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淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用

阅读：961发布：2020-05-18

专利汇可以提供淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明公开了一种淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用。本发明提供了一种DNA 片段，为如下1）或2）或3）的DNA分子：1）序列表中序列1所示的DNA分子；2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。本发明的实验证明，本发明克隆得到启动子NSE，NSE启动子驱动目的基因仅在淀粉胚乳之外的部分高效表达，将其运用于以淀粉胚乳为主要收获产物的作物中，对外源基因（如抗除草剂、抗病虫害等）进行选择性表达，既能节约能量，也能提高大众对转基因粮食的接受。，下面是淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种DNA片段，为序列表中序列1所示的DNA分子。
2.含有权利要求1所述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌。
3.如权利要求2所述的重组载体，其特征在于：所述重组载体为将权利要求1所述DNA片段替换掉表达载体pCAMBIA-1300-SGN中的CaMV 35S启动子，得到的重组载体。
4.扩增权利要求1所述DNA片段全长的引物对。
5.根据权利要求4所述的引物对，其特征在于：所述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。
6.权利要求1所述DNA片段在植物中启动目的基因表达的应用；所述植物为水稻。
7.如权利要求6所述的应用，其特征在于：所述目的基因表达为组织特异表达。
8.如权利要求7所述的应用，其特征在于：所述组织为除种子淀粉胚乳以外的其他植物组织。
9.如权利要求8所述的应用，其特征在于：所述除种子淀粉胚乳以外的其他植物组织为
1)或2)：1)种子的胚、糊粉层或种皮；2)植物的根、叶鞘、茎、茎节、叶或穗。
10.如权利要求6-9中任一所述的应用，其特征在于：所述目的基因为GUS基因。

说明书全文

淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物技术领域，尤其涉及一种淀粉胚乳特异非表达启动子NSE及其应用。

背景技术

[0002] 在植物基因工程中，对以种子，果实为主要收获产物的植物，利用种子无表达启动子驱动目的基因仅在茎，叶等绿色组织中表达，而在种子食用部分无表达，是提高转基因食品安全性的有效策略。

[0003] 目前与植物种子不表达相关国内外专利举例如下：（1）申请号:201210202831.8：一种柑橘的绿色组织特异启动子；（2）申请号:200710051443.3：组织特异性表达启动子PD540及其在水稻改良中的应用；（3）申请号:01823070.9：营养生长特异性启动子及由此而得的基因重组植物；（4）申请号:96104811.5，一种豆荚内特异表达毒蛋白的转基因植物；
（5）WO0077223:―PROMOTER ENABLING TRANSGENE EXPRESSION IN THE WHOLE PLANT EXCEPT IN THE SEED.(6)US2004117876:―Vegetative growth-specific promoter and genetically modified plants obtained thereby.(7)

[0004] CN102417906:―rice green tissue-specific promoter PD54O-544,not expressed in embryos and endosperms.(8)WO2008081478:―Chimeric promoter constructed by fusion of GhrbcSP and D35SP promoters(expressed in all tissues except seed endosperm)。这些专利为转基因植物的应用提供了有利启动子工具，但是由于不同专利涉及不同的启动子，其表达谱（即具体的表达部位和表达水平）存在明显差异；而且同一个启动子应用在不同的单，双子叶植物，甚至不同物种间时经常有不同的表达效果。因此现有的启动子资源难以满足植物基因工程的实际需求。

发明内容

[0005] 本发明的一个目的是提供一种DNA片段。

[0006] 本发明提供的DNA片段，为如下1）或2）或3）的DNA分子：

[0007] 1）序列表中序列1所示的DNA分子；

[0008] 2）在严格条件下与1）限定的DNA序列杂交且具有启动子功能的DNA分子；

[0009] 3）与1）限定的DNA序列具有90%以上同源性，且具有启动子功能的DNA分子。

[0010] 上述严格条件可为在0.1×SSPE（或0.1×SSC）、0.1％SDS的溶液中，65℃条件下杂交并洗膜。

[0011] 含有上述DNA片段的重组载体、表达盒、转基因细胞系或重组菌也是本发明保护的范围。

[0012] 上述重组载体为将上述DNA片段替换掉表达载体pCAMBIA-1300-SGN中的CaMV35S启动子，得到的重组载体。

[0013] 所述重组载体具体为将上述DNA片段取代pCAMBIA-1300-SGN的PstI和BamHI酶切识别位点间的小片段（CaMV35S启动子）得到的重组质粒。

[0014] 扩增上述DNA片段的全长或其任意片段的引物对也是本发明保护的范围。

[0015] 上述引物对由序列表中序列2所示的单链DNA分子和序列表中序列3所示的单链DNA分子组成。

[0016] 上述DNA片段在植物中启动目的基因表达中的应用也是本发明保护的范围。

[0017] 上述应用中，所述目的基因表达为组织特异表达。

[0018] 上述应用中，所述组织为除种子淀粉胚乳以外的其他植物组织。

[0019] 上述应用中，所述除种子淀粉胚乳以外的其他植物组织为1）或2）：1）种子的胚、糊粉层或种皮；2）植物的根、叶鞘、茎、茎节、叶或穗。

[0020] 上述应用中，所述植物为单子叶植物或双子叶植物；所述单子叶植物具体为水稻；

[0021] 所述目的基因为GUS基因。

[0022] 单子叶植物水稻种子的结构包括种皮、胚和胚乳，其中胚乳又分为糊粉层（aleurone layer）和淀粉胚乳（starchy endosperm）。在水稻加工成大米的过程中，种皮和果皮、胚以及胚乳的糊粉层都被破坏，而淀粉胚乳留下食用。

[0023] 本发明的实验证明，本发明克隆得到启动子NSE，NSE启动子驱动目的基因仅在淀粉胚乳之外的部分高效表达，是国内外首个淀粉胚乳特异非表达启动子，将其运用于以淀粉胚乳为主要收获产物的作物中，对外源基因（如抗除草剂、抗病虫害等）进行选择性表达，既能节约能量，也能提高大众对转基因粮食的接受。另外，水稻，玉米等作物种子的糊粉层中不仅富含蛋白质、B族维生素及矿质元素（P、K、Mg），也是赤霉素信号反应因子及α-淀粉酶合成的关键部位。NSE启动子在糊粉层中的高表达特性对作物育种中提高种子萌发率，改良种子品质等具有重要应用意义。附图说明

[0024] 图1为植物表达载体的构建及转NSE:GUS水稻的GUS染色分析

[0025] 图2为转NSE:GUS水稻种子的GUS染色分析

[0026] 图3为转NSE:GUS水稻干种子及种子萌发过程中的GUS染色分析

具体实施方式

[0027] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。

[0028] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。

[0029] 实施例1、水稻NSE启动子的获得

[0030] 通过CTAB方法从水稻‘日本晴’（Oryza sativa ssp.japonica cultivarNipponbare，记载在Yuman Zhang,Yongsheng Yan,Lina Wang,Kun Yang,Na Xiao,Yunfeng Liu,Yaping Fu,Zongxiu Sun,Rongxiang Fang,Xiaoying Chen.A novel rice gene,NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth.Mol.Plant，2012,5(1):63-72.公众可从中国科学院微生物研究所获得。）叶片中提取基因组 D N A ，设计了正、反向特异引物 N S E - S - N s i : 5 ’-ATGCATGCCCTGGCTAGCTTCTTCATCACTTC-3’（序列2）；NSE-R-BH:5’-
GGATCCGGCCTGCACCGCAAATGGCGGATTTCC-3’（序列3）（带下划线的碱基为分别引入的NsiI和BamHI限制性酶切位点），采用TaKaRa LA-Taq DNA聚合酶进行PCR扩增，得到2,208bp的PCR产物。将该PCR产物送去测序，结果将该PCR产物所示的DNA分子命名为NSE，该DNA分子的核苷酸序列为序列表中序列1。

[0031] 实施例2、水稻NSE启动子的功能验证

[0032] 1、重组载体的获得

[0033] 将实施例1得到的PCR产物经NsiI和BamHI酶切，得到2,208bp的酶切产物，将该酶切产物与经过PstI（与NsiI是同尾酶）和BamHI酶切的植物表达载体pCAMBIA-1300-SGN（记载在Yuman Zhang,Yongsheng Yan,Lina Wang,Kun Yang,Na Xiao,Yunfeng Liu,Yaping Fu,Zongxiu Sun,Rongxiang Fang,Xiaoying Chen.A novel rice gene,NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth.Mol.Plant，2012,5(1):63-72.公众可从中国科学院微生物研究所获得。该载体中驱动GUS基因表达的启动子为35S）连接，得到重组载体。

[0034] 采用引物NSE-S-Nsi和NSE-R-BH对重组载体进行PCR检测，得到2,208bp产物的为阳性重组载体。阳性重组载体送去测序，结果该重组载体为将序列表中序列1所示的DNA分子NSE插入表达载体pCAMBIA-1300-SGN的PstI和BamHI酶切位点间（替换掉CaMV35S启动子）得到的载体，命名为p130-NSE。该重组载体的部分结构示意图如图1A所示，可以看出，NSE插入GUS基因的上游。

[0035] 2、重组菌的获得

[0036] 将上述1得到的重组载体p130-NSE转入根癌农杆菌EHA105（记载在Yuman Zhang,Yongsheng Yan,Lina Wang,Kun Yang,Na Xiao,Yunfeng Liu,Yaping Fu,Zongxiu Sun,Rongxiang Fang,Xiaoying Chen.A novel rice gene,NRR responds to macronutrient deficiency and regulates root growth.Mol.Plant，2012,5(1):63-72.公众可从中国科学院微生物研究所获得。）中，得到重组菌。

[0037] 提取重组菌的质粒，送去测序，该质粒为p130-NSE，含有该质粒的重组菌命名为EHA105/p130-NSE。

[0038] 3、转NSE:GUS水稻的获得

[0039] 1）转NSE:GUS水稻的获得

[0040] 将重组菌EHA105/p130-NSE转入水稻‘日本晴’（Oryza sativa ssp.japonica cultivar Nipponbare，也称为野生型水稻）中，得到30株T0代转NSE:GUS水稻。

[0041] 2）转NSE:GUS水稻的分子鉴定

[0042] 提取T0代转NSE:GUS水稻叶片的基因组DNA，用引物GUS-S1705：5‘-TGGCCAATGGTGATGTCAGCGTT-3’和GUS-R2329：5‘-TCCGGTTCGTTGGCAATACTCC-3’进行PCR扩增，得到625bp的为阳性，得到30株阳性T0代转NSE:GUS水稻。

[0043] 从阳性T0代转NSE:GUS水稻上收获T1代种子，播种、培育，并通过潮霉素（50ug/ml）抗性筛选得到了T2代转基因纯系种子。后续实验均以T2代转NSE:GUS水稻纯系种子为实验材料进行NSE启动子分析。

[0044] 采用同样的方法，将空载体pCAMBIA1300vector(Fisher Scientific catalog NO.50-513-40，载体中没有GUS插入)转入野生型水稻中，得到T0代转空载体水稻，收种(T1代)、播种、培育，得到T2代转空载体水稻纯系，按照上述方法对其进行PCR鉴定，未得到625bp的产物。

[0045] 采用同样的方法，将载体pCAMBIA-1300-SGN转入野生型水稻中，得到T0代转pCAMBIA-1300-SGN水稻，收种(T1代)、播种、培育，得到T2代转pCAMBIA-1300-SGN水稻纯系（阳性对照），PCR鉴定（同样用引物GUS-S1705和GUS-R2329进行扩增，得到625bp的为阳性）。

[0046] 4、转NSE:GUS水稻的GUS表达特性分析

[0047] 采用GUS组织染色方法检测NSE启动子驱动GUS报告基因在水稻中的表达特性：

[0048] 下述实验采用的水稻为7个独立的T2代转NSE:GUS水稻纯系(NSE)、T2代转空载体水稻（阴性对照，Vec）、野生型水稻（WT）和T2代转pCAMBIA-1300-SGN水稻（阳性对照，或35S），每个株系5株，实验重复三次。

[0049] GUS染色液配方：0.1M Na3PO4,pH7.0,10mM EDTA,0.5mM K3[Fe(CN)6],0.5mM K4[Fe(CN)6],1.0mM X-Glucuronide,0.1%Triton X-100和10%MeOH。

[0050] 1）NSE驱动GUS在水稻植株的特异表达

[0051] 将处于开花期T2代转NSE:GUS水稻纯系、野生型水稻（WT）植株的叶鞘、茎、茎节、叶和穗分别取样后，浸入GUS染色液中，在0.08Mpa 真空下保持3min，37℃染色过夜，然后用75%乙醇脱色三次。

[0052] 结果如图1B所示，表明T2代转NSE:GUS水稻纯系由NSE启动子驱动GUS在叶鞘、茎、茎节、叶和穗这些绿色组织中均有明显的蓝色信号。

[0053] 野生型水稻（WT）没有蓝色信号。

[0054] 用同样的方法检测阴性对照和阳性对照，阴性对照组织无蓝色信号，阳性对照组织全部有蓝色信号。

[0055] 2）NSE驱动GUS在种子的淀粉胚乳特异非表达特性

[0056] A、初步检测

[0057] 在T2代转NSE:GUS水稻纯系（NSE）、T2代转空载体水稻（阴性对照，Vec）、野生型水稻（WT）种子不同发育时期取样，具体分别在开花后17天（17DAF）、35天（35DAF）、45天（45DAF）收集种子，剥去颖壳后，进行GUS染色。

[0058] 结果如图1C所示，可以看到，T2代转NSE:GUS水稻纯系（NSE）在种皮、糊粉层中有很强的GUS信号，而淀粉胚乳中无信号，也就是NSE驱动GUS选择性地在水稻淀粉胚乳以外的部分高表达。

[0059] T2代转空载体水稻（阴性对照，Vec）和野生型水稻（WT）的种子中无GUS信号。

[0060] 用同样的方法检测阳性对照，阳性对照在整个组织包括淀粉胚乳部分均有蓝色信号。

[0061] 由于禾本科作物（水稻、玉米、小麦等）的食用部分均为种子的淀粉胚乳部分，NSE启动子驱动目的基因选择性地在淀粉胚乳以外的部分高表达，能在转基因作物中增强抗逆性、提高产量的同时，提高其食品安全性。

[0062] B、进一步检测

[0063] 在T2代转NSE:GUS水稻纯系（NSE）、T2代转空载体水稻（阴性对照，Vec）、T2代转pCAMBIA1300-sgn水稻（阳性对照）开花后30天（30DAF）的种子进行GUS染色。具体操作：将生长发育中的水稻种子先剥离颖壳后进行纵向切割，或者剥离淀粉胚乳外部的种皮和糊粉层后，迅速进行GUS染色。

[0064] 结果如图2所示，其中，A,E为T2代转空载体水稻(Vec)阴性对照；B,C和F为T2代转NSE:GUS水稻（NSE）种子，其中C为剥离种皮和糊粉层后的GUS染色；D为T2代转pCAMBIA-1300-SGN水稻（阳性对照）；染色结果表明T2代转NSE:GUS水稻（NSE）在糊粉层和胚中有明显的GUS信号，而白色的淀粉胚乳中GUS无表达；此结果进一步确认了NSE驱动GUS在种子淀粉胚乳中不表达，而在非淀粉胚乳的糊粉层和胚中高表达特性。

[0065] 阳性对照全部都有信号，阴性对照都没有信号。

[0066] 3）在种子萌发时NSE驱动GUS的表达

[0067] 将T2代转NSE:GUS水稻纯系（NSE）、T2代转空载体水稻（阴性对照，Vec）、T2代转pCAMBIA-1300-SGN水稻（阳性对照）的干种子（自然干燥）分别剥去颖壳，横切后进行GUS染色，结果如图3所示，T2代转NSE:GUS水稻纯系（NSE）仅在糊粉层中有强的蓝色信号，而淀粉胚乳是白色的，没有GUS信号。阳性对照全部都有信号，阴性对照都没有信号。

[0068] 将上述各水稻的干种子在水中浸泡3天时，剥去颖壳后进行GUS染色，结果如图3所示，T2代转NSE:GUS水稻纯系（NSE）除了在糊粉层中有明显的GUS信号外，在萌发的芽中也有强的GUS信号，而淀粉胚乳中是白色无GUS信号。阳性对照全部都有信号，阴性对照都没有信号。

[0069] 将上述各水稻的干种子在水中浸泡7天时，将萌发得到水稻植株进行GUS染色，结果如图3所示，阳性对照全部都有信号，阴性对照都没有信号，T2代转NSE:GUS水稻纯系（NSE）植株的根和地上部分均有较强的蓝色信号，与CaMV35S启动子驱动的GUS信号相似。

[0070] 综上所述，DNA分子NSE为启动子，且在除种子淀粉胚乳外其他组织中均高效表达。

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