技术领域
[0001] 本
发明属于
植物保护技术领域，具体涉及一种棘孢曲霉菌株及其应用，本发明与蔬菜土传病害
生物防治领域相关。
背景技术
[0002] 我国设施蔬菜产业发展迅速，2014年全国设施蔬菜面积超过380万hm2(5700万亩)，蔬菜生产方式得到进一步丰富，对于保障蔬菜周年供应和调整蔬菜品种结构意义重大。与露地栽培相比，设施栽培棚室湿度高、
轮作倒茬困难，为病虫害的发生流行提供了有利条件。设施地
土壤的次生盐渍化、
酸化，土壤养分失衡，土传病害严重，造成蔬菜产量下降、品质恶劣，严重制约了设施蔬菜生产的可持续发展。
[0003] 对设施蔬菜基地调查结果表明，猝倒病、立枯病、枯萎病、根腐病、黄萎病、青枯病、根结
线虫等土传病害呈加重趋势。目前，针对这些病害主要以
化学防治为主，但化学
农药的长期和过量使用会导致生态环境破坏、次要病害猖獗、蔬菜农药残留超标等问题，直接影响了设施蔬菜的产量和品质，
生物防治是一种环境友好且能够有效防治植物病害的方法，已成为继农业防治、化学防治之后的又一重要防治方法，并且有修复土壤
生物多样性的作用，极具开发潜
力。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于克服
现有技术存在的
缺陷，为了解决设施蔬菜土传病害化学防治中的环境安全问题，提供一种分离的棘孢曲霉菌株及其在土传病害防治中的应用。
[0005] 本发明的技术方案如下所述：
[0006]
申请人于2017年7月，在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖蔬菜基地土传病害发生严重的
地块，从设施蔬菜作物
根际土壤中分离筛选得到一种拮抗
真菌，申请人将该菌株命名为棘孢曲霉Aa19，Aspergillus aculeatus Aa19，于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2018648。
[0007] 棘孢曲霉Aa19的菌学特征：
[0008] 棘孢曲霉Aa19菌株在PDA培养基平板上生长迅速，28℃培养5d菌落直径达6cm，质地紧密，呈丝绒状，气生菌丝较多，中心下凹、四周突起、边缘平坦、中心呈黑色、边缘白色、背面平坦呈放射状，背面中心呈黄色四周白色，菌落表面有黑色干粉，无渗出液，顶囊初生时呈球形或
辐射状，后呈球形或椭圆形，直径50-65μm，孢梗茎无色或淡褐糙有刺突，直径约5μm，串生于小梗顶端，小梗
单层，全部表面可育。
[0009] 上述分离的棘孢曲霉Aa19菌株可在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用。
[0010] 本发明还提供了棘孢曲霉Aa19在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中应用的具体步骤，所述的步骤包括：
[0011] A.以豇豆枯萎病菌JWS-1作为指示菌
[0012] 用于检测豇豆枯萎病的指示菌为豇豆枯萎病菌(Fusarium oxysporum Schl.)JWS-1，保藏在中国典型培养物保藏中心，保藏编号为CCTCC NO：M 2014314；
[0013] B、棘孢曲霉Aa19的拮抗活性
稳定性的测定
[0014] 在PDA培养基平板上对保藏编号为CCTCC NO：M 2018648的棘孢曲霉Aa19进行了连续10代的继代培养，以豇豆枯萎病菌JWS-1为指示菌，采用平板对峙法测定棘孢曲霉Aa19拮抗活性的稳定性；
[0015] C、棘孢曲霉菌株Aa19孢子悬浮液活性的测定
[0016] 取培养好的棘孢曲霉Aa19斜面菌种，加入5mL无菌
水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10mL，即为10-1孢子悬液，血球计数法在
显微镜下检查孢子数，并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5，分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径，明确棘孢曲霉Aa19孢子悬浮液活性；
[0017] D、棘孢曲霉Aa19
发酵滤液活性的测定
[0018] 用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的棘孢曲霉Aa19菌丝，接种于50mL的PD培养基，180rpm/min、28℃恒温振荡培养5d，用四层无菌纱布过滤后，分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径，明确棘孢曲霉Aa19发酵滤液活性；
[0019] E、活体盆栽
[0020] 将
种子用55℃温水浸泡30min，清水清洗干净后
播种，当
幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子2.05×107cfu/mL豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，在接种病原菌7d后做如下处理：用棘孢曲霉Aa19发酵滤液(7.20×107cfu/mL)灌根8mL/株，以清水灌根8mL/株为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查(在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理)；
[0021] 每处理3次重复，每重复10株，按时统计幼苗发病情况，按病情分级(参照张衍荣等，2005年报道)，计算病情指数和防治效果，计算公式如下；
[0022]
[0023]
[0024] PDA培养基及制备方法：去皮
马铃薯200g，切成厚约2mm的片，加入1000mL蒸馏水煮沸30min，用4层纱布过滤，向滤液中加入
葡萄糖20g和琼脂20g，加热溶解后再补足蒸馏水至1000mL，自然pH，在121℃湿热
蒸汽下高压灭菌30min，之后在超净
工作台上倒平板，得到PDA培养基；
[0025] PD培养基及制备方法：称取200g马铃薯，洗净去皮切片，加水1000mL煮沸15min，纱布过滤后加蒸馏水补足至1000mL，再加12g葡萄糖，煮沸至固体充分溶解后分装到三
角瓶中，于121℃湿热蒸汽下高压灭菌20min，得到PD培养基。
[0026] 本发明具有以下有益效果：
[0027] 1、棘孢曲霉Aa19从设施蔬菜根际土壤分离获得，对蔬菜作物安全，且对豇豆枯萎病具有防治作用，可用于设施蔬菜土传病害的防治。
[0028] 2、棘孢曲霉Aa19稳定性好，防效较高，连续10代继代培养对豇豆枯萎病菌JWS-1抑菌效果稳定在68％以上，田间盆栽防效达到69.43％，适合设施蔬菜土传病害防治要求。
[0029] 3、棘孢曲霉Aa19防治设施蔬菜土传病害，使用方法简单，只需将菌株进行发酵培养，然后取发酵滤液对作物灌根即可，使用方便。
附图说明
[0030]
序列表SEQ ID NO:1是棘孢曲霉Aa19的18S rDNA序列。
[0031] 图1：棘孢曲霉Aa19菌落形态及分生孢子和分生孢子梗形态。
[0032] 图2：棘孢曲霉Aa19的18S rDNA-ITS系统发育树。
[0033] 图3：棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病的防治效果。附图标记说明：图3中的A为棘孢曲霉Aa19发酵滤液处理组；图3中的B为对照组(仅接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1)。
具体实施方式
[0035] A、土样的采集
[0036] 2017年7月在中国.湖北省.武汉市.武汉市农业科学院武湖基地土传病害发生严重的地块，采用5点取样法，取地下15-20cm处土样，采集设施蔬菜作物根际土壤，自然
风干后保存备用；
[0037] B、候选菌株的分离纯化
[0038] 称取5g土样倒入三角瓶中，加无菌水至50mL，28℃振荡30min后静置，即为10-1土壤悬液；再从上述溶液中取出1mL，加入9mL无菌水充分振荡制成10-2的土壤稀释液，吸取100μL稀释液涂于马丁氏培养基(配方：葡萄糖10g，蛋白胨5g，K2HPO4 1g，MgSO4·7H2O 0.5g，孟加拉红0.03g，琼脂20g，加蒸馏水定容至1L，自然pH，分装后121℃湿热蒸汽下高压灭菌30min)，使用时每mL培养基中加入30μg
链霉素以抑制放线菌生长，置于28℃
培养箱中培养，生长5天后挑取单菌落于培养基上，进行分离纯化，4℃保存备用；
[0039] C、候选菌株形态学观察
[0040] 将候选菌株接种到PDA培养基平板上，置于28℃恒温培养，观察菌落形态和
颜色，5d后制作玻片在
光学显微镜下观察分生孢子及分生孢子梗的形态特征。
[0041] 菌学特征：
[0042] 候选菌株在PDA培养基平板上，生长迅速，28℃培养5d菌落直径达6cm，质地紧密，呈丝绒状，气生菌丝较多，中心下凹、四周突起、边缘平坦、中心呈黑色、边缘白色、背面平坦呈放射状，背面中心呈黄色四周白色，菌落表面有黑色干粉，无渗出液，顶囊初生时呈球形或辐射状，后呈球形或椭圆形，直径50-65μm，孢梗茎无色或淡褐糙有刺突，直径约5μm，串生于小梗顶端，小梗单层，全部表面可育。
[0043] D、菌丝收集
[0044] 用接种针挑取少量候选菌株的菌丝，在无菌条件下接种至装有100mL PD培养基的三角瓶内，于28℃，180rpm/min下振荡培养4d，取10mL上述菌液至无菌离心管内，于13000rpm/min离心10min，弃上清收集菌丝备用。
[0045] E、基因组DNA的提取
[0046] 采用OMEGA HP Fugal DNA Kit
试剂盒提取候选菌株基因组DNA，利用通用引物ITS1/ITS4对候选菌株的18s rDNA的ITS
片段进行扩增(PCR为常规方法)，引物序列为ITS1：5’-TCCGTAGGTGAACCTGCGG-3’；ITS4：5’-TCCTCCGCTTATTGATATGC-3’(PCR方法为常用方法)。
[0047] F、测序
[0048] 采用1.0％琼脂糖凝胶法对扩增产物进行检测，并用紫外凝胶成像系统进行拍照保存，将PCR扩增得到的产物直接送武汉擎科创新生物技术有限公司进行测序。
[0049] G、分子鉴定
[0050] 将测序所得的序列在NCBI BlAST(https://blast.ncbi.nlm.nih.gov/Blast.cgi)
数据库中进行比对，确定待鉴定菌株(即候选菌株)的遗传来源，利用MEGA6.0.6
软件与已知菌种ITS序列作序列同源性比较，并对检索获得的同源性较近的菌株采用邻接法(Neighbor-Joining,NJ)构建系统发育树(Boot-strap＝1000，见图2)，分析亲缘关系和系统发育，结合
微生物形态分类鉴定，将分离株(即候选株)命名为棘孢曲霉Aa19，Aspergillus aculeatus Aa19，于2018年9月21日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心(CCTCC)保藏，保藏编号为CCTCC NO：M2018648。
[0051] 实施例2棘孢曲霉Aa19在防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病中的应用
[0052] 实施步骤如下所述：
[0053] A、棘孢曲霉Aa19菌株的稳定性测定
[0054] 在PDA培养基平板上对筛选得到的棘孢曲霉Aa19进行连续10代的继代培养，并每一代以豇豆枯萎病菌JWS-1(JWS-1于2014年7月3日送中国.武汉.武汉大学中国典型培养物保藏中心保藏，保藏编号为CCTCC NO：M 2014314，该菌株已获中国发明
专利授权，专利号为ZL 2014103340109，授权公告日为2016.02.17)为指示菌，利用平板对峙法测定棘孢曲霉Aa19拮抗活性的稳定性；
[0055] 结果表明，棘孢曲霉Aa19连续10代培养对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制率稳定在68％以上，结果见表1。
[0056] 表1棘孢曲霉Aa19的拮抗活性稳定性
[0057]
[0058]
[0059] B、棘孢曲霉Aa19菌株孢子悬浮液活性测定
[0060] 取培养好的棘孢曲霉Aa19斜面菌种，加入5mL无菌水，轻轻将琼脂表面的孢子刮下，将该孢子悬液移入20mL已灭菌的塑料管内，充分振荡混匀后，用无菌纱布过滤，并用无菌水冲洗滤渣2-3次，最终使滤液达到10mL，即为10-1孢子悬液，血球计数法在显微镜下检查孢子数，并将其依次稀释为10-2、10-3、10-4、10-5，分别吸取100μL稀释液涂于PDA培养基平板上，中央接豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径；
[0061] 结果表明，棘孢曲霉Aa19孢子悬液对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制作用随稀释倍数的增加而降低，由84.32％降至64.33％，在最低浓度时其抑制率均超过60％，具体数据见表2。
[0062] 表2棘孢曲霉Aa19孢子悬浮液活性
[0063]
[0064] C、棘孢曲霉Aa19菌株发酵滤液活性的测定
[0065] 用无菌接种环挑取一环在斜面上培养的棘孢曲霉Aa19菌丝，接种于50mL的PD培养基中，在180rpm/min，28℃恒温下振荡培养5d。用四层无菌纱布过滤后，分别取100μL均匀涂布在PDA培养基平板上，在平板的中央接种指示菌豇豆枯萎病菌JWS-1，以仅接豇豆枯萎病菌JWS-1为对照，每处理3次重复，28℃恒温培养5d，测量菌落直径。
[0066] 结果表明，棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病菌JWS-1的抑制率为70.75％，结果见表3。
[0067] 表3棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病菌的抑制作用
[0068]
[0069] D、棘孢曲霉Aa19活体盆栽试验
[0070] 将市购豇豆种子用55℃温水浸泡30min，清水清洗干净后播种，当幼苗长齐2片真叶时拔出，抖落根部土壤，用清水冲洗，得到干净根系，剪去根尖部分，浸入含孢子数为2.05×107cfu/mL豇豆枯萎病菌JWS-1菌液中30min，再移植到营养钵内，置于大棚内培养，在接种豇豆枯萎病菌JWS-1菌液7d后做如下处理：用棘孢曲霉Aa19发酵滤液(7.20×107cfu/mL)灌根8mL/株，以清水灌根8mL/株做为对照，7d后进行第1次调查，14d后进行第2次调查，在第1次调查结束后及时进行第2次灌根处理。
[0071] 每处理3次重复，每重复10株。按时统计幼苗发病情况，按病情分级(参照张衍荣等，2005年报道)，计算病情指数和防治效果，公式如下；
[0072] 豇豆枯萎病病情分级标准：(张衍荣等，2005年报道)
[0073] 0级：无症状；
[0074] 1级：胚轴或子叶出现轻微病症，但生长正常；
[0075] 3级：胚轴或子叶出现明显
坏死，或1片子叶黄化，影响生长；
[0076] 5级：2片子叶黄化，或1片子叶枯死；
[0077] 7级：2片子叶生长僵化，植株部分萎蔫或停止生长；
[0078] 9级：整株萎蔫、倒伏或枯死；
[0079]
[0080]
[0081] 采用浸根接种法测定棘孢曲霉Aa19发酵滤液(7.20×107cfu/mL)对豇豆枯萎病防效，结果表明，7d时对豇豆枯萎病的防治效果为100％，14d时为69.43％，具体数据见表4。
[0082] 表4棘孢曲霉Aa19发酵滤液对豇豆枯萎病的防效
[0083]
[0084]
[0085] 本实施例验证表明，本发明得到的棘孢曲霉Aa19具有较强的稳定性，较高的孢子悬浮液活性和发酵滤液的活性，防治设施蔬菜土传病害豇豆枯萎病具有积极效果。
