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一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法

阅读：1063发布：2020-07-12

专利汇可以提供一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本发明涉及生物 3D打印技术领域，具体是一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法；所述方法包括如下步骤：(1)处理得当卵巢细胞的裸卵及颗粒细胞；(2)卵巢颗粒细胞体外平衡培养；(3)将卵母细胞放入卵巢颗粒细胞中，继续培养2天；(4)作为3D打印用墨水；(5)制备3D打印用凝胶；(6)采用3D打印技术打印出卵泡，在卵泡内放置卵母细胞和体外成熟培养液，培养一周即得；本发明试图通过模拟出与人体生化环境相仿的卵泡，再依托于3D打印技术将卵母细胞快速准确的置于卵泡中进行人工培育，从而实现人体未成熟的卵母细胞的体外成熟，本发明以3D打印技术为依托，整个过程快捷方便，自动化程度高，有助于降低卵母细胞体外成熟的技术费用。，下面是一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法专利的具体信息内容。

权利要求

1.一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，该方法包括以下步骤：
(1)挑选出直径在50～60μm之间的卵巢细胞，用生理盐水清洗，再收集起来用消化酶消化成卵巢细胞的裸卵及颗粒细胞；
(2)在培养皿中放入体外成熟培养液，再放入卵巢颗粒细胞，覆盖上矿物油，放入CO2培养箱中平衡培养24h；
(3)挑除凋亡的卵母细胞，以每个液滴包含15个卵母细胞为标准，将该液滴放入培养24小时后的卵巢颗粒细胞中，继续培养2天；
(4)将生物水凝胶和经步骤(3)培养得到的细胞混合，作为3D打印用墨水；
(5)分别选择与步骤(4)、步骤(2)中相同的生物水凝胶和体外成熟培养液，将两者混合制备3D打印用凝胶；
(6)采用3D打印技术将3D打印用凝胶打印成一半的卵泡，将3D打印用墨水打印到卵泡中，然后向卵泡内加入2/3体积的体外成熟培养液，再用3D打印用凝胶打印出另一半卵泡，使卵泡浑然一体呈球状，培养一周即得。
2.根据权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中培养基的培养温度为37℃，培养湿度为饱和湿度。
3.根据权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述步骤(2)和步骤(3)中外部气体环境包含5.0％CO2。
4.根据权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述体外成熟培养液由常规培养液、维生素B12、血清、卵泡刺激素、黄体生成素、17β-雌二醇、hCG、丙酮酸钠、EGF、青霉素、硫酸链霉素、L-谷氨酰胺、表皮生长因子组成。
5.根据权利要求4所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述常规培养液选自DMEM培养液、TCM199培养液、MEM培养液中的其中一种。
6.根据权利要求4所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述血清为小孩血清、胎儿血清或新生儿血清中的其中一种。
7.根据权利要求4所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述维生素B12的浓度为4mg/ml、血清的浓度为0.2ml/ml、黄体生成素的浓度为0.02IU/ml、所述17β-雌二醇的浓度为2μg/ml、丙酮酸钠的浓度为24.5mg/L、青霉素的浓度为100IU/ml、硫酸链霉素的浓度为120μg/ml。
8.根据权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述生物水凝胶中卵母细胞的分散密度为50000-200000/ml。
9.根据权利要求1所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述步骤(4)中生物水凝胶和细胞的体积比为40-50：1。
10.根据权利要求4所述的一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，其特征在于，所述卵泡刺激素的浓度为0.04IU/ml、hCG的浓度为0.12IU/ml、L-谷氨酰胺的浓度为1mmol/L、表皮生长因子的浓度为10ng/ml。

说明书全文

一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法

技术领域

[0001] 本发明涉及生物3D打印技术领域，具体是一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法。

背景技术

[0002] 目前，我国育龄人群中不孕不育患者已高达12.5％，不孕不育现象逐渐已成为一个热点问题，引起整个社会的高度关注。现代辅助生殖技术的提出为不孕不育患者解决生育问题带来了希望，通过控制性超排卵获得更多可利用的卵母细胞，再通过镜子显微注射技术进行人工体外受精，最后将体外培养的受精卵植回女性子宫中发育成胚胎，然而超促排卵的高额费用以及频繁的就诊次数增加了患者的负担，此类药物对卵巢的刺激更可能导致恶心、腹痛、情绪不佳、闭经、卵巢过度刺激综合症以及潜在的致癌风险。因此将未成熟的卵母细胞进行体外培育后，在进行体外受精和胚胎移植，最终获得妊娠，成为了一条可行的解决方案。然而目前卵母细胞体外成熟技术需要依赖高水平的技术人员进行精密操作才得以实现，因此，存在造假过高的问题，给病人带来了经济负担，因此如何降低卵母细胞体外成熟技术的费用成为急需解决的问题。

发明内容

[0003] 本发明要解决的技术问题是克服现有技术的缺陷，提供一种技术费用低的利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法。

[0004] 为解决上述技术问题，本发明提供以下技术方案：一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括以下步骤：

[0005] (1)挑选出直径在50～60μm之间的卵巢细胞，用生理盐水清洗，再收集起来用消化酶消化成卵巢细胞的裸卵及颗粒细胞；

[0006] (2)：在培养皿中放入体外成熟培养液，再放入卵巢颗粒细胞，覆盖上矿物油，放入CO2培养箱中平衡培养24h；

[0007] (3)挑除凋亡的卵母细胞，以每个液滴包含15个卵母细胞为标准，将该液滴放入培养24小时后的卵巢颗粒细胞中，继续培养2天；

[0008] (4)将生物水凝胶和经步骤(3)培养得到的细胞混合，作为3D打印用墨水；

[0009] (5)分别选择与步骤(4)、步骤(2)中相同的生物水凝胶和体外成熟培养液，将两者混合制备3D打印用凝胶；

[0010] (6)采用3D打印技术将3D打印用凝胶打印成一半的卵泡，将3D打印用墨水打印到卵泡中，然后向卵泡内加入2/3体积的体外成熟培养液，再用3D打印用凝胶打印出另一半卵泡，使卵泡浑然一体呈球状，培养一周即得。

[0011] 进一步的，所述步骤(2)和步骤(3)中培养基的培养温度为37℃，培养湿度为饱和湿度。

[0012] 进一步的，所述步骤(2)和步骤(3)中外部气体环境包含5.0％CO2。

[0013] 进一步的，所述体外成熟培养液由常规培养液、维生素B12、血清、卵泡刺激素、黄体生成素、17β-雌二醇、hCG、丙酮酸钠、EGF、青霉素、硫酸链霉素、L-谷氨酰胺、表皮生长因子组成。

[0014] 进一步的，所述常规培养液选自DMEM培养液、TCM199培养液、MEM培养液中的其中一种。

[0015] 进一步的，所述血清为小孩血清、胎儿血清或新生儿血清中的其中一种。

[0016] 进一步的，所述维生素B12的浓度为4mg/ml、血清的浓度为0.2ml/ml、黄体生成素的浓度为0.02IU/ml、所述17β-雌二醇的浓度为2μg/ml、丙酮酸钠的浓度为24.5mg/L、青霉素的浓度为100IU/ml、硫酸链霉素的浓度为120μg/ml。

[0017] 进一步的，所述生物水凝胶中卵母细胞的分散密度为50000-200000/ml。

[0018] 进一步的，所述步骤(4)中生物水凝胶和细胞的体积比为40-50：1。

[0019] 进一步的，所述卵泡刺激素的浓度为0.04IU/ml、hCG的浓度为0.12IU/ml、L-谷氨酰胺的浓度为1mmol/L、表皮生长因子的浓度为10ng/ml。

[0020] 本发明与现有技术相比具有的有益效果是：本发明通过模拟出与人体生化环境相仿的卵泡，再依托于3D打印技术将卵母细胞快速准确的置于卵泡中进行人工培育，从而实现人体未成熟的卵母细胞的体外成熟，本发明以3D打印技术为依托，整个过程快捷方便，自动化程度高，有助于降低卵母细胞体外成熟的技术费用。

具体实施方式

[0021] 为了使本发明的目的、技术方案及优点更加清楚明白，以下结合实施例，对本发明进行进一步详细说明。应当理解，此处所描述的具体实施例仅仅用以解释本发明，并不用于限定本发明。

[0022] 实施例1：

[0023] 一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括以下步骤：

[0024] (1)挑选出直径在50～60μm之间的卵巢细胞，用生理盐水清洗，再收集起来用消化酶消化成卵巢细胞的裸卵及颗粒细胞；

[0025] (2)在培养皿中放入体外成熟培养液，再放入卵巢颗粒细胞，覆盖上矿物油，放入CO2培养箱中平衡培养24h，培养温度为37℃，培养湿度为饱和湿度，外部气体环境包含5.0％CO2；

[0026] (3)挑除凋亡的卵母细胞，以每个液滴包含15个卵母细胞为标准，将该液滴放入培养24小时后的卵巢颗粒细胞中，继续培养2天，培养温度为37℃，培养湿度为饱和湿度，外部气体环境包含5.0％CO2；

[0027] (4)将生物水凝胶和经步骤(3)培养得到的细胞混合，作为3D打印用墨水，其中，[0028] 生物水凝胶和细胞的体积比为40-50：1，生物水凝胶中卵母细胞的分散密度为50000-200000/ml；

[0029] (5)分别选择与步骤(4)、步骤(2)中相同的生物水凝胶和体外成熟培养液，将两者混合制备3D打印用凝胶；

[0030] (6)采用3D打印技术将3D打印用凝胶打印成一半的卵泡，将3D打印用墨水打印到卵泡中，然后向卵泡内加入2/3体积的体外成熟培养液，再用3D打印用凝胶打印出另一半卵泡，使卵泡浑然一体呈球状，培养一周即得。

[0031] 本实施例中的熟培养液由DMEM培养液、维生素B12、小孩血清、卵泡刺激素、黄体生成素、17β-雌二醇、hCG、丙酮酸钠、EGF、青霉素、硫酸链霉素、L-谷氨酰胺、表皮生长因子组成。

[0032] 各成分的含量/浓度为：维生素B12的浓度为4mg/ml、血清的浓度为0.2ml/ml、卵泡刺激素的浓度为0.04IU/ml、黄体生成素的浓度为0.02IU/ml、所述17β-雌二醇的浓度为2μg/ml、hCG的浓度为0.12IU/ml、丙酮酸钠的浓度为24.5mg/L、青霉素的浓度为100IU/ml、硫酸链霉素的浓度为120μg/ml、L-谷氨酰胺的浓度为1mmol/L、表皮生长因子的浓度为10ng/ml。

[0033] 实施例2：

[0034] 一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括以下步骤：

[0035] (1)挑选出直径在50～60μm之间的卵巢细胞，用生理盐水清洗，再收集起来用消化酶消化成卵巢细胞的裸卵及颗粒细胞；

[0036] (2)在培养皿中放入体外成熟培养液，再放入卵巢颗粒细胞，覆盖上矿物油，放入CO2培养箱中平衡培养24h，培养温度为37℃，培养湿度为饱和湿度，外部气体环境包含5.0％CO2；

[0037] (3)挑除凋亡的卵母细胞，以每个液滴包含15个卵母细胞为标准，将该液滴放入培养24小时后的卵巢颗粒细胞中，继续培养2天，培养温度为37℃，培养湿度为饱和湿度，外部气体环境包含5.0％CO2；

[0038] (4)将生物水凝胶和经步骤(3)培养得到的细胞混合，作为3D打印用墨水，其中，生物水凝胶和细胞的体积比为40-50：1，生物水凝胶中卵母细胞的分散密度为50000-200000/ml；

[0039] (5)分别选择与步骤(4)、步骤(2)中相同的生物水凝胶和体外成熟培养液，将两者混合制备3D打印用凝胶；

[0040] (6)采用3D打印技术将3D打印用凝胶打印成一半的卵泡，将3D打印用墨水打印到卵泡中，然后向卵泡内加入2/3体积的体外成熟培养液，再用3D打印用凝胶打印出另一半卵泡，使卵泡浑然一体呈球状，培养一周即得。

[0041] 本实施例中的熟培养液由TCM199培养液、维生素B12、胎儿血清、卵泡刺激素、黄体生成素、17β-雌二醇、hCG、丙酮酸钠、EGF、青霉素、硫酸链霉素、L-谷氨酰胺、表皮生长因子组成。

[0042] 各成分的含量/浓度为：维生素B12的浓度为4mg/ml、血清的浓度为0.2ml/ml、卵泡刺激素的浓度为0.04IU/ml、黄体生成素的浓度为0.02IU/ml、所述17β-雌二醇的浓度为2μg/ml、hCG的浓度为0.12IU/ml、丙酮酸钠的浓度为24.5mg/L、青霉素的浓度为100IU/ml、硫酸链霉素的浓度为120μg/ml、L-谷氨酰胺的浓度为1mmol/L、表皮生长因子的浓度为10ng/ml。

[0043] 实施例3：

[0044] 一种利用3D打印技术促进人未成熟卵母细胞体外成熟的方法，该方法包括以下步骤：

[0045] (1)挑选出直径在50～60μm之间的卵巢细胞，用生理盐水清洗，再收集起来用消化酶消化成卵巢细胞的裸卵及颗粒细胞；

[0046] (2)在培养皿中放入体外成熟培养液，再放入卵巢颗粒细胞，覆盖上矿物油，放入CO2培养箱中平衡培养24h，培养温度为37℃，培养湿度为饱和湿度，外部气体环境包含5.0％CO2；

[0047] (3)挑除凋亡的卵母细胞，以每个液滴包含15个卵母细胞为标准，将该液滴放入培养24小时后的卵巢颗粒细胞中，继续培养2天，培养温度为37℃，培养湿度为饱和湿度，外部气体环境包含5.0％CO2；

[0048] (4)将生物水凝胶和经步骤(3)培养得到的细胞混合，作为3D打印用墨水，其中，生物水凝胶和细胞的体积比为40-50：1，生物水凝胶中卵母细胞的分散密度为50000-200000/ml；

[0049] (5)分别选择与步骤(4)、步骤(2)中相同的生物水凝胶和体外成熟培养液，将两者混合制备3D打印用凝胶；

[0050] (6)采用3D打印技术将3D打印用凝胶打印成一半的卵泡，将3D打印用墨水打印到卵泡中，然后向卵泡内加入2/3体积的体外成熟培养液，再用3D打印用凝胶打印出另一半卵泡，使卵泡浑然一体呈球状，培养一周即得。

[0051] 本实施例中的熟培养液由MEM培养液、维生素B12、新生儿血清、卵泡刺激素、黄体生成素、17β-雌二醇、hCG、丙酮酸钠、EGF、青霉素、硫酸链霉素、L-谷氨酰胺、表皮生长因子组成。

[0052] 各成分的含量/浓度为：维生素B12的浓度为4mg/ml、血清的浓度为0.2ml/ml、卵泡刺激素的浓度为0.04IU/ml、黄体生成素的浓度为0.02IU/ml、所述17β-雌二醇的浓度为2μg/ml、hCG的浓度为0.12IU/ml、丙酮酸钠的浓度为24.5mg/L、青霉素的浓度为100IU/ml、硫酸链霉素的浓度为120μg/ml、L-谷氨酰胺的浓度为1mmol/L、表皮生长因子的浓度为10ng/ml。

[0053] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内所作的任何修改、等同替换和改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。

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