锈病抗性基因

阅读:528发布:2020-05-15

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1.一种包含编码多肽的外源多核苷酸的重组细胞,所述多肽的特征为以下一个或多个或全部:
i)在植物中表达时,所述多肽赋予所述植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,优先地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性,ii)在细胞内表达时,所述多肽在转运葡萄糖通过所述细胞膜时不如包含SEQ ID NO:4中所提供的序列的基酸的多肽有效,
iii)当在所述细胞内表达时,所述多肽作为糖转运蛋白有效,
iv)所述多肽包含具有SEQ ID NO:1中所提供的序列或与SEQ ID NO:1至少40%同一性的氨基酸序列或其生物活性片段的氨基酸,和
v)所述多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置不包含甘氨酸,优选地地所述多肽在对应于所述SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置包含除了甘氨酸的氨基酸,其中所述多核苷酸可操作地连接到能在所述细胞中引导所述多核苷酸表达的启动子。
2.如权利要求1所述的细胞,其中所述一个或多个活体营养性真菌病原是锈病或霉病或锈病和霉病两者,优选地其中所述一个或多个活体营养性真菌病原是小麦白粉菌、禾谷镰刀菌、小麦根腐病菌、白粉病菌、小麦杆锈菌、小麦条锈菌、大麦柄锈菌和小麦柄锈菌。
3.如权利要求1或权利要求2所述的细胞,其是植物细胞或酵母细胞。
4.如权利要求3所述的细胞,其中所述植物细胞是谷类植物细胞如小麦植物细胞。
5.如权利要求4所述的细胞,其中所述启动子引导叶细胞和/或茎细胞中的基因表达。
6.根据权利要求1至5中任一项所述的细胞,其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置包含氨基酸,且其中所述氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸和组氨酸所组成的组。
7.根据权利要求1至6中任一项所述的细胞,其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号387的位置不包含缬氨酸,优选地所述多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号387的位置包含除了缬氨酸的氨基酸。
8.根据权利要求7所述的细胞,其中所述多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号387的位置包含氨基酸,且其中所述氨基酸选自由亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸、丙氨酸和苯丙氨酸所组成的组。
9.根据权利要求1至8中任一项所述的细胞,其中将所述外源多核苷酸整合入所述细胞的基因组中。
10.根据权利要求1至9中任一项所述的细胞,其中所述多肽包含具有SEQ ID NO:1中所提供的序列或与SEQ ID NO:1至少80%同一性、至少90%同一性或至少95%同一性的氨基酸序列或其生物活性片段的氨基酸。
11.根据权利要求1至10中任一项所述的细胞,其中所述多肽包含12个跨膜结构域。
12.一种包括根据权利要求1至11中任一项所述的细胞的转基因植物,其中所述转基因植物是外源多核苷酸转基因。
13.如权利要求12所述的转基因植物,相较于缺乏所述外源多核苷酸的等基因植物,其对一个或多个活体营养性真菌病原抗性增强,优选地对锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部的抗性增强。
14.如权利要求12或权利要求13所述的转基因植物,其在生长幼苗期对一个或多个活体营养性真菌病原抗性增强。
15.如根据权利要求12至14中任一项所述的转基因植物,其包含一个或多个编码除了Lr67多肽的植物病原抗性多肽的其它外源多核苷酸,优选地Lr34多肽、Sr33多肽或Sr35多肽。
16.根据权利要求12至15中任一项所述的转基因植物,其是谷类植物如小麦植物。
17.根据权利要求12至16中任一项所述的转基因植物,其对于所述外源多核苷酸是纯合的。
18.根据权利要求12至17中任一项所述的转基因植物,其在田地里生长。
19.根据权利要求12至18中任一项所述的至少100个植物的群体,其在田地里生长。
20.一种用于确定多肽是否赋予对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性或易感性的方法,所述真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部的抗性或敏感性,其包括:
i)获取可操作性连接到启动子的多核苷酸,所述多核苷酸编码所述多肽,其中所述多肽包含具有SEQ ID NO:1中所提供的序列或与一个SEQ ID NO:1至少40%同一性的氨基酸序列的氨基酸,或其生物活性片段,
ii)将所述多核苷酸引入到植物,
iii)确定对所述一个或多个活体营养性真菌病原的抗性或易感性的程度,所述真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地确定对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部的抗性或敏感性的程度,相对于缺乏所述多核苷酸的等基因植物是增加或减少,以及
iv)任选地,如果抗性平或易感性水平增加,则选择编码所述多肽的多核苷酸,所述多肽表达时会赋予对所述一个或多个活体营养性真菌病原的抗性或易感性,所述真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部的抗性或敏感性。
21.如权利要求20所述的方法,其中下列一个或多个适用,
a)所述多核苷酸包含具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中所提供的序列、与SEQ ID NO:
2和SEQ ID NO:3中任一个或两个至少40%同一性的序列、或与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中一个或两个杂交的序列的核苷酸。
b)所述植物是谷类植物如小麦植物,
c)所述多肽是植物多肽或其突变体,以及
d)步骤ii)进一步包括将可操作性连接到启动子的多核苷酸稳定整合入所述植物的基因组
e)所述多肽的特征为权利要求2至11所限定的特征的一个或多个。
22.一种基本上纯化和/或重组的多肽,其特征为以下一个或多个或全部:
i)在植物中表达时,所述多肽赋予所述植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,所述真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性,
ii)在细胞内表达时,所述多肽在转运葡萄糖通过细胞膜时不如包含SEQ ID NO:4中所提供的序列的氨基酸的多肽有效,
iii)当在所述细胞内表达时,所述多肽作为糖转运蛋白有效,
iv)所述多肽包含具有SEQ ID NO:1中所提供序列的氨基酸或具有与SEQ ID NO:1至少
40%同一性的氨基酸序列,或其生物活性片段,以及
v)所述多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置不包含甘氨酸,优选地所述多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置包含除了甘氨酸的氨基酸。
23.如权利要求22中所述的多肽,其包含具有SEQ ID NO:1中所提供的序列或与SEQ ID NO:1至少80%同一性、至少90%同一性或至少95%同一性的氨基酸序列或其生物活性片段的氨基酸。
24.如权利要求22或权利要求23所述的多肽,其是包含至少一个其它多肽序列的融合蛋白。
25.一种分离的和/或外源性多核苷酸,其包含具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中所提供的序列、与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个或两个至少40%同一性的序列、编码根据权利要求22至24中任一项所述的多肽的序列、或与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中一个或两个杂交的序列的核苷酸。
26.一种嵌合载体,其包含如权利要求25所述的多核苷酸。
27.如权利要求26所述的载体,其中所述多核苷酸可操作地连接到启动子。
28.一种重组细胞,其包括权利要求25所述的外源性多核苷酸,和/或权利要求26或权利要求27所述的载体。
29.如权利要求28所述的细胞,其是植物细胞。
30.如权利要求29所述的细胞,其中所述的植物细胞是谷类植物细胞如小麦细胞。
31.一种生产根据权利要求22至24中任一项所述的多肽的方法,所述方法包括在细胞表达系统或无细胞表达系统中表达权利要求25所述的多核苷酸。
32.一种生产根据权利要求1至11或28至30中任一项所述的细胞的方法,所述方法包括将权利要求25所述的多核苷酸或权利要求26或权利要求27所述的载体引入到细胞的步骤。
33.一种生产根据权利要求12至18中任一项所述的转基因植物的方法,所述方法包括以下步骤
i)将权利要求25中所限定的多核苷酸和/或权利要求27所述的载体引入到植物的细胞,
ii)使转基因植物从所述细胞再生,以及
iii)任选地从所述植物中收获种子,和/或
iv)任选地从所述转基因植物中生产一个或多个子代植物,从而生产所述转基因植物。
34.一种生产植物的方法,其已经将编码根据权利要求22至24中任一项的多肽的多核苷酸整合至其基因组,所述方法包括以下步骤
i)将两亲本植物杂交,其中至少一个植物包括编码所述多肽的多核苷酸,ii)筛选来自所述杂交的一个或多个子代植物存在或不存在所述多核苷酸,以及iii)选择包含所述多核苷酸的子代植物,
从而生产所述植物。
35.如权利要求34所述的方法,其中所述多肽包含具有SEQ ID NO:1中所提供的序列或与SEQ ID NO:1至少40%同一性的氨基酸序列、或其生物活性片段的氨基酸,以及其中当在所述植物中表达时,所述多肽赋予所述植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,所述真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性。
36.如权利要求34或权利要求35所述的方法,其中所述亲本植物中至少有一个是四倍体或六倍体小麦植物。
37.根据权利要求34至36中任一项所述的方法,其中步骤ii)包括分析来自所述植物含有DNA的样品中的所述多核苷酸。
38.根据权利要求34至37中任一项所述的方法,其中步骤iii)包括
i)选择所述多核苷酸纯合的子代植物,和/或
ii)分析所述植物或其一个或多个子代植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,所述真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优先地分析对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性。
39.根据权利要求34至38中任一项所述的方法,其进一步包括
iv)将步骤i)所述的杂交子代和与缺乏编码所述多肽的多核苷酸的第一个亲本植物具有相同基因型的植物进行回交足够数量的次数以生产具有大多数所述第一亲本的基因型但包含所述多核苷酸的植物,以及
iv)选择已经对一个或多个活体营养性真菌病原具有抗性的子代植物,所述真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部具有抗性。
40.根据权利要求33至39中任一项所述的方法,其中所述方法进一步包括分析所述植物至少一个其它遗传标记的步骤。
41.一种使用根据权利要求33至40中任一项所述的方法生产的植物。
42.如权利要求25所述的多核苷酸或权利要求26或权利要求27所述的载体生产重组细胞和/或转基因植物的用途。
43.如权利要求42所述的用途,其中相较于缺乏所述外源多核苷酸和/或载体的等基因植物,所述转基因植物对一个或多个活体营养性真菌病原具有增强的抗性,所述真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部具有增强的抗性。
44.一种用于鉴定包括编码根据权利要求22至24中任一项的多肽的多核苷酸的植物的方法,所述方法包括以下步骤
i)从一种植物中获取核酸样品,以及
ii)筛选所述样品存在或不存在所述多核苷酸。
45.如权利要求44所述的方法,其中相较于缺乏所述外源多核苷酸的等基因植物,所述多核苷酸的存在表明所述植物对一个或多个活体营养性真菌病原具有增强的抗性,所述真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部具有增强的抗性。
46.如权利要求44或权利要求45所述的方法,其鉴定根据权利要求12至18中任一项所述的转基因植物。
47.根据权利要求44至46中任一项所述的方法,其进一步包括步骤i)前从种子生产植物。
48.根据权利要求12至18、或41中任一项所述的植物的植物部分。
49.如权利要求48所述的植物部分,其是包括编码根据权利要求22至24中任一项所述的多肽的外源性多核苷酸的种子。
50.一种生产植物部分的方法,所述方法包括,
a)种植根据权利要求12至18、或41中任一项所述的植物,以及
b)收获所述植物部分。
51.一种生产从种子获取的面粉、全麦粉、淀粉或其它产品的方法,所述方法包括;
a)获取如权利要求49的种子,以及
b)提取所述面粉、全麦粉、淀粉或其它产品。
52.一种从如权利要求12至18、或41中任一项所述的植物和/或如权利要求48或权利要求49所述的植物部分生产的产品。
53.如权利要求52所述的产品,其中所述部分是种子。
54.如权利要求52或权利要求53所述的产品,其中所述产品是食物产品或饮料产品。
55.如权利要求54所述的产品,其中
i)所述食物产品选自由面粉、淀粉、发酵的或未经发酵的面包、意大利面、面条、动物饲料、早餐谷物、休闲食物、糕点、麦芽酒、啤酒、糕饼和含面粉酱料的食物所组成的组,或ii)所述饮料产品是啤酒或麦芽酒。
56.如权利要求52或权利要求53所述的产品,其中所述产品是非食物产品。
57.一种制备如权利要求54或权利要求55所述的食物产品的方法,所述方法包括将种子或来自所述种子的面粉、全麦粉或淀粉与另一种食物成分相混合。
58.一种制备麦芽酒的方法,其包括使如权利要求49所述的种子发芽的步骤。
59.根据权利要求12至18或41中任一项所述的植物或其部分作为动物饲料、或生产用于动物食用的饲料或用于人类食用的食物的用途。
60.一种组合物,包含根据权利要求22至24中任一项所述的多肽中的一个或多个、如权利要求25所述的多核苷酸、如权利要求26或权利要求27所述的载体、或根据权利要求1至11或28至30中任一项所述的重组细胞、以及一个或多个可接受载剂。
61.一种鉴定化合物的方法,所述化合物结合到包含具有SEQ ID NO:1中所提供的序列或与SEQ ID NO:1至少40%同一性的氨基酸序列、其生物活性片段的氨基酸的多肽,所述方法包括:
i)将所述多肽与候选化合物接触,以及
ii)确定所述化合物是否结合到所述多肽。
62.如权利要求61所述的方法,其中所述多肽嵌在细胞膜中,优选地嵌在所述植物细胞膜中。
63.一种鉴定化合物的方法,所述化合物由包含具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中所提供的序列或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的一个或两个至少40%同一性的氨基酸序列,或其生物活性片段的氨基酸的多肽转运通过细胞膜,所述方法包括:
i)将所述嵌在细胞膜中的多肽与候选化合物接触,所述细胞膜优选地为植物细胞膜,ii)确定所述化合物是否通过所述多肽从所述膜的一侧转运到另一侧。

说明书全文

锈病抗性基因

技术领域

[0001] 本发明涉及用于赋予植物对一个或多个活体营养性病原真菌抗性的新型转运多肽及其编码基因。

背景技术

[0002] 已经鉴定多种赋予病原抗性的基因,并将其用于植物育种。然而,由于病原体新毒性品种的出现,植物中单基因病原抗性往往变得无效。相反,植物持久的抗病性一般被认为是由多基因控制的。一些锈病抗性基因已经从小麦(Feuillet等,2003;Huang等,2003;Cloutier等,2007)及其它谷物(Collins等,1999;Brueggeman等,2002)中分离和克隆出,且这些基因主要来自重要抗性(R)基因的核苷酸结合位点-富亮酸重复(NB-LRR)类别。例如,可防御小麦叶锈病真菌,小麦叶锈菌(Puccinia triticina),的三个小麦R基因(Lr1,Lr10和Lr21)已经被克隆(Somers等,2004;Hayden等,2008;Manly等,2001)。一个例外是编码蛋白激酶的大麦Rpg1锈病抗性基因。这些基因编码基因对基因对单个病原的抗性,且一般导致植物组织对感染的强烈的过敏性反应。
[0003] 相反,小麦(Triticum aestivum L.)锈病抗性基因如Lr34,位于染色体壁7DS,赋予广谱和持久的成熟的植物对包括子囊菌纲和担子菌纲真菌的数个专性活体营养性病原的抗性。这些包括叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病,且因此Lr34基因已经在小麦育种中广泛使用,虽然它具有较弱、非过敏性反应表型(Dyck,1977和1987;German和Kolmer,1992;Bossolini等,2006;Spielmeyer等,2008)。具有抗性位点Lr34的栽培品种如Frontana已经具有对叶锈病真菌小麦叶锈菌埃里克(Puccinia triticina Eriks)的有效并持久的抗性(Dyck等,1966;Singh和Rajaram,1994)。迄今为止,尚未检测出小麦叶锈病(P.triticina)的分离菌具有Lr34的完整毒(Kolmer等,2003)。最近Lr34基因被克隆并被显示编码ABC转运蛋白家族中的蛋白(Krattinger等,2009),虽然并没有证明该基因作为转运蛋白的功能。
Lr34抗性在遗传学度仍然同赋予对条锈病抗性的命名为Yr18的基因(小麦条锈菌(P.striiformis))不可分离(Singh,1992;McIntosh,1992)。已经记录Lr34/Yr18与其它特性共分离,如成熟植物阶段叶片尖端坏死(Ltn1),白粉病(最近定名为Pm38),对大麦黄矮病毒(Bdv1)和斑枯病(麦根腐病菌(Bipolaris sorokiniana))耐受((Singh,1992a,b;
McIntosh,1992;Joshi等,2004;Spielmeyer等,2005;Liang等,2006)),且这些表型被认为全部由Lr34抗性多肽多赋予的。
[0004] 赋予广谱、成熟的植物对数个专性活体营养性病原的抗性的第二个基因Lr67,位于小麦染色体4DL,且在一些小麦新增品种如RL6077中被发现(Herrera-Foessel等,2011)。与Lr34相反,Lr67基因尚未广泛用于生产抗性栽培品种来进行商品化小麦生产。虽然基于植物表型的最初报告(Dyck等,(1994)显示RL6077的抗性基因可能是易位的Lr34,但是这随后被证明并非如此(Herrera-Foessel等,2011)。在两个分离的人群中定位该基因后,Hiebert等,(2010)将在RL6077的基因定名为Lr67。虽然Lr67也如同Lr34导致叶片尖部坏死,并对叶锈病和条锈病提供部分的、广谱的、成熟植物抗性,但是这些是明显不同的基因。
[0005] 需要确定如Lr67等基因的分子基础,这些基因对广谱病原提供数量上非品种特异性、成熟植物病原抗性类型或部分抗性。

发明内容

[0006] 本发明人已经鉴定新的转运多肽及其编码基因,这用于赋予植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性。
[0007] 一方面,本发明提供一种包含编码多肽的外源多核苷酸的重组细胞,该多肽的特征为以下一个或多个或全部:
[0008] i)在植物中表达时,多肽赋予植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性,
[0009] ii)在细胞内表达时,多肽在转运葡萄糖通过细胞膜时不如包含SEQ ID NO:4中所提供的序列的氨基酸的多肽有效,
[0010] iii)当在细胞内表达时,多肽作为糖转运蛋白有效,
[0011] iv)多肽包含SEQ ID NO:1中所提供的序列或与SEQ ID NO:1至少40%同一性的氨基酸序列或其生物活性片段的氨基酸,和
[0012] v)多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置不包含甘氨酸,优选地多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置包含除了甘氨酸的氨基酸,
[0013] 其中多核苷酸可操作地连接到能够在细胞中引导多核苷酸表达的启动子。
[0014] 在一个优选实施方案中,该多肽至少具有特征i)和iv),i),ii)和iv),ii)和iv),或iv)和v),更优选特征i),iv)和v),i),ii),iv)和v),或i),iv)和v)。
[0015] 在一个实施方案中,一个或多个活体营养性真菌病原是锈病或霉病或锈病和霉病。活体营养性真菌的实例包括但不限于,小麦白粉病菌(Blumeria graminis f.sp.tritici)、禾谷镰刀菌(Fusarium graminearum)、小麦根腐病(Bipolaris sorokiniana)、白粉病菌(Erysiphe graminis f.sp.tritici)、小麦杆锈菌(Puccinia graminis f.sp.tritici)、小麦条锈菌(Puccinia striiformis)、大麦柄锈菌(Puccinia hordei)和小麦柄锈菌(Puccinia recondita f.sp.tritici)。
[0016] 在一个实施方案中,细胞是植物细胞或酵母细胞。更优选地,细胞是植物细胞。在一个实施方案中,植物细胞是谷类植物细胞如小麦植物细胞。在另一个实施方案中,植物细胞是葡萄细胞。
[0017] 在一个实施方案中,启动子引导叶子和/或干细胞中的基因表达。
[0018] 优选地,如果多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置上不包含甘氨酸,则多肽包含与SEQ ID NO:1、4或7至9的一个或多个或全部或其一个或多个的生物活性片段至少40%同一性的氨基酸序列。
[0019] 在一个优选的实施方案中,多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置上包含氨基酸,其中该氨基酸选自由精氨酸、赖氨酸和组氨酸组成的组。
[0020] 在又一个优选实施方案中,多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号387的位置上不包含缬氨酸,优选地多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号387的位置上包含除了缬氨酸的氨基酸。更优选地,多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号387的位置上包含氨基酸,其中该氨基酸选自由亮氨酸、异亮氨酸、蛋氨酸丙氨酸和苯丙氨酸组成的组。
[0021] 在一个实施方案中,外源多核苷酸整合到细胞的基因组中。
[0022] 在又一个实施方案中,多肽包含具有SEQ ID NO:1中所提供的序列或与SEQ ID NO:中1至少80%同一性、至少90%同一性或至少95%同一性的氨基酸序列或其生物活性片段的氨基酸。
[0023] 在一个实施方案中,多肽包括12个跨膜结构域。
[0024] 另一方面,本发明提供一种包含本发明的细胞的转基因植物,其中该转基因植物是外源性多核苷酸转基因。
[0025] 在一个优选的实施方案中,植物的每个体细胞包括外源多核苷酸。
[0026] 在又一个优选实施方案中,相较于缺乏外源多核苷酸的等基因植物,该植物对一个或多活体营养性真菌病原抗性增强,优选地对锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部的抗性增强。
[0027] 在又一个实施方案中,植物在生长幼苗期对一个或多个活体营养性真菌病原抗性增强。
[0028] 在另一个实施方案中,植物包括一个或多个编码除了Lr67多肽的植物病原抗性多肽的其它外源多核苷酸,优选地Lr34多肽、Sr33多肽或Sr35多肽。其它植物病原抗性多肽包括,但不限于Lr1、Lr3、Lr2a、Lr3ka、Lr11、Lr13、Lr16、Lr17、Lr18、Lr21和LrB。
[0029] 优选地,植物是谷类植物。本发明的转基因谷类植物的实例包括,但不限于小麦、大麦、玉米、大米、燕麦和黑麦。在一个特别优选的实施方案中,植物是小麦。在另一个实施方案中,植物是葡萄藤
[0030] 在一个实施方案中,启动子在植物的地上部分(如叶和/或茎)引导基因表达。
[0031] 优选地,植物的外源多核苷酸是纯合的。
[0032] 在又一个实施方案中,植物在田地里生长。
[0033] 还提供在田地中生长的本发明的至少100个植物的群体。
[0034] 在另一方面,本发明提供一种确定多肽是否赋予对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性或易感性的方法,该真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部的抗性或敏感性,其包括:
[0035] i)获取可操作性连接到启动子的多核苷酸,多核苷酸编码包含具有SEQ ID NO:1中所提供的序列或与一个SEQ ID NO:1至少40%同一性的氨基酸序列,或其生物活性片段的氨基酸的多肽,
[0036] ii)将多核苷酸引入到植物,
[0037] iii)确定对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性或易感性的程度,该真菌病原优选为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地对确定叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部的抗性或敏感性的程度,相对于缺乏多核苷酸的等基因植物是增加还是减少,以及
[0038] iv)任选地,如果抗性平或易感性水平增加,选择编码多肽的多核苷酸,多肽表达时会赋予对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性或易感性,该真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部的抗性或敏感性。
[0039] 在一个实施方案中,下列一个或多个适用于该方法,
[0040] a)多核苷酸包含具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中所提供序列、与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中一个或两个至少40%同一性的序列、或与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中一个或两个杂交的序列的核苷酸。
[0041] b)植物是谷类植物如小麦植物或葡萄藤植物,
[0042] c)多肽是植物多肽或其突变体,以及
[0043] d)步骤ii)进一步包括将可操作性连接到启动子的多核苷酸稳定整合入植物的基因组
[0044] e)多肽的特征为与本发明的细胞有关的上文所限定的特征的一个或多个。
[0045] 另一方面,本发明提供一种基本上纯化和/或重组的多肽,其特征为以下一个或多个或全部:
[0046] i)在植物中表达时,多肽赋予植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,该真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性,
[0047] ii)在细胞内表达时,多肽在转运葡萄糖通过细胞膜时不如包含具有SEQ ID NO:4中所提供的序列的氨基酸的多肽有效,
[0048] iii)当在细胞内表达时,多肽作为糖转运蛋白有效,
[0049] iv)多肽包含具有SEQ ID NO:1中所提供序列或与SEQ ID NO:1至少40%同一性的氨基酸序列,或其生物活性片段的氨基酸,以及
[0050] v)多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置不包含甘氨酸,优选地多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置包含除了甘氨酸的氨基酸。
[0051] 在一个优选的实施方案中,多肽的特征为与本发明的细胞有关的上文所限定的特征的一个或多个。
[0052] 另一方面,多肽包含具有SEQ ID NO:1所提供的序列或与SEQ ID NO:1至少80%同一性、至少90%同一性或至少95%同一性的氨基酸序列或其生物活性片段的氨基酸。
[0053] 在一个实施方案中,本发明的多肽是进一步包含至少一个其它多肽序列的融合蛋白。至少一个其它多肽可能是(例如)增强本发明的多肽的稳定性的多肽,或有助于融合蛋白的纯化或检测的多肽。
[0054] 又一方面,本发明提供一种分离的和/或外源性多核苷酸,其包含具有SEQ ID NO:2或SEQ ID NO:3中所提供序列、与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中任一个或两个至少40%同一性的序列、或与SEQ ID NO:2和SEQ ID NO:3中一个或两个杂交的序列的核苷酸。
[0055] 另一方面,本发明提供一种包含本发明的多核苷酸的嵌合载体。
[0056] 优选地,多核苷酸可操作地连接到启动子。
[0057] 又一方面,本发明提供一种包括本发明的外源多核苷酸和/或本发明的载体的重组细胞。
[0058] 细胞可以是任何细胞类型如,但不限于,植物细胞、细菌细胞、动物细胞或酵母细胞。
[0059] 优选地,细胞是植物细胞。更优选地,植物细胞是谷类植物细胞。更加优选地,谷类植物细胞是小麦细胞。在另一个实施方案中,植物细胞是葡萄细胞。
[0060] 又一方面,本发明提供一种生产本发明的多肽的方法,该方法包括在细胞表达系统或无细胞表达系统中表达本发明的多核苷酸。
[0061] 优选地,方法进一步包括分离多肽。
[0062] 另一方面,本发明提供一种生产本发明的细胞的方法,该方法包括将本发明的多核苷酸或本发明的载体引入细胞的步骤。
[0063] 优选地,细胞是植物细胞。
[0064] 另一方面,本发明提供一种生产本发明的转基因植物的方法,该方法包括以下步骤:
[0065] i)将本发明的多核苷酸和/或本发明的载体引入到植物的细胞,
[0066] ii)使转基因植物从细胞再生,以及
[0067] iii)任选地从植物中收获种子,和/或
[0068] iv)任选地从转基因植物中生产一个或多个子代植物,从而生产转基因植物。
[0069] 另一方面,本发明提供一种生产植物的方法,其已经将编码本发明的多肽的多核苷酸整合至其基因组,该方法包括以下步骤
[0070] i)将两亲本植物杂交,其中至少一个植物包括编码多肽的多核苷酸,
[0071] ii)筛选来自杂交的一个或多个子代植物存在或不存在多核苷酸,以及
[0072] iii)选择包括多核苷酸的子代植物,从而生产植物。
[0073] 在一个实施方案中,多肽包含具有SEQ ID NO:1中所提供的序列或与SEQ ID NO:1至少40%同一性的氨基酸序列、或其生物活性片段的氨基酸,以及其中在植物中表达时,多肽赋予植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,该真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性。
[0074] 在一个实施方案中,亲本植物中至少有一个是四倍体或六倍体小麦植物。在另一个实施方案中,亲本植物是葡萄藤。
[0075] 在另一个实施方案中,步骤ii)包括分析来自植物含有DNA的样品中的多核苷酸。
[0076] 在又一个实施方案中,步骤iii)包括
[0077] i)选择多核苷酸纯合的子代植物,和/或
[0078] ii)分析植物或其一个或多个子代植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,该真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地分析对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性。
[0079] 在另一个实施方案中,该方法进一步包括
[0080] iv)将步骤i)所述的杂交子代和与缺乏编码多肽的多核苷酸的第一个亲本植物具有相同基因型的植物进行回交足够数量的次数以生产具有大多数第一亲本的基因型但包括多核苷酸的植物,以及
[0081] iv)选择已经对一个或多个活体营养性真菌病原具有抗性的子代植物,该真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部具有抗性。
[0082] 在一个实施方案中,该方法进一步包括分析植物至少一个其它遗传标记的步骤。
[0083] 还提供一种使用本发明的方法生产的植物。
[0084] 另一方面,本发明提供本发明的多核苷酸或本发明的载体生产重组细胞和/或转基因植物的用途。
[0085] 在一个实施方案中,相较于缺乏外源多核苷酸和/或载体的等基因植物,该转基因植物对一个或多个活体营养性真菌病原具有增强的抗性,该真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部具有增强的抗性。
[0086] 又一方面,本发明提供一种鉴定包含编码本发明的多肽的多核苷酸的植物的方法,该方法包括以下步骤
[0087] i)从一种植物中获取核酸样品,以及
[0088] ii)筛选样品存在或不存在多核苷酸。
[0089] 在一个实施方案中,相较于缺乏外源多核苷酸的等基因植物,多核苷酸的存在表明植物对一个或多个活体营养性真菌病原具有增强的抗性,该真菌病原优选地为锈病、霉病或锈病和霉病两者,更优选地对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部具有增强的抗性。
[0090] 在一个实施方案中,扩增涵盖多核苷酸的基因组区,并对扩增产物进行测序以确定其是否编码多肽。用于扩增和用于测序的引物,可以由技术人员很容易地设计。
[0091] 在又一个实施方案中,该方法鉴定本发明的转基因植物。
[0092] 在实施方案中,该方法进一步包括在步骤i)前从种子生产植物。
[0093] 还提供一种本发明的植物的植物部分。
[0094] 在一个实施方案中,植物部分是包含编码本发明的多肽的外源性多核苷酸的种子。
[0095] 又一方面,本发明提供一种生产植物部分的方法,该方法包括,
[0096] a)种植本发明的植物,以及
[0097] b)收获植物部分。
[0098] 另一方面,本发明提供一种生产从种子获取的面粉、全麦粉、淀粉或其它产品的方法,该方法包括;
[0099] a)获取本发明的种子,以及
[0100] b)提取面粉、全麦粉、淀粉或其它产品。
[0101] 又一方面,本发明提供一种从本发明的植物和/或本发明的植物部分生产的产品。
[0102] 在一个实施方法中,部分是种子。
[0103] 在一个实施方案中,产品是食物产品或饮料产品。实例包括,但不限于;
[0104] i)选自由面粉、淀粉、发酵的或未经发酵的面包、意大利面、面条、动物饲料、早餐谷物、休闲食物、糕点、麦芽酒、啤酒、糕饼和含面粉酱料的食物组成的组的食物产品,或[0105] ii)啤酒或麦芽酒的饮料产品。
[0106] 在一个替代实施方案中,产品是非食物产品。实例包括,但不限于,薄膜、涂层、粘合剂建筑材料包装材料。
[0107] 又一方面,本发明提供一种制备本发明的食物产品的方法,方法包括将种子或来自种子的面粉、全麦或淀粉与另一种食物成分相混合。
[0108] 另一方面,本发明提供一种制备麦芽酒的方法,其包括使本发明的种子发芽的步骤。
[0109] 也提供本发明的植物或其部分作为动物饲料或生产用于动物食用的饲料或人类食用的食物的用途。
[0110] 又一方面,本发明提供一种组合物,其包含一个或多个本发明的多肽、本发明的多核苷酸、本发明的载体、或本发明的重组细胞以及一个或多个可接受载剂。
[0111] 又一方面,本发明提供一种鉴定化合物的方法,该化合物结合到包含具有SEQ ID NO:1中所提供的序列或与SEQ ID NO:1至少40%同一性的氨基酸序列、及其生物活性片段的氨基酸的多肽,该方法包括:
[0112] i)将多肽与候选化合物接触,以及
[0113] ii)确定化合物是否结合到多肽。
[0114] 在一个实施方案中,多肽嵌在细胞膜中,优选地嵌在植物细胞膜中。
[0115] 又一方面,本发明提供一种鉴定化合物的方法,该化合物由包含具有SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4中所提供的序列或与SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4的一个或两个至少40%同一性的氨基酸序列,或其生物活性片段的氨基酸的多肽转运通过细胞膜,该方法包括:
[0116] i)将嵌在细胞膜中的多肽与候选化合物接触,该细胞膜优选地为植物细胞的膜,[0117] ii)确定该化合物是否通过该多肽从膜的一侧转运到另一侧。
[0118] 除非另外特别说明,否则应该对本文中任何实施方案进行必要的修正以适用于其它任何实施方案。
[0119] 本发明不局限于本文所描述的特定的实施方案的范围,这些实施方案只是为了例证。功能等效的产品、组合物和方法显然也在本发明的范围中,如本文所描述。
[0120] 在本说明书中,除非另外特别说明或上下文另有规定,应该参考单个步骤、物质的组成、步骤组或物质组成的组来涵盖这些步骤中的一个和多个(即,一个或多个)、物质组成、步骤组或物质组成的组。
[0121] 本发明在下文中通过下列非限制性实例的方式以及参考附图进行描述。

附图说明

[0122] 图1-比较基因组学和突变分析。
[0123] 图2–缺失的Hsp70基因与Lr67完全相连。
[0124] 图3–包括SUT和PIP的比较基因组学和突变分析。
[0125] 图4–在Lr67变形中所发现的核苷酸的变化。
[0126] 图5–由小麦Lr67(抗性)等位基因编码的SUT多肽的氨基酸序列(514个氨基酸,SEQ ID NO:1)。在预测第四跨膜域第144位的精氨酸和第387位的亮氨酸区分抗性Lr67和易感的Lr67多肽。
[0127] 图6–与Lr67抗性等位基因对应的cDNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:3)。区分+/-Lr67位于第514位和第1243位的两个SNP的位置;这些导致在编码的多肽中的氨基酸替换。翻译起始密码子是在第85-87位,以及翻译终止密码子是在第1627-1629位。
[0128] 图7–Lr67易感性多肽(SUT)的氨基酸序列(SEQ ID NO:4)。
[0129] 图8–与Lr67易感性等位基因SUT对应的DNA的核苷酸序列(SEQ ID NO:6)。
[0130] 图9–小麦Lr67(抗性)多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)与同源的拟南芥(Arabidopsis thaliana)多肽(Arath;来自基因库登记号NP_198006,526个氨基酸)(SEQ ID NO:7)排列。星号表示在那个位置的相同的氨基酸残基,而“+”表示在那个位置相似的氨基酸。
[0131] 图10–小麦Lr67(抗性)多肽的氨基酸序列(SEQ ID NO:1)与同源的水稻(Oryza sativa)多肽(基因库登记号AAQ24871,515个氨基酸)(SEQ ID NO:8)的排列。星号表示在那个位置的相同的氨基酸残基,“+”表示在那个位置相似的氨基酸。
[0132] 图11–表达Lr67(抗性)和Lr67(易感)蛋白的酵母细胞的葡萄糖摄取。
[0133] 图12–在表达Lr67(易感)的酵母中的葡萄糖摄取动力学。
[0134] 图13–不同氨基酸通过Lr67蛋白对葡萄糖转运的影响。
[0135] 图14–与Lr67(易感)基因的蛋白编码区对应的基因组片段的核苷酸序列。该序列开始于翻译起始密码子ATG,并结束于翻译终止TGA。在蛋白编码区内这两个内含子是核苷酸137-876(内含子1,740nt)和1197-3154(内含子2,1958nt)。
[0136] 序列表说明
[0137] SEQ ID NO:1–小麦Lr67(抗性)蛋白。
[0138] SEQ ID NO:2–编码小麦Lr67(抗性)蛋白的开放阅读框。
[0139] SEQ ID NO:3–编码小麦Lr67(抗性)蛋白的cDNA。
[0140] SEQ ID NO:4–小麦Lr67(易感)蛋白
[0141] SEQ ID NO:5–编码小麦Lr67(易感)蛋白的开放阅读框。
[0142] SEQ ID NO:6–编码小麦Lr67(易感)蛋白的cDNA。
[0143] SEQ ID NO:7–拟南芥Lr67蛋白。
[0144] SEQ ID NO:8–水稻Lr67蛋白。
[0145] SEQ ID NO:9–葡萄藤(Vitis vinifera)Lr67蛋白。
[0146] SEQ ID NO:10–编码小麦Lr67(易感)蛋白的基因。

具体实施方式

[0147] 常规技术和定义
[0148] 除非另外特别限定,本文中所使用的全部技术和科学术语都与本领域(如,在细胞培养、分子遗传学、植物分子生物学、蛋白化学和生物化学领域中)普通技术人员通常理解的含义相同。
[0149] 除非另外说明,本发明所利用的重组蛋白、细胞培养和免疫学技术是本领域技术人员所熟知的标准程序。此类技术在以下来源的文献中得到描述和说明,如,J.Perbal,A Practical Guide to Molecular Cloning,John Wiley and Sons(1984),J.Sambrook等,Molecular Cloning:A Laboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory Press(1989),T.A.Brown(编辑),Essential Molecular Biology:A Practical Approach,卷1和卷2,IRL Press(1991),D.M.Glover和B.D.Hames(编辑),DNA Cloning:A Practical Approach,卷1-4,IRL Press(1995和1996),and F.M.Ausubel等(编辑),Current Protocols in Molecular Biology,Greene Pub.Associates and Wiley-Interscience(1988,包括直到现在所有的更新资料),Ed Harlow和David Lane(编辑)Antibodies:ALaboratory Manual,Cold Spring Harbour Laboratory,(1988)和J.E.Coligan等(编辑)Current Protocols in Immunology,John Wiley&Sons(包括直到现在所有的更新资料)。
[0150] 术语“和/或”,例如,“X和/或Y”应该被理解为意思是或“X和Y”或“X或Y”,并应该被用来提供对两个意思或其中一个意思的明确的支持。
[0151] 在本说明书中,单词“包括/包含(comprise)”或变体如“包括/包含(comprises)”或“包括/包含(comprising)”将被理解为暗示着包含所说明的要素、整体或步骤,或要素、整体或步骤的组,但不排除其它任何要素、整体或步骤,或要素、整体或步骤的组。
[0152] 多肽
[0153] 本发明涉及多肽,其在植物中表达时,赋予植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,优选地对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部。本发明还涉及多肽,其在细胞内表达时,在转运葡萄糖通过细胞膜时不如包含SEQ ID NO:4中所提供的序列的氨基酸的多肽有效。此外,本发明也涉及多肽,其在细胞内表达时,以糖转运蛋白的形式发挥作用。在一个优选的实施方案中,多肽是由赋予植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性的Lr67基因的等位基因或变形编码的。此类多肽的实例包括,但不限于,那些包含在SEQ ID NO:1中所提供的氨基酸序列的多肽。相较于缺乏编码多肽的多核苷酸的等基因的植物,本发明的多肽赋予对一个或多个活体营养性真菌病原的增强的抗性。
[0154] 本文所使用的术语“Lr67”涉及分享高度初级氨基酸序列同一性的蛋白家族,例如,与SEQ ID NO:1、4或7至9所提供的一个或多个氨基酸序列至少40%、至少80%、至少90%或至少95%同一性,优选地SEQ ID NO:1。本发明已经证明Lr67蛋白家族的一些变形,其在植物中表达时,赋予植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,优先地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性。此变形的实例包括SEQ ID NO:
1所提供的氨基酸序列。因此,赋予抗性的变形在本文中被称为Lr67(抗性)多肽,而那些没有赋予抗性的变形(如包括SEQ ID NO:4所提供的氨基酸序列)在本文中被称为Lr67(易感)多肽。在一个优选的实施方案中,Lr67(抗性)蛋白在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置不包含甘氨酸,优选地多肽在对应于SEQ ID NO:1的氨基酸号144的位置包含除了甘氨酸的氨基酸。第144位的氨基酸优选地是带电荷的氨基酸如精氨酸、赖氨酸或组氨酸。
[0155] 本文中所使用的“抗性”是相对术语,因为在本发明的多肽的存在(i)减少包含赋予抗性的基因(R(抗性)基因)的植物的疾病症状,相对于缺乏R基因的植物,和/或(ii)减少在植物中或在包含R基因的植物种群中病原繁殖或传播。本文中所使用的抗性相对于植物对相同病原的“易感”反应。通常,相较于被病原感染但缺乏R基因的等基因植物,当病原感染时,R基因的存在改善至少一个包含R基因的植物的生产特性,如谷物产量。等基因植物可能对病原具有一定程度的抗性,或可能被分类为易感的。因此,术语“抗性”和“增强的抗性”一般在本文中互换使用。此外,本发明的多肽未必赋予完全的病原抗性,例如当在植物中或植物种群中某些症状仍旧出现或有某些病原繁殖感染但数量减少。抗性可能只在植物生长的某些阶段出现,例如在成熟植物(在大小上完全长成)和没那么成熟,或根本未成熟,在幼苗期,或在植物生长的全部阶段通过使用转基因策略以在植物中表达Lr67多肽,为本发明的植物在其生长发育中提供抗性。通过本领域已知的一些方法来确定增强的抗性,如分析植物病原数量和/或在病原存在的情况下分析植物生长或植物的损失数量或疾病症状,以及将这些参数的一个或多个与缺乏编码本发明的多肽的外源基因的等基因植物进行比较。
[0156] 如本文中所使用的“糖转运蛋白”是膜结合蛋白,其促进糖跨膜运动,例如从细胞外进入细胞,或在相反的方向从细胞内到细胞外,或穿过细胞内的亚细胞器的膜。该促进作用可能是主动的,使用能量源如从离子梯度穿过膜,或被动的。对于Lr67(易感)蛋白,糖可以是葡萄糖。在一个实施方案中,糖是单糖,优选地己糖单糖或戊多糖。在一个实施方案中,糖可能被修饰,如糖醇或磷酸化糖。
[0157] 本文所使用的短语“在转运葡萄糖穿过细胞膜不如包含具有SEQ ID NO:4中所提供的序列的氨基酸的多肽有效”意思是本发明的多肽具有低于50%、或低于25%或低于10%的包含具有SEQ ID NO:4中所提供的序列的氨基酸的多肽的转运葡萄糖进入细胞的能力,如酵母细胞或植物细胞。这可以如本文所描述的很容易地被确定(见,例如,图11和相关的实验细节)。
[0158] 通过“基本上纯化的多肽”或“纯化的多肽”,我们指的是通常已经与其天然状态中其结合的脂质、核苷酸、其它肽和其它杂质分子分离的多肽。优选地,基本上纯化的多肽是至少90%从与其天然状态结合的其它成分中分离。在一个实施方案中,本发明的多肽具有除了天然状态出现的Lr67多肽的氨基酸序列,即,它是氨基酸序列变形。
[0159] 本发明的转基因植物和宿主细胞可能包含编码本发明的多肽的外源多核苷酸。在这些情况下,植物和细胞生产重组多肽。在多肽的上下文中,术语“重组”当由细胞生产时指的是外源多核苷酸所编码的多肽,其多核苷酸已经通过重组DNA或RNA技术(如,例如转换)引入到细胞或祖细胞。通常,细胞包含引起待产生的多肽数量发生改变的非内生基因。在一个实施方案中,“重组多肽”是植物细胞中通过外源(重组)多核苷酸表达所产生的多肽。
[0160] 术语“多肽”和“蛋白”通常可以互换使用。
[0161] 通过GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)来测定多肽的%同一性,使用缺口产生罚分=5,且缺口延伸罚分=0.3。查询序列至少为400个氨基酸长,且GAP分析在至少400个氨基酸的区内对两个序列进行比对。更优选地,查询序列至少为500个氨基酸长,且GAP分析在至少500个氨基酸的区内对两个序列进行比对。更加优选地,GAP分析在其全长上对两个序列进行比对,其对于Lr67多肽约为514个氨基酸残基。
[0162] 本文所使用的“生物活性片段”是本发明的多肽的一部分,其保持全长多肽的限定活性,如以下的其中一个或两个i)在植物中表达时,如小麦,赋予对一个或多个活体营养性真菌病原的(增强的)活性,优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的(增强的)活性,以及(ii)当在细胞内表达时,多肽作为糖转运蛋白有效,优选地在转运葡萄糖通过细胞膜时不如包含具有SEQ ID NO:4中所提供的序列的氨基酸的多肽有效。生物活性片段可以是任何大小,只要它们保持限定活性,但优选地至少400或至少500个氨基酸残基的长度。优选地,生物活性片段保持至少50%、至少75%或至少90%的全长蛋白的活性。在一个实施方案中,生物活性片段包含12个跨膜结构域。
[0163] 关于限定的多肽,应理解比上述提供的数字较高的%同一性性的数字将涵盖优选的实施方案。因此,在适用的情况下,按照%同一性数字的最低值,优选地,多肽包含与相关命名的SEQ ID NO具有至少60%、更优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少76%、更优选地至少80%、更优选地至少85%、更优选地至少90%、更优选地至少91%、更优选地至少92%、更优选地至少93%、更优选地地至少94%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%、更优选地至少99%、更优选地至少99.1%、更优选地至少99.2%、更优选地至少99.3%、更优选地至少99.4%、更优选地至少99.5%、更优选地至少99.6%、更优选地至少99.7%、更优选地至少99.8%、甚至更优选地至少99.9%同一性的氨基酸序列。
[0164] 在一个实施方案中,本发明的多肽不是以天然状态出现的、由SEQ ID NO:1或SEQ ID NO:4所提供的氨基酸序列所组成的多肽。
[0165] 本文中所使用的短语“在对应于氨基酸号的位置”或其变体指的是与周围氨基酸相比氨基酸的相对位置。在这点上,在一些实施方案中,当将其与如SEQ ID NO:1进行比对时,本发明的多肽可能具有改变氨基酸相对定位的缺失或替换突变。例如,如图9所示,小麦Lr67(抗性)的氨基酸号178对应于同源的拟南芥Lr67蛋白的氨基酸号179。
[0166] 可通过将合适的核苷酸变异引入本发明的核酸,或通过所需多肽的体外合成,来制备本发明的多肽的氨基酸序列突变体。这样的突变体包括,例如,在氨基酸序列中残基的缺失、插入或替代。在最终的构造中可出现缺失、插入和替代的组合,只要最终肽产品拥有所需的特征。相对于参考野生型多肽,优选的氨基酸序列突变体只能具有一个、两个、三个、四个或低于10个氨基酸改变。
[0167] 突变的(改变的)多肽可以使用本领域已知的任何技术进行制备,例如,使用定向进行或合理的设计策略(见下文)。来源于突变/改变DNA的产品可以使用本文所描述的技术很容易地筛选,来确定是否它们具有以下特征的一个或多个i)在植物中表达时,如小麦,赋予一个或多个活体营养性真菌病原(增强的)抗性,优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部(增强的)抗性,以及(ii)当在细胞内表达时,被编码的多肽在转运葡萄糖通过细胞膜时不如包含具有SEQ ID NO:4中所提供的序列的氨基酸的多肽有效,以及(iii)当在细胞内表达时,多肽作为糖转运蛋白有效。例如,关于i),方法可能包括生产表达突变/改变DNA的转基因植物以及确定病原对植物生长的影响。
[0168] 在设计氨基酸序列突变体时,突变位点的位置和突变的性质将取决于要修饰的特征。突变的位点可以单独或连续地修饰,例如,通过(1)首先用保守性氨基酸选择进行替代,且然后取决于要达到的结果用更为彻底的选择,(2)删除靶残基,或(3)邻近定位的位点插入其它残基。
[0169] 氨基酸序列缺失的范围一般是从约1至15个残基,更优选地约1至10个残基,通常约1至5个邻接的残基。
[0170] 替代突变体在多肽中至少除去一个氨基酸残基,并在其位置插入不同的残基。其保持一定的活性是可取的,优选非替代或只是在相关蛋白家族中高度保守的氨基酸位置上的保守替代。在“示例性替代”的标题下,表1中显示保守替代的实例。
[0171] 在一个优选的实施方案中,相较于天然存在的多肽,突变/变异多肽具有一个或两个或三个或四个保守氨基酸变化。表1提供保守氨基酸变化的细节。在一个优选的实施方案中,变化并不在随本文所提供的不同多肽之间的高度保守的一个或多个基序内,和/或不在Lr67多肽的12个跨膜螺旋。如技术人员所知,可以合理地预测在重组细胞表达时,此微小的变化不会改变多肽的活性。
[0172] 本发明的多肽的初级氨基酸序列可以用来设计变形/突变体,其基于与密切相关的糖转运蛋白多肽的比较(例如,如图9和10所示)。如技术人员可以理解,密切相关蛋白内高度保守的残基比保守性较差的残基被改变的可能性更低,特别是非保守替代和活性保持(见上文)。
[0173] 也包含在本发明的范围内的是在合成期间或之后发生差异性修饰的本发明的多肽,如通过生物素化、糖基化、乙酰化、磷酸化、酰胺化、已知保护/阻碍组的衍生化、蛋白水解、连接到抗体分子或其它细胞配体,等。多肽可能在细胞中发生翻译后修饰,例如通过磷酸化,其调节其活性。这些修饰可用于增加本发明的多肽的稳定性和/或生物活性。
[0174] 表1.示例性替代。
[0175]
[0176] 定向进化
[0177] 在定向进化中,随机诱变被应用到蛋白,且选择方案用于挑选出具有所需特性的突变体,例如,活性增加。然后应用下一轮的突变和选择。典型地定向进化策略包括三个步骤:
[0178] 1)多样化:使编码受关注蛋白的基因突变和/或随机重组以创建大型基因变形的文库。变形基因文库可以通过易错PCR(见,例如,Leung,1989;Cadwell和Joyce,1992)从由亲本模板所制备的DNaseI酶切片段库(Stemmer,1994a;Stemmer,1994b;Crameri等,1998;Coco等,2001),从变性寡核苷酸(Ness等,2002,Coco,2002)或从两者的混合物,甚至从未酶切亲本模板(Zhao等,1998;Eggert等,2005;Jézéquek等,2008)进行构建,通常通过PCR进行装配,文库也可以在体内或体外从重组的亲本序列通过同源的或非同源重组进行创建,(Ostermeier等,1999;Volkov等,1999;Sieber等,2001),变形基因库也可以通过将受关注基因亚克隆到合适的载体,将载体转化进入“突变基因”系统如E.coli XL-1red(Stratagene),并将被转化的细菌繁殖合适的代的数量。变形基因文库也可通过将受关注基因进行DNA改组(即,在体外通过随机分割和重新组装将选择的突变基因库同源重组),如Harayama(1998)广泛描述。
[0179] 2)选择:使用筛查或选择来测试文库拥有所需特性的突变体(变形)的存在。筛查能手工鉴定和分离高性能突变体,而选择自动消除全部非功能性突变体。筛查可能包括筛查已知保守的氨基酸基序的存在。或者,或此外,筛查可能包括在宿主生物体或其部分表达突变多核苷酸以及测定活性水平。
[0180] 3)扩增:在选择或筛选中所鉴定的变形被复制很多倍,使研究者可以测序其DNA,以了解发生了什么突变。
[0181] 这三个步骤一起被称为定向进化的一个“回合”。大多数实验将需要超过一个回合。在这些实验中,前一轮的“赢家”在下一轮被多样化来创建新的文库。在实验结束时,使用生物化学的方法来表征全部进化蛋白或多核苷酸突变体。
[0182] 合理设计
[0183] 在蛋白结构和折叠的已知信息的基础上,蛋白被合理设计。这可以通过从头开始的设计(de novo design)或通过基于天然支架的重新设计(见,例如,Hellinga,1997;以及Lu和Berry,Protein Structure Design and Engineering,Handbook of Proteins 2,1153-1157(2007))来完成。蛋白设计通常包括鉴定折叠成给定或靶结构的序列,其可使用计算机模型来完成。计算机蛋白设计算法搜索当折叠成靶结构时能量低的序列的序列-构象空间。计算机蛋白设计算法使用蛋白热力学模型来评价突变如何影响蛋白的结构和功能。这些能量的功能通常包括分子力学,统计学(即,以知识为基础),和其它经验方面的组合。合适的可用软件包括IPRO(迭代蛋白重新设计和优化)、EGAD(蛋白的设计的遗传学算法)、Rosetta Design、Sharpen和Abalone。
[0184] 多核苷酸和基因
[0185] 本发明涉及各种多核苷酸。本文所使用的“多核苷酸”或“核酸”或“核酸分子”指的是核苷酸的聚合物,其可能是DNA或RNA或其组合,且包括基因组DNA、mRNA、cRNA和cDNA。非优选的多核苷酸包括tRNA、siRNA、shRNA和hpRNA。它可能是细胞来源、基因组来源或合成来源的DNA或RNA,例如由自动化合成仪所形成,其可能与水化合物、脂质、蛋白或其它物质结合,用荧光素或其它基团标记,或附接到固相支持体以执行本文限定的特性活性,或包括一种和多种自然界未发现的、被修饰的核苷酸,这些都是本领域技术人员所公知的。聚合物可能是单链的,本质上是双链或部分双链的。本文所使用的配对是指核苷酸之间标准的碱基配对,包括G:U碱基配对。“互补的”是指两个多核苷酸能够沿着它们长度的一部分或其中一个或两个的全长进行碱基配对(杂交)。“杂交的多核苷酸”是指多核苷酸与其互补物确实碱基配对。本文所使用的术语“多核苷酸”与术语“核酸”可互换使用。本发明的优选的多核苷酸编码本发明的多肽。
[0186] “分离的多核苷酸”,我们是指如果多核苷酸在自然界发现,则多核苷酸通常已经从与其天然状态下结合或相连的多核苷酸序列中分离。优选地,如果分离的多核苷酸在自然界中发现,则其至少90%从与其天然状态下结合的其它成分中分离出来。优选的多核苷酸不是天然存在的,例如通过以自然界中未发现的方式共价连接两个较短的多核苷酸序列(嵌合多核苷酸)。
[0187] 本发明涉及基因活性的修饰和嵌合基因的构建和使用。本文所使用的术语“基因”包括任何脱核糖核苷酸序列,其包含蛋白编码区或其在细胞中转录但未翻译,以及相关的非编码区和调控区。这些相关的区通常位于邻近5’端和3’端的编码区或转录区任一侧约2kb的距离。在这点上,基因可能包括天然与给定基因相关的控制信号如启动子、增强子、终止和/或多聚腺苷酸化信号,或异源控制信号,在这种情况下,基因被称为“嵌合基因”。位于编码区5’端的序列和存在于mRNA上的序列被称为5’非翻译序列。位于编码区3’端或下游并且存在于mRNA上的序列被称为3’非翻译序列。术语“基因”包括cDNA和基因组形式的基因。
[0188] 本文所使用的“Lr67基因”指的是与分离的Lr67cDNA同源的核苷酸序列(如SEQ ID NO:3和SEQ ID NO:6所提供)。如本文所描述,Lr67基因家族的某些等位基因和变形编码赋予对一个或多个活体营养性真菌病原抗性的蛋白,优先地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部(见,例如,SEQ ID NO:3)抗性。Lr67基因包括天然存在的等位基因或存在于谷类的变形如小麦,以及人工生产的变形。
[0189] 可用被称为“内含子”或“插入区”或“插入序列”的非编码序列中断包含转录区的基因的基因组形式或克隆,相对于基因的“外显子”,其可能是同源的或异源的。本文所使用的“内含子”是基因片段,其作为初级RNA转录物的一部分被转录,但并不存在于成熟的mRNA分子中。内含子从核的或初级转录物除去或“剪除”;因此,内含子不存在于信使RNA(mRNA)。内含子可包含调控元件如增强子。如本文所描述,小麦Lr67基因(抗性和易感等位基因)在其蛋白编码区含有两个内含子。本文所使用的“外显子”指的是在RNA分子不被翻译的情况下对应于成熟mRNA或成熟mRNA中存在的RNA序列的DNA区。mRNA在翻译过程中用来指定新生多肽中的氨基酸的序列或顺序。术语“基因”包括编码本文所描述的本发明的蛋白的全部或一部分的合成的或融合的分子,以及上述任何一个的互补核苷酸序列。基因可被引入到适宜的载体中,用于细胞内的染色体外维持或,优选地,用于整合到宿主基因组中。
[0190] 如本文所使用,“嵌合基因”指的是包含未在天然状态下发现的共价连接的序列的任何基因。通常情况下,嵌合基因包含未在天然状态下一起发现的调控序列和转录序列或蛋白编码序列。因此,嵌合基因可能包含源自不同来源的调控序列和编码序列,或源自相同来源的调控序列和编码序列,但以不同于天然下发现的方式进行排列。在一个实施方案中,Lr67基因的蛋白编码区可操作地连接到Lr67基因异源的启动子或多聚腺苷酸化/终止区,从而形成嵌合基因。本文所使用的术语“内源性的”在本文用来表示正常存在或在与所研究的植物相同发育阶段下的未改变的植物中产生的物质。“内源性基因”是指在生物体基因组中天然位置的天然基因。如本文中所使用,“重组核酸分子”、“重组多核苷酸”或其变形是指已经通过重组DNA技术被构建或修饰的核酸分子。术语“外源多核苷酸”或“外源性多核苷酸”或“异源多核苷酸”等是指通过实验操作被引入到细胞基因组的任何核酸。
[0191] 外源或外源性基因可能是被插入到非天然生物体的基因、被引入到天然宿主内的新位置的天然基因或嵌合基因。“转基因”是已经通过转化程序被引入到基因组的基因。术语“遗传修饰的”包括通过转化或转导将基因引入细胞、使细胞中的基因发生突变,或改变或调节已经进行了这些行为的细胞或生物体或其子代内基因的调控。
[0192] 此外,术语“外源性的”在多核苷酸(核酸)的上下文是指当存在于天然不包含多核苷酸的细胞中时的多核苷酸。细胞可能是包含引起被编码的多肽产量发生改变的非内源性多核苷酸的细胞,例如增加内源多肽表达的外源多肽,或天然状态下不能产生多肽的细胞。本发明的多肽生产增加在本文中也指的是“过表达”。本发明的外源多核苷酸包括尚未与所在的转基因(重组)细胞表达系统或无细胞表达系统的其它成分分离的多核苷酸,以及随后与至少某些其它成分纯化分离的、在这些细胞或无细胞系统内生产的多核苷酸。外源多核苷酸(核酸)可以是在自然界中存在的核苷酸的连续伸展,或包含被连接形成成单个多核苷酸的、来自不同来源(天然存在和/或合成的)的两个或多个核苷酸的连续伸展。通常,此嵌合多核苷酸包含至少一个编码本发明的多肽的、可操作地连接到启动子的开放阅读框,该启动子适合在受关注细胞内驱动开放阅读框的转录。
[0193] 多核苷酸的%同一性通过GAP(Needleman和Wunsch,1970)分析(GCG程序)来确定,其缺口创建罚分=5,且缺口延伸罚分=0.3。查询序列长度至少为1,200个核苷酸,且GAP分析在至少1,200个核苷酸的区内对两个序列进行比对。更加优选地,查询序列长度至少为1,500个核苷酸,且GAP分析在至少1,500个核苷酸的区内对两个序列进行比对。甚至更优选地,GAP分析比对两个序列全长。
[0194] 关于已限定的多核苷酸,应理解比上述提供的数字较高的%同一性的数字将涵盖优选的实施方案。因此,在适用的情况下,按照%同一性数字的最低值,优选地,多核苷酸包含与相关命名的SEQ ID NO具有至少60%、更优选地至少65%、更优选地至少70%、更优选地至少75%、更优选地至少80%、更优选地至少85%、更优选地至少90%、更优选地至少91%、更优选地至少92%、更优选地至少93%、更优选地至少94%、更优选地至少95%、更优选地至少96%、更优选地至少97%、更优选地至少98%、更优选地至少99%、更优选地至少
99.1%、更优选地至少99.2%、更优选地至少99.3%、更优选地至少99.4%、更优选地至少
99.5%、更优选地至少99.6%、更优选地至少99.7%、更优选地至少99.8%、甚至更优选地至少99.9%同一性的多核苷酸序列。
[0195] 在又一个实施方案中,本发明涉及与本文特别描述的多核苷酸基本上相同的多核苷酸。如本文所使用,关于多核苷酸术语“基本上相同”是指一个或一些(例如,2、3或4)核苷酸的替代同时保持该多核苷酸所编码的天然蛋白的至少一个活性。此外,该术语包括导致所编码的天然蛋白大小的增加或减少,同时保持该多核苷酸所编码的天然蛋白的至少一个活性的一个或一些(例如,2、3或4)氨基酸的核苷酸的增加或缺失。
[0196] 本发明还涉及寡核苷酸的用途,例如在筛选本发明的多核苷酸的方法中,或编码本发明的多肽的方法中。如本文所使用,“寡核苷酸”是长度最多50个核苷酸的多核苷酸。此寡核苷酸大小的最低值是寡核苷酸和本发明的核酸分子的互补序列之间形成稳定的杂交体所需的大小。它们可以是RNA、DNA或任一的组合或衍生物。通常,寡核苷酸是10至30个核苷酸的相对短的单链分子,一般15-25个核苷酸长度。当用作探针或在扩增反应中作为引物时,此寡核苷酸大小的最低值是寡核苷酸和靶核酸分子的互补序列之间形成稳定的杂交体所需的大小。优选地,寡核苷酸长度至少15个核苷酸,更优选地至少18个核苷酸,更优选地至少19个核苷酸,更优选地至少20个核苷酸、甚至跟优选地至少25个核苷酸。用作探针的本发明的寡核苷酸通常与标记偶联,如放射性同位素、酶、生物素、荧光分子或化学发光分子。
[0197] 本发明包括可用于,例如,鉴定核酸分子的探针或生产核酸分子的引物的寡核苷酸。探针和/或引物可用于从其它物种克隆本发明的多核苷酸的同系物。此外,本领域已知的杂交技术也可用于筛选此同系物的基因组或cDNA文库。
[0198] 本发明的多核苷酸和寡核苷酸包括在严格的条件下与SEQ ID NO:2、3、5或6所提供的序列中的一个或多个杂交的那些。如本文所使用,严格的条件是以下那些(1)采用低离子强度和高温来洗涤,例如,在50℃时0.015M NaCl/0.0015M柠檬酸钠/0.1%NaDodSO4;(2)在42℃时杂交中采用变性剂如甲酰胺,例如,50%(体积/体积)甲酰胺和0.1%血清白蛋白、0.1%聚蔗糖、0.1%聚乙烯吡咯烷、pH值为6.5的50mM磷酸钠缓冲液和750mM NaCl、75mM柠檬酸钠;或(3)在42℃时在0.2x SSC和0.1%SDS中采用50%甲酰胺、5xSSC(0.75M NaCl,0.075M柠檬酸钠)、50mM磷酸钠(pH 6.8)、0.1%焦磷酸钠、5x Denhardt's溶液、超声处理的鲑鱼精子DNA(50g/ml)、0.1%SDS和10%硫酸葡聚糖。
[0199] 本发明的多核苷酸可能拥有,相较于天然存在的分子,一个或多个突变,即核苷酸残基的缺失、插入或替代。突变体可以是天然存在的(也就是说,从天然来源分离出)或合成的(例如,通过对核酸的定点诱变)。本发明的多核苷酸或寡核苷酸的变形包含接近本文所限定的参考多核苷酸或寡核苷酸的基因组的小麦基因组不同大小的分子,和/或能够与其杂交的分子。例如,变形可能包括额外的核苷酸(如1、2、3、4或更多)或更少的核苷酸,只要它们仍与靶区域杂交。此外,一些核苷酸可能被替代,不影响寡核苷酸与靶区域杂交能力。此外,可能很容易地设计出在本文所限定的特定寡核苷酸发生杂交的位置与植物基因组的区域(例如在50个核苷酸内)进行紧密杂交的变形。特别是,这包括编码相同的多肽或氨基酸序列、但核苷酸序列因遗传密码冗余而变化的多核苷酸。术语“多核苷酸变形”和“变形”还包括天然存在的等位基因变形。
[0200] 核酸构建体
[0201] 本发明包括包含本发明的多核苷酸的核酸构建体,以及含有这些的载体和宿主细胞,生产和使用它们的方法及其用途。本发明是指可操作地联结或连接的元件。“可操作地联结”或“可操作地连接”等是指多核苷酸元件以功能关联的方式连接。通常,可操作地联结的核酸序列是被连续连接、连续地并处在阅读框内,必要时接合两个蛋白编码区。当RNA聚合酶将两个编码序列转录成单RNA,编码序列是“可操作地联结到”另一个编码序列,如果被翻译的话,然后其被翻译为具有起源于两个编码序列的氨基酸的单个多肽。编码序列不需要与另一个序列连续,只要所表达的序列可最终被处理去生产所需蛋白。
[0202] 如本文所使用,术语“顺式作用序列”“顺式作用元件”或“顺式调控区”或“调控区”或类似术语应是指任何核苷酸序列,当其处在适当位置并被联结到可表达遗传序列时,其能够调控,至少部分遗传序列的表达。本领域技术人员将知道顺式调控区能够在转录或转录后水平激活、沉默、增强、抑制或改变基因序列的表达水平和/或细胞类型特异性和/或发育特异性。在本发明的优选的实施方案中,顺式作用序列是增强或刺激可表达的遗传序列表达的激活剂序列。
[0203] 将启动子或增强子元件“可操作地连接”到可转录的多核苷酸是指将可转录的多核苷酸(如蛋白编码多核苷酸或其它转录物)置于启动子的调控下,从而控制那个多核苷酸的转录。在构建异源启动子/结构基因组合中,一般优选将启动子或其变形置于距离可转录多核苷酸的转录起始位点一段距离,大概与在自然环境中对照的启动子和蛋白编码区之间的距离相同;即从启动子所起源的基因。如本领域所已知的,在该距离内一些变形可以无功能损失地被容纳。类似地,调控序列元件(如操纵子、增强子等)相对于待置于其控制下的可转录多核苷酸的优选定位由在自然环境下元件的定位来界定;即它所起源的基因。
[0204] 如本文所使用的“启动子”或“启动子序列”是指基因的区域,一般RNA编码区的上游(5’),其控制受关注细胞中转录的起始和水平。“启动子”包括经典的基因组基因的转录调控序列,如TATA盒和CCAAT盒序列,以及响应于发育和/或环境刺激或以一种组织特异性或细胞类型特异性方式改变基因表达的其它调控元件(即,上游激活序列、增强子和沉默子)。启动子常常,但未必(例如,某些PolIII启动子),定位于其所调控表达的结构基因的上游。此外,包含启动子的调控元件常常定位在基因转录起始位点的2kb内。启动子可能含有其它特异调控元件,位于起始位点更远侧以进一步增强细胞内的表达,和/或以改变其可操作地联结的结构基因表达的时间或可诱导性。
[0205] “组成型启动子”是指在如植物的生物体的很多或全部组织中引导可操作地连接被转录序列的表达。本文所使用的术语组成型未必表明在全部细胞类型中基因以相同的水平表达,但表明基因在大范围的细胞类型中表达,虽然某些变形的水平往往是可以检测出的。本文所使用的“选择性表达”是指几乎只在(如植物)特定器官内表达,如,胚乳、胚、叶、果、茎或根。在一个优选的实施方案中,启动子在植物的叶和/或茎中选择性或优先地表达,优选地谷类植物。因此,选择性表达可能与组成型表达相反,后者是指在植物所经历的大部分或全部条件下在植物的很多或全部组织中表达。
[0206] 选择性表达也可能导致在特定植物组织、器官或发育阶段基因表达产物的区室化。在特定的亚细胞位置(如质体、胞液、液泡或质外体间隙)中的区室化可能通过适当信号的基因产品的结构的包含物来实现,如信号多肽,用于转运到所需的细胞腔隙,或对于半自主性细胞器(质体和线粒体)通过将适当调控序列的转基因直接整合入细胞器的基因组来实现。
[0207] “组织特异性启动子”或“器官特异性启动子”是相对于优先在一个组织或器官表达的启动子,相对于很多其它组织或器官,优选大多数(如果不是全部其它组织或器官在,例如,植物)。通常,启动子在特定性组织或器官比其它组织或器官表达水平高10倍。
[0208] 在一个实施方案中,启动子是茎特异性启动子、叶特异性启动子或引导植物地上部分(至少茎和叶)基因表达的启动子(绿色组织特异性启动子)如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(RUBISCO)启动子。
[0209] 茎特异性启动子的实例包括,但不限于在US5,625,136和Bam等(2008)所描述的那些。
[0210] 本发明所设想的启动子可能源于待转化的宿主植物或可能起源于替代来源,在宿主植物中其所在的区是功能性的。其它来源包括农杆菌(Agrobacterium)T-DNA基因,如用于胭脂碱、章鱼碱(octapine)、甘露碱或其它冠瘿碱启动子生物合成的基因启动子,组织特异性启动子(见,如US 5,459,252和WO 91/13992);来自病毒的启动子(包括宿主特异性病毒),或部分或全部合成的启动子。本领域内熟知在单-双子叶植物中的大量功能性启动子(见,例如,Greve,1983;Salomon等,1984;Garfinkel等,1983;Barker等,1983);包括各种从植物和病毒分离出的启动子如花椰菜花叶病毒启动子(CaMV 35S,19S)。评价启动子活性的非限制方法由Medberry等(1992,1993),Sambrook等(1989,同上)和US5,164,316公开。
[0211] 或者或此外,启动子可能是可诱导型启动子或能够在如植物等的适当的发育阶段驱动被引入多核苷酸表达的发育调控启动子。其它可能被采用的顺式作用序列包括转录和/或翻译增强子。增强子区为本领域技术人员所熟知,并包括ATG翻译起始密码子和邻近序列。当被包含时,起始密码子可能与与外源或外源性多核苷酸有关的编码序列的阅读框同相以确保整个序列的翻译(如果其要被翻译)。翻译起始区可能由转录起始区的来源提供,或由外源或外源性多核苷酸提供。序列还可起源于选择用于驱动转录的启动子的来源,且被特定修饰以增加mRNA的翻译。
[0212] 本发明的核酸构建体可能包含约50至1000个核苷酸碱基对的3’非翻译序列,其包括转录终止序列。3’非翻译序列可能含有转录终止信号,其可或可不包含多聚腺苷酸化信号和任何能够影响mRNA加工的其它调控信号。多聚腺苷酸化信号作用在将多聚腺苷酸束添加到mRNA前体的3’端。尽管变异并不常见,但普遍通过与5'AATAAA-3'的典型形式同源性的存在而识别多聚腺苷酸化信号。不包括多聚腺苷酸化信号的转录终止序列包括包含一段4个或更多胸腺嘧啶脱氧核苷的PolI或PolIII RNA聚合酶的终止子。合适的3’非翻译序列的实例是3’转录的非翻译区,其含有来自根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)的章鱼碱合成酶(ocs)基因或胭脂碱合成酶(nos)基因的多聚腺苷酸化信号(Bevan等,1983)。合适的3’非翻译序列的实例还可能起源于植物基因如核酮糖-1,5-二磷酸羧化酶(ssRUBISCO)基因,尽管本领域技术人员已知的其它3’元件也可被采用。
[0213] 由于转录起始位点和编码序列起始处所插入的DNA序列,即非翻译5’前导序列(5’UTR),如果其被翻译且被转录,则可影响基因表达,一个还可采用特定前导序列。合适的前导序列包括包含被选择用于引导外源或外源性DNA序列的最佳表达的序列的序列。例如,关于Joshi(1987)所描述的实例,这些前导序列包括可增加或保持mRNA稳定性以及防止翻译不当起始的优选的共有序列。
[0214] 载体
[0215] 本发明包括载体用于基因结构的操作和转移的用途。“嵌合载体”是指核酸分子,优选地例如起源于质体、噬菌体或植物病毒的DNA分子,核酸序列可能被插入或克隆至其中。优选的载体是双链DNA,并含有一个或多个独特的限制性位点,且可以能够在包括靶细胞或组织或祖细胞或其组织的限定的宿主细胞内进行自主复制,或能够整合入所限定宿主的基因组,以便被克隆的序列可以复制。因此,载体可能是自主复制的载体,即以染色体外实体存在的载体,其复制独立于染色体的复制,如线性或闭合环状质体,染色体外元件、微型染色体或人工染色体。载体可能含有保证自我复制的任何方式。或,当被引入到细胞时,载体可能被整合入受体细胞的基因组内并与其所已经整合入的染色体一起复制。载体系统可包括单个载体或质体,一起包含待引入到宿主细胞基因组中的总DNA的两个或多个载体或质体,或转座子。选择载体通常将依赖于载体与其待引入的细胞的相容性。载体也可包括选择标记物如抗生素抗性基因、除草剂抗性基因或其它用于选择合适转化体的基因。这些基因的实例为本领域技术人员所熟知。
[0216] 本发明的核酸构建体可被引入到载体,如质体。质体载体通常包括能在真核和原核细胞中提供方便地选择、扩增和转化表达盒的额外的核酸序列,如pUC-起源载体、pSK-起源载体、pGEM-起源载体、pSP-起源载体、pBS-起源载体或含有一个多个T-DNA区的二元载体。额外的核酸序列包括提供载体自主复制的复制起端,可选择标记基因,优选地编码抗生素或除草剂抗性,提供用于插入在核酸构建体中所编码的核酸序列或基因的独特多克隆位点以及增强真核和原核(特别是植物)细胞转化的序列。
[0217] “标记基因”是指将不同的表型传给予表达该标记基因的细胞的基因,且因此可以使此转化细胞与不具有该标记的细胞相区分。可选择的标记基因赋予特性,使其可基于对选择剂的抗性来选择(如,除草剂、抗生素、辐射、热或其它对非转化细胞的损害处理)。可筛选的标记基因(或报告基因)赋予可通过观察或试验鉴定的特性,即,通过“筛选”(如β-葡萄糖酸酶、荧光素酶、GFP或其它在非转化细胞内不存在活性的酶)。标记基因和受关注核苷酸序列不必被连接。
[0218] 为了便于鉴定转化体,理想的核酸构建体包含可选择的或可筛选的标记基因,如,或还有,外源或外源性多核苷酸。标记的实际选择并不严格,只要它在与选择的植物细胞联合时具有功能(即,具有选择性)。不必连接标记基因和受关注外源或外源性多核苷酸,因为未连接基因的共转化在植物转化中也是有效方法,例如,如US4,399,216中所描述的。
[0219] 细菌可选择标记的实例是赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、红霉素、氯霉素或四环素抗性的标记,优选地卡那霉素抗性。用于选择植物转化体的示例性可选择标记物包括,但不限于,编码抗潮霉素B抗性的hyg基因;赋予对卡那霉素、巴龙霉素、G418抗性的新霉素磷酸转移酶(nptII)基因;赋予对谷胱甘肽衍生除草剂的抗性、来自大鼠肝脏的谷胱甘肽-S-转移酶基因,如EP 256223中所描述的;过表达时赋予对谷氨酰胺合成酶抑制剂如草丁膦的抗性的谷氨酰胺合成酶基因,例如,如WO 87/05327所描述的,赋予对选择剂草丁膦的抗性来自产绿色链霉菌(Streptomyces viridochromogenes)的乙酰转移酶基因,例如,如EP 275957所描述的,编码赋予对N-膦酰甲基甘氨酸的耐性的5-烯醇丙酮莽草酸-3-磷酸酯合酶(EPSPS)的基因,例如,如Hinchee等(1988)所描述的,赋予对双丙氨酰林的抗性的bar基因,例如,如WO91/02071中所描述的;赋予对溴草腈的抗性来自臭鼻克雷伯氏菌(Klebsiella ozaenae)的腈水解酶基因如bxn(Stalker等,1988);赋予对氨甲蝶呤的抗性的二氢叶酸还原酶(DHFR)基因(Thillet等,1988);突变的乙酰乳酸合成酶基因(ALS),其赋予对咪唑啉酮类、磺酰脲类或其它ALS-抑制化合物的抗性(EP154,204);赋予对5-甲基色氨酸的抗性的突变的邻氨基苯甲酸合成酶基因;或赋予对除草剂抗性的茅草枯脱卤酶基因。
[0220] 优选的可筛选的标记物包括,但不限于,编码β-葡萄糖醛酸酶(GUS)的uidA基因(该酶各种显色第五已知),编码显色底物已知的酶的β-半乳糖苷酶基因,应用于敏感生物发光检测的水母发光蛋白基因(Prasher等,1985);绿色荧光蛋白基因(Niedz等,1995)或其衍生物;允许生物发光检测的荧光素酶(luc)基因(Ow等,1986),以及其它本领域所已知的。本说明书中所使用的“报告基因”是指按照其化学特性提供便于通过蛋白产物来鉴定启动子的活性的分析可识别信号的分子。
[0221] 优选地,核酸构建体稳定并入例如植物的基因组中。因此,核酸包括允许分子并入基因组的适当的元件,或构建体被置于能够并入植物细胞的染色体的适当的载体中。
[0222] 本发明的一个实施方案包括重组载体,其包括至少一个被插入到能够将核酸分子传递到宿主细胞的任何载体的本发明的多核苷酸分子。此类载体含有异源核酸序列,即发现与本发明的核酸分子非自然相邻的核酸序列和优选衍生自除了核酸分子所衍生的物种的物种的核酸序列。载体可以是RNA或DNA,真核或原核,且通常是病毒或质体。
[0223] 很多适于植物细胞稳定转染或适于建立转基因植物的载体已经在如Pouwels等,Cloing Vectors:A Laboratory Manual,1985,增刊,1987;Weissbach和Weissbach,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,1989;和Gelvin等,Plant Molecular Biology Manual,Kluwer Academic Publishers,1990。通常,植物表达载体包括,例如,一个或多个在5’和3’调控序列和显性可选择的标记物的转录控制下被克隆的植物基因。此植物表达载体也含有启动子调控区(如控制可诱导的或结构性的、环境调控的或发育调控的,或细胞特异性或组织特异性表达的调控区)、转录起始位点、核糖体结合位点、RNA加工信号、转录终止位点和/或多聚腺苷酸化信号。
[0224] 本发明的蛋白水平可通过增加编码植物细胞内该蛋白的核苷酸序列的表达水平或通过减少编码植物中该蛋白的基因的表达水平来进行调节,从而导致修饰的病原抗性。基因的表达水平可通过改变每个细胞的拷贝数来进行调节,例如通过引入包含编码序列及其可操作性联结的、在细胞具有功能的转录控制元件的合成基因构建体。多个转化体可能被选择并筛选出具有有利水平和/或起因于转基因整合位点周围内源序列的影响的转基因表达特异性的那些转化体。转基因表达的有利水平和形式是导致病原抗性或其它表型的实质性修饰的水平和形式。或,可能筛选诱变的种子种群或来自育种计划的植物种群中具有改变的病原抗性或与病原抗性有关的其它表型的单个系。
[0225] 重组细胞
[0226] 本发明的另一个实施方案包括包含由一个或多个本发明的重组分子所转化的宿主细胞的重组细胞或其子代细胞。将核酸分子转化到细胞可以通过将核酸分子插入到细胞的任何方法来完成。转化技术包括,但不限于转染、电穿孔、微注射法、脂质转染法、吸附法和原生质体融合。重组细胞可保持单细胞或可生长成为组织、器官或多细胞生物体。本发明的转化的核酸分子以保留它们表达能力的一种方式可保持染色体外或可整合入被转化(即,重组的)细胞的染色体内一个或多个位点。优选的宿主细胞是植物细胞,更优选地谷类植物细胞,更优选地大麦或小麦细胞,甚至更优选地小麦细胞。
[0227] 转基因植物
[0228] 本文所使用的名词术语“植物”指的是整个植物,以及是指植物界的任何诚意,但作为形容词,是指存在于、获取于、衍生自或相关于植物的任何物质,如,植物器官(如叶、茎、根、花)、单个细胞(如花粉)、种子、植物细胞等。植株和根和苗所来自的发芽的种子也被包括在“植物”的意思中。本文所使用的“植物部分”是指从植物中所获取的一个或多个植物组织或器官,其包含植物的基因组DNA。植物部分包括营养结构(例如,叶、茎)、根、花器官/结构、种子(包括胚、子叶和种皮)、植物组织(例如,脉管组织、基本组织等)、细胞及其子代。本文所使用的术语“植物细胞”是指从植物中获取的细胞或在植物中的细胞,且包括原生质体或衍生自植物的其它细胞、配子生产细胞和再生成完整植物的细胞。植物细胞可能是在培养中的细胞。“植物组织”是指植物中分化的组织或从植物(“移植物”)或衍生自未成熟或成熟的胚、种子、根、苗、果实、块茎、花粉、肿瘤组织(冠瘿)的未分化的组织中获取,以及培养中植物细胞不同形式的聚集物,如愈伤组织。在或源自种子中的示例性植物组织是子叶、胚和胚轴。因此本发明包括植物和植物部分和包含这些的产品。
[0229] 如本文所使用的,术语“种子”指的是植物的“成熟种子”,其或准备被收获或已经从植物被收获,通常在田地中被商业收获,或是“发育中的种子”在受精后和建立种子休眠之前和收货前在植物中出现。
[0230] 本发明所使用的“转基因植物”是指含有在相同物种、变种或栽培品种的野生型植物中未发现的核酸构建体的植物。也就是说,转基因植物(转化植物)含有转化之前不含有的遗传物质(转基因)。转基因可包括从植物细胞、其它植物细胞中获取或衍生自这些细胞的遗传序列,或非植物来源,或合成序列。通常,通过人为操作如,例如,通过转化将转基因引入到植物源,但可使用任何方法作为本领域所识别的技术中的一种。遗传物质优选地稳定整合入植物的基因组。被引入的遗传物质可能包含在相同物种以天然状态存在但以重新排列的顺序或不同的元件排列的序列,如反义序列。在本文中的“转基因植物”中包括含有这些序列的植物。
[0231] “非转基因植物”是已经通过重组DNA技术引入遗传物质被遗传修饰的植物。在一个优选的实施方案中,转基因植物对于每一和每个已经被引入的基因(转基因)是纯合的,因此它们的子代不会分离所需表型。
[0232] 如本文中所使用的,术语“相较于等基因植物”,或类似短语,是指相对于转基因植物,但不具有受关注转基因的等基因的植物。优选地,相应的非转基因植物具有与受关注转基因植物的前体相同的栽培品种或变种,或缺乏构建体的同胞植物系,往往被称为“分离子”,或发生“空载体”构建体转化的相同栽培品种或变种的植物,其可能是非转基因植物。“野生型”,如本文所使用的,是指尚未根据本发明进行修饰的细胞、组织或植物。野生型细胞、组织或植物可能被用作对照以与修饰的细胞、组织或植物比较外源核酸的表达水平或特性修饰的程度和性质,如本文所描述。
[0233] 转基因植物,如本发明的上下文所限定的,包括已使用重组技术进行遗传修饰的植物的后代,其中后代包含受关注转基因。此类后代可能通过原发转基因植物的自花传粉或通过将此植物与相同物种的其它植物杂交来获取。这一般在所需植物或植物器官中调节至少一个本文所限定的蛋白的生产。转基因植物部分包括包含转基因的植物的全部部分和细胞,如培养的组织、愈伤组织和原生质体。
[0234] 考虑用于本发明实践的植物包括单子叶植物和双子叶植物。靶植物包括,但不限于,如下:谷类(例如,小麦、大麦、黑麦、燕麦、水稻、玉米、高粱和相关作物);葡萄;甜菜(糖用甜菜和饲用甜菜);梨果、核果和软水果(苹果、梨、李子、桃子、杏仁、樱桃、草莓、覆盆子、黑莓);豆科植物(蚕豆、扁豆、豌豆、大豆);油料作物(油菜或其它芸薹属、芥末、罂粟、橄榄、向日葵、红花、亚麻、椰子、蓖麻油植物、可可豆、花生);黄瓜植物(葫芦、黄瓜、甜瓜);纤维植物(花、亚麻、大麻、黄麻);柑橘类水果(橙橘、柠檬、柚子、柑橘);蔬菜(菠菜、生菜、芦笋、卷心菜、胡萝卜、洋葱、西红柿、土豆、辣椒);樟科(鳄梨、肉桂、樟脑)或植物如玉米、烟草、坚果、咖啡、甘蔗、茶叶、藤蔓、啤酒花、草皮、香蕉和天然橡胶植物,以及观赏植物(花卉、灌木、阔叶树和常青树如针叶树)。优选地,植物是谷类植物,更优选地小麦、水稻、玉米、黑小麦、燕麦或大麦,甚至更优选地小麦。
[0235] 如本文所使用的,术语“小麦”是指小麦属的任何物种,包括其前体,以及通过其与其它物种杂交生产的其子代。小麦包括“六倍体小麦”,其具有AABBDD的基因组构成,由42条染色体构成;以及“四倍体小麦”,其具有AABB的基因组构成,由28条染色体构成。六倍体小麦包括普通小麦(T.aestivum)、斯卑尔脱小麦(T.spelta)、莫迦小麦(T.macha)、密穗小麦(T.compactum)、印度圆粒小麦(T.sphaerococcum)、瓦维洛夫小麦(T.vavilovii)及其种间杂交。六倍体小麦的优选种为T.aestivum ssp aestivum(也被称为“面包小麦”)。四倍体小麦包括T.durum(本文也被称为硬质小麦或Triticum turgidum ssp.durum)、野生二粒小麦(T.dicoccoides)、二粒小麦(T.dicoccum)、波兰小麦(T.polonicum)及其种间杂交.此外,术语“小麦”包括六倍体或四倍体小麦属的潜在前体,如对于A基因组,为乌拉尔图小麦(T.uartu)、一粒小麦(T.monococcum)或野生一粒小麦(T.boeoticum),对于B基因组,为拟斯卑尔脱山羊草(Aegilops speltoides),以及对于D基因组,为节节麦(T.tauschii)(也被称为粗山羊草(Aegilops squarrosa)或山羊草(Aegilops tauschii))。尤其优选的前体是A基因组的前体,甚至更优选地A基因组的前体是一粒小麦。用于本发明的小麦栽培品种可属于,但不限于,上述所列物种的任一种。还涵盖使用小麦属作为有性杂交中的亲本与非小麦属(如黑麦[Secale cereale])通过传统技术产生的植物,非小麦属包括但不限于黑小麦(Triticale)。
[0236] 如本文所使用的,术语“大麦”指的是大麦属(Genus Hordeum)的任一物种,包括其前体,以及通过与其它种杂交生产的其子代。优选商业化种植的大麦种的植物如大麦(Hordeum vulgare)或适于粮食商品生产的株系或栽培品种或变种。
[0237] “转基因植物”,如在本发明的上下文中所限定的,包括已经使用重组技术在遗传上改变的植物(以及植物的部分和细胞)及其子代,该重组技术使得在所需植物或植物器官中产生至少一种本发明的多肽。使用本领域已知的技术生产转基因植物,如在A.Slater等,Plant Biotechnology-The Genetic Manipulation of Plants,Oxford University Press(2003)和P.Christou and H.Klee,Handbook of Plant Biotechnology,John Wiley和Sons(2004)中所述的那些。
[0238] 在一个优选的实施方案中,转基因植物对于已经被引入的每个基因(转基因)是纯合的,使得它们的子代对于所需表型不分离。转基因植物对于引入的转基因也可以是杂合的,如例如,在F1子代中,其式从杂交种子生长得到的。此植物可提供本领域公知的优势如杂交优势。
[0239] 如本文所使用的,“其它遗传标记”可能是任何连接到植物所需特性的分子。此类标记为本领域技术人员所熟知,包括连接到决定特性(如疾病抗性)、产量、植物形态、籽粒质量、休眠特性、籽粒颜色、种子中赤霉酸度、植物高度、粉末颜色等的基因的分子标记。此类基因的实例是条锈病抗性基因Yr10或Yr17、线虫抗性基因如Cre1和Cre3、确定面团强度的谷蛋白位点的等位基因如Ax,Bx,Dx,Ay,By和Dy等位基因、确定半矮杆生长习性和从而倒伏抗性的Rht基因。
[0240] 将基因直接传递入细胞的四种一般方法已经描述如下:(1)化学方法(Graham等,1973);(2)物理方法如微注射(Capecchi,1980);电穿孔(见,例如,WO 87/06614,US 5,472,
869,5,384,253,WO 92/09696和WO 93/21335)与基因枪(见,例如,US 4,945,050和US 5,
141,131);(3)病毒载体(Clapp,1993;Lu等,1993;Eglitis等,1988);和(4)受体介导机制(Curiel等,1992;Wagner等,1992)。
[0241] 可使用的加速方法包括,例如微粒轰击等。将转化的核酸分子传递到植物细胞的方法的实例是微粒轰击。该方法已由Yang等,Particle Bombardment Technology for Gene Transfer,Oxford Press,Oxford,England(1994)综述。用核酸涂覆在非生物颗粒(微粒),并通过推进力将其传递到细胞。示例性颗粒包括由钨、金、铂等所组成的那些颗粒。除了其是可重复转化单子叶植物的有效方法,微粒轰击的特定优势在于既不需要分离原生质体,也不需要农杆菌感染的易感性。适合本发明使用的微粒传递系统是氦加速PDS-1000/He枪,其可从Bio-Rad实验室获得。对于轰击,可将不成熟的胚或源自不成熟胚的靶细胞如盾片或愈伤组织排列在固体培养基上。
[0242] 在另一个替代实施方案中,可稳定地转化质体。所公开的在较高等植物中的质体转化的方法包括含有选择标记的DNA的颗粒枪传递,且通过同源重组将DNA靶向定位到质体基因组中(US 5,451,513,US 5,545,818,US 5,877,402,US 5,932479和WO 99/05265)。
[0243] 农杆菌介导转移是广泛适用于将基因引入植物细胞的系统,由于DNA可被引入到整个植物组织中,从而绕过从原生质体再生完整植物的需要。本领域已熟知农杆菌介导植物整合载体用于将DNA引入植物细胞(见,例如,US 5,177,010,US 5,104,310,US 5,004,863,US 5,159,135)。此外,T-DNA的整合是一个相对精确的方法,几乎不导致重排。待转移的DNA区由边界序列进行限定,且间插DNA常常插入到植物基因组中。
[0244] 农杆菌转化载体能够在大肠杆菌(E.coli)以及农杆菌复制,如描述的方便操作(Klee等,Plant DNA Infectious Agents,Hohn和Schell,(编辑),Springer-Verlag,New York,(1985):179-203)。此外,农杆菌介导的基因转移的载体的技术进步,已改善基因排列和载体中的限制性位点,以便于构建能够表达各种多肽编码基因的载体。所描述的载体具有与启动子和多聚腺苷酸化位点侧面连接的便捷的多接头区,用于直接表达所插入的多肽编码基因,且载体适合用于本文的目的。此外,含有装配了Ti基因或未装配Ti基因的农杆菌可用于转化。在那些农杆菌介导的转化有效的植物品种上,由于基因转移的方便性和限定的属性,这是一种选择的方法。
[0245] 用农杆菌转化方法所形成的转基因植物通常在一条染色体上含有单个遗传位点。此类转基因植物可以被称为所加入的基因的半合子。更优选的是对于加入的结构基因是纯合的转基因植物;即含有两个加入的基因的转基因植物,在染色体对的每一染色体上相同位点处各有一个基因。纯合的转基因植物可通过下述步骤获取:使含有单个所加入基因的独立分离转基因植物进行有性交配(自交),使某些所生产的种子发芽并分析所得到的植物的受关注基因。
[0246] 还应理解的是,可以使两个不同的转基因植物交配来产生含有两个独立分离外源基因的后代。合适的子代的自交可以产生两个外源基因纯合的植物。还应考虑与亲本植物的回交和与非转基因植物的杂交,如无性繁殖。普遍用于不同特性和作物的其它繁殖方法的描述可在Fehr,Breeding Methods for Cultivar Development,J.Wilcox(editor)American Society of Agronomy,Madison Wis.(1987)中发现。
[0247] 使用基于磷酸钙沉淀、聚乙二醇处理、电穿孔和这些处理的组合的方法来实现植物原生质体的转化。将这些系统应用于不同植物变种,取决于从原生质体再生特定的植物品种的能力。从原生质体再生谷类的说明性的方法被描述(Fujimura等,1985;Toriyama等,1986;Abdullah等,1986)。
[0248] 也可使用其它细胞转化的方法,且这些方法包括但不限于通过引导DNA转移进入花粉、引导DNA注射入植物的繁殖器官或通过引导DNA注射入不成熟的胚细胞随后干燥胚胎补液将DNA引入植物。
[0249] 来自单个植物原生质体转化体或来自各种转化外植体的植物的再生、发育和种植是本领域所熟知的(Weissbach等,Methods for Plant Molecular Biology,Academic Press,San Diego,(1988))。再生和生长过程通常包括以下步骤:选择转化的细胞,培养这些个体化的细胞通过胚胎发育常见阶段到生根幼苗阶段。以类似方法再生转基因胚胎和种子。然后将得到的转基因生根幼苗种植到合适的植物生长培养基中,如土壤
[0250] 含有外源、外源性基因的植物的发育或再生是本领域所熟知的。优选地,再生的植物是自花授粉以便提供纯合转基因植物。或,从再生的植物获取的花粉与农业上重要品种的种子长成的植物进行杂交。相反,这些重要品种的植物的花粉用来对再生植物授粉。使用本领域技术人员所熟知的方法培养含有所需外源核酸的本发明的转基因植物。
[0251] 用于转化双子叶植物,主要是通过使用根癌农杆菌,和获取转基因植物的方法已经公布,用于棉花(US 5,004,863,US 5,159,135,US 5,518,908);大豆(US 5,569,834,US 5,416,011);芸薹属(US 5,463,174);花生(Cheng等,1996)和豌豆(Grant等,1995)。
[0252] 用于将谷类植物(如小麦和大麦)转化为通过引入外源核酸将遗传变形引入到植物的方法,以及植物从原生质体或植物不成熟的胚再生的方法为本领域所熟知,例如,见CA2,092,588,AU 61781/94,AU 667939,US 6,100,447,WO 97/048814,US 5,589,617,US 6,541,257,及其它方法在WO 99/14314阐述。优选地,通过根癌农杆菌介导的转化操作生产转基因小麦或大麦植物。携带所需核酸构建体的载体可能被引入到组织培养植物或外植体的可再生小麦细胞或合适的植物系统,例如原生质体。可再生小麦细胞优选来自不成熟的胚的盾片、成熟的胚及衍生自这些的愈合组织,或分生组织。
[0253] 为确认转基因在转基因细胞和植物中存在,可以使用本领域技术人员已知的方法,进行聚合酶链反应(PCR)扩增或Southern印迹分析。根据转基因表达产物的性质,可以采用多种方法中的任何一种检测产物,其中包括Western印迹分析和酶测定。一种在不同植物组织中定量蛋白表达和检测复制的尤其有效的方法是使用报告基因,例如GUS。一旦获取转基因植物,就可以培养植物,生产具有所需表型的植物组织或部分。可以收获植物组织或植物部分,和/或收集种子。种子可以用作培养其它植物的来源,植物包含具有所需特征的组织或部分。
[0254] 标记辅助选择
[0255] 标记辅助选择是一种在经典育种计划中当与轮回亲本回交时选择杂合植物的公认的方法。在每个回交世代中植物的种群将对于受关注基因是杂合的,在回交种群中以1:1的比率正常存在,且分子标记可用于区分基因的两个等位基因。通过从如幼苗中提取DNA,并用特定标记测试所植入的所需特性,可以选择用于进一步回交的植物而能量和资源集中于较少的植物。为进一步加快回交计划,未成熟种子的胚(开花后25天)可被切除并在无菌条件下在营养介质中生长,而非成熟种子。该工艺,被称为“胚拯救”,用于在三叶期与DNA提取结合使用,并分析至少一个赋予植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性的Lr67等位基因或变形,优选地对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病中的一个或多个或全部,允许快速选择携带所需特性的植物,其可在温室或田间培育成熟以用于随后进一步与轮回亲本回交。
[0256] 本领域中已知的任何分子生物学技术可用于本发明的方法。此类方法包括,但不限于,使用核酸扩增、核酸测序、核酸与合适的标记探针杂交、单链构象分析(SSCA)、变性梯度凝胶电泳(DGGE)、异源双链分析(HET)、化学裂解分析(CCM)、催化核酸切割或其组合(见,例如,Lemieux,2000;Langridge等,2001)。本发明还包括使用分子标记技术来检测关于(如)Lr67基因的等位基因的多态性,该基因赋予植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性。此类方法包括限制性片段长度多态性(RFLP)、RAPD、扩增片段长度多态性(AFLP)和卫星(简单序列重复,SSR)多态性的检测或分析。可以通过本领域所熟知的方法很容易获取紧密相连的标记,如群体分离分析法(Bulked Segregant Analysis),如Langridge等,(2001)所综述。
[0257] 在一个实施方案中,标记辅助选择的相连位点至少在来编码本发明的多肽的基因1cM或0.5cM或0.1cM或0.01cM的范围内。
[0258] “聚合酶链反应”(“PCR”)是其中复制拷贝由靶多核苷酸形成的反应,该反应使用由“上游”和“下游”引物组成的“引物对”或“引物套”、聚合催化剂(如DNA聚合酶)并且通常是热稳定聚合酶。例如,在“PCR”(M.J.McPherson和S.G Moller(编辑),BIOS Scientific Publishers Ltd,Oxford,(2000))中教导本领域已知PCR的方法。可在获自逆转录mRNA的cDNA上进行PCR,逆转录mRNA从表达Lr67基因或等位基因的植物细胞中分离得到,Lr67基因或等位基因赋予植物对一个或多个活体营养性真菌病原的抗性,优选地赋予对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的一个或多个或全部的抗性。然而,如果对从植物分离的基因组DNA进行PCR,一般将会更加容易。
[0259] 引物是能够以序列特异性方式与靶序列杂交的寡核苷酸序列,并在PCR过程中被延伸。扩增子或PCR产物或PCR片段或扩增产物是包含引物和靶序列新合成拷贝的延伸产物。多重PCR系统含有多套引物,其导致超过一个的扩增子的同时生产。引物可与靶序列完全匹配或它们可能含有内部不匹配的碱基,这会导致在特异性靶序列中引入限制酶或催化核酸识别/切割位点。引物还可含有额外的序列和/或含有修饰的或标记的核苷酸以便于捕获或检测扩增子。DNA热变性、引物退火至其互补序列和聚合酶作用下已退火的引物的延伸的重复循环导致靶序列的指数扩增。术语靶或靶序列或模板是指被扩增的核酸序列。
[0260] 核苷酸序列直接测序的方法为本领域技术人员所熟知,并在Ausubel等,(同上)和Sambrook等,(同上)中发现其实例。可通过任何合适的方法进行测序,例如,双脱氧测序、化学测序或其变化形式。直接测序具有确定特定序列的任何碱基对上的变化的优势。
[0261] TILLING
[0262] 可使用被称为TILLING的工艺来生产本发明的植物(基因组中靶向诱导的局部病变)。第一步骤,在植物种群中通过用化学诱变剂处理种子(或花粉)诱导被引入的突变,如新的单碱基改变),且然后将植物扩增一代,其中突变被稳定遗传。提取DNA,并储存来自种群全部成员的种子,以创建随着时间流逝可被反复获取的资源。
[0263] 对于TILLING测定,设计PCR引物以特异性地扩增单个受关注靶基因。如果靶是基因家族的成员或多倍体基因组的一部分,则特异性特别重要。其次,染料标记的引物可用于从多个个体汇集的DNA中扩增PCR产物。变性和退火这些PCR产物,以允许错配碱基对形成。错配,或异源双链体,代表天然产生的单核苷酸多态性(SNP)(即,来自种群的若干植物可能携带相同的多态性)和诱导的SNP(即,只有罕见的植物个体可能显示这种突变)。异源双链体形成后,使用可识别和分裂错配DNA的核酸内切酶(如Cel I)对于发现TILLING种群中新的SNP至关重要。
[0264] 使用这种方法,筛选很多植物来鉴定任何基因或基因组的特定区具有单个碱基改变以及小插入或缺失(1-30bp)的任何个体。所测定的基因组片段大小处于从0.3至1.6kb的范围。在8倍池中,每个测定96个泳道和1.4kb片段(忽视片段末端,其由于噪音SNP检测有问题),这个组合使每个测定中筛选基因组DNA中高达100万个碱基对,使得TILLING称为高通量技术。
[0265] Slade和Knauf(2005)和Henikoff等(2004)中进一步描述TILLING。
[0266] 除了允许有效检测突变,高通量TILLING技术对于检测天然多态性也是理想的。因此,通过与已知序列形成异源双链询问未知同源DNA揭示多态位点的数量和位置。均可鉴定核苷酸改变和小的插入和缺失,包括至少一些重复数的多肽。这已经被称作Ecotilling(Comai等,2004)。
[0267] 通过SNP在一些核苷酸内的大致位置进行记录每一SNP。因此,基于单倍型的迁移率使每一单倍型存档。使用用于错配-切割测定的相同的被扩增的DNA的等分,用相对小的增量努力来获取序列数据。通过测序引物接近多肽性,选择单个反应的左测序引物或右测序引物Sequencher软件进行多个比对,并发现碱基改变,其在每一种情况下由凝胶带来确认。
[0268] 进行Ecotilling比当前发现大多数SNP所使用的方法-全测序更为便宜。筛选含有生态的DNA阵列的板,而非来自被诱变植物的DNA池。由于在近乎碱基对的分辨率以及各泳道的背景图案均一的凝胶上进行检测,可匹配同一大小的条带,从而在单步骤内发现和分型SNP。以这种方式,SNP的最终测序简单有效,通过用于筛选的相同PCR产物等分可直接进行DNA测序,这使得更为简单有效。
[0269] 植物/谷物加工
[0270] 本发明的谷物/种子,优选谷物和更优选地小麦谷物,或本发明的其它植物部分,可以使用本领域已知技术经加工以生产食物配料、食物或非食物产品。
[0271] 在一个实施方案中,产品是整谷物面粉如超细碾全谷物面粉,或由100%谷物制成的面粉。全谷物面粉包括精制面粉成分(精制的面粉或精制面粉)和粗粒含量(超细碾磨粗粒含量)。
[0272] 精制面粉是所制备的面粉,例如,通过碾磨和筛选清洁的谷物如小麦或大麦谷物。精制面粉的颗粒大小被描述为不低于98%的颗粒通过具有不大于“212微米(US金属丝70)”所指定的金属丝编织网的孔的面粉。粗粒部分至少包括糠和胚芽的其中一个。例如,胚芽是在谷物内核中发现的胚植物。胚芽包括脂质、纤维、维生素、蛋白、矿物质和植物营养素如黄酮类化合物。糠包括数个细胞层,并具有大量的脂质、纤维、维生素、蛋白、矿物质和植物营养素如黄酮类化合物。此外,粗粒部分可包括糊粉层,其也包括脂质、纤维、维生素、蛋白、矿物质和植物营养素,如黄酮类化合物。糊粉层虽然在技术上认为是胚乳部分,但呈现出很多与糠相同的特征,因此通常在碾磨过程中通常与糠和胚芽一起被去除。糊粉层含有蛋白、维生素和植物营养素,如阿魏酸。
[0273] 此外,粗粒部分可能与精制面粉成分相混合。粗粒部分可以与精制面粉成分相混合以形成全谷物面粉,从而提供相较于精制面粉具有更高营养价值、更高纤维含量和更高抗氧化能力的全谷物面粉。例如,粗粒含量或全谷物面粉可以不同含量用于替换烘焙制品、零食产品和食物产品的精致面粉或全谷物面粉。本发明的全谷物面粉(即,超细碾磨的全谷物面粉)可能直接销售给消费者,用于在它们的自制烘焙产品中。在一个示例性实施方案中,全谷物面粉的造粒情况是这样的:按全谷物面粉重量计算,98%的的颗粒低于212微米。
[0274] 在又一个实施方案中,灭活在全谷物面粉和/或粗粒含量的糠和胚芽内所发现的酶,以使全谷物面粉和/或粗粒含量保持稳定。稳定化是一种使用蒸汽、热、辐射或其它处理来灭活糠和胚芽层所发现的酶的工艺。已经稳定化的面粉保留其烹饪特征,并具有较长的保质期。
[0275] 在额外的实施方案中,全谷物面粉、粗粒含量或精制面粉可能是实物产品的成分(组成物),并可用于食物产品。例如,食物产品可以是百吉饼、饼干、面包、小圆面包、牛角面包、饺子、英式松饼、松饼、皮塔面包、速制烤饼(quickbread)、冷藏/冷冻面团、面团、烘焙豆、墨西哥玉米煎饼、辣椒、墨西哥玉米薄饼卷、玉米面团包馅卷、玉米粉圆饼、锅饼、即食谷物、即食餐点、馅、可微波餐点、核仁巧克力饼、蛋糕、奶酪蛋糕、咖啡蛋糕、饼干、甜点、糕点、甜面包、糖果、馅饼皮、馅饼馅、婴儿食品、烘焙混合料、面糊、拌粉、混合汁、肉增亮剂、肉类替代品、调味料、汤混合料、肉汁、掺油面粉糊、沙拉酱、汤、酸奶、面条、意大利面、拉面、炒面面条、捞面面条、淇淋包含物、糕、冰淇淋蛋卷、夹心冰淇淋、薄脆饼干、油煎面包块、炸面圈、蛋卷、膨化食品、水果和谷物棒、可微波零食产品、营养棒、烙饼、平价烘焙产品、咸脆饼干、布丁、基于燕麦产品、零食炸薯条、零食食物、零食组合、华夫饼、披萨饼皮、动物食物或宠物食物。
[0276] 在一个替代实施方案中,全谷物面粉、精制面粉或粗粒含量均是营养补充剂的成分。例如,营养补充剂可以是添加到含有一个或多个额外成分的日常饮食的产品,通常包括:维生素、矿物质、草药、氨基酸、酶、抗氧化剂、草药、香料、益生菌、提取物、益生元和纤维。本发明的全谷物面粉、精制面粉或粗粒含量包括维生素、矿物质、氨基酸、酶和纤维。例如,粗粒部分含有集中量的膳食纤维以及其它必需营养素,如维生素B、硒、铬、锰、镁和抗氧化剂,这对于健康膳食是必不可少的。例如,22克的本发明的粗粒含量提供33%的个体每日推荐纤维摄入量。营养补充剂可包括任何有助于个体整体健康的已知的营养成分,实例包括但不限于维生素、矿物质、其它纤维组分、脂肪酸、抗氧化剂、氨基酸、多爱、蛋白、叶黄素、核糖、ω-3脂肪酸和/或其它营养成分。补充剂可以以下列方式进行提供,但并不限于这些形式:即食混合饮料、即饮饮料、营养棒、薄脆饼、饼干、薄脆饼干、胶状丸粒、胶囊、咀嚼物、咀嚼片和药丸。一个实施方案以味混合饮料或麦芽酒型饮料的形式提供纤维补充剂,该实施方案作为儿童纤维补充剂可能特别具有吸引力。
[0277] 在一个额外的实施方案中,碾磨工艺可被用于制作多谷物面粉或多谷物粗粒含量。例如,可以将来自一种类型谷物的糠和胚芽磨碎并将其与另一类型谷类的磨碎的胚乳或全谷物谷类面粉相混合。或,可以将一种类型谷物的糠和胚芽磨碎并将其与另一类型谷物的磨碎的胚乳或全谷物谷类面粉相混合。可以预期本发明涵盖将一个或多个糠、胚芽、胚乳的任何组合与一个或多个谷物的全谷物面粉相混合。该多谷物的方法可用于制作定制面粉,并利用多类型的谷类谷物的质量和营养含量来制作面粉。
[0278] 可以预期可通过本领域已知的碾磨方法生产本发明的全谷物面粉、粗粒含量和/或谷物产品。一个示例性实施方案涉及在单流中磨碎谷物,未将谷物的胚乳、糠和胚芽分离至单独的流。将清洁并调制的谷物输送到第一通道研磨机,如锤磨机、滚筒碾粉机、针磨机、冲击式碾磨机、盘磨机、空气碾磨机、凹口研磨机等。谷物被磨碎后流出并被输送到筛具。此外,可以预期通过许多其它方法修饰或增强本发明的全谷物面粉、粗粒含量和/或谷物产品,如发酵、速溶、挤压、封装、烘烤、烘培等。
[0279] 麦粒发芽
[0280] 本发明所提供的麦芽酒型饮料涉及通过使用麦芽酒作为其起始原料的部分或全部所生产的酒精饮料(包括蒸馏饮料)和非酒精饮料。实例包括啤酒、发泡酒(低麦芽酒啤酒饮料)、威士忌、低酒精麦芽酒型饮料(例如,含有少于1%酒精的麦芽酒型饮料)和非酒精饮料。
[0281] 麦粒发芽是一种控制浸泡和发芽,随后使谷物(如大麦和小麦谷物)干燥的工艺。这一系列事件对于合成引起谷物修饰的许多酶很重要,谷物修饰是一种主要使死胚乳细胞壁解聚并调动谷物营养素的工艺。在随后的干燥方法中,由化学褐变反应生产气味和颜色。
虽然麦芽酒主要用于饮料生产,但是它还可以用于其它工业过程中,例如在烘焙业中作为酶的来源,或在食品业中作为调味剂着色剂,如作为麦芽酒或麦芽酒粉,或直接作为麦芽酒糖浆等。
[0282] 在一个实施方案中,本发明涉及生产麦芽酒组合物的方法。该方法优选地包括以下几个步骤:
[0283] (i)提供谷物,如本发明的大麦或小麦谷物,
[0284] (ii)浸泡谷物,
[0285] (iii)使所浸泡的谷物在预定的条件下发芽以及
[0286] (iv)干燥发芽的谷物。
[0287] 例如,可通过Hoseney(Principles of Cereal Science and Technology,第二版,1994:American Association of Cereal Chemists,St.Paul,Minn.)所描述的方法的任何一种生产麦芽酒。然而,本发明还使用任何其它适用于生产麦芽酒的方法,如生产特种麦芽酒的方法,包括但不限于,烘烤麦芽酒的方法。
[0288] 麦芽酒主要用于酿造啤酒,但还用于生产蒸馏酒。酿造包括生产麦芽酒汁、主要和次要发酵以及后处理。首先碾磨麦芽酒,并将其搅拌成水并加热。在这个“糖化”期间,在麦粒发芽中激活的酶使谷粒的淀粉降解成可发酵的糖。澄清所生产的麦芽酒汁,并添加酵母,将混合物发酵并进行后处理。
[0289] 实施例
[0290] 实施例1.Lr67/Yr46基因是不同于Lr34/Yr18和Lr46/Yr29的成熟植物抗性基因[0291] 引言
[0292] 小麦中锈病抗性基因被分为两大类,其被称为幼苗和成熟植物抗性(APR)基因。幼苗抗性基因可在锈病病原作用于植物之后根据表型进行检测,且在幼苗期和成熟植物期间进行观察;这样它们在植物生长的全部阶段赋予抗性表型。相反,APR一般在幼苗期不能被检测到,但在幼苗后期的生长阶段可以被检测到,且经常作为田地中生长植物对病原的抗性。相反,通过改变生长温度和光照条件诱导某些APR基因在幼苗期表达,但在全部生长条件下,在幼苗期这些基因不能表达。此外,幼苗抗性基因通常呈现主要效应表型和不同的感染类型,而大多数的APR基因部分影响不同水平的疾病严重程度幼苗抗性基因的种族特异性更为常见。小麦中已经研究的很少的APR基因中,大多数似乎具有品种非特异性,且明显品种特异性数量有限。具有部分抗性的非品种特异的类别的那些与Caldwell(1968)首次描述的慢锈病表型有关。通常,相较于易感植物,慢锈病抗性在接种后的两周内显示较长的潜伏期、较少和更小的夏孢子堆。
[0293] 已经充分表征的非品种特异性基因中的一种是成熟植物叶锈病抗性基因Lr34(WO2010/022443)。此前被称为LrT2(Dyck 1977,1987),它存在于较成熟的南美小麦栽培品种如Frontana及其衍生物,上世纪初某些早期杂交小麦栽培品种以及某些小麦地方品种(从野生小麦中分离出的非栽培种类)尤其是中国起源的那些(Borghi 2001;Kolmer等,2008)。Lr34的重要特征是至今尚未报告小麦叶锈病病原的毒力,以及当Lr34基因在小麦栽培品种中结合其它品种特异性叶锈病抗性基因时锈病抗性增强的效应促成具有Lr34基因组合的小麦栽培品种的持久性(Kolmer,1996)。然而,已经报道Lr34基因的叶锈病分离菌之间锈病群体发育程度的变异性(Bender和Pretorius,2000)。在许多小麦背景下显示双锈病抗性中Lr34与成熟植物条锈病抗性基因Yr18共分离(McIntosh 1992;Singh 1992)可已促成Lr34/Yr18种质在小麦育种中的继续广泛使用。随后的观察Lr34/Yr18位点也促成对成熟植物白粉病(Pm38)的部分抗性-突出小麦染色体7D短臂上Lr34/Yr18/Pm38位点的多病原的本质(Spielmeyer等,2005;Lillemo等,2008)。
[0294] 化学和物理诱变法用于研究小麦染色体7DS上含有Lr34的多病原抗性位点(Spielmeyer等,2008)。易感突变体恢复,其在7DS上的QTL间隔中无DNA标记的损失。这些突变体随后显示出带有点突变,其中化学诱变剂已经创建单碱基替代。通过γ-射线辐射所产生的额外的突变体在多病原抗性位点处在编码ATP结合盒(ABC)转运蛋白的基因中具有单碱基缺失(Krattinger等,2009)。除了ABC转运蛋白,6个其它基因与抗性位点共分离,且遗传学上和物理上紧密相连。然而这些突变体(8个单独的突变体)无一在额外的基因上具有改变。因此,单独对ABC转运蛋白的诱变改变足以赋予Lr34/Yr18/Pm38所编码的叶锈病、条锈病和白粉病抗性全部丧失。结合单倍型分析和高分辨率定位,证实单个基因、ABC转运蛋白赋予全部三个抗性(Krattinger等,2009)。
[0295] Lr67/Yr46不同于Lr34/Yr18和Lr46/Yr29
[0296] 在Thatcher栽培品种中发展叶锈病抗性的近等基因系进程中,Dyck(1987)在系RL6077中观察到表型谱(Thatcher*6/PI250413),其类似于RL6058,一种携带Lr34/Yr18的近等基因系。在随后研究中,RL6077中APR独立分离于Lr34/Yr18,且有证据证明系间的易位差异。因此Dyck等(1994)推断RL6077是Lr34/Yr18基因的载体,但在于除了7DS的染色体上。随着紧密相连的遗传标记的发展,以及Lr34/Yr18的最终克隆,逐渐清楚地是,RL6077缺乏在RL6058中所存在的Lr34/Yr18a抗性单倍型,从而含有不同的APR基因(Kolmer等,2008;
Lagudah等,2009)。
[0297] 使用来自加拿大、墨西哥和澳大利亚的多位置的小麦叶锈菌和小麦条锈菌分离菌,对来自含有RL6077的杂交的图谱种群的研究,证实染色体4DL(染色体4D的常闭,在面包小麦上的D基因组)各个APR的共分离(Herrera-Foessel等,2011;Hiebert等,2010)。已将位于4DL上的抗性位点的这些APR基因指定为Lr67/Yr46。
[0298] 实施例2Lr67.(syn=Yr46=Sr55=Pm46)基因的克隆
[0299] 除了小麦基因型RL6077,两个其它小麦基因型,NP876和Sujata已被假定携带Lr67。这是基于叶尖坏死表型(Ltn)、慢锈叶锈感染和与RL6077上Lr67相连的简单序列重复(SSR)标记等位基因的存在(Hererra等,2011)。作为鉴定共分离标记和Lr67基因克隆的策略的一部分,本发明人研制出来自涉及成熟植物叶锈病和条锈病Avocet易感亲本杂交的重组自交(RI)家族。这些RI家族衍生于Avocet x RL6077、Avocet x Sujata和Avocet x NP876的杂交。还产生来自Thatcher x Thatcher+Lr67(RL6077)杂交的F2家族。然后在遗传图谱研究和突变实验中使用这些RI家族如下。
[0300] 首先,使用剂量为20krad的来自60Co源的γ辐射进行来自Lr67固定的Avocet x RL6077的衍生系的种群诱变。其次,在标准诱变条件下使用对甲基磺酸乙酯(EMS)的化学诱变用于生成使用小麦基因型RL6077的突变种群。从诱变的种群生产M2子代系,并测试每个M2子代系抗性表型的丧失。进行M2突变子代的田地评价,以鉴定Lr67基因失活引起的叶锈病抗性和条锈病抗性。在M3和M4期测试推定的突变体,以选择同源易感系。5个γ辐射系植物(被指定为γ318、γ676、γ1183、γ1239和γ1656)和2个EMS系(被指定为emsSu1和emsSu2)被鉴定为易感突变体。它们均显示丧失叶锈病和条锈病抗性表型以及叶尖坏死表型,表明单基因负责三个表型。EMS突变体的小麦基因型背景便于杆锈病和白粉病的评价,且每一突变体均显示对两种疾病的易感性,与在其子代和原始亲本中所观察的抗性相反。
[0301] 为了鉴定处在Lr67位点或与Lr67位点紧密相连的DNA序列,选择15个同源重组自交系(RIL)(每一来自抗性(Lr67R)和易感(Lr67S)表型),将其进行广泛的AFLP和SSR分析。基于PstI限制性内切酶来自15个抗性同源系的汇集的DNA的基因组文库,评价基因组复杂度降低文库的以SNP为基础的标记物。还可使用来自含有与Lr67紧密相连的SSR的小麦BAC克隆的序列(Hererra等,2011)作为锚定点进行比较基因组学的方法,以鉴定来自水稻和短柄草属(Brachypodium)基因组的同源基因(图1)。然后短柄草属1号染色体与水稻3号染色体之间的共线性区用于开发DNA标记物来扩增来自小麦和山羊草的对应序列,其紧密连接到小麦染色体4DL的D基因组前体(图1)。
[0302] 从Lr67相连的标记所生产的基因组复杂度降低文库的AFLP和SNP生成DNA标记,但与全部15个同源抗性和易感重组自交系均未共分离。然而,由比较基因组学方法所分离的、含Hsp70(热休克蛋白,见图1)域的伴侣蛋白编码基因的不同部分所分离的DNA片段完全连接到15个易感重组自交系,且在15个抗性系中不存在(图2)。在500个重组自交系内确认Hsp70伴侣蛋白的相连程度,并证实Hsp70伴侣蛋白的相连程度,以显示与Lr67位点的完全相关。基因组DNA印迹分析提供额外的证据表明在Lr67抗性亲本系、RL6077、Sujata和NP876中缺失编码Hsp70伴侣蛋白的基因。鉴于失去功能的易感突变体已从Lr67分离,在抗性植物中缺失的Hsp70伴侣蛋白基因不足以产生Lr67抗性表型。因此,在Hsp70近距离(21kb之内)搜索全部预测的基因序列,通过比较基因组学鉴定其它三个基因。它们是在水稻或短柄草属基因组图谱上,具有被注释为编码Sec14B细胞质因子家族蛋白、单糖转运蛋白(MST—紧密连接于糖转运蛋白-SUT)和蛋白相互作用/结合蛋白(PIP)的蛋白域的基因。
[0303] 确定在数个小麦品种和Lr67突变体中对应的基因的核苷酸序列。亲本系Thatcher(Lr67易感)、Avocet(Lr67易感)和Thatcher+Lr67(RL6077)的序列分析显示Sec14B基因中无差异,而MST和PIP基因揭示序列多肽性。在SUT基因中所发现两个SNP(C/G和T/G)是含Lr67的小麦所独有的(图4),而PIP的插入/缺失多肽性对于Lr67并非诊断性的。在520个重组自交系内建立SUT基因中的SNP与Lr67成熟植物锈病共分离。为保证无额外基因序列丢失或含有关短柄草属(染色体1)和水稻(染色体3)对应的合成区的Lr67的小麦染色体4DL区中未知重排,分析来自山羊草(D基因组前体)的对等的区。70kb的序列叠连群显示定位于在叠连群中21kb片段内的Hsp70、SUT和PIP存在,该区并无其它预测基因。当分析来自Thatcher x Thatcher+Lr67杂交的F2子代群的1152个植物时,这三个基因之间未检测到重组。
[0304] 对Lr67表型被灭活的突变体的分析,揭示对于Lr67区内SUT、PIP和从比较基因组学所鉴定的标记中的一些,三个γ突变体缺失(图3,如虚线所示的缺失)。然而突变体中的4个(2个EMS突变体和2个来自γ辐射的突变体,即,γ318和γ1239)保留在Lr67共分离的SUT和PIP基因。在这些突变体中SUT基因的序列分析只在SUT基因中发现单核苷酸改变和小缺失,但PIP中没有发现。在4个突变体中每一个突变改变均出现在氨基酸己糖转运蛋白的保守区内所发现的氨基酸(图4)。由RL6077的叠氮化钠诱变所获取的额外的4个突变体,也显示改变SUT基因氨基酸组成的单核苷酸改变。基于共分离和突变分析,本发明人推断SUT基因足以赋予Lr67抗性表型。当测试全部范围的锈病和白粉病时,小麦EMS突变体全部显示出对叶锈病、条锈病、杆锈病和白粉病的易感性。因此,单基因,SUT,失活对多种疾病具有影响。因此,SUT基因决定性地被鉴定为Lr67基因。
[0305] Lr67基因编码含有514个氨基酸的蛋白(图5),据预测含有12个跨膜域。当使用TMHMM Server v2.0和PSIPRED v3.3程序进行预测时,对于氨基酸跨膜域被预测为:TMhelix1,20-42;TMhelix2,81-100;TMhelix3,107-126;TMhelix4,136-158;TMhelix5,
170-192;TMhelix6;202-221;TMhelix7,282-304;TMhelix8,319-341;TMhelix9,348-370;
TMhelix10,380-402;TMhelix11,423-445;和TMhelix12,450-472。由相同的程序预测下列氨基酸区的每一个:N端19个氨基酸,TM螺旋2和3间的氨基酸,TM螺旋4和5间的氨基酸,TM螺旋6和7间的氨基酸,TMA螺旋8和9间的氨基酸,和C端42个氨基酸位于膜内侧,且其它氨基酸位于膜外侧。蛋白是主要易化物超家族(Major Facilitator Superfamily,MFS)中的成员,该超家族是次级转运蛋白的大型多元化的组,其包括单向转运蛋白、协同转运蛋白和反向转运蛋白,其便于将包括糖的多种化合物转运通过细胞质或内部细胞膜。通过查询NCBI蛋白数据库SEQ ID NO:1的氨基酸序列来鉴定同源多肽,以及鉴定多同系物。Lr67的氨基酸序列与包括水稻的数种谷物内的同源多肽具有约89-93%同一性,以及与拟南芥中的同源物-糖转运蛋白13(Accession No.NP_198006)具有约80%同一性。
[0306] 从小麦中克隆对应于Lr67基因的DNA片段,将其核苷酸序列与cDNA序列(SEQ ID NO:10)相比较。这揭示在该基因的蛋白编码区内存在两个内含子(图14)。
[0307] RT-PCR分析显示全部三个在小麦的A、B和D基因组中同源的Lr67基因在植物中表达。由Lr67基因的A基因组同源物所编码的多肽,其氨基酸序列相对于SEQ ID NO:1是507/514(98.6%)同一性,包括在第144位具有甘氨酸,在第387位具有缬氨酸,其是典型的易感Lr67多肽。此结果对本发明人表明,抗性Lr67多肽可能作为负显性多肽起作用,减少六倍体小麦中A和B基因组所编码的易感Lr67多肽的活性。
[0308] 由Lr67抗性和易感等位基因所编码的多肽间的差异的分子基础被限定在两个核苷酸的改变,其产生Lr67诊断性标记物中所使用的SNP。这两个核苷酸改变导致氨基酸改变,参考SEQ ID NO:1,在预测第四跨膜域中从保守的甘氨酸变为精氨酸(144位)和在第十跨膜域中由缬氨酸至亮氨酸(387位)(图6、7、8)。这两个核苷酸改变在小麦中罕见,且在D基因组前体或大多数商用小麦品种中未发现,除了少数携带Lr67。因此,Lr67抗性可能起源于通过从其二倍体祖小麦杂交形成六倍体小麦之后。当分析超过1000个来自广泛的地理来源的小麦地方品种和地域范围广泛的增加物两个Lr67诊断标记,引起Lr67的突变非常罕见,并位于来源于印度-恒河平原的地方品种的子集。
[0309] 在其它植物物种的同源物中,如在拟南芥和谷类中的糖转运蛋白13,毫无例外,在对应于SEQ ID NO:1的144位氨基酸的位置上不含有精氨酸,或在对应于387位的氨基酸的位置上不含有亮氨酸。不变地是,同源物在对应于144位的氨基酸的位置上具有甘氨酸,几乎一直在387位上是缬氨酸(见,例如,在图9和10中所提供的比对)。因此,在SUT多肽中这两个氨基酸高度保守,以及其中一个的突变或两个的突变,指示改变的功能的氨基酸是对锈病或白粉病病原抗性的原因。
[0310] 实施例3.在酵母中所表达的Lr67(SUT)的葡萄糖摄取研究-多肽序列的变异[0311] Lr67基因编码对已知糖转运蛋白显示同源性的蛋白的示范引导本发明人测试Lr67多肽在酵母细胞内的糖转运功能。
[0312] 实验过程
[0313] 使用将编码Lr67多肽的蛋白编码区(抗性和易感等位基因)克隆入酵母表达载体下列实验pRS416来完成下列实验。该载体含有为所插入编码区的表达的结构性ADH1启动子和CYC1终止子。所采用的酵母菌株是命名为EBY.VW4000的酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)的己糖转运缺陷变形。使用放射性标记[14C]葡萄糖结合液体闪烁计数测定掺入的放射物质来确定摄取。
[0314] 结果
[0315] 随时间葡萄糖摄取
[0316] 将为表达Lr67的抗性(Lr67(res))或易感(Lr67(sus))等位基因由遗传学构建体14
所转化的酵母细胞由100μM[ C]葡萄糖孵育10分钟。以2分钟的间隔测试葡萄糖摄取。显示表达Lr67易感等位基因的酵母细胞比表达Lr67抗性等位基因或空载体的酵母细胞转运葡萄糖的速率较快(图11)。事实上,表达Lr67抗性等位基因的细胞没有显示出可检测的高于对照的葡萄糖转运活性,虽然这个测定只进行10分钟,并不敏感。
[0317] Lr67(sus)葡萄糖摄取动力学
[0318] Lr67(sus)对[14C]葡萄糖的浓度依赖性摄取表现出经典的米氏(Michaelis–Menten)饱和动力学。双倒数(Lineweaver-Burk)方程式用于转换数据进行线性回归分析。显示Lr67(sus)表现出对葡萄糖的高亲和性,其对该底物具有Km为73μM,Vmax为3.02nmol min-1g FW-1。(图12)
[0319] 氨基酸转换率分析
[0320] 如上所述,在核苷酸序列上,Lr67的易感和抗性等位基因间有2个SNP的差异。这创建蛋白产物的两个氨基酸替代,其包括144位的甘氨酸至精氨酸(G144R)和387位的缬氨酸至亮氨酸(V387L)。为了测试这些氨基酸替代,单独或一起,是否影响LR67的葡萄糖摄取率,在LR67抗性等位基因中144位和387位的氨基酸分别通过所克隆基因的诱变被转换为存在于LR67易感等位基因中的等效氨基酸(即,R144G和L387V)。
[0321] 由Lr67(sus)或Lr67(res)或Lr67(res)R144G和Lr67(res)L387V所转化酵母细胞由100μM[14C]葡萄糖孵育10分钟。表达Lr67(res)R144G的酵母细胞显示出能够比表达Lr67(res)或Lr67(res)L387V(图13)以较高的速率转运葡萄糖,但达不到Lr67(sus)的充分的程度。这指示144位是锈病抗性功能的两个替代的氨基酸中更为重要的氨基酸,以及甘氨酸至精氨酸的转换(G144R)或反之亦然(R144G)改变Lr67多肽的葡萄糖转运速率。然而,第二个氨基酸替代(L387V)的加入也有助于葡萄糖转运速率。
[0322] 由于在由可去除Lr67的γ辐射所创建的Avocet x RL6077中的缺失突变导致对锈病和白粉病的易感等位基因,本发明人得出结论:Lr67(抗性)多肽必须在小麦细胞具有积极的功能,当然作为除了葡萄糖的糖类的转运,更有可能是已糖转运。也就是说,在小麦植物中如Avocet中Lr67易感等位基因的转换至抗性等位基因需要144位的精氨酸,且其由387位的亮氨酸的存在所改善。
[0323] 实施例4.转基因植物的生产
[0324] 用已克隆的基因和将遗传构建体引入到转基因小麦的氨基酸变形,使用标准的农杆菌所介导技术转化Fielder品种的小麦植物,和其它植物如谷类来进行实验,以增加对真菌病原如锈病和白粉病的抗性。还可做实验以修饰编码Lr67的拟南芥和葡萄同源物的基因以编码在144位具有精氨酸及在387位具有亮氨酸的突变多肽,以及为了为这些植物物种和其它植物提供抗性基因,将它们转换成抗性多肽。
[0325] 材料和方法
[0326] 编码Lr67的基因用于转化大麦植物如下。从小麦基因型Thatcher+Lr67分离7133bp的基因组片段。该片段含有Lr67基因的全长基因组序列,并包括1318bp的天然启动子区和包含3’非翻译区的1512bp的天然终止子序列。将Lr67片段插入到双转化载体pWBVec8。将Lr67双载体转化入农杆菌(A.tumefaciens)菌株AGL-1,并用于生产稳定转化的大麦植物(cv.Golden Promise),如Tingay等(1997)所描述的。
[0327] 结果
[0328] 已经鉴定8个由Lr67转基因所转化的独立的转基因植物。已经接受转化所包含的组织培养步骤的、但缺乏Lr67转基因的全部8个植物和野生型植物被大麦叶锈病所感染,大麦叶锈病可感染T0代的植物。在T1阶段进一步测试高级Lr67转基因系的其中一个。在使用大麦柄锈菌致病型4653P+(悉尼大学PBIC培养号码990492)在湿度室所种植的转基因大麦的成熟植物和幼苗进行叶锈病感染和随后的培养,该细菌对于具有抗性基因Rph3、5、7、10、11、14和15的植物是无毒的,对于具有抗性基因Rph1、2、4、6、8、9、12、13和19的系是有毒的。
[0329] 在对照植物的叶子上可观察到锈孢但在T0代的阳性Lr67转基因植物中未观察到。相较于对照植物,全部的Lr67转基因植物表现出叶片早衰,类似于被描述为叶尖坏死的叶片衰老表型,其是小麦Lr67-介导抗性的特征性特点。当测试植物的T1代时,当对幼苗测试时,全部含有Lr67的植物显示叶锈病抗性表型,而全部缺乏Lr67基因的植物显示叶锈病易感性。这些结果证实分离的Lr67基因功能活跃,足以赋予大麦叶锈病抗性基因。这些实验还将Lr67赋予其抗性的病原物种的范围延伸到包括除了小麦条锈菌、小麦叶锈菌、小麦杆锈菌(P.graminis)和寻常型白粉菌(Blumeria vulgaris)的大麦柄锈菌(P.hordeii)。
[0330] 本领域技术人员要理解的是,在不偏离如广泛描述的本发明的精神或范围的情况下,可以对本发明进行如特定实施方案中所显示的许多变异和/或修饰。因此,应在所有方面将本实施方案考虑为说明性的,而非限制性的。
[0331] 本申请要求2013年8月21日提交的AU 2013903161的优先权,其内容在此全部引用作为参考。
[0332] 本文讨论和/或引用的出版物均在此以其全文并入。
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