咪草烟的抗性评级。A/A纯合的AHAS突变体；A/G杂合的；G/G野生型纯合的。

[0074]

[0075] 进一步地，对抗除草剂且特异性SNP-SbAHAS标记物进行遗传作图。基于GenBank中公开的高粱AHAS序列(登记号GM663363.1，SEQ ID No.4)，进行BLAST分析以使Sorghum bicolor的DNA序列与Phytozome数据库(http://www.phytozome.net/search.php)进行匹配。图4所示的结果表明了：与除草剂抗性相关的AHAS序列位于Sorghum bicolor基因组的染色体4中，其中除草剂属于咪唑啉酮类的组。基于此信息，使用各种SSR型的DNA分子标记物，对本发明的突变的ADV-IMI-R品系和同系交配的90253品系进行指纹分析(fingerprinting)(基因分型)程序。选择位于染色体4中的七个多态SSR用于基因分型(Mace,ES等人,A consensus genetic map of sorghum that integrates multiple component maps and high-throughput Diversity Array Technology(DArT)markers,BMC Plant Biology,2009,9:13；Srinivas,G等人,Exploration and mapping of microsatellite markers from subtracted drought stress ESTs in Sorghum bicolor(L.),Moench.Theor.Appl.Genet.2009,118:703-717；Ramu,P等人,In silico mapping of important genes and markers available in the public domain for efficient sorghum breeding,Mol Breeding 2010,26:409-418)；http://www.lbk.ars.usda.gov/psgd/sorghum/2009SorghumSEAMs_LBKARS.xls)。

[0076] 根据此程序的结果，能够对SNP-SbAHAS标记物和抗性表型进行遗传作图，示出对咪唑啉酮类的抗性和特异性的SNP-SbAHAS标记物位于染色体4中，两侧为在Sorghum bicolor的染色体4中已经识别的SSR(图5)。

[0077] 本发明的多核苷酸(SEQ ID NO.1)可以被引入植物中，用于获得转基因植物。存在不同的方法用于将多核苷酸引入植物中，特别是引入农艺学上重要的植物，例如，玉米、大豆、高粱、小麦、甘蔗、亚麻、向日葵，或其它植物；蔬菜、树木，或观赏植物中。用于引入多核苷酸以获得转基因植物的方法是本领域众所周知的，并且也可以使用重组方法。

[0078] 存在不同的方法用于植物转化，例如，使用载体(An,G.等人,(1986)Plant Pysiol.,81:301-305；Fry,J.,等人,(1987)Plant Cell Rep.,6:321-325；Block,M.(1988)Theor.Appl Genet.,76:767-774；Hinchee,等人,(1990)Stadler.Genet.Symp.,203212.203-212；Barcelo,等人,(1994)Plant J.,5:583-592；Becker,等人,(1994)Plant J.,5:299-307；Borkowska等人,(1994)Acta Physiol Plant.,16:225-230；Christou,等人,(1992)Trends Biotechnol.,10:239-246；D'Halluin,等人,(1992)Bio/Technol.,10:
309-314；Dhir,等人,(1992)Plant Physiol.,99:81-88；Casas等人,(1993)Proc.Nat.Acad Sci.USA 90:11212-11216；Dong,J.A.and Mchughen,A.(1993)Plant Sci.,91:139-148；
Golovkin,等人,(1993)Plant Sci.,90:41-52；Guo Chin Sci.,Bull.,38:2072-2078；
Asano,等人,(1994)Plant Cell Rep.,13；Christou,P.(1994)Agro.Food.Ind.Hi Tech.,
5:17-27；Eapen等人,(1994)Plant Cell Rep.,13:582-586；Hartman,等人,(1994)Bio-Technology 12:919923；Christou,P.(1993)In Vitro Cell.Dev.Biol.-Plant；29P:119-
124；Davies,等人,(1993)Plant Cell Rep.,12:180-183；Ritala,等人,(1994)
Plant.Mol.Biol.24:317-325；和Wan,Y.C.and Lemaux,P.G.(1994)Plant Physiol.,104:
3748)。

[0079] 一些用于转化植物的方法和基因工程技术被描述在以下出版物中：Sambrook等人，(1989年)《，冷泉港出版社，普莱恩维尤，纽约洲；Ausubel FM等人《，当前分子生物学技术》，John Wiley&Sons，纽约，纽约州(Sambrook,等人,(1989)Molecular cloning,A laboratory manual(分子克隆实验指南),Cold Spring Harbor Press(冷泉港出版社),Plainview(普莱恩维尤),N.Y.；Ausubel FM,等人,Current Protocols in Molecular Biology(当前分子生物学技术),John Wiley&Sons(约翰威立出版公司),New York(纽约),N.Y.)。

[0080] 载体也可以使用弹道粒子加速技术引入，诸如在美国专利4,945,050和Casas等人,Proc.Natl.Sci.,USA,90:11212,1993中所描述的。

[0081] 例如，经本发明的多核苷酸转化的植物表达抗除草剂的AHAS蛋白，并且表现出对除草剂诸如咪唑啉酮类和/或磺酰脲类的抗性性状。“抗除草剂的AHAS蛋白”是指如下的蛋白：当在干扰AHAS活性的除草剂以一定浓度存在下，该蛋白显示出比野生型AHAS活性高的AHAS活性，其中除草剂的浓度为除草剂干扰野生型AHAS蛋白的AHAS活性的浓度。

[0082] 本发明的多核苷酸序列可以被包括表达盒中，该表达盒用于在感兴趣的植物，例如具有农艺学上兴趣的植物中表达抗性AHAS蛋白。表达盒包括与例如至少一种启动子可操作地连接的调控序列。启动子是本领域众所周知的，并且可以是例如组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子、叶绿体特异性启动子，所有这些启动子都能在植物中起作用。表达盒进一步包括本领域中众所周知的转录终止序列。为了提高抗除草剂的AHAS多核苷酸的表达效率，表达盒可以包括各种调控序列，例如，增强子(诸如，内含子、病毒序列或诸如此类的)；或者可以包括与所述多核苷酸结合或不结合的、与本发明的多核苷酸不同的其它感兴趣的多核苷酸序列；或者前导序列。

[0083] 启动子包括，但并不限于：组成型启动子、诱导型启动子、组织特异性启动子或细胞器特异性启动子，诸如，35S启动子、创伤诱导型启动子或化学诱导型启动子、热休克启动子、四环素诱导型启动子或诸如此类的(Chao等人1999,Plant Physiol.,120:979；US 5,187,267，US 5,057,422)。

[0084] 本领域技术人员还已知的是可以用于植物的合适的转录终止子，参见例如：Odell,等人,1985,Nature 313:810；Sanfacon,等人,Genes Dev.,5:141,1990；Munroe,等人,1990Gene 91:151；Rosenberg等人,1987,Gene 56:125；Joshi,等人,Nucleic Acid Res.,15:9627,1987。

[0085] “可操作地连接”意指启动子和第二序列之间的功能性连接。启动子序列启动并介导对应于第二序列的DNA序列的转录。术语“可操作地连接”是指：所连接的核酸序列是毗邻的，并且在需要连接两个蛋白编码区时，所连接的核酸序列是毗邻的并且处于相同的阅读框中。表达盒可以是多个表达盒。

[0086] 本发明的多核苷酸可以以多核苷酸融合的形式或分离地被附接至其它多核苷酸。其它多核苷酸可以编码例如本领域技术人员所众所周知的抗除草剂的、抗虫的或其它的植物部分。

[0087] 为了提高在植物中的表达，可以对本发明的多核苷酸进行修饰，例如通过包括植物优选的密码子、缺失序列诸如内含子的序列或有害的序列。也在本发明范围内的是：编码本发明的有抗性的AHAS多肽的多核苷酸，其中本发明的有抗性的AHAS多肽已被突变，并显示出例如缺失或插入或与本文中所描述的突变不同的其它突变。“突变的多核苷酸”是指在其核苷酸序列中具有永久性改变的多核苷酸。

[0088] 本发明的多核苷酸可以通过替换、缺失、截短和插入来改变。用于这种操作的方法是本领域公知的。用于诱变和核苷酸序列改变的方法是本领域众所周知的(Kunkel(1985年)《美国科学院院报》，82期：488-492页；Kunkel等人，(1987年)，《酶学方法》，154期：367-382页；编辑：Walker和GAASTRA，(1983年)《现代分子生物学技术》(麦克米伦出版公司，纽约)(Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.,USA 82:488-492；Kunkel等人,(1987)Methods in Enzymol.,154:367-382；Walker和Gaastra,编辑,(1983)Techniques in Molecular Biology(现代分子生物学技术)(MacMillan Publishing Company(麦克米伦出版公司),纽约)及其引用的文献。在Dayhoff等人,(1978)Atlas of Protein Sequence and Structure(蛋白序列和结构的图谱)(Natl.Biomed.Res.Found.,Washington,D.C.(华盛顿特区)中，可以发现不影响感兴趣的蛋白的生物活性的氨基酸替换，该出版物通过引用而并入本文中。

[0089] 包括本发明的AHAS多核苷酸的DNA可以作为载体的一部分被引入不同的植物中。选择合适的载体取决于旨在用于转化的方法和待转化的植物。本领域技术人员清楚地知道不同的载体，例如，Ti和/或Ri。T-DNA也用作整合Ti或Ri载体的侧翼区(WO 84/02913，Herrera-Estrella等人,1983,Nature 303:209；Horsch等人,1984,Science 223:496；
Fraley等人,1983,Proc.Natl.Acad.Sci,USA 80:4803)。

[0090] 载体可以包括表达盒和其它的核苷酸序列，例如，选择性标记物(诸如赋予对抗生素或除草剂的抗性的标记物)，和在植物中驱动感兴趣的多核苷酸(例如，SEQ ID No.2的AHAS大亚基多肽)的表达的序列。

[0091] 一载体包括编码本发明的有抗性的AHAS多肽的多核苷酸，该载体可以用于获得转基因植物，该转基因植物对咪唑啉酮类和磺酰脲类类型的除草剂有抗性。经转化的植物可以是任何类型的植物，诸如双子叶植物和单子叶植物，其中有但并不限于在农艺学上感兴趣的植物，诸如，高粱(Sorghum bicolor，Sorghum vulgare)、玉米(Zea mays)、芸苔属(例如，B.napus，B.rapa，B.juncea)、苜蓿(Medicago sativa)、稻(Oryza sativa)、黑麦(Secale cereale)、谷子(Pennisetum glaucum)、(Panicum miliaceum(糜子))、(Setaria italica(小米))、(Eleusine coracana(穇子))、向日葵(Helianthus annuus)、小麦、(Triticum aestivum，T.Turgidum ssp.durum)、大豆(Glycine max)、烟草(Nicotiana tabacum)、花生(Arachis hypogaea)、棉花(Gossypium barbadense，Gossypium hirsutum)、甘薯(Ipomoea batatus)、木薯(Manihot esculenta)、咖啡(Coffea spp.)、椰子(Cocos nucifera)、红花(Carthamus tinctorius)、菠萝(Ananas comosus)、柑桔树(Citrus spp.)、可可(Theobroma cacao)、茶(Camellia sinensis)、香蕉(Musa spp.)、牛油果(Persea americana)、橄榄(Olea europaea)、腰果(Anacardium occidentale)、扁桃(Prunus amygdalus)、甜菜(Beta vulgaris)、马铃薯(Solanum tuberosum)、甘蔗(Saccharum spp.)、蔬菜、观赏植物和树。本发明的植物优选是高粱。

[0092] 本发明更好地示于下面的实施例中，下面的实施例不应当被解释为限制本发明的范围。与此相反，在阅读本说明书之后，应当清楚地理解：在不脱离本发明的精神和/或所附权利要求书的范围的前提下，本领域技术人员可以提出本发明的其它实施方式、修改和等同物。

[0093] 实施例

[0094] 实施例1

[0095] 同系交配的高粱品系80237的诱变和抗咪唑啉酮的突变体80237EMS2-192的选择[0096] 将同系交配的品系80237的三万两千个预发芽的高粱种子浸入0.05％v/v甲磺酸乙酯(EMS)的水溶液中达16小时。2007年12月21日，将处理过的种子种植在阿根廷圣达非省贝纳多图埃托市(Venado Tuerto)安地种子(Advanta Seeds)实验站的1号样地(33°41’47”S；61°58’45”W)中，并且进行自由授粉。

[0097] 总共选择了273株M1植物，并且，2008年5月23日，将每株植物的两粒种子种植在阿根廷萨尔塔省奥兰市(Orán)的安地种子实验站中的苗圃(22°49’37”S；64°20’14”W)中，并且获得总共546株M2植物。收集每对植物中的一株植物的花粉，用于对该对植物中的另一株植物授粉。收获由273株已授粉的M2植物中的每一株植物得到的M3种子。2008年12月16日，将总共273个垄沟的M3后代种植在贝纳多图埃托市，并且，2008年12月23日，向每个M3垄沟中的50株植物喷洒了100ml L a.i./ha的咪草烟。在用除草剂处理后，垄沟中的六十八株植物示出了正常生长且没有症状，因此认为该六十八株植物对除草剂有抗性且识别为VT09-9754。识别垄沟中有抗性的植物的系谱，并且将它们指定为80237EMS2-192(在下文中称为ADV-IMI-R)。

[0098] 世代历史(generational history)示于表5中。

[0099] 表5

[0100]

[0101]

[0102] OR：奥兰(Oran)；VT：贝纳多图埃托

[0103] 实施例2

[0104] 相比于原始的高粱同系交配的品系80237，在有抗性的ADV-IMI-R突变体中对使用咪唑啉酮类进行处理的反应率的分析

[0105] 在田间，向高粱品系80237(安地专有的优秀品系)和本发明的抗咪唑啉酮的ADV-IMI-R突变体(原始突变)喷洒来自咪唑啉酮类的组的三种除草剂：咪草烟、灭草烟和甲基咪草烟。对每种除草剂，检测四种不同的比率：1X、2X、3X和4X(1X为推荐的施用比率)(见上面的表1)：

[0106] 田间试验在贝纳多图埃托进行，并且于2010年12月1日进行种植。出苗后的20天(阶段V6)，喷洒除草剂。所有处理都与它们各自未经处理的对照相比较。实验设计由分为3个重复的样地(主样地：用除草剂进行处理；子样地：品系)组成。

[0107] 喷洒后的十天，检测所有植物地上组织中的干物质(DM)。以各自未经处理的对照的气生组织中的DM百分比来评定除草剂反应。

[0108] 因而，对每一比率j的对除草剂敏感的品系i表示为：

[0109] DMij％对照＝(DMij*100)/DM对照

[0110] DMij％对照是对每一品系进行的每种处理的3次实验的平均值。

[0111] 实施例3

[0112] 对编码本发明的突变的多肽的高粱AHAS基因的测序，其中本发明的突变的多肽具有乙酰羟酸合成酶活性且是抗咪唑啉酮的

[0113] 对来自ADV-IMI-R突变体(VT11-11331-BK选择体)和野生型同系交配的品系80237的叶片组织进行了测序研究。分离基因组DNA，并且以100ng/μl的最终浓度重悬于水中。对来自ADV-IMI-R突变体和来自高粱品系80237的乙酰羟酸合成酶(AHAS)的基因进行的测序，基于GenBank中登记号GM663363.1所公开的高粱AHAS序列，设计特异性引物用于聚合酶链反应(PCR)扩增。设计引物，以产生5个重叠的DNA片段(扩增子)，这5个重叠的DNA片段代表完整的AHAS编码序列。所设计的引物的序列是：

[0114]

[0115] PCR混合物的最终体积为25μl，且具有以下组分：1X反应缓冲液(Invitrogen(英杰公司))、0.2mM的dNTP(GE Healthcare(通用医疗))、2.5mM的MgCl2(Invitrogen)、0.2μM的各种引物、0.5μl Platinum Taq(5U/μl)(Invitrogen)和100ng的基因组DNA。PCR反应在GeneAmp PCR系统9700热循环仪(Perkin-Elmer(珀金埃尔默公司))中进行，并且扩增条件如下：在94℃下持续1分钟的初始变性步骤；随后在94℃下持续45秒，在57℃下持续45秒，并且在72℃下持续70秒，进行35个循环；以及，在72℃下持续10分钟的最终延伸步骤。

[0116] 当对ADV-IMI-R产品以及原始高粱品系80237进行扩增时，当使用SbAHAS-F1引物和SbAHAS-R1OLD1-R2引物没有得到扩增产物。

[0117] 为了克服这个问题，设计了两种新的引物以产生第六扩增子：

[0118]

[0119] 使用与上述相同的PCR条件来获得第6扩增子。

[0120] 通过琼脂糖凝胶电泳，取2μl由PCR扩增得到的每种DNA产物进行检验，并参照分子量标记物Low DNA Mass Ladder(DNA低分子量阶梯)(Invitrogen)来分析片段大小并且估计DNA浓度。使用 SV凝胶(Promega(普洛麦格))和PCR Clean-Up System(PCR净化系统)(Promega)对剩余的PCR产物进行纯化。根据制造商的说明书，使用
Terminator v3.1Cycle Sequencing System( 终结者v3.1Cycle Sequencing
System循环测序系统)(Applied Biosystems(应用生物系统))对经纯化的DNA进行测序。

[0121] 使用CAP3 Sequence Assembly Program(CAP3序列组装程序)(http://pbil.univ-lyon1.fr/cap3.php)，组装由每个扩增子所得到的乙酰羟酸合成酶的测序文件。使用Clustal W version 2.1program(Clustal W版本2.1程序)(http://
www.clustal.org)，对所得的乙酰羟酸合成酶基因的DNA序列进行比对。

[0122] 实施例4

[0123] 在通过使咪草烟敏感品系与抗性ADV-IMI-R突变体杂交所生成的分离的F2高粱种群中，咪草烟抗性的遗传

[0124] 定向杂交(targeted crossing)在高粱品系90523(安地专有的优秀品系，对咪唑啉酮类敏感)和抗咪唑啉酮的ADV-IMI-R突变体(VT09-9754-48-6-BK选择体)之间进行。所得的F1植物经自动授粉，并且收获F2种子。2010年10月，将F2种子种植在贝纳多图埃托的田间。以3X的比率(其中，1X是由制造商对于商业使用所推荐的与100ml a.i./ha相当的比率)，向F2植物(177株植物)喷洒咪草烟( BASF)。在喷洒之前，收集来自ADV-IMI-R突变体(VT09-9754-48-6-BK选择体)和野生型品系90523的177株F2植物中的每一株植物的叶片组织，分离基因组DNA，该基因组DNA以100ng/μl的最终浓度重悬于水中，用于进行基因型分析。

[0125] 出苗后20天(阶段V6)，喷洒除草剂。喷洒后10天，评估植物，并且根据以下的表型得分所得到的视觉评估的症状，将除草效果分成三个种类：

[0126] -1＝无损伤

[0127] -2＝萎黄病

[0128] -3＝死亡

[0129] 实施例5

[0130] 对SNP-SbAHAS有特异性的DNA标记物的开发

[0131] 在AHAS基因中的核苷酸第+277位(密码子93)处发生的核苷酸G被替换成A的单点突变，将原始的同系交配的高粱品系80237(除草剂敏感的)与诱导的ADV-IMI-R突变体区分开。使用以下的双标记的引物和探针的组，来设计分子标记物(在本文中被命名为SNP-SbAHAS)：

[0132]

[0133] 使用AB 7500热循环仪(Applied Biosystems,Foster City(福斯特城),CA,US)进行实时PCR等位基因的分型检测，从而来执行基因分型。制备最终体积为25μl的PCR反应混合物，其中PCR反应混合物包括：12.5μl 2X qPCR Supermix(Quanta Biosciences,Gaithersburg(盖瑟斯堡),MD,US)、0.08μM引物(正向引物和反向引物)、0.4μM探针(探针1和探针2)、10μl基因组DNA和补至最终体积的不含DNase的水。扩增条件：一次初始变性循环，在95℃下进行10分钟；然后进行50次变性循环，在92℃下进行15秒，以及在
60℃下进行1分钟的杂交/延伸。在扩增后，使用AB Sequence Detection System(AB序列探测系统)(SDS)7500 1.4软件程序(Applied Biosystems,Foster City,CA,US)，分析等位基因分型检测的结果。

[0134] 实施例6

[0135] 建立除草剂抗性与ADV-IMI-RAHAS突变体中的突变的相关性

[0136] 在喷洒了咪草烟(使用实施例4的方法)后，对由ADV-IMI-R×90523杂交所得到的个体F2后代植物进行表型分类(无损伤、萎黄病和死亡)，然后使用分子标记物SNP-SbAHAS(使用实施例5中描述的方法)进行基因型分类，其中分子标记物SNP-SbAHAS对AHAS中诱导的突变是有特异性的。

[0137] 实施例7

[0138] 除草剂抗性和特异性的SNP-SbAHAS标记物的遗传作图

[0139] 对除草剂抗性和特异性的SNP-SbAHAS标记物进行基因作图。基于GenBank公开的高粱AHAS序列(登记号GM663363.1)，进行BLAST分析，以将它与Phytozome数据库(http://www.phytozome.net/search.php)中保藏的Sorghum bicolor基因组DNA序列进行匹配。

[0140] 使用一组SSR型分子标记物，对突变的ADV-IMI-R品系和同系交配的品系90253进行基因分型(指纹识别)。选择位于Sorghum bicolor基因组染色体4中七个多态SSR，用于进行基因分型(Mace,ES等人,A consensus genetic map of sorghum that integrates multiple component maps and high-throughput Diversity Array Technology(DArT)markers,BMC Plant Biology,2009,9:13；Srinivas,G等人,Exploration and mapping of microsatellite markers from subtracted drought stress ESTs in Sorghum bicolor(L.),Moench.Theor.Appl.Genet.2009,118:703-717；Ramu,P等人,In silico mapping of important genes and markers available in the public domain for efficient sorghum breeding,Mol Breeding 2010,26:409-418；

[0141] http://www.lbk.ars.usda.gov/psgd/sorghum/2009SorghumSEAMs_LBKARS.xls)。

[0142] 7个选定的多态SSR是：

[0143]

[0144] 使用自动测序仪ABI3130xl(Applied Biosystems)进行毛细管电泳，对来自每个测试的SSR的所得PCR片段进行解析。在177株由ADV-IMI-R×90523杂交所得的F2后代个体中，进行这7个SSR的基因分型。此外，分析了这些相同的177株F2后代植物，以确定是否存在对于AHAS基因中的诱导突变有特异性的SNP-SbAHAS标记物。根据对F2后代植物施用咪草烟的表型评级对结果进行分类，并且使用计算机程序JoinMap(Van Ooijen,JW和Voorips,RE，用于遗传连锁图谱的计算的JoinMap 3.0软件，Plant Research International(国际植物研究所)，2001年，Wageningen(瓦赫宁恩)，荷兰)分析这些结果。

[0145] 打印输出(原始的电子表格)

[0146] (该页面不是国际申请的一部分，且不作为国际申请的页面)

[0147]

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