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具有对 植物病原体增强的抗性的植物以及用于在植物中产生增强的病原体抗性的方法

阅读：991发布：2020-05-14

专利汇可以提供具有对植物病原体增强的抗性的植物以及用于在植物中产生增强的病原体抗性的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及对植物病原体具有增强的抗性的植物，其中与野生型植物相比，在所述植物中肌醇焦磷酸盐 InsP7和/或InsP8的细胞内浓度是增加的。具体地，本发明涉及具有至少一种参与合成肌醇焦磷酸盐InsP7和/或InsP8的蛋白质 (例如蛋白质VIH2和VIH1)的增加的表达的植物。根据本发明的植物对以下植物病原体特别地有抗性：食草性昆虫，例如农业相关害虫的幼虫；致病真菌，如死体营养性真菌；或其他植物害虫，如活体营养性病原体。本发明还涉及用于增强对植物病原体的植物抗性的方法，其中与野生型植物相比，肌醇焦磷酸盐lnsP7和/或InsP8的细胞内浓度是增加的。，下面是具有对植物病原体增强的抗性的植物以及用于在植物中产生增强的病原体抗性的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.对植物病原体具有增强的抗性的植物，其中与野生型植物相比，肌醇焦磷酸盐InsP7和/或InsP8的细胞内浓度是增加的。
2.如权利要求1所述的植物，其具有至少一种参与合成肌醇焦磷酸盐InsP7和/或InsP8的蛋白质的可诱导的表达或增加的表达。
3.如权利要求1至2中任一项所述的植物，其中与野生型相比，由核苷酸序列2(GenBank登录号：At3g01310)编码的蛋白质VIH2或能够合成肌醇焦磷酸盐InsP7和/或InsP8的同源蛋白质的表达和/或活性在整个植物或在特定组织中是可诱导的或增加的。
4.如权利要求1至2中任一项所述的植物，其中与野生型相比，由核苷酸序列1(GenBank登录号：At5g15070)编码的蛋白质VIH1或能够合成肌醇焦磷酸盐InsP7和/或InsP8的同源蛋白质的表达和/或活性在整个植物或在特定组织中是可诱导的或增加的。
5.如权利要求3至4中任一项所述的植物，其中所述核苷酸序列1或所述核苷酸序列2来源于相同的植物物种或不同的生物体。
6.如权利要求3至5中任一项所述的植物，其中所述核苷酸序列1或所述核苷酸序列2在诱导型启动子的控制下。
7.如权利要求3至6中任一项所述的植物，其中所述核苷酸序列1或所述核苷酸序列2在组成型启动子的转录控制下。
8.如权利要求7所述的植物，其中所述启动子是组织特异性的，例如叶特异性的、果实特异性的或种子特异性的。
9.如权利要求1至8中任一项所述的植物，其中所述植物病原体是食草性昆虫，例如农业相关害虫诸如小白菜白蛾或夜蛾的幼虫；或致病真菌，诸如死体营养性真菌，例如链格孢属(Alternaria)或葡萄孢属(Botrytis)的代表；或其它植物害虫，包括活体营养性病原体。
10.增强对植物病原体的植物抗性的方法，其中与野生型植物相比，肌醇焦磷酸盐InsP7和/或InsP8的细胞内浓度是增加的。
11.如权利要求10所述的方法，其中用InsP7、InsP8和/或用InsP7或InsP8的衍生物处理所述植物，例如以喷洒、喷雾等形式。
12.如权利要求11所述的方法，其中所述衍生物是可透过膜的酯。

说明书全文

具有对 植物病原体增强的抗性的植物以及用于在植物中产生

增强的病原体抗性的方法

[0001] 描述

[0002] 本发明涉及对植物病原体具有增强的抗性的植物以及通过影响肌醇焦磷酸盐，特别是InsP8，的细胞内浓度来在植物中产生增强的病原体抗性的方法。

[0003] 植物经常暴露于植物病原体。具体为食草性昆虫及其幼虫，以及真菌和真菌样病原体(例如卵菌纲)。保守估计提出，由葡萄孢属(Botrytis)物种单独造成的农艺损害估计约为十亿/年1。产生的损害不仅由直接的产量损失引起，而且还由产品质量的损失(例如由真菌毒素的富集)引起。

[0004] 用于防治昆虫和真菌病原体的常规方法是使用化学的植物保护产品。然而，这些措施往往导致部分产量的损失。在作物中使用化学的植物保护产品可能对人类和环境具有负面影响。此外，这些措施是非常成本密集型和劳动密集型的。此外，用化学的植物保护产品消灭的病原体经常发展适应机制，使得这些措施往往达不到期望的保护效果。

[0005] 使用化学试剂的替代方法是使用昆虫和真菌抗性品种。因为植物基因组的复杂性，使用常规植物育种的新品种的育种是非常枯燥和困难的；常规植物培养通常使用自发突变或诱导突变，其表现不受外部因素(例如冷休克或放射性照射)的影响。

[0006] 常规育种的替代方法是生产转基因植物。将具有期望性质的基因特异地引入植物的基因组中。目前，特别是抗除草剂和抗虫植物作为转基因植物销售。新一代品种的目标是在不利条件(如干旱胁迫或昆虫侵袭)下的产量增加。

[0007] 目前正在种植的主要是具有抗虫性的转基因玉米和棉花植物。在大多数情况下，该属性来自Bt毒素，Bt毒素由引入植物的基因编码。该基因来源于土壤细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)，其天然产生这种活性成分。然而，这一策略的一个问题是第一抗性已经在植物病原体中发展。

[0008] 此外，许多科学论文已经表明Bt玉米会伤害蝴蝶并危及许多其他非目标生物体。Bt毒素仅缓慢降解，积累在土壤中，并在食物链中传播。类似于Bt毒素在生物植物保护中的使用以及对蚊子的控制，Bt玉米的种植因此对生物多样性带来了广泛的风险。

[0009] 因此，本发明的目标是提供对植物病原体具有提高的抗性的植物及其制备方法，其不具有现有技术已知的活性物质的长期毒性的缺点，例如，通过积累在土壤中。此外，通过分别提供此类植物和方法，应扩大针对病原体的可能措施的范围，从而最小化抗性发展的可能性。

[0010] 该目标通过提供与野生型植物相比，其中肌醇焦磷酸盐InsP7和/或InsPe8的细胞内浓度增加的植物来实现。

[0011] 在动物系统中，肌醇焦磷酸盐已被描述为重要的细胞内信号转导分子。在本发明中，首次显示蛋白质VIH2和VIH1抑制肌醇焦磷酸盐InsP6和InsP7的磷酸化，并且在拟南芥(Arabidopsis)幼苗中的VIH2主要负责合成肌醇焦磷酸盐InsP8。VIH2转录物主要在不同的营养组织中表达，并通过机械损伤以及毛虫侵染诱导，而VIH1转录物主要在花粉中积累。

[0012] 在本发明中，显示VIH2(GenBank登录号：At3g01310)参与植物中病原体防御(参见实施例)。

[0013] 具体地，通过提供具有至少一种参与合成肌醇焦磷酸盐，特别是InsP8，的蛋白质的可诱导的表达或提高的表达的植物来实现本发明的目标。

[0014] 本发明的一实施方案是这样的植物，其中由核苷酸序列2(GenBank登录号：At3g01310)编码的蛋白质VIH2或能够合成肌醇焦磷酸盐，特别是InsP8，的同源蛋白质的表达和/或活性，与野生型植物相比，在整个植物或特定组织中是可诱导的或增加的。

[0015] 在本发明的另一实施方案中，植物是其中由核苷酸序列1(GenBank登录号：At5g15070)编码的蛋白质VIH1或能够合成肌醇焦磷酸盐，特别是InsP8，的同源蛋白质的表达和/或活性，与野生型植物相比，在整个植物或特定组织中是可诱导的或增加的植物。

[0016] 核苷酸序列1或核苷酸序列2可以来源于一种植物物种，即是同源表达的，或来源于自另一种生物体，即是异源表达的。异源表达可能是有利的，因为宿主生物体中的转录后或翻译后调节机制(例如由于过度产生导致酶的失活)可以被频繁地规避。

[0017] VIH2、VIH1或其同源蛋白的可诱导性可以通过本领域技术人员已知的方法来实现。例如，相应的核苷酸序列的表达可以在目标植物中的诱导型启动子的控制下实现。已经在拟南芥、烟草、水稻或玉米中成功使用的已知的诱导型表达系统通常由两个组分组成：组成型或组织特异性表达的(通常是嵌合的)转录因子和控制期望的核苷酸序列表达的实际启动子。这种启动子可以通过外部刺激被嵌合转录因子活化。已知的实例是乙醇诱导型(“AlcR/AlcA”系统)、地塞米松诱导型(GR-融合体、GVG系统和pOp/LhGR系统)、β-雌二醇诱导型(XVE/OlexA系统)和热休克诱导型表达系统。

[0018] 对于诱导表达，也可以使用天然存在于目标植物中的启动子，例如由病原体诱导的启动子。已知的实例是例如调节在茉莉酮酸酯代谢中重要的并存在于所有高等植物中的JAZ(“茉莉酮酸酯ZIM结构域”)蛋白的转录物的表达的启动子。

[0019] VIH2、VIH1或其同源蛋白的增加的表达(过表达)可以通过本领域技术人员已知的方法实现。因此，相应的核苷酸序列的表达可以在组成型启动子(例如花椰菜花叶病毒启动子CaMV 35S或泛素(UBQ)启动子)的转录控制下进行。也可以使用组织特异性启动子，其是例如仅在可能被病原体感染的组织中表达，如叶特异性启动子、果实特异性启动子或种子特异性启动子。

[0020] 本发明还涉及用于增强针对植物病原体的植物抗性的方法，其中与野生型植物相比，肌醇焦磷酸盐InsP7和/或InsP8的细胞内浓度是被调节的或增加的。

[0021] 具体地，肌醇焦磷酸盐InsP7和/或InsP8的细胞内浓度可以通过VIH2、VIH1或它们的同源蛋白的诱导型表达或组成型表达和/或活性来实现。

[0022] 在替代的实施方案中，通过用InsP7的底物(InsP8的前体)、用InsP8和/或用InsP7或InsP8的衍生物处理(例如以喷雾、喷洒等形式)植物来增加肌醇焦磷酸盐InsP7和/或InsP8的细胞内浓度。在这种情况下，可透过膜的酯是特别有意义的，例如为信使InsP3的外源性应用的开发的那些可透过膜的酯2。在这种情况下，利用在细胞中天然存在的酯酶活性，其在衍生物摄取后导致活性肌醇磷酸盐或肌醇焦磷酸盐的释放。

[0023] 根据本发明的植物所抵抗的植物病原体具体为食草性昆虫，例如农业相关害虫的幼虫，农业相关害虫如小白菜白蛾或夜蛾；以及病原性真菌，诸如死体营养性真菌(necrotrophic fungi)，例如链格孢属(Alternaria)或葡萄孢属(Botrytis)的代表。

[0024] 与现有技术已知的方法(例如，植物中来自细菌苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)的Bt毒素的表达)相比，本发明的优点是在本发明的植物中，可有利地利用内源性机制用于增强对植物病原体和环境胁迫的抗性。由于这需要使用原始植物基因而不是外来物种基因和物质，可以假定此类植物在公众中的接受度比常规转基因植物的情况更好。此外，预料根据本发明的植物的农业使用将不会对非目标生物体和环境具有严重影响，诸如使用常规杀虫剂或培育Bt植物的影响。也可以假定与用于生产抗性植物的常规方法相反，害虫的抗性形成发生得更慢，因为针对病原体的整个植物防御机制是由肌醇焦磷酸盐而不仅仅是个别毒素引起的。

[0025] 根据参阅附图的下面描述的示例性实施方案，在下文中描述了本发明的进一步的优势、特征和可能的应用。

[0026] 图1.拟南芥VIH2功能缺失突变体对小白菜白蛾(菜粉蝶(Pieris rapae))的幼虫显示出降低的抗性。在所谓的“无选择”分析中研究幼虫发育。在该分析中，将幼虫阶段L1中的一只单一毛虫置于指定基因型的单株5周龄的植物上，并使用纱布防止其逸出。Col-0表示使用的野生型拟南芥(Arabidopsis thaliana)(拟南芥(thale cress))生态型，vih2-3和vih2-4是在Col-0背景中VIH2功能缺失突变体。7天后确定毛虫的鲜重。值表示平均值(±标准误差)(n＝20)。统计学显著性差异由星号(t检验；*p<0.02)表示。

[0027] 图2.拟南芥VIH2功能丧失突变体对夜蛾甘蓝夜蛾(Mamestra brassicae)(圆白菜蛾)幼虫显示出降低的抗性。在所谓的“无选择”分析中研究幼虫发育。在该分析中，将幼虫阶段L1中的一只单一毛虫置于指定基因型的单株5周龄的植物上，并使用纱布防止其逸出。Col-0表示使用的野生型拟南芥(拟南芥)生态型，vih2-4是在Col-0背景中VIH2功能缺失突变体。8天后确定毛虫的鲜重。值表示平均值(±标准误差)(n＝20)。统计学显著性差异由星号(t检验；*p<0.02)表示。

[0028] 图3.拟南芥VIH2过表达系对夜蛾甘蓝夜蛾(圆白菜蛾)幼虫显示出增强的抗性。在所谓的“无选择”分析中研究幼虫发育。在该分析中，将幼虫阶段L1中的一只单一毛虫置于指定基因型的单株5周龄的植物上，并使用纱布防止其逸出。Col-0表示使用的野生型拟南芥(拟南芥)生态型，“CaMV 35S：VIH2”是转基因植物，其中野生型VIH2基因的激酶结构域在强病毒CaMV 35S启动子的控制下是过表达的。8天后确定毛虫的鲜重。值表示平均值(±标准误差)(n＝20)。统计学显著性差异由星号(t检验；*p<0.05)表示。这些实验显示VIH2的表达增加(与肌醇焦磷酸盐InsP8的增加有关)导致植物对食草性昆虫害虫的增强的抗性。害虫在转基因植物上的生长(和近似害虫诱发的损害)减少约30％。肌醇焦磷酸盐的增加没有“不良”的副作用：植物健康，正常发育和繁殖。

[0029] 图4.在拟南芥中，VIH2的过表达导致对死体营养性子囊菌甘蓝链格孢菌(Alternaria brassicicola)增强的抗性，然而VIH2功能缺失突变体显示出降低的抗性。如前所述进行用甘蓝链格孢菌(分离株MUCL20297)的感染实验3。为此，将孢子调节至5×105个孢子/ml的密度，将四至六滴5μl孢子悬浮液滴加到叶表面，并将植物在100％的湿度，22℃和8小时/16小时光/黑暗节律中培育7-10天(植株数≥15)。随后，将疾病症状记录在案，并将其分为不同等级的每种叶损害表型。等级如下。I级(横条纹)：感染部位的浅棕色斑点；II级(斜条纹)：感染部位的深棕色斑点和坏死的第一迹象；III级(全黑)：进行性坏死和叶片浸解。通过卡方检验评估数据的分布，并显示Col-0和vih2-3之间、Col-0和vih2-4之间以及Col-0和CaMV 35S：VIH2之间的差异是显著的(p<0.05)。vih2-3和vih2-4是VIH2功能缺失突变体，CaMV 35S：VIH2是其中野生型VIH2基因的激酶结构域在强的病毒CaMV 35S启动子的控制下被过表达的转基因植物。这些实验表明，VIH2表达的增加(与肌醇焦磷酸盐InsP8的增加相关)导致植物针对死体营养性真菌的增强的抗性，因为对此类植物的真菌诱导型损伤是显著降低的。

[0030] 图5.拟南芥VIH2功能缺失突变体显示出对死体营养性真菌和灰霉病成因剂灰葡萄孢菌(Botrytis cinerea)的降低的抗性。将5μL大滴的灰葡萄孢菌的分生孢子(孢子)悬浮液吸移到5周龄植物的叶表面上。这是针对指定基因型的每株植物5个生长的叶子和总共20个植物进行的。只使用比各个植物的第4叶更年轻的叶子。此后，将接种的植物在21℃的气候室中，在10小时/14小时光/黑暗节律中，在100％湿度下培育3天。随后，根据病变的大小和发生时间，记录疾病症状并分为不同的等级。等级如下：I级(横条纹)：直径2mm的病变；
II级(全黑)：伴有褪绿病的直径2mm的病变；III级(斜条纹)：伴有褪绿病的直径2-4mm的病变；IV级(竖条纹)：有直径≥4毫米和褪绿病的病变。采用卡方检验进行数据的分布，并显示Col-0和vih2-3之间以及Col-0和vih2-4之间的差异是显著的(p<0.001)。如前所述制备用于这些实验的分生孢子悬浮液4。为此，将灰葡萄孢菌的分生孢子从甘油储备液接种到半浓TM
缩马铃薯葡萄糖肉汤固体培养基(PDB，Difco )上，并在22℃，在10小时/14小时光/黑暗节律下培育2周。随后，用半浓缩PDB液体培养基从固体培养基表面洗涤分生孢子，通过玻璃棉过滤，并用计数室测定分生孢子密度。将悬浮液在半浓缩的PDB-液体培养基中调节至5×
105个分生孢子/ml的密度，在室温下培育2小时，并用于叶接种。实验重复3次，结果相似。

[0031] 示例性实施方案

[0032] 用相同生态型(拟南芥，Col-0)的同基因系进行实验，其以完整VIH2基因(和因此VIH2蛋白)的存在(Col-0)和不存在(vih2-3和vih2-4)为特征，或以VIH2激酶结构域的增加的表达(CaMV 35S：VIH2)为特征。在后一植物(CaMV 35S：VIH2)中，野生型VIH2基因的激酶结构域处于强病毒CaMV 35S启动子的控制下。为此，通过拟南芥cDNA扩增VIH2激酶序列，并插入到载体pENTRTM/ (Invitrogen Life Technologies)中。从那里，VIH2激酶结构域序列由 LRConaseTM II(Invitrogen Life Technologies)转移到二元植物转化载体pGWB441(Nakagawa等人，2007，Biosci.Biotechnol.Biochem，71,2095-2100)中。由此产生的载体“pGWB441-VIH2 KD”用于拟南芥植物的转化。在卡那霉素上选择几个独立的转化体，建立不再分离的CaMV 35S：VIH2 T3植物，并在这些植物中证实了增加的InsP8生物合成。图3和图4显示了这些系的一个的实验的实例，证明VIH2激酶结构域的增加的表达(并伴随着增加的InsP8的产生)导致对食草性昆虫甘蓝夜蛾(圆白菜蛾，图3)的幼虫以及针对死体营养性真菌甘蓝链格孢菌(图4)的增强的抗性。使用的VIH2功能缺失植物(vih2-3和vih2-4)来源于如下公开可取得的种子库：来自“索尔克研究所基因组分析实验室(Salk Institute Genomic Analysis Laboratory)”(USA)的拟南芥Col-0(基因组完全测序的Columbia-0，CS60000)；来自先正达拟南芥插入物库(Syngenta Arabidopsis Insertion Library(SAIL))收集的vih2-3(SAIL_165_F12)。这一品系通过“俄亥俄州立大学(Ohio State University)”的“拟南芥生物研究中心(Arabidopsis Biological Research Center”(ABRC)(USA)提供给我们；vih2-4(GK-080A07)来源于比勒费尔德大学(university Bielefeld)的“生物体系中植物基因组分析(Genomanalyse im biologischen System Pflanze)(GABI-KAT)”收集。在两种情况下(SAIL和GABI-KAT)，通过借助农杆菌转化含有特异性T-DNA的载体来转化拟南芥Col-0植物。T-DNA大部分非定向地整合到基因组中，并且根据基因组位点可导致受影响基因的破坏(并因此导致由该基因编码的蛋白质的缺失)。借助于T-DNA特异性寡核苷酸，在相应的库中对多个此类植物进行测序以确定特定植物中的插入位点和因此受影响基因的身份。相应的数据可在线获得，以便能够鉴定所期望蛋白质的潜在的功能缺失突变体。这种迂回路线(非定向插入和随后的基因分型)是必需的，因为在较高等的植物中，通过同源重组原理(与例如面包酵母或小鼠相反)的靶向生产的“敲除”植物是非常无效的。

[0033] 示例性实施方案指出VIH2功能缺失突变体对食草性昆虫和死体营养性真菌具有降低的抗性(图1、图2、图4和图5)，而VIH2激酶结构域的增加的表达(和因此增加InsP8的产生)导致对食草性昆虫和死体营养性真菌增强的抗性(图3和图4)。

[0034] 参考文献

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