可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法
阅读：1022发布：2020-06-03
专利汇可以提供可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一种可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因 植物 获得法，依次进行以下步骤：1）将一个或多个目标基因表达框与显色标记基因及抑制转基因禾本科 农作物 中参与 除草剂 解毒基因表达的基因构建在同一个质粒上的同一个T-DNA片断内或者构建在同一个可导入植物基因组的片断中，形成载体；2）将上述载体中的T-DNA片断通过转基因的方法导入禾本科农作物中。首先，选用苯达松或磺酰脲类除草剂对上述转基因禾本科农作物进行喷洒处理，转基因禾本科植物则基本被杀灭，非转基因禾本科植物能够存活；其次，直接用肉眼观察 鉴别 ，存活下来的植株中，具有显色标记的植株为转基因植株，而无显色标记的为非转基因植株。，下面是可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法专利的具体信息内容。
1.可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，其特征是依次进行以下步骤：
1）、将一个或多个目标基因表达框与显色标记基因及抑制转基因禾本科农作物中参与除草剂解毒基因表达的基因构建在同一个质粒上的同一个T-DNA片断内或者构建在同一个可导入植物基因组的片断中，形成载体；
2）、将上述载体中的T-DNA片断通过转基因的方法导入禾本科农作物中，获得所述能被选择性消灭且能有效显色标记的转基因禾本科农作物。
2.根据权利要求1所述的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，其特征是：采用以下方法进行鉴别是否为转基因禾本科农作物：
首先，选用苯达松或磺酰脲类除草剂对上述转基因禾本科农作物进行喷洒处理，转基因禾本科植物则基本被杀灭，非转基因禾本科植物能够存活；
其次，直接用肉眼观察鉴别，存活下来的植株中，具有显色标记的植株为转基因植株，而无显色标记的为非转基因植株。
3.根据权利要求1或2所述的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，其特征是：所述显色标记基因为远红荧光蛋白基因mKate-S158A，其核苷酸序列为SEQ ID No:1。
4.根据权利要求3所述的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，其特征是：所述目标基因为医用蛋白质基因、工业用途蛋白质基因、抗除草剂基因或抗虫基因。
5.根据权利要求4所述的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，其特征是：
所述医用蛋白质基因包括胰岛素、胶原蛋白、抗菌肽、人血清白蛋白、乳铁蛋白、人生长因子、抗体、各种疫苗；
所述工业用途蛋白质基因包括溶菌酶、脂肪酶、淀粉酶、果胶酶；
所述抗除草剂基因包括抗草甘膦基因；
抗虫基因包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ab、Vip3。
6.根据权利要求5所述的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，其特征是：所述抑制转基因禾本科农作物中参与除草剂解毒基因表达的基因为苯达松或磺酰脲类除草剂的解毒基因。
7.根据权利要求6所述的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，其特征是：所述转基因的方法为基因枪法或农杆菌介导方法。
8.根据权利要求1~7中任一所述的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，其特征是：所述步骤1）所得的载体为以下任意一种：
同时含有目标基因与显色标记基因融合表达框、苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒基因的抑制表达框的载体，或者同时含有目标基因表达框、显色标记基因表达框及苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒基因的抑制表达框的载体。
9.根据权利要求8所述的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，其特征是：所述步骤1）所得的载体为以下任意一种：
为同时包含目标基因与显色标记基因融合表达框，抗草甘膦基因的表达框和控制苯达松和磺酰脲类解毒酶基因表达的抑制表达框，在水稻中转化；
为同时包含显色标记基因表达框，胰岛素原基因表达框，抗草甘膦基因表达框和控制苯达松和磺酰脲类解毒酶基因表达的抑制表达框，在水稻中转化；
为同时包含目标基因与显色标记基因融合表达框，抗草甘膦基因的表达框和控制苯达松和磺酰脲类解毒酶基因表达的抑制表达框，在玉米中转化。
10.根据权利要求8或9所述的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，其特征是：所述步骤1）所得的载体为以下任意一种：
水稻转化T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter，水稻转化T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-GluC-Proinsulin-ter，玉米转化T-DNA载体pcamb1300Corn-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter。
可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法
技术领域
[0001] 本发明涉及一种可被选择性杀灭并具有有效显色标记的转基因植物的获得方法，属于植物基因工程领域。
背景技术
[0002] 转基因农作物目前已经在世界许多国家大量推广植株。例如转基因抗虫、抗除草剂玉米已在北美大量推广，转基因棉花也已经在中国大量种植。进一步利用转基因农作物作为生物反应器生产药用蛋白质、工业用酶等也正在广泛研究和开发（Larrick and Thomas,Current Opinion in Biotechnology,2001,12:411-418）。转基因农作物应用的重要工作之一是控制它们的传播、防止它们混入到非转基因农作物之中；特别是防止作为生物反应器生产药用蛋白质、工业酶和其他短期或长期食用可能对人和动物有不良作用的转基因品种混入用于粮食和饲料品种是非常重要的。而转基因植物和非转基因植物在外观上几乎没有明显差异，很难通过肉眼快速有效地鉴别出是否为转基因植株，并确定在生态环境中是否有转基因种子污染，或者因花粉漂移造成外源基因逃逸。因此，发明一种快速有效的控制且可直观便捷的鉴别转基因作物的方法具有重大意义和价值。
[0003] 1999年，Matz等报道了第一个红色荧光蛋白 (red fluorescent protein，RFP)，其是从印度太平洋与海葵相关的Discosoma sp中分离得到的一种生物发光蛋白，它能在紫外线激发下发出红色荧光，激发波长和发射波长较长，其最大激发波长为558 nm，最大发射波长为583nm（Matz M V and Fradkov A F，Nat Biotechnol，1999，17(10)：969-973）。近年来，随着红色荧光蛋白多样性的发展，不同形式的红色荧光蛋白用于科学研究。远红荧光蛋白mKate-S158A是由一种来源于拳头海葵（Entacmaea quadricolor）的红色荧光蛋白eqFP578经一系列突变而来的单体，它的最大激发波长为588nm，最大发射波长为635nm，发色团为Met63-Tyr64-Gly65，因其具有远红荧光，并且亮度高、成熟快、强光稳定性及pH稳定性，被用在完整组织中作示踪蛋白，融合蛋白标签，并且可以和其他荧光蛋白进行多重颜色标记，以及用于荧光共振能量转移技术（fluorescence resonance energy transfer，FRET）。目前，荧光探针技术的发展趋势是扩大染色在远红光和近红外区的作用，因为在哺乳动物细胞中，自发荧光和吸收光都会在光谱的红色末端大大降低。因此，远红荧光探针的开发在检测厚标本和整体动物时非常有用。如果荧光蛋白成功的作为转化系统中的报告基因，在整个组织中使用远红荧光蛋白会在未来的研究中变得越来越重要。
[0004] 苯达松和磺酰脲类除草剂是常用的农业除草剂。它们对许多宽叶杂草具有很好的杀草能力。但是禾本科农作物由于具有这些除草剂的解毒酶，因此对这些除草剂具有良好的抗性（Pan et al., Plant Molecular Biology, 2006,61:933-94，Siminszky, Phytochemistry Reviews 5:445-458）。通过利用反义RNA或者RNAi的方法能够抑制禾本科农作物中苯达松或者磺酰脲类除草剂的解毒酶基因的表达 ，从而使转基因农作物对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感，进而有效的控制转基因农作物的传播（Lin C, et al. , PLoSONE, 2008, 3:e1818.）。然而，在这种方法的使用过程中难免会存在一些不可避免的人为错误或遗漏。近年来，转基因植物的生态安全和食品安全问题备受关注，尤其是作为生物反应器的农作物更加需要有效安全的控制策略以确保其在安全可控的条件下生产，并且其产物不对非转基因产品造成威胁。选择性杀灭技术在转基因植株生长发育阶段可以对其进行有效的控制和杀灭，而对于转基因种子则无任何识别和控制作用。因此，急需一种更直观有效的方法解决转基因植物及其产物在应用阶段由一些不可避免的错误引起的基因漂流或种子污染问题。
[0005] 目前还没有将选择性杀灭技术和能够直接进行有效显色标记连锁在一起的双保险的策略，进而控制转基因农作物的生产和应用。
发明内容
[0006] 本发明要解决的技术问题是提供一种可被选择性杀灭和具有有效显色标记转基因植物的获得方法，使用该方法能够有效地控制并且简单快速的识别出转基因的禾本科植物及其种子。
[0007] 为了解决上述技术问题，本发明提供一种可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法，依次进行以下步骤：
[0008] 1）、将一个或多个目标基因表达框与显色标记基因及抑制转基因禾本科农作物中参与除草剂解毒基因（即解毒酶基因）表达的基因构建在同一个质粒上的同一个T-DNA片断内或者构建在同一个可导入植物基因组的片断中，形成载体；
[0009] 2）、将上述载体中的T-DNA片断通过转基因的方法导入禾本科农作物中，获得所述能被选择性消灭且能有效显色标记（即直观标示）的转基因禾本科农作物。
[0010] 作为本发明的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法的改进：采用以下方法进行鉴别是否为转基因禾本科农作物：
[0011] 首先，选用苯达松或磺酰脲类除草剂对上述转基因禾本科农作物进行常规浓度的喷洒处理，转基因禾本科植物则基本被杀灭（只有极少数的能够侥幸存活），非转基因禾本科植物能够存活；
[0012] 其次，直接用肉眼观察鉴别，存活下来的植株中，具有显色标记的植株为转基因植株，而无显色标记的为非转基因植株。
[0013] 作为本发明的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法的进一步改进：显色标记基因为远红荧光蛋白基因mKate-S158A，其核苷酸序列为SEQ ID No:1（即，序列表中的No1）。
[0014] 备注说明：红色只出现在种子中，即，能使种子呈现红色。即，本发明中使用远红荧光蛋白基因mKate-S158A起有效显色标记作用。
[0015] 具体而言：
[0016] 首先，选用苯达松或磺酰脲类除草剂对上述转基因禾本科农作物进行常规的喷洒处理，转基因禾本科植物则基本被杀灭（只有极少数的能够侥幸存活），非转基因禾本科植物能够存活；
[0017] 其次，直接用肉眼观察鉴别，存活下来的植株中，种子为红色的植株为转基因植株，而种子为常规色的为非转基因植株。
[0018] 作为本发明的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法的进一步改进：目标基因为医用蛋白质基因、工业用途蛋白质基因、抗除草剂基因或抗虫基因。
[0019] 作为本发明的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法的进一步改进：
[0021] 工业用途蛋白质基因包括溶菌酶、脂肪酶、淀粉酶、果胶酶；
[0022] 抗除草剂基因包括抗草甘膦基因；
[0023] 抗虫基因包括Cry1Ab、Cry1Ac、Cry2Ab、Vip3。
[0024] 作为本发明的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法的进一步改进：
[0025] 抑制转基因禾本科农作物中参与除草剂解毒基因表达的基因（转基因禾本科农作物中被抑制的除草剂解毒基因）为：苯达松或磺酰脲类除草剂的解毒基因。
[0026] 作为本发明的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法的进一步改进：转基因的方法为基因枪法或农杆菌介导方法。
[0027] 作为本发明的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法的进一步改进：
[0028] 步骤1）所得的载体为以下任意一种：
[0029] 同时含有目标基因与显色标记基因融合表达框、苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒基因的抑制表达框的载体，或者同时含有目标基因表达框、显色标记基因表达框及苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒基因的抑制表达框的载体。
[0030] 作为本发明的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法的进一步改进：
[0031] 步骤1）所得的载体为以下任意一种：
[0032] 为同时包含目标基因与显色标记基因融合表达框，抗草甘膦基因的表达框和控制苯达松和磺酰脲类解毒酶基因表达的抑制表达框，在水稻中转化；
[0033] 为同时包含显色标记基因表达框，胰岛素原基因表达框，抗草甘膦基因表达框和控制苯达松和磺酰脲类解毒酶基因表达的抑制表达框，在水稻中转化；
[0034] 为同时包含目标基因与显色标记基因融合表达框，抗草甘膦基因的表达框和控制苯达松和磺酰脲类解毒酶基因表达的抑制表达框，在玉米中转化。
[0035] 作为本发明的可被选择性杀灭且具有有效显色标记的转基因植物获得法的进一步改进：
[0036] 步骤1）所得的载体为以下任意一种：
[0037] 水稻转化T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter，[0038] 水稻转化T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-GluC-Proinsulin-ter，
[0039] 玉米转化T-DNA载体pcamb1300Corn-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter。
[0040] 本发明中，Proinsulin的序列如SEQ ID No:2所述。
[0041] 具体而言，本发明是一种利用苯达松或磺酰脲类除草剂选择性地消灭，同时利用远红荧光蛋白进行有效显色标记转基因禾本科农作物的方法。
[0042] 本发明为：在生产试验阶段使用选择性杀灭技术有效的控制转基因植物，防治其发生基因漂流等，这是第一道防线；但没有任何一种安全控制方法能做到百分之百的安全，万一有转基因植株遗漏或残留且其种子意外混入到常规种子中，我们可通过显色标记立即识别出转基因，因此也不会发生误食或其他基因漂流事件，这是第二道防线，本发明属于一个双保险的策略。
[0043] 本发明的设计构思如下：在转基因禾本科植物中表达目的基因（目标基因）的同时，通过和显色标记基因连锁使整个转基因植物或转基因植株的特定器官或组织表达特殊的颜色而将其与非转基因植株区别开来，同时通过抑制转基因禾本科农作物中参与苯达松或磺酰脲类除草剂解毒基因的表达，使转基因农作物对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感。而且在本发明中，目标基因表达框与显色标记基因及苯达松、磺酰脲类除草剂的解毒基因的抑制表达框连接在同一个T-DNA片断上，从而达到在转基因农作物中目标基因与显色标记基因及苯达松、磺酰脲类除草剂的解毒基因的抑制表达框紧密连锁。特别是上述目标基因包括一种抗草甘膦基因，从而使获得的转基因农作物对草甘膦除草剂具有高抗性而对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感。 利用本发明的方法获得的转基因禾本科农作物，能被苯达松和磺酰脲类除草剂选择性地杀灭，并且在发生意外的基因漂流时，通过外观有效的显色标记可以迅速的识别出来。因此必要时可以通过使用常用的苯达松和磺酰脲类除草剂防止转基因禾本科农作物的传播，消灭混入常规禾本科农作物中的转基因禾本科农作物。
[0044] 本发明能使转基因的禾本科农作物对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感并且从外观上与非转基因禾本科农作物直观地区别开来，同时这种对除草剂敏感的性状及具有显色标记的性状与目的基因紧密连锁。而这种连锁是通过插入DNA的构建来实现的：即本发明将目标基因表达框与显色标记基因表达框及苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒基因的抑制表达框连接在同一个载体上。在利用农杆菌转化时，则是连接在同一个T-DNA片断中。
[0045] 本发明中显色标记基因的表达框有两种情况，一种是显色标记基因与目的基因直接融合表达，另一种是显色标记基因有单独的表达框，这个表达框由三个部分组成。一个是启动子，它可以是胚乳特异性表达的启动子GluA-2(Gt1)（Fumio Takaiwa,Shoshi Kikuehi, and Kiyoharu Oono，Mol Gen Genet,1987,208:15-22），或者是其他胚乳特异性表达的启动子GluA-1、GluA-3、GluB-3、GluB-4、GluB-5、GluC或NRP33，或者是其他器官特异性表达的启动子，或者是CaMV35S启动子，或者是玉米泛素（Ubiquitin）启动子，或者水稻泛素启动子，或者水稻Actin启动子，或者是其他在禾本科农作物中有活性的启动子。第二个部分是显色标记基因的DNA序列。将荧光蛋白作为报道基因和标记基因的技术是已有的技术（Chalfie M，Tu Y and Euskirchen G，Science，1994，263：802-805）。在禾本科农作物中可以根据SEQ ID No:1设计。第三个部分是Nos终止子。苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒基因的抑制表达框由二个部分组成。一个是启动子，它可以是玉米泛素（Ubiquitin）启动子，或者水稻泛素启动子，或者水稻Actin启动子，或者是CaMV35S启动子，或者是其他在禾本科农作物中有活性的启动子。另一个部分是与启动子功能性相联的产生苯达松和磺酰脲类的解毒酶基因的反义RNA的DNA模板，或者产生RNAi的DNA模板。利用反义RNA和RNAi抑制表达的机理和技术已经有完整的描述，是已经有的技术（Nature Reviews Genetics 2006，7，334-335）。
[0046] 同时含有目标基因与显色标记基因融合表达框、苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒基因的抑制表达框的载体，或者同时含有目标基因表达框、显色标记基因表达框及苯达松和磺酰脲类除草剂的解毒基因的抑制表达框的载体，可以通过转基因的方法稳定导入禾本科农作物中。这个方法包括但是不限于基因枪方法、农杆菌介导方法和花粉管导入方法。基因枪方法、农杆菌介导方法和花粉管导入方法是已有的技术（Hiei et al.,The Plant Journal, 1994, 6:271-282;Ishida et al., Nature Biotechnology,1996, 14:745-750;Ayres and Park, Critical Reviews in Plant Science, 1994,
13:219-239;Bommineni and Jauhar, Maydica, 1997, 42:107-120;孔青等，分子植物育种 3:113-116）。
13:219-239;Bommineni and Jauhar, Maydica, 1997, 42:107-120;孔青等，分子植物育种 3:113-116）。
[0047] 本发明中，目标基因的选择并不受限制。目的基因（即，目标基因）包括但是不限于药物蛋白质基因、工业酶基因、抗虫基因、抗除草剂基因或其他有价值的基因。药用蛋白基因包括但是不限于治疗用的药用蛋白质如胰岛素，胶原蛋白，抗菌肽，人血清白蛋白，乳铁蛋白，人生长因子，抗体，各种疫苗等；工业用的蛋白质基因包括但是不限于各种工业用酶如溶菌酶，脂肪酶，淀粉酶，果胶酶等。在植物中表达各种用途的蛋白质是已有的技术（Franken et al.,Current Opinion in Biotechnology,8:411-416）。抗虫基因包括但是不限于Cry1Ab，Cry1Ac，Cry2Ab，Vip3等；抗除草剂基因包括但是不限于抗草甘膦基因等。
[0048] 本发明所述的目的基因可以是一个或者多个。它们可以单独表达，也可以与显色标记基因融合表达，单独表达或者融合表达的表达框与解毒酶基因表达抑制框连接在一个转化DNA片段中。
[0049] 优选的，上述目的基因中的一个为抗草甘膦基因。抗草甘膦基因已有描述（例如，Park et al.,Molecular Microbiology 51:963-971;Eschenburg et al.,Planta216:129-135;US Pat.No.4,769,
[0050] 061;US Pat.No.4,940,835）。这种方法获得的转基因农作物对草甘膦除草剂具有高抗性而对苯达松或磺酰脲类除草剂敏感，因此获得的转基因植物可以利用草甘膦进行筛选和杂草防治，同时也可以利用苯达松或磺酰脲类除草剂防止转基因禾本科农作物的扩散。优选的，上述目的基因中的另一个为胰岛素原基因。随着糖尿病发病率在世界各地逐年增高，市场对于胰岛素的需求量也越来越大。通过转基因植物表达外源蛋白已成为植物基因工程领域内的一个研究热点，且正在逐步形成产业化，具有极大的市场前景和商业价值，而通过基因工程手段生产胰岛素的技术也在逐步成熟（Chance,R.E et al.,(1981),pp.721-728,Pierce Chemical Company,Rockford,IL;Lars Thim et al.(1987) FEBS 212:307-312）。由于胰岛素本身分子量较小，不便于直接进行表达且表达产物的提纯分离较困难，目前利用基因工程手段生产胰岛素大多表达其前体形式即胰岛素原，因此，利用转基因植物表达胰岛素原具有重大的商业价值和意义。
[0051] 更进一步，本发明所述的目标除草剂为下列除草剂及其他们的类似物中的一种或者多种：苯达松、烟嘧磺隆、苄嘧磺隆、甲磺隆、绿磺隆、甲嘧磺隆、吡嘧磺隆、氯嘧磺隆和噻磺隆。
[0052] 转基因植物可以通过花粉扩散或者直接通过种子传播到计划种植以外的地方。本发明提供了一种直观标示转基因植物的方法，通过使转基因植物表达有效显色标记基因，直接从外观上鉴别出混入到非转基因植物种植区域转基因植株，或混入到常规种子中的转基因种子。同时，将显示标记基因与抑制苯达松和磺酰脲类的解毒基因的DNA片断紧密连锁，必要时可以快速地使用苯达松或磺酰脲类除草剂对转基因植物污染区域进行选择性杀灭，而对于极个别意外因素造成的种子污染则通过显色标记有效识别，从而非常有效的保护了生态安全和食品安全。
[0053] 本发明还提供了一种使用显色荧光蛋白作为生物反应器标记基因的方法，将显色标记基因与胰岛素原等目标基因紧密连锁，表达显色基因的转基因植株必然也表达了目标基因。目前对于目标基因表达的检测大多限于分子生物学方法，方法虽然有效，但是费时费力，而且检测样本有限。本发明提供的方法可以直观便捷的检测目标基因的表达，省时省力，简单易操作。
[0054] 本发明还提供了一种同时使用显色标记基因标示转基因植株并作为生物反应器的标记基因的方法。将显色标记基因与抑制苯达松和磺酰脲类的解毒基因的基因及胰岛素原基因等目标基因紧密连锁，在转基因植株污染区域使用苯达松或磺酰脲类除草剂进行选择性杀灭，并且通过显色标记快捷地识别出可能残留的表达目标基因的转基因植株，防止目标基因向非转基因区域扩散和传播，发生基因漂移，这一双保险的策略有效地保证了目的基因能够被快速有效的控制。
[0055] 本发明还提供了一种利用不同除草剂对转基因植物可以进行正选择和负选择的技术。一种抗草甘膦基因，与抑制苯达松和磺酰脲类的解毒基因的DNA片断构建在同一个质粒上。这样，对草甘膦的抗性和对苯达松和磺酰脲类的敏感性在转基因禾本科农作物中高度连锁。这种方法获得的转基因植物可以利用草甘膦进行筛选和杂草防治，同时也可以利用苯达松和磺酰脲类除草剂控制和消灭转基因禾本科农作物。
[0056] 本发明还提供了三种质粒：一种质粒为同时包含目标基因与显色标记基因融合表达框，抗草甘膦基因的表达框和控制苯达松和磺酰脲类解毒酶基因表达的抑制表达框，在水稻中转化；一种为同时包含显色标记基因表达框，胰岛素原基因表达框，抗草甘膦基因表达框和控制苯达松和磺酰脲类解毒酶基因表达的抑制表达框，在水稻中转化；另一种质粒为同时包含目标基因与显色标记基因融合表达框，抗草甘膦基因的表达框和控制苯达松和磺酰脲类解毒酶基因表达的抑制表达框，在玉米中转化。
[0057] 本发明还提供了三种包含上述质粒的禾本科农作物细胞。
[0058] 本发明还提供了一种对植物进行改造的方法：包括利用上述植物细胞，再将其分化培育成相应的转基因植株。所获得的植株能够表达目的基因，但是明显大幅度降低了抗苯达松和磺酰脲类除草剂的能力，同时表达显色标记基因方便于快速有效的识别。
[0059] 因此本发明的可被选择性杀灭和具有有效显色标记转基因植物的获得方法涉及一种生物技术，此种方法使转基因作物可以选择性地被正常所有浓度的苯达松和磺酰脲类除草剂杀死且一些可能的意外残留能被直观快速地识别，因此可以有效地防止转基因禾本科农作物扩散或者混入非转基因禾本科农作物中，做到有效的安全防治。附图说明
[0060] 下面结合附图对本发明的具体实施方式作进一步详细说明。
[0061] 图1是本发明水稻的转化T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter的示意图。
[0062] 图2是本发明水稻的转化T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-ter-GluC-proinsulin-ter的示意图。
[0063] 图3是本发明玉米的转化T-DNA载体pcamb1300Corn-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter的示意图。
[0064] 图4是本发明获得的转基因水稻种子和非转基因水稻种子对比示意图。
[0065] 图5是本发明用Western印迹分析检测胰岛素原基因在转基因水稻种子中表达结果图。
[0066] 图5中：
[0067] 横向的100、85、83、79、48这些数字代表所获得的不同的转基因株系的编号；CK代表非转基因水稻种子，即所用来转化的秀水134.；M即纵向的蛋白Marker；
[0068] 纵向的72、55、43、34、26、17代表蛋白Marker（货号：SM0671）的分子量。
具体实施方式
[0069] 实施例1和实施例2所述的方法酶切、PCR等方法均为常规技术，例如可按照已经公开发表的Andrew P. Feinberg,Bert Vogelstein. 1983.Analytical Biochemistry.132(1),6-13.;John C. Fiddes,G. Nigel Godson. 1978. Virology.89(1), 322-326.;Randall K.S, Teodorica L.B, Kary B.M.1986.Nature.324,163-166所述方法进行。
[0070] 实施例1：水稻转化T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter的构建
[0071] 显色标记基因与胰岛素原基因的融合片断mKate-proinsulin是由上海生工公司（上海，中国）人工合成的，长1021bp（如SEQ ID NO:3所述），然后再利用PCR引物Red-INF（5’AGC TCT AGA ACC GAA CTC ATC ACC GAG AAC，下横线是XbaⅠ位点）和Red-INR（5’gct gaG ctc tca tta gtt gca gta gtt，下横线是SacⅠ位点）通过PCR获得的。
[0072] 这个片断被克隆到T载体（上海生工，即PUCM-T载体，PUC57）中，获得载体T-Vector-mkate-proinsulin，并将酶切鉴定正确的克隆送杭州博尚生物公司测序。片断mkate-proinsulin从测序正确的T克隆载体中用XbaⅠ和SacⅠ酶双酶切而获得。水稻种子特异性表达的启动子GT1片断是通过PCR从水稻（Oryza sativa japonica L.）总基因组DNA扩增获得。
[0073] 备注说明：水稻种子特异性表达的启动子GT1片断在Takaiwa F, Kikuchi S, Oono K. 1987. A rice glutelin gene family.A major type of glutelin mRNAs can be divided into two classes. Molecular and General Genetics 208, 15-22中有明确告知。
[0074] 将pcamb1300空 载 体 用HindⅢ 和SacⅠ 进 行 双 酶 切，将PCR扩 增 出的水稻种子特异性表达的启动子GT1片断用HindⅢ和XbaⅠ进行双酶切，然 后 将pcamb1300，GT1，mkate-proinsulin 这3个 片 段 连 接，在 大 肠 杆 菌 中克 隆，得 到 pcamb1300-GT1-mkate-proinsulin。 然 后 再 用Hind Ⅲ 和 SacⅠ 将pcamb1300-GT1-mkate-proinsulin进行双酶切，回收GT1-mkate-proinsulin片断，并将Nos终止子用SacⅠ和KpnⅠ进行双酶切，回收Nos终止子ter片断。
[0075] 将含有抗草甘膦基因和能够产生RNAi的抑制苯达松和磺酰脲类除草剂解毒酶基因表达的基因的T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i（基于pcamb1300）用HindⅢ和Kpn1进行双酶切，然后，将pcamb1300rice-GlyR-450i，GT1-mkate-proinsulin，ter这3个片段连接，在大肠杆菌中克隆，得到pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter载体（图1）。这样，此T-DNA载体含有抗除草剂基因，能够产生RNAi的抑制苯达松和磺酰脲类除草剂解毒酶基因表达的基因，起显色标记作用的远红荧光蛋白基因和胰岛素原基因。
[0076] 备注说明：pcamb1300rice-GlyR-450i在CN 101205537 A的《一种能被选择性消灭的转基因禾本科农作物的获得方法》中有明确告知。
[0077] 实施例2：水稻转化T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-GluC-Proinsulin-ter的构建
[0078] GT1-mKate片断是以实施例1获得的pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter载体为模板，利用PCR引物GT1F（5’GCT AAG CTT GTT AAT CAT GGT GTA GGC AAC CCA，下横线是HindⅢ位点）和REDR（5’GTC GAG CTC TCA TTA CGG CTT CTC GCC CTC CTC GCG CTT，下横线是SacⅠ位点）通过PCR获得的，然后再与Nos终止子ter及pcamb1300rice-GlyR-450i载体功能性的连接在一起，获得pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-ter载体。
[0079] 水稻种子特异性表达的启动子GluC片断是以水稻（Oryza sativa japonica L.）基因组为模板利用引物GLUC-F（5’CGG GTA CCA ATG TAA TAT CTC AAA GTT TTT ATA AG，下横线是KpnⅠ位点）和GLUC-R（5’CAG AGG TGC TGG TTC ACG AAT GCC ATG GAC ACT TGG AAG AAG AG）通过PCR获得；Proinsulin-ter片断是以实施例1获得的pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter载体为模板，利用PCR引物INSF（5’CTC TTC TTC CAA GTG TCC ATG GCA TTC GTG AAC CAG CAC CTC TG）和INSR（5’GAG GGT ACC CAC TGG ATT TTG GT TTA GGA ATT AGA，下横线是KpnⅠ位点）通过PCR获得。然后再分别以GluC片断和Proinsulin-ter片断为模板，利用引物GLUC-F和INSR通过PCR扩增出GluC-Proinsulin-ter片断，并将此片断克隆到T载体（上海生工）中，获得载体T-Vector-GluC-Proinsulin-ter，将酶切鉴定正确的克隆送杭州博尚生物公司测序。然后再从测序正确的T克隆载体中用KpnⅠ单酶切切出GluC-Proinsulin-ter片断。同时将获得的pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-ter载体用KpnⅠ酶进行单酶切并去磷酸化，然后将这两个片断连接在一起，并在大肠杆菌中克隆，得到pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-GluC-Proinsulin-ter载体（图2）。这样，此T-DNA载体含有抗除草剂基因，能够产生RNAi的抑制苯达松和磺酰脲类除草剂解毒酶基因表达的基因，起显色标记作用的远红荧光蛋白基因和胰岛素原基因。
[0080] 实施例3：具有显色标记和对苯达松和磺酰脲类除草剂敏感并表达胰岛素原的抗草甘膦转基因水稻的获得
[0081] 转基因水稻的获得方法是采用现有技术（Hiei Y,Ohta S,Komari T,Kumashiro T (1994) .Plant J 6:271–282.；Yoshida S,Forno DA,Cock JH,Gomez KA(1976) .Manila,Philippines:International Rice Research Institute.pp 61–66.）。选取成熟饱满的“秀水134”种子去壳，诱导产生愈伤组织作为转化材料。通过电击方法将T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter和 pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-GluC-Proinsulin-ter导入农杆菌LBA4404。取含T-DNA载体pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter和 pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-GluC-Proinsulin-ter的农杆菌划板，挑单菌落接种准备转化用农杆菌。将待转化的愈伤组织放入OD660为
0.6的农杆菌菌液中（含乙酰丁香酮，40mg/ml），让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含2mM草甘膦的筛选培养基上，筛选培养两个月（中间继代一次）。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养10天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。
0.6的农杆菌菌液中（含乙酰丁香酮，40mg/ml），让农杆菌结合到愈伤组织表面，然后把愈伤组织转移到共培养基中，共培养2-3天。用无菌水冲洗转化后的愈伤，转移到含2mM草甘膦的筛选培养基上，筛选培养两个月（中间继代一次）。把筛选后，生长活力良好的愈伤转移到预分化培养基上培养10天左右，然后将预分化好的愈伤组织移到分化培养基，14小时光照分化发芽。2-3周后，把抗性再生植株转移到生根培养基上壮苗生根，最后将再生植株洗去琼脂移植于温室，作为鉴定材料。
[0082] T-DNA的插入可以通过PCR分析检测，基因的表达可以直接通过外观观察鉴别，也可通过Western印迹做进一步分析检测。基因组DNA可以根据现有的方法从转化再生植株和非转化禾本科农作物中提取。
[0083] 实施例4：检测转基因水稻种子中显色标记基因及胰岛素原基因的表达情况[0084] 获得的转化了pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter和pcamb1300r-ice-GlyR-450i-GT1-mkate-GluC-Proinsulin-ter的T0转基因水稻植株和没有转化的水稻植株待进入乳熟期后手剥观察胚乳的颜色，转基因植株的胚乳是红色乳状，而非转基因植株则是白色乳状。待种子完全成熟后，将这两种水稻种子去壳，直观的可以看到转基因植株的种子胚乳及外表都是红色（图4）。
[0085] 将成熟的T0转基因水稻种子和没有转化的水稻种子磨样进行了Western印迹分析检测，Western印迹结果显示出胰岛素原基因在转基因水稻种子中进行了正常表达（图5），且表达量很高，而非转基因水稻种子中则无表达。
[0086] 实施例5：利用除草剂对转基因水稻的正选择和负选择
[0087] 获得的转化了pcamb1300rice-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter和pcamb1300r-ice-GlyR-450i-GT1-mkate-GluC-Proinsulin-ter的T0转基因水稻植株和没有转化的水稻植株分别在培养液中单株培养。这些植株分为3个处理，每个处理包括来自不同转化事件的二种转基因各30个植株和10个非转基因植株。处理1：喷20mM草甘膦；处理2：
喷2000mg/L苯达松；处理3：喷水。每个处理喷80mL/平方米，处理后10天记录植株的成活率。结果如下表1。
喷2000mg/L苯达松；处理3：喷水。每个处理喷80mL/平方米，处理后10天记录植株的成活率。结果如下表1。
[0088] 备注说明：每平方米种植64株。
[0089] 上述培养液的配方参考Yoshida S,Forno DA,Cock JH,Gomez KA (1976) .Manila,Philippines:International Rice Research Institute.pp 61–66。
[0090] 表1：转基因水稻对草甘膦和苯达松的敏感性
[0091]
[0092] 实施例6：玉米转化T-DNA载体pcamb1300Corn-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter的构建
[0093] 玉米中显色标记基因与胰岛素原基因的融合片断mKate-proinsulin、水稻种子特异性表达的启动子GT1片断和Nos终止子ter片断的获得及连接方法与实施例1的方法是相同的，将获得的GT1-mkate-proinsulin-ter片断连接在同时含有抗草甘膦基因和能够产生RNAi的抑制苯达松和磺酰脲类除草剂解毒酶基因表达的基因的T-DNA载体pcamb1300Corn-GlyR-450i中，获得T-DNA载体pcamb1300Corn-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter（图3），用于玉米的转化。因此，载体pcamb1300Corn-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter的T-DNA包含：1）一个显色标记基因，2）一个胰岛素原基因，3）一个抑制苯达松和烟嘧磺隆解毒酶基因表达的基因，4）一个抗草甘膦基因（图3）。
[0094] 备注说明：pcamb1300Corn-GlyR-450i在CN 101205537A的《一种能被选择性消灭的转基因禾本科农作物的获得方法》中有明确告知。
[0095] 实施例7：转基因玉米的获得
[0096] 取授粉后8-10天的Hi-Ⅱ玉米穗。收集所有的未成熟胚（大小为1.0-1.5mm）。将含有pcamb1300Corn-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter的农杆菌与未成熟胚共培育培养2-3天（22℃）。转移未成熟胚到愈伤诱导培养基上（含200mg/L的Timentin杀农杆菌），28℃暗培养10-14天。将所有的愈伤转到带有2mM草甘膦的筛选培养基上（M4），28℃暗培养2-3周。
[0097] 转移所有的组织到新鲜草甘膦的筛选培养基上，28℃暗培养2-3周。然后，转移所有筛选后成活的胚性组织到再生培养基上，28℃暗培养10-14天，每皿一个株系。转移胚性组织到新鲜的再生培养基上，26℃光照培养10-14天。转移所有发育完全的植株到生根培养基上，26℃光照培养直到根发育完全，然后移植到温室单株培养。
[0098] 备注说明：上述玉米的转化可参考Ishida Y, Saito H, Ohta S, Hiei Y, Komari T, Kumashiro T (1996) Nature Biotechnol 14: 745–750 。
[0099] 实施例8：检测转基因玉米中显色标记基因及胰岛素原基因的表达情况
[0100] 获得的转化了pcamb1300Corn-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter的T0转基因玉米植株待进入乳熟期后手剥观察胚乳的颜色，转基因植株的胚乳是红色乳状而非转基因植株则是白色乳状。待玉米完全成熟后，直观的可以看到转基因植株的玉米粒是红色的而非转基因植株的玉米粒则是黄色的。
[0101] 将成熟的T0转基因玉米种子和没有转化的玉米种子磨样，进行SDS-PAGE蛋白电泳和Western印迹分析检测，蛋白电泳结果和Western印迹结果共同显示出胰岛素原基因在转基因玉米种子中进行了正常表达，且表达量很高，而非转基因玉米种子中则无表达。
[0102] 实施例9： pcamb1300Corn-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter转化的玉米愈伤组织对苯达松敏感性的测定
[0103] 将经过农杆菌感染的在草甘膦的筛选培养基上筛选培养56天的20个成活玉米愈伤组织，和20个未经农杆菌感染未经筛选的20个成活玉米愈伤组织，分别在2mM草甘膦的筛选培养基和苯达松培养基（浓度为5mg/L）培养，10天后观察愈伤组织的生长情况。pcamb1300Corn-GlyR-450i-GT1-mkate-proinsulin-ter转化的玉米愈伤组织明显抗草甘膦（100%愈伤组织明显生长），但是78%在苯达松（5mg/L）培养基上死亡。相反，未经农杆菌感染转化的愈伤组织明显不抗草甘膦，但抗苯达松。
[0104] 最后，还需要注意的是，以上列举的仅是本发明的若干个具体实施例。显然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到的所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
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