TCR和肽

阅读:269发布:2020-05-13

专利汇可以提供TCR和肽专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且TCR和肽。T细胞受体(TCR),其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯 肿瘤 1蛋白(WT1)肽。,下面是TCR和肽专利的具体信息内容。

1.T细胞受体(TCR),其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯(Wilms)肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中所述TCR:
(i)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CGTAWINDYKLSF(SEQ ID NO:3)的基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRKTGGYSNQPQHF(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(ii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CVVNLLSNQGGKLIF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSQDYLVSNEKLFF(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(iii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(iv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(v)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(vi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(vii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(viii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASTQTPYEQYF(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(ix)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSTVGGEDYGYTF(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(x)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASTQTPYEQYF(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSTVGGEDYGYTF(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xiii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CAISVGQGALYEQYF(SEQ ID NO:80)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xiv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSVARDRRNYGYTF(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAANNARLMF(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xvi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xvii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xviii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xix)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xx)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVTVGNKLVF(SEQ ID NO:175)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRGWREQFF(SEQ ID NO:180)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxiii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAARSYNTDKLIF(SEQ IDNO:186)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSWGYQETQYF(SEQ ID NO:196)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxiv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPTGGEYYGYTF(SEQ ID NO:202)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含
CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF(SEQ ID NO:208)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxvi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSWGYQETQYF(SEQ ID NO:196)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxvii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPTGGEYYGYTF(SEQ ID NO:202)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxviii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含
CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF(SEQ ID NO:208)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxix)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASGGRDDKIIF(SEQ ID NO:214)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSYSRTESTDTQYF(SEQ ID NO:219)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxx)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAANNARLMF(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxiii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxiv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxvi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxvii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxviii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxix)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRTSYDKVIF(SEQ IDNO:113)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxx)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ IDNO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxxi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;或(xxxxii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRTSYDKVIF(SEQ IDNO:113)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
2.根据权利要求1的TCR,其包含以下CDR序列:
(i)CDR1α-KALYS(SEQ ID NO:1),
CDR2α-LLKGGEQ(SEQ ID NO:2),
CDR3α-CGTAWINDYKLSF(SEQ ID NO:3),
CDR1β-SGHDY(SEQ ID NO:6),
CDR2β-FNNNVP(SEQ ID NO:7),和
CDR3β-CASRKTGGYSNQPQHF(SEQ ID NO:8),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(ii)CDR1α-NSASQS(SEQ ID NO:34),
CDR2α-VYSSGN(SEQ ID NO:35),
CDR3α-CVVNLLSNQGGKLIF(SEQ ID NO:36),
CDR1β-LGHNA(SEQ ID NO:39),
CDR2β-YSLEER(SEQ ID NO:40),和
CDR3β-CASSQDYLVSNEKLFF(SEQ ID NO:41),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(iii)CDR1α-SSVPPY(SEQ ID NO:12),
CDR2α-YTSAATLV(SEQ ID NO:13),
CDR3α-CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14),
CDR1β-SGHAT(SEQ ID NO:22),
CDR2β-FQNNGV(SEQ ID NO:23),和
CDR3β-CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(iv)CDR1α-SSVPPY(SEQ ID NO:12),
CDR2α-YTSAATLV(SEQ ID NO:13),
CDR3α-CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14),
CDR1β-SGHTA(SEQ ID NO:28),
CDR2β-FQGNSA(SEQ ID NO:29),和
CDR3β-CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(v)CDR1α-TSESDYY(SEQ ID NO:17),
CDR2α-QEAYKQQN(SEQ ID NO:18),
CDR3α-CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19),
CDR1β-SGHAT(SEQ ID NO:22),
CDR2β-FQNNGV(SEQ ID NO:23),和
CDR3β-CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(vi)CDR1α-TSESDYY(SEQ ID NO:17),
CDR2α-QEAYKQQN(SEQ ID NO:18),
CDR3α-CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19),
CDR1β-SGHTA(SEQ ID NO:28),
CDR2β-FQGNSA(SEQ ID NO:29),和
CDR3β-CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(vii)CDR1α–TSINN(SEQ ID NO:45),
CDR2α-IRSNERE(SEQ ID NO:46),
CDR3α–CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47),
CDR1β-MNHNS(SEQ ID NO:55),
CDR2β-SASEGT(SEQ ID NO:56),和
CDR3β-CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(viii)CDR1α–TSINN(SEQ ID NO:45),
CDR2α-IRSNERE(SEQ ID NO:46),
CDR3α–CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47),
CDR1β–MNHNY(SEQ ID NO:61),
CDR2β-SVGAGI(SEQ ID NO:62),和
CDR3β-CASTQTPYEQYF(SEQ ID NO:63),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(ix)CDR1α–TSINN(SEQ ID NO:45),
CDR2α-IRSNERE(SEQ ID NO:46),
CDR3α–CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47),
CDR1β–SGHNS(SEQ ID NO:67),
CDR2β-FNNNVP(SEQ ID NO:68),和
CDR3β–CASSTVGGEDYGYTF(SEQ ID NO:69),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(x)CDR1α-DSAIYN(SEQ ID NO:50),
CDR2α–IQSSQRE(SEQ ID NO:51),
CDR3α-CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52),
CDR1β-MNHNS(SEQ ID NO:55),
CDR2β-SASEGT(SEQ ID NO:56),和
CDR3β-CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xi)CDR1α-DSAIYN(SEQ ID NO:50),
CDR2α–IQSSQRE(SEQ ID NO:51),
CDR3α-CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52),
CDR1β–MNHNY(SEQ ID NO:61),
CDR2β-SVGAGI(SEQ ID NO:62),和
CDR3β-CASTQTPYEQYF(SEQ ID NO:63),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xii)CDR1α-DSAIYN(SEQ ID NO:50),
CDR2α–IQSSQRE(SEQ ID NO:51),
CDR3α-CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52),
CDR1β–SGHNS(SEQ ID NO:67),
CDR2β-FNNNVP(SEQ ID NO:68),和
CDR3β–CASSTVGGEDYGYTF(SEQ ID NO:69),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xiii)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:73),
CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:74),
CDR3α-CAASMAGAGSYQLTF(SEQ ID NO:75),
CDR1β-ENHRY(SEQ ID NO:78),
CDR2β–SYGVKD(SEQ ID NO:79),和
CDR3β-CAISVGQGALYEQYF(SEQ ID NO:80),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xiv)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:73),
CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:74),
CDR3α-CAASMAGAGSYQLTF(SEQ ID NO:75),
CDR1β–SGDLS(SEQ ID NO:84),
CDR2β–YYNGEE(SEQ ID NO:85),和
CDR3β–CASSVARDRRNYGYTF(SEQ ID NO:86),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xv)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:90),
CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:91),
CDR3α-CAANNARLMF(SEQ ID NO:92),
CDR1β–SGHNS(SEQ ID NO:95),
CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:96),和
CDR3β–CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xvi)CDR1α-DSSSTY(SEQ ID NO:101),
CDR2α–IFSNMDM(SEQ ID NO:102),
CDR3α-CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103),
CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:161),
CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:162),和
CDR3β–CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xvii)CDR1α-DSSSTY(SEQ ID NO:101),
CDR2α–IFSNMDM(SEQ ID NO:102),
CDR3α-CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103),
CDR1β–SQVTM(SEQ ID NO:167),
CDR2β–ANQGSEA(SEQ ID NO:168),和
CDR3β–CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xviii)CDR1α-DSVNN(SEQ ID NO:106),
CDR2α–IPSGT(SEQ ID NO:107),
CDR3α-CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108),
CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:161),
CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:162),和
CDR3β–CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xix)CDR1α-DSVNN(SEQ ID NO:106),
CDR2α–IPSGT(SEQ ID NO:107),
CDR3α-CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108),
CDR1β–SQVTM(SEQ ID NO:167),
CDR2β–ANQGSEA(SEQ ID NO:168),和
CDR3β–CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xx)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:111),
CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:112),
CDR3α-CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113),
CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:161),
CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:162),和
CDR3β–CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxi)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:111),
CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:112),
CDR3α-CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113),
CDR1β–SQVTM(SEQ ID NO:167),
CDR2β–ANQGSEA(SEQ ID NO:168),和
CDR3β–CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxii)CDR1α-VGISA(SEQ ID NO:173),
CDR2α–LSSGK(SEQ ID NO:174),
CDR3α-CAVTVGNKLVF(SEQ ID NO:175),
CDR1β–MNHNS(SEQ ID NO:178),
CDR2β–SASEGT(SEQ ID NO:179),和
CDR3β–CASRGWREQFF(SEQ ID NO:180),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxiii)CDR1α-VGISA(SEQ ID NO:184),
CDR2α–LSSGK(SEQ ID NO:185),
CDR3α-CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186),
CDR1β–SGHTS(SEQ ID NO:194),
CDR2β–YDEGEE(SEQ ID NO:195),和
CDR3β–CASSWGYQETQYF(SEQ ID NO:196),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxiv)CDR1α-VGISA(SEQ ID NO:184),
CDR2α–LSSGK(SEQ ID NO:185),
CDR3α-CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186),
CDR1β–KGHSH(SEQ ID NO:200),
CDR2β–LQKENI(SEQ ID NO:201),和
CDR3β–CASSPTGGEYYGYTF(SEQ ID NO:202),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxv)CDR1α-VGISA(SEQ ID NO:184),
CDR2α–LSSGK(SEQ ID NO:185),
CDR3α-CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186),
CDR1β–MNHEY(SEQ ID NO:206),
CDR2β–SVGAGI(SEQ ID NO:207),和
CDR3β–CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF(SEQ ID NO:208),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxvi)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:189),
CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:190),
CDR3α-CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191),
CDR1β–SGHTS(SEQ ID NO:194),
CDR2β–YDEGEE(SEQ ID NO:195),和
CDR3β–CASSWGYQETQYF(SEQ ID NO:196),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxvii)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:189),
CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:190),
CDR3α-CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191),
CDR1β–KGHSH(SEQ ID NO:200),
CDR2β–LQKENI(SEQ ID NO:201),和
CDR3β–CASSPTGGEYYGYTF(SEQ ID NO:202),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxviii)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:189),
CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:190),
CDR3α-CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191),
CDR1β–MNHEY(SEQ ID NO:206),
CDR2β–SVGAGI(SEQ ID NO:207),和
CDR3β–CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF(SEQ ID NO:208),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxix)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:212),
CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:213),
CDR3α-CAASGGRDDKIIF(SEQ ID NO:214),
CDR1β–MNHEY(SEQ ID NO:217),
CDR2β–SVGAGI(SEQ ID NO:218),和
CDR3β–CASSYSRTESTDTQYF(SEQ ID NO:219),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxx)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:90),
CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:91),
CDR3α-CAANNARLMF(SEQ ID NO:92),
CDR1β–SGHRS(SEQ ID NO:269),
CDR2β–YFSETQ(SEQ ID NO:270),和
CDR3β–CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxi)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:264),
CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:265),
CDR3α-CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266),
CDR1β–SGHNS(SEQ ID NO:95),
CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:96),和
CDR3β–CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxii)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:264),
CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:265),
CDR3α-CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266),
CDR1β–SGHRS(SEQ ID NO:269),
CDR2β–YFSETQ(SEQ ID NO:270),和
CDR3β–CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxiii)CDR1α-TSINN(SEQ ID NO:275),
CDR2α–IRSNERE(SEQ ID NO:276),
CDR3α-CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277),
CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:161),
CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:162),和
CDR3β–CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxiv)CDR1α-TSINN(SEQ ID NO:275),
CDR2α–IRSNERE(SEQ ID NO:276),
CDR3α-CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277),
CDR1β–SQVTM(SEQ ID NO:167),
CDR2β–ANQGSEA(SEQ ID NO:168),和
CDR3β–CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxv)CDR1α-TSINN(SEQ ID NO:275),
CDR2α–IRSNERE(SEQ ID NO:276),
CDR3α-CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277),
CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:280),
CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:281),和
CDR3β–CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxvi)CDR1α-TSINN(SEQ ID NO:275),
CDR2α–IRSNERE(SEQ ID NO:276),
CDR3α-CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277),
CDR1β–SGHDY(SEQ ID NO:286),
CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:287),和
CDR3β–CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxvii)CDR1α-DSSSTY(SEQ ID NO:101),
CDR2α–IFSNMDM(SEQ ID NO:102),
CDR3α-CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103),
CDR1β–SGHDY(SEQ ID NO:286),
CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:287),和
CDR3β–CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxviii)CDR1α-DSVNN(SEQ ID NO:106),
CDR2α–IPSGT(SEQ ID NO:107),
CDR3α-CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108),
CDR1β–SGHDY(SEQ ID NO:286),
CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:287),和
CDR3β–CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxix)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:111),
CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:112),
CDR3α-CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113),
CDR1β–SGHDY(SEQ ID NO:286),
CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:287),和
CDR3β–CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxx)CDR1α-DSSSTY(SEQ ID NO:101),
CDR2α–IFSNMDM(SEQ ID NO:102),
CDR3α-CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103),
CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:280),
CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:281),和
CDR3β–CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
(xxxxi)CDR1α-DSVNN(SEQ ID NO:106),
CDR2α–IPSGT(SEQ ID NO:107),
CDR3α-CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108),
CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:280),
CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:281),和
CDR3β–CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;或
(xxxxii)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:111),
CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:112),
CDR3α-CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113),
CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:280),
CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:281),和
CDR3β–CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282),
或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
3.根据权利要求1或2的TCR,其包含:
(i)α链可变域,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(ii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(iii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(iv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(v)α链可变域,其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(vi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(vii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(viii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(ix)α链可变域,其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(x)α链可变域,其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xiii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xiv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xvi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xvii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xviii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xix)α链可变域,其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xx)α链可变域,其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxiii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxiv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxvi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxvii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxviii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxix)α链可变域,其包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxx)α链可变域,其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxiii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxiv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxvi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxvii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxviii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxix)α链可变域,其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxx)α链可变域,其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxxi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxxii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体。
4.前述权利要求中任一项的TCR,其包含
(i)α链,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:10和11的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(ii)α链,其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:43和44的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(iii)α链,其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:26和
27的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(iv)α链,其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:32和33的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(v)α链,其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:26和27的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(vi)α链,其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:32和33的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(vii)α链,其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:59和
60的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(viii)α链,其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:65和
66的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(ix)α链,其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:71和72的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(x)α链,其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:59和60的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xi)α链,其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:65和66的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xii)α链,其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:71和
72的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xiii)α链,其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:82和
83的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xiv)α链,其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:88和
89的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xv)α链,其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;
和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xvi)α链,其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:
165和166的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xvii)α链,其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:
171和172的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xviii)α链,其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:
165和166的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xix)α链,其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:
171和172的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xx)α链,其包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:
165和166的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxi)α链,其包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:
171和172的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxii)α链,其包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:
182和183的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxiii)α链,其包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:
198和199的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxiv)α链,其包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205和SEQ ID NO:
204和205的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxv)α链,其包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211和SEQ ID NO:
210和211的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxvi)α链,其包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:
198和199的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxvii)α链,其包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205和SEQ ID NO:
204和205的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxviii)α链,其包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211和SEQ ID NO:
210和211的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxix)α链,其包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222和SEQ ID NO:
221和222的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxx)α链,其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274和SEQ ID NO:
273和274的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxi)α链,其包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:99和100的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxii)α链,其包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274和SEQ ID NO:
273和274的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxiii)α链,其包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:
165和166的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxiv)α链,其包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:
171和172的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxv)α链,其包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285和SEQ ID NO:
284和285的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxvi)α链,其包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291和SEQ ID NO:
290和291的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxvii)α链,其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291和SEQ ID NO:
290和291的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxviii)α链,其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291和SEQ ID NO:290和291的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxix)α链,其包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291和SEQ ID NO:
290和291的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxx)α链,其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285和SEQ ID NO:
284和285的与其具有至少75%序列同一性的变体;
(xxxxi)α链,其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285和SEQ ID NO:
284和285的与其具有至少75%序列同一性的变体;或
(xxxxii)α链,其包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列或与其具有至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285和SEQ ID NO:
284和285的与其具有至少75%序列同一性的变体。
5.T细胞受体(TCR),其结合主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中所述WT1肽包含选自下组的氨基酸序列:EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123),YESDNHTTPIL(SEQ ID NO:126),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127),QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118),EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119),SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120),APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117),NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250),DPGGIWAKLGAAEAS(SEQ ID NO:251),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:252),KRHQRRHTGVKPFQC(SEQ ID NO:253)PSCQKKFARSDELVR(SEQ ID NO:254)和它们各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
6.根据前述权利要求中任一项的TCR,其结合MHC I和/或MHC II肽复合物。
7.根据前述权利要求中任一项的TCR,其限制于人白细胞抗原(HLA)等位基因,优选地其中所述TCR限制于HLA-A或HLA-B等位基因,更优选地其中所述TCR限制于选自下组的HLA-A等位基因:HLA-A*0201、HLA-A*0101、HLA-A*2402和HLA-A*0301,或其中所述TCR限制于选自下组的HLA-B等位基因:HLA-B*0702、HLA-B*3501和HLA-B*3502。
8.根据以下的TCR:
a.权利要求1-4中任一项的(i)、(ii)、(xv)、(xvi)、(xxix)、(xxx)-(xxxiii)、(xxxv)或(xxxx),所述TCR限制于HLA-A*0201;
b.权利要求1-4中任一项的(vii),所述TCR限制于HLA-B*3502;或
c.权利要求1-4中任一项的(xiii)-(xiv)中任一项,所述TCR限制于HLA-B*3501。
9.根据前述权利要求中任一项的TCR,其包含α链/β链界面处的一个或多个突变,使得当在T细胞中表达所述α链和所述β链时,所述链和内源TCRα和β链之间的错配频率减少。
10.根据权利要求9的TCR,其中所述一个或多个突变将半胱氨酸残基引入所述α链和所述β链中每个的恒定区域中,其中所述半胱氨酸残基能够在所述α链和所述β链之间形成二硫键。
11.根据前述权利要求中任一项的TCR,其包含鼠源化(murinized)恒定区。
12.根据前述权利要求中任一项的TCR,其中所述TCR是可溶性TCR。
13.分离的多核苷酸,其编码根据前述权利要求中任一项的T细胞受体(TCR)的所述α链,和/或根据前述权利要求中任一项的TCR的所述β链。
14.根据权利要求13的分离的多核苷酸,其中所述多核苷酸编码与所述β链连接的所述α链。
15.根据权利要求13或14的分离的多核苷酸,其编码一种或多种短干扰RNA(siRNA)或能够减少或阻止一种或多种内源TCR基因表达的其他试剂
16.载体,其包含根据权利要求13-15中任一项的多核苷酸。
17.根据权利要求16的载体,其包含编码一个或多个CD3链、CD8、自杀基因和/或选择标志物的多核苷酸。
18.细胞,其包含根据权利要求1-11中任一项的TCR、根据权利要求13-15中任一项的多核苷酸,或根据权利要求16或17的载体,
任选地,其中所述细胞进一步包含编码一个或多个CD3链、CD8、自杀基因和/或选择标志物的载体。
19.根据权利要求18的细胞,其中所述细胞是T细胞、淋巴细胞或干细胞,任选地,其中所述T细胞、所述淋巴细胞或所述干细胞选自下组:CD4细胞、CD8细胞、幼稚T细胞、记忆干T细胞、中央记忆T细胞、双阴性T细胞、效应记忆T细胞、效应T细胞、Th0细胞、Tc0细胞、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞、Tc2细胞、Th17细胞、Th22细胞、γ/δT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、造血干细胞和多能干细胞。
20.根据权利要求19的细胞,其中所述细胞是已经从受试者分离的T细胞。
21.根据权利要求18-20中任一项的细胞,其中编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因受到破坏,优选地使得不表达所述编码TCRα链的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因,
任选地,其中通过插入表达盒破坏所述编码TCRα链的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因,所述表达盒包含编码权利要求1-11中任一项的TCR的多核苷酸序列,进一步任选地,其中一个或多个编码MHC的内源基因受到破坏,
进一步任选地,其中涉及持久性、扩充、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢(homing)能或其他T细胞功能的内源基因被破坏,优选地其中涉及持久性,扩充,活性,对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能的内源基因选自下组:PD1、TIM3、LAG3、2B4、KLRG1、TGFbR、CD160和CTLA4。
22.制备细胞的方法,其包括以下步骤:在体外、离体或体内将根据权利要求16和/或17的载体导入细胞中,例如通过转染或转导进行。
23.根据权利要求22的制备细胞的方法,其包括T细胞编辑的步骤,所述步骤包括用人工核酸酶破坏编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因,优选地,其中所述人工核酸酶选自下组:锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)和CRISPR/Cas系统。
24.根据权利要求23的制备细胞的方法,其包括将表达盒靶向整合到通过所述人工核酸酶破坏的所述编码TCRα链的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因中的步骤,其中所述表达盒包含编码权利要求1-11中任一项的TCR的多核苷酸序列。
25.根据权利要求22-24中任一项的制备细胞的方法,其包括破坏一个或多个编码MHC的内源基因的步骤,优选地,其中通过所述方法制备的细胞是非同种异体反应性(non-alloreactive)的通用T细胞。
26.根据权利要求22-25中任一项的制备细胞的方法,其包括以下步骤:破坏一个或多个内源基因以改变持久性、扩充、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能,优选地,其中所述方法包括将表达盒靶向整合到通过人工核酸酶破坏的内源基因中的步骤,所述内源基因涉及持久性、扩充、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能,其中所述表达盒包含编码权利要求1-11中任一项的TCR的多核苷酸序列,优选其中所述内源基因选自下组:PD1、TIM3、LAG3、2B4、KLRG1、TGFbR、CD160和CTLA4。
27.根据权利要求18-21中任一项的细胞或通过权利要求22-26中任一项的方法制备的细胞,用于过继(adoptive)细胞转移,优选过继T细胞转移,任选地其中所述过继T细胞转移是同种异体过继T细胞转移、自体过继T细胞转移或通用的非同种异体反应性过继T细胞转移。
28.嵌合分子,其包含与非细胞底物、毒素和/或抗体缀合的权利要求1-11中任一项的TCR或其一部分,任选地其中所述非细胞底物选自下组:纳米颗粒、外来体(exosome)和其他非细胞底物。
29.根据权利要求1-11中任一项的TCR、根据权利要求13-15中任一项的分离的多核苷酸、根据权利要求16或17的载体、根据权利要求18-21中任一项的细胞、通过权利要求22-26中任一项的方法制备的细胞、或根据权利要求28的嵌合分子,用于疗法。
30.根据权利要求1-11中任一项的TCR、根据权利要求13-15中任一项的分离的多核苷酸、根据权利要求16或17的载体、根据权利要求18-21中任一项的细胞、通过权利要求22-26中任一项的方法制备的细胞、或根据权利要求28的嵌合分子,用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病,任选地,其中所述与WT1表达有关的疾病是增殖性病症,优选其中所述增殖性病症是血液恶性疾病或实体瘤,优选其中所述血液恶性疾病选自下组:急性髓样白血病(acute myeloid leukemia)(AML)、慢性髓样白血病(chronic myeloid leukemia)(CML)、成淋巴细胞性白血病(lymphoblastic leukemia)、骨髓增生异常综合征(myelodisplastic syndrome)、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤(non Hodgkin lymphoma)和何杰金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma);或优选地,其中所述实体瘤选自下组:癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌(cholangiocarcinoma)、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤(synovial sarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、横纹肌肉瘤(rabdomyosarcoma)、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌(urothelial cancer)、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结直肠癌
31.治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法,所述方法包括以下步骤:对由此需要的受试者施用根据权利要求1-11中任一项的TCR、根据权利要求13-15中任一项的分离的多核苷酸、根据权利要求16或17的载体、根据权利要求18-21中任一项的细胞、通过权利要求
22-26中任一项的方法制备的细胞、或根据权利要求28的嵌合分子。
32.权利要求31的方法,其中所述与WT1表达有关的疾病是增殖性病症,优选其中所述增殖性病症是血液恶性疾病或实体瘤,优选其中所述血液恶性疾病选自下组:急性髓样白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、成淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤;或优选地,其中所述实体瘤选自下组:肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤、横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结直肠癌。
33.分离的免疫原性WT1肽,其包含选自下组的氨基酸序列:EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:
123)YESDNHTTPIL(SEQ ID NO:126),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127),QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118),EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119),SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:
120),APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117),NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250),DPGGIWAKLGAAEAS(SEQ ID NO:251),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:252),KRHQRRHTGVKPFQC(SEQ ID NO:
253),PSCQKKFARSDELVR(SEQ ID NO:254)和它们各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。

说明书全文

TCR和肽

发明领域

[0001] 本发明涉及T细胞受体(TCR),其结合主要组织相容性复合物呈递时源自维尔姆斯(Wilms)肿瘤1蛋白(WT1)的肽。在这方面,本发明涉及特异性识别WT1肽的互补决定区(CDR)。本发明进一步涉及源自WT1的免疫原性肽。
[0002] 发明背景
[0003] T细胞受体(TCR)基因疗法基于将高亲合性肿瘤特异性TCR基因遗传转移到T淋巴细胞中,从而能够特异性靶向期望的肿瘤相关抗原并且降低较小毒性且更特异性和有效的疗法。此种方法已在临床试验中显示出希望。限制利用TCR基因疗法进行癌症临床治疗的主要障碍之一是缺乏肿瘤特异性T细胞和相应的TCR。因此,肿瘤特异性TCR的低可用性仍然是一个限制基于TCR的免疫治疗方法的广泛应用的开放问题。
[0004] 大部分肿瘤相关抗原(TAA)是自身抗原,因此,对此类分子特异的T细胞由于中枢和外周耐受性而被破坏或变得无应答。尽管如此,在同种异体造血干细胞移植(allo-HSCT)后,在健康的供体和患者中,特别是在受血液恶性疾病影响的患者中,观察到了天然存在的肿瘤特异性T细胞,在所述同种异体造血干细胞移植中肿瘤特异性淋巴细胞的频率与疾病消退联系起来(Kapp,M.et al.Bone Marrow Transplantation 43,399–410(2009);和Tyler,E.M.et al.Blood 121,308–317(2013))。
[0005] 要由免疫治疗方法靶向的肿瘤抗原的选择仍然是一个争论的问题。理想的TAA在肿瘤细胞上高表达,而在健康组织中最低表达。
[0006] 维尔姆斯肿瘤(Wilms tumor)1(WT1)是一种编码锌指转录因子的胞内蛋白,所述锌指转录因子在细胞生长和分化中起着重要作用(Yang,L.et al.Leukemia 21,868-876(2007))。WT1在多种血液肿瘤和实体瘤中广泛表达,而在各种健康组织(例如性腺、子宫、肾、间皮、不同组织中的祖细胞)中显示有限的表达。最近的证据表明WT1在白血病发生和肿瘤发生中的作用。
[0007] 几项正在进行的临床试验依赖于用WT1肽接种疫苗后细胞毒性T淋巴细胞(CTL)应答的产生。然而,尽管认识到WT1可用于免疫疗法,但目前使用少量WT1表位(它们限制于有限数目的HLA等位基因)用于疫苗接种目的(DiStasi,A.et al.Front.Immunol.(2015))。一种此类表位是WT1 126-134表位(RMFPNAPYL;SEQ ID NO:255),其被由HLA-A*0201等位基因编码的MHC呈现(即表位受HLA-A*0201限制)。
[0008] 由于具有HLA-A*0201单倍型的主要组织相容性复合物(MHC)在绝大多数(60%)白种人群体中表达,因此HLA-A*0201限制性表位和相应的TCR受到关注。因此,靶向HLA-A*0201限制的WT1表位的TCR是特别有利的,因为利用此类TCR的免疫疗法可以得到广泛应用。
[0009] WT1 126-134表位已经单独或与其他肿瘤抗原组合在数项试验中进行了广泛研究。然而,最近的报道强调了对此特定表位的加工的主要担忧,这可能损害其用于免疫疗法目的的用途。值得注意的是,与标准蛋白酶体相比,免疫蛋白酶体更有效加工WT1 126-134表位(Jaigirdar,A.et al.J Immunother.39(3):105-16(2016)),这导致内源表达WT1的许多HLA-A*0201肿瘤细胞系或原代白血病细胞的较差认识。
[0010] 因此,仍然需要新的WT1表位,特别是由具有普遍HLA单倍型(例如HLA-A*0201)的MHC呈递的WT1表位。
[0011] 已经鉴定出的一种天然加工的HLA-A*0201限制性表位是WT1 37-45,其具有基酸序列VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157,see e.g.Smithgall et al 2001;Blood 98(11Part 1):121a)。然而,已经报道了对此肽序列特异性的很少的TCR氨基酸序列,特别是CDR序列(Schmitt,T.M.et al.(2017)Nat Biotechnol35:1188-1195)。
[0012] 因此,仍然需要新的WT1表位,特别是限制于共同HLA等位基因的那些WT1表位,并且需要能够结合WT1表位的新的TCR。
[0013] 发明概述
[0014] 我们已经鉴定出新的TCR,其结合由MHC呈现时的WT1肽。进一步,我们已经确定了TCR的氨基酸序列,包括其CDR区的氨基酸序列,它们负责对WT1的结合特异性。此外,我们已经证明了表达根据本发明的TCR的T细胞特异性靶向和杀死表达WT1蛋白的细胞。另外,已经显示了本发明的TCR限制于由白种人群体中共同的HLA1和2类等位基因编码的MHC,例如HLA-A*0201和HLA-B*3501或HLA-B*3502。
[0015] 因此,在第一方面,本发明提供了T细胞受体(TCR),其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中所述TCR:
[0016] (i)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CGTAWINDYKLSF(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRKTGGYSNQPQHF(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0017] (ii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CVVNLLSNQGGKLIF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSQDYLVSNEKLFF(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0018] (iii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0019] (iv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0020] (v)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0021] (vi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0022] (vii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0023] (viii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASTQTPYEQYF(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0024] (ix)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSTVGGEDYGYTF(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0025] (x)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0026] (xi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASTQTPYEQYF(SEQ ID NO:63)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0027] (xii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSTVGGEDYGYTF(SEQ ID NO:69)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0028] (xiii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CAISVGQGALYEQYF(SEQ ID NO:80)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0029] (xiv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSVARDRRNYGYTF(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0030] (xv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAANNARLMF(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0031] (xvi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0032] (xvii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0033] (xviii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0034] (xix)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0035] (xx)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0036] (xxi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0037] (xxii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVTVGNKLVF(SEQ ID NO:175)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRGWREQFF(SEQ ID NO:180)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0038] (xxiii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSWGYQETQYF(SEQ ID NO:196)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0039] (xxiv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPTGGEYYGYTF(SEQ ID NO:202)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0040] (xxv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF(SEQ ID NO:208)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0041] (xxvi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSWGYQETQYF(SEQ ID NO:196)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0042] (xxvii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPTGGEYYGYTF(SEQ ID NO:202)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0043] (xxviii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF(SEQ ID NO:208)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0044] (xxix)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASGGRDDKIIF(SEQ ID NO:214)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSYSRTESTDTQYF(SEQ ID NO:219)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0045] (xxx)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAANNARLMF(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0046] (xxxi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0047] (xxxii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0048] (xxxiii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0049] (xxxiv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0050] (xxxv)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0051] (xxxvi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0052] (xxxvii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0053] (xxxviii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0054] (xxxix)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0055] (xxxx)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0056] (xxxxi)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;或
[0057] (xxxxii)包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0058] 在一个实施方案中,本发明提供了本发明的TCR,其包含以下CDR序列:
[0059] (i)CDR1α-KALYS(SEQ ID NO:1),
[0060] CDR2α-LLKGGEQ(SEQ ID NO:2),
[0061] CDR3α-CGTAWINDYKLSF(SEQ ID NO:3),
[0062] CDR1β-SGHDY(SEQ ID NO:6),
[0063] CDR2β-FNNNVP(SEQ ID NO:7),和
[0064] CDR3β-CASRKTGGYSNQPQHF(SEQ ID NO:8),
[0065] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0066] (ii)CDR1α-NSASQS(SEQ ID NO:34),
[0067] CDR2α-VYSSGN(SEQ ID NO:35),
[0068] CDR3α-CVVNLLSNQGGKLIF(SEQ ID NO:36),
[0069] CDR1β-LGHNA(SEQ ID NO:39),
[0070] CDR2β-YSLEER(SEQ ID NO:40),和
[0071] CDR3β-CASSQDYLVSNEKLFF(SEQ ID NO:41),
[0072] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;(iii)CDR1α-SSVPPY(SEQ ID NO:12),
[0073] CDR2α-YTSAATLV(SEQ ID NO:13),
[0074] CDR3α-CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14),
[0075] CDR1β-SGHAT(SEQ ID NO:22),
[0076] CDR2β-FQNNGV(SEQ ID NO:23),和
[0077] CDR3β-CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24),
[0078] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0079] (iv)CDR1α-SSVPPY(SEQ ID NO:12),
[0080] CDR2α-YTSAATLV(SEQ ID NO:13),
[0081] CDR3α-CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14),
[0082] CDR1β-SGHTA(SEQ ID NO:28),
[0083] CDR2β-FQGNSA(SEQ ID NO:29),和
[0084] CDR3β-CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30),
[0085] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0086] (v)CDR1α-TSESDYY(SEQ ID NO:17),
[0087] CDR2α-QEAYKQQN(SEQ ID NO:18),
[0088] CDR3α-CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19),
[0089] CDR1β-SGHAT(SEQ ID NO:22),
[0090] CDR2β-FQNNGV(SEQ ID NO:23),和
[0091] CDR3β-CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24),
[0092] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0093] (vi)CDR1α-TSESDYY(SEQ ID NO:17),
[0094] CDR2α-QEAYKQQN(SEQ ID NO:18),
[0095] CDR3α-CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19),
[0096] CDR1β-SGHTA(SEQ ID NO:28),
[0097] CDR2β-FQGNSA(SEQ ID NO:29),和
[0098] CDR3β-CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30),
[0099] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0100] (vii)CDR1α–TSINN(SEQ ID NO:45),
[0101] CDR2α-IRSNERE(SEQ ID NO:46),
[0102] CDR3α–CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47),
[0103] CDR1β-MNHNS(SEQ ID NO:55),
[0104] CDR2β-SASEGT(SEQ ID NO:56),和
[0105] CDR3β-CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57),
[0106] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0107] (viii)CDR1α–TSINN(SEQ ID NO:45),
[0108] CDR2α-IRSNERE(SEQ ID NO:46),
[0109] CDR3α–CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47),
[0110] CDR1β–MNHNY(SEQ ID NO:61),
[0111] CDR2β-SVGAGI(SEQ ID NO:62),和
[0112] CDR3β-CASTQTPYEQYF(SEQ ID NO:63),
[0113] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0114] (ix)CDR1α–TSINN(SEQ ID NO:45),
[0115] CDR2α-IRSNERE(SEQ ID NO:46),
[0116] CDR3α–CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47),
[0117] CDR1β–SGHNS(SEQ ID NO:67),
[0118] CDR2β-FNNNVP(SEQ ID NO:68),和
[0119] CDR3β–CASSTVGGEDYGYTF(SEQ ID NO:69),
[0120] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0121] (x)CDR1α-DSAIYN(SEQ ID NO:50),
[0122] CDR2α–IQSSQRE(SEQ ID NO:51),
[0123] CDR3α-CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52),
[0124] CDR1β-MNHNS(SEQ ID NO:55),
[0125] CDR2β-SASEGT(SEQ ID NO:56),和
[0126] CDR3β-CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57),
[0127] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0128] (xi)CDR1α-DSAIYN(SEQ ID NO:50),
[0129] CDR2α–IQSSQRE(SEQ ID NO:51),
[0130] CDR3α-CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52),
[0131] CDR1β–MNHNY(SEQ ID NO:61),
[0132] CDR2β-SVGAGI(SEQ ID NO:62),和
[0133] CDR3β-CASTQTPYEQYF(SEQ ID NO:63),
[0134] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0135] (xii)CDR1α-DSAIYN(SEQ ID NO:50),
[0136] CDR2α–IQSSQRE(SEQ ID NO:51),
[0137] CDR3α-CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52),
[0138] CDR1β–SGHNS(SEQ ID NO:67),
[0139] CDR2β-FNNNVP(SEQ ID NO:68),和
[0140] CDR3β–CASSTVGGEDYGYTF(SEQ ID NO:69),
[0141] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0142] (xiii)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:73),
[0143] CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:74),
[0144] CDR3α-CAASMAGAGSYQLTF(SEQ ID NO:75),
[0145] CDR1β-ENHRY(SEQ ID NO:78),
[0146] CDR2β–SYGVKD(SEQ ID NO:79),和
[0147] CDR3β-CAISVGQGALYEQYF(SEQ ID NO:80),
[0148] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0149] (xiv)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:73),
[0150] CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:74),
[0151] CDR3α-CAASMAGAGSYQLTF(SEQ ID NO:75),
[0152] CDR1β–SGDLS(SEQ ID NO:84),
[0153] CDR2β–YYNGEE(SEQ ID NO:85),和
[0154] CDR3β–CASSVARDRRNYGYTF(SEQ ID NO:86),
[0155] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0156] (xv)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:90),
[0157] CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:91),
[0158] CDR3α-CAANNARLMF(SEQ ID NO:92),
[0159] CDR1β–SGHNS(SEQ ID NO:95),
[0160] CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:96),和
[0161] CDR3β–CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97),
[0162] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0163] (xvi)CDR1α-DSSSTY(SEQ ID NO:101),
[0164] CDR2α–IFSNMDM(SEQ ID NO:102),
[0165] CDR3α-CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103),
[0166] CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:161),
[0167] CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:162),和
[0168] CDR3β–CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163),
[0169] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0170] (xvii)CDR1α-DSSSTY(SEQ ID NO:101),
[0171] CDR2α–IFSNMDM(SEQ ID NO:102),
[0172] CDR3α-CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103),
[0173] CDR1β–SQVTM(SEQ ID NO:167),
[0174] CDR2β–ANQGSEA(SEQ ID NO:168),和
[0175] CDR3β–CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169),
[0176] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0177] (xviii)CDR1α-DSVNN(SEQ ID NO:106),
[0178] CDR2α–IPSGT(SEQ ID NO:107),
[0179] CDR3α-CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108),
[0180] CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:161),
[0181] CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:162),和
[0182] CDR3β–CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163),
[0183] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0184] (xix)CDR1α-DSVNN(SEQ ID NO:106),
[0185] CDR2α–IPSGT(SEQ ID NO:107),
[0186] CDR3α-CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108),
[0187] CDR1β–SQVTM(SEQ ID NO:167),
[0188] CDR2β–ANQGSEA(SEQ ID NO:168),和
[0189] CDR3β–CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169),
[0190] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0191] (xx)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:111),
[0192] CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:112),
[0193] CDR3α-CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113),
[0194] CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:161),
[0195] CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:162),和
[0196] CDR3β–CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163),
[0197] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0198] (xxi)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:111),
[0199] CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:112),
[0200] CDR3α-CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113),
[0201] CDR1β–SQVTM(SEQ ID NO:167),
[0202] CDR2β–ANQGSEA(SEQ ID NO:168),和
[0203] CDR3β–CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169),
[0204] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0205] (xxii)CDR1α-VGISA(SEQ ID NO:173),
[0206] CDR2α–LSSGK(SEQ ID NO:174),
[0207] CDR3α-CAVTVGNKLVF(SEQ ID NO:175),
[0208] CDR1β–MNHNS(SEQ ID NO:178),
[0209] CDR2β–SASEGT(SEQ ID NO:179),和
[0210] CDR3β–CASRGWREQFF(SEQ ID NO:180),
[0211] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0212] (xxiii)CDR1α-VGISA(SEQ ID NO:184),
[0213] CDR2α–LSSGK(SEQ ID NO:185),
[0214] CDR3α-CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186),
[0215] CDR1β–SGHTS(SEQ ID NO:194),
[0216] CDR2β–YDEGEE(SEQ ID NO:195),和
[0217] CDR3β–CASSWGYQETQYF(SEQ ID NO:196),
[0218] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0219] (xxiv)CDR1α-VGISA(SEQ ID NO:184),
[0220] CDR2α–LSSGK(SEQ ID NO:185),
[0221] CDR3α-CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186),
[0222] CDR1β–KGHSH(SEQ ID NO:200),
[0223] CDR2β–LQKENI(SEQ ID NO:201),和
[0224] CDR3β–CASSPTGGEYYGYTF(SEQ ID NO:202),
[0225] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0226] (xxv)CDR1α-VGISA(SEQ ID NO:184),
[0227] CDR2α–LSSGK(SEQ ID NO:185),
[0228] CDR3α-CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186),
[0229] CDR1β–MNHEY(SEQ ID NO:206),
[0230] CDR2β–SVGAGI(SEQ ID NO:207),和
[0231] CDR3β–CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF(SEQ ID NO:208),
[0232] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0233] (xxvi)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:189),
[0234] CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:190),
[0235] CDR3α-CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191),
[0236] CDR1β–SGHTS(SEQ ID NO:194),
[0237] CDR2β–YDEGEE(SEQ ID NO:195),和
[0238] CDR3β–CASSWGYQETQYF(SEQ ID NO:196),
[0239] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0240] (xxvii)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:189),
[0241] CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:190),
[0242] CDR3α-CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191),
[0243] CDR1β–KGHSH(SEQ ID NO:200),
[0244] CDR2β–LQKENI(SEQ ID NO:201),和
[0245] CDR3β–CASSPTGGEYYGYTF(SEQ ID NO:202),
[0246] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0247] (xxviii)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:189),
[0248] CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:190),
[0249] CDR3α-CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191),
[0250] CDR1β–MNHEY(SEQ ID NO:206),
[0251] CDR2β–SVGAGI(SEQ ID NO:207),和
[0252] CDR3β–CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF(SEQ ID NO:208),
[0253] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0254] (xxix)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:212),
[0255] CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:213),
[0256] CDR3α-CAASGGRDDKIIF(SEQ ID NO:214),
[0257] CDR1β–MNHEY(SEQ ID NO:217),
[0258] CDR2β–SVGAGI(SEQ ID NO:218),和
[0259] CDR3β–CASSYSRTESTDTQYF(SEQ ID NO:219),
[0260] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0261] (xxx)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:90),
[0262] CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:91),
[0263] CDR3α-CAANNARLMF(SEQ ID NO:92),
[0264] CDR1β–SGHRS(SEQ ID NO:269),
[0265] CDR2β–YFSETQ(SEQ ID NO:270),和
[0266] CDR3β–CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271),
[0267] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0268] (xxxi)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:264),
[0269] CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:265),
[0270] CDR3α-CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266),
[0271] CDR1β–SGHNS(SEQ ID NO:95),
[0272] CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:96),和
[0273] CDR3β–CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97),
[0274] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0275] (xxxii)CDR1α-NSMFDY(SEQ ID NO:264),
[0276] CDR2α–ISSIKDK(SEQ ID NO:265),
[0277] CDR3α-CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266),
[0278] CDR1β–SGHRS(SEQ ID NO:269),
[0279] CDR2β–YFSETQ(SEQ ID NO:270),和
[0280] CDR3β–CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271),
[0281] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0282] (xxxiii)CDR1α-TSINN(SEQ ID NO:275),
[0283] CDR2α–IRSNERE(SEQ ID NO:276),
[0284] CDR3α-CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277),
[0285] CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:161),
[0286] CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:162),和
[0287] CDR3β–CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163),
[0288] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0289] (xxxiv)CDR1α-TSINN(SEQ ID NO:275),
[0290] CDR2α–IRSNERE(SEQ ID NO:276),
[0291] CDR3α-CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277),
[0292] CDR1β–SQVTM(SEQ ID NO:167),
[0293] CDR2β–ANQGSEA(SEQ ID NO:168),和
[0294] CDR3β–CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169),
[0295] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0296] (xxxv)CDR1α-TSINN(SEQ ID NO:275),
[0297] CDR2α–IRSNERE(SEQ ID NO:276),
[0298] CDR3α-CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277),
[0299] CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:280),
[0300] CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:281),和
[0301] CDR3β–CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282),
[0302] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0303] (xxxvi)CDR1α-TSINN(SEQ ID NO:275),
[0304] CDR2α–IRSNERE(SEQ ID NO:276),
[0305] CDR3α-CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277),
[0306] CDR1β–SGHDY(SEQ ID NO:286),
[0307] CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:287),和
[0308] CDR3β–CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288),
[0309] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0310] (xxxvii)CDR1α-DSSSTY(SEQ ID NO:101),
[0311] CDR2α–IFSNMDM(SEQ ID NO:102),
[0312] CDR3α-CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103),
[0313] CDR1β–SGHDY(SEQ ID NO:286),
[0314] CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:287),和
[0315] CDR3β–CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288),
[0316] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0317] (xxxviii)CDR1α-DSVNN(SEQ ID NO:106),
[0318] CDR2α–IPSGT(SEQ ID NO:107),
[0319] CDR3α-CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108),
[0320] CDR1β–SGHDY(SEQ ID NO:286),
[0321] CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:287),和
[0322] CDR3β–CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288),
[0323] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0324] (xxxix)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:111),
[0325] CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:112),
[0326] CDR3α-CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113),
[0327] CDR1β–SGHDY(SEQ ID NO:286),
[0328] CDR2β–FNNNVP(SEQ ID NO:287),和
[0329] CDR3β–CASSLGLSISQETQYF(SEQ ID NO:288),
[0330] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0331] (xxxx)CDR1α-DSSSTY(SEQ ID NO:101),
[0332] CDR2α–IFSNMDM(SEQ ID NO:102),
[0333] CDR3α-CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103),
[0334] CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:280),
[0335] CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:281),和
[0336] CDR3β–CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282),
[0337] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0338] (xxxxi)CDR1α-DSVNN(SEQ ID NO:106),
[0339] CDR2α–IPSGT(SEQ ID NO:107),
[0340] CDR3α-CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108),
[0341] CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:280),
[0342] CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:281),和
[0343] CDR3β–CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282),
[0344] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;或
[0345] (xxxxii)CDR1α-DSASNY(SEQ ID NO:111),
[0346] CDR2α–IRSNVGE(SEQ ID NO:112),
[0347] CDR3α-CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113),
[0348] CDR1β–DFQATT(SEQ ID NO:280),
[0349] CDR2β–SNEGSKA(SEQ ID NO:281),和
[0350] CDR3β–CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282),
[0351] 或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0352] 在一个实施方案中,本发明提供了本发明的TCR,其包含:
[0353] (i)α链可变域,其包含SEQ ID NO:4的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:9的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0354] (ii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:37的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:42的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0355] (iii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0356] (iv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:15的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0357] (v)α链可变域,其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:25的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0358] (vi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:20的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:31的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0359] (vii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0360] (viii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0361] (ix)α链可变域,其包含SEQ ID NO:48的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0362] (x)α链可变域,其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:58的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0363] (xi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:64的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0364] (xii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:53的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:70的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0365] (xiii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:81的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0366] (xiv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:76的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:87的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0367] (xv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列或与其具有至少
75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0368] (xvi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0369] (xvii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0370] (xviii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0371] (xix)α链可变域,其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0372] (xx)α链可变域,其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0373] (xxi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0374] (xxii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:176的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:181的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0375] (xxiii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0376] (xxiv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0377] (xxv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:187的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0378] (xxvi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:197的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0379] (xxvii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:203的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0380] (xxviii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:192的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:209的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0381] (xxix)α链可变域,其包含SEQ ID NO:215的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:220的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0382] (xxx)α链可变域,其包含SEQ ID NO:93的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少
99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0383] (xxxi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:98的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0384] (xxxii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:267的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:272的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0385] (xxxiii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:164的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0386] (xxxiv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:170的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0387] (xxxv)α链可变域,其包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0388] (xxxvi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:278的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0389] (xxxvii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0390] (xxxviii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0391] (xxxix)α链可变域,其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:289的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0392] (xxxx)α链可变域,其包含SEQ ID NO:104的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0393] (xxxxi)α链可变域,其包含SEQ ID NO:109的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0394] (xxxxii)α链可变域,其包含SEQ ID NO:114的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链可变域,其包含SEQ ID NO:283的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体。在一个实施方案中,本发明提供了本发明的TCR,其包含
[0395] (i)α链,其包含SEQ ID NO:5的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:10、SEQ ID NO:11和SEQ ID NO:10和11的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0396] (ii)α链,其包含SEQ ID NO:38的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:43、SEQ ID NO:44和SEQ ID NO:43和44的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0397] (iii)α链,其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:26和27的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0398] (iv)α链,其包含SEQ ID NO:16的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:32和33的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0399] (v)α链,其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:26、SEQ ID NO:27和SEQ ID NO:26和27的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0400] (vi)α链,其包含SEQ ID NO:21的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:32、SEQ ID NO:33和SEQ ID NO:32和33的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0401] (vii)α链,其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:59和60的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0402] (viii)α链,其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:65和66的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0403] (ix)α链,其包含SEQ ID NO:49的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:71和72的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0404] (x)α链,其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:59、SEQ ID NO:60和SEQ ID NO:59和60的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0405] (xi)α链,其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:65、SEQ ID NO:66和SEQ ID NO:65和66的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0406] (xii)α链,其包含SEQ ID NO:54的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:71、SEQ ID NO:72和SEQ ID NO:71和72的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0407] (xiii)α链,其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:82、SEQ ID NO:83和SEQ ID NO:82和83的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0408] (xiv)α链,其包含SEQ ID NO:77的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:88、SEQ ID NO:89和SEQ ID NO:88和89的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0409] (xv)α链,其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:99和100的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0410] (xvi)α链,其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:165和166的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0411] (xvii)α链,其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:171和172的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0412] (xviii)α链,其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:165和166的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0413] (xix)α链,其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:171和172的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0414] (xx)α链,其包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:165和166的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0415] (xxi)α链,其包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:171和172的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0416] (xxii)α链,其包含SEQ ID NO:177的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:182、SEQ ID NO:183和SEQ ID NO:182和183的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0417] (xxiii)α链,其包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:198和199的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0418] (xxiv)α链,其包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205和SEQ ID NO:204和205的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0419] (xxv)α链,其包含SEQ ID NO:188的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211和SEQ ID NO:210和211的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0420] (xxvi)α链,其包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:198、SEQ ID NO:199和SEQ ID NO:198和199的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0421] (xxvii)α链,其包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:204、SEQ ID NO:205和SEQ ID NO:204和205的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0422] (xxviii)α链,其包含SEQ ID NO:193的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:210、SEQ ID NO:211和SEQ ID NO:210和211的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0423] (xxix)α链,其包含SEQ ID NO:216的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:221、SEQ ID NO:222和SEQ ID NO:221和222的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0424] (xxx)α链,其包含SEQ ID NO:94的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274和SEQ ID NO:273和274的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0425] (xxxi)α链,其包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:99、SEQ ID NO:100和SEQ ID NO:99和100的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0426] (xxxii)α链,其包含SEQ ID NO:268的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:273、SEQ ID NO:274和SEQ ID NO:273和274的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0427] (xxxiii)α链,其包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:165、SEQ ID NO:166和SEQ ID NO:165和166的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0428] (xxxiv)α链,其包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:171、SEQ ID NO:172和SEQ ID NO:171和172的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0429] (xxxv)α链,其包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285和SEQ ID NO:284和285的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0430] (xxxvi)α链,其包含SEQ ID NO:279的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291和SEQ ID NO:290和291的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0431] (xxxvii)α链,其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291和SEQ ID NO:290和291的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0432] (xxxviii)α链,其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291和SEQ ID NO:290和291的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0433] (xxxix)α链,其包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:290、SEQ ID NO:291和SEQ ID NO:290和291的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0434] (xxxx)α链,其包含SEQ ID NO:105的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285和SEQ ID NO:284和285的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;
[0435] (xxxxi)α链,其包含SEQ ID NO:110的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285和SEQ ID NO:284和285的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体;或[0436] (xxxxii)α链,其包含SEQ ID NO:160的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少
80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少
75%序列同一性的变体;和β链,其包含选自下组的氨基酸序列:SEQ ID NO:284、SEQ ID NO:285和SEQ ID NO:284和285的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的变体。
[0437] 在一个实施方案中,本发明提供了本发明的TCR,其α链和β链,所述α链包含SEQ ID NO:257的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的其变体;所述β链包含SEQ ID NO:259的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的其变体。
[0438] 在一个实施方案中,本发明提供了本发明的TCR,其α链和β链,所述α链包含SEQ ID NO:261的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的其变体;所述β链包含SEQ ID NO:263的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少
95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%,优选至少75%序列同一性的其变体。
[0439] 本发明的TCR可以结合包含选自下组的氨基酸序列的WT1肽:EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123),YESDNHTTPIL(SEQ ID NO:126),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127),QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118),EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119),SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120),APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250),
DPGGIWAKLGAAEAS(SEQ ID NO:251),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:252),KRHQRRHTGVKPFQC(SEQ ID NO:253),PSCQKKFARSDELVR(SEQ ID NO:254)和和它们各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0440] 在另一个方面,本发明提供了T细胞受体(TCR),其结合主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中所述WT1肽包含选自下组的氨基酸序列:EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123),YESDNHTTPIL(SEQ ID NO:126),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127),QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118),EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119),
SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120),APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117),NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250),DPGGIWAKLGAAEAS(SEQ ID NO:251),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:252),
KRHQRRHTGVKPFQC(SEQ ID NO:253)PSCQKKFARSDELVR(SEQ ID NO:254)和它们各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0441] 在一个实施方案中,本发明的TCR结合MHC I和/或MHC II肽复合物。
[0442] 在一个实施方案中,本发明的TCR限制于人白细胞抗原(HLA)等位基因。在一个实施方案中,本发明的TCR限制于HLA-A或HLA-B等位基因在一个实施方案中,本发明的TCR限制于选自下组的HLA-A等位基因:HLA-A*0201、HLA-A*0101、HLA-A*2402和HLA-A*0301或选自下组的HLA-B等位基因:HLA-B*0702、HLA-B*3501和HLA-B*3502。
[0443] 在一个实施方案中,本发明的TCR限制于HLA-A*0201。
[0444] 在一个实施方案中,本发明的TCR限制于HLA-B*3502。
[0445] 在一个实施方案中,本发明的TCR限制于HLA-B*3501。
[0446] 在一个实施方案中,本发明的TCR限制于HLA-C等位基因。在一个实施方案中,本发明的TCR限制于选自下组的HLA-C等位基因:HLA-C*07:01,HLA-C*03:04,HLA-C*04:01,HLA-C*05:01,HLA-C*06:02和HLA-C*07:02。
[0447] 在一个实施方案中,本发明的TCR包含α链/β链界面处的一个或多个突变,使得当在T细胞中表达所述α链和所述β链时所述链和内源TCRα和β链之间的错配频率减少。
[0448] 在一个实施方案中,本发明的TCR包含α链/β链界面处的一个或多个突变,使得当在T细胞中表达所述α链和所述β链时TCRα和β链的表达平升高。
[0449] 在一个实施方案中,一个或多个突变将半胱氨酸残基引入所述α链和所述β链中每个的恒定区域中,其中所述半胱氨酸残基能够在所述α链和所述β链之间形成二硫键。
[0450] 本发明的TCR可以包含鼠源化(murinized)恒定区。
[0451] 在一个实施方案中,本发明的TCR是可溶性TCR。
[0452] 在另一个方面,本发明提供了分离的多核苷酸,其编码本发明的T细胞受体(TCR)的所述α链和/或本发明的TCR的所述β链。
[0453] 在另一个方面,本发明提供了分离的多核苷酸,其包含SEQ ID NO:256的核苷酸序列和/或SEQ ID NO:258的核苷酸序列或与其具有至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的其变体。
[0454] 在另一个方面,本发明提供了分离的多核苷酸,其包含SEQ ID NO:260的核苷酸序列和/或SEQ ID NO:262的核苷酸序列或与其具有至少40%、至少50%、至少60%、至少70%、至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%或至少99%序列同一性的其变体。
[0455] 在一个实施方案中,分离的多核苷酸编码与所述β链连接的所述α链。在一个实施方案中,分离的多核苷酸编码一种或多种短干扰RNA(siRNA)或能够减少或阻止一种或多种内源TCR基因表达的其他试剂
[0456] 在另一个方面,本发明提供了载体,其包含本发明的多核苷酸。在另一个实施方案中,载体包含编码一个或多个CD3链、CD8、自杀基因和/或选择标志物的多核苷酸。
[0457] 在另一个方面,本发明提供了细胞,其包含本发明的TCR、本发明的多核苷酸或本发明的载体,
[0458] 在一个实施方案中,细胞进一步包含编码一个或多个CD3链、CD8、自杀基因和/或选择标志物的载体。
[0459] 在一个实施方案中,细胞是T细胞、淋巴细胞或干细胞,例如造血干细胞或诱导多能干细胞(iPS)。T细胞、所述淋巴细胞或所述干细胞可以选自下组:CD4细胞、CD8细胞、Th0细胞、Tc0细胞、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞、Tc2细胞、Th17细胞、Th22细胞、γ/δT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、双阴性T细胞、幼稚T细胞、记忆干T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、效应T细胞、造血干细胞和多能干细胞。
[0460] 在一个实施方案中,细胞是已经从受试者分离的T细胞。
[0461] 在一个实施方案中,细胞中编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因受到破坏,优选使得不表达所述编码TCRα链的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因。在一个实施方案中,通过插入表达盒破坏所述编码TCRα链的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因,所述表达盒包含编码本发明的TCR的多核苷酸序列。在一个实施方案中,细胞中的一个或多个编码MHC的内源基因受到破坏,优选地其中细胞是非自体反应性通用T细胞。在一个实施方案中,细胞中涉及持久性、扩充、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢(homing)能或其他T细胞功能的内源基因被破坏,优选其中涉及持久性,扩充,活性,对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能的内源基因选自下组:PD1、TIM3、LAG3、2B4、KLRG1、TGFbR、CD160和CTLA4。在一个实施方案中,通过表达盒整合破坏涉及持久性、扩充、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能的内源基因,其中表达盒包含编码本发明的TCR的多核苷酸序列。
[0462] 在另一个方面,本发明提供了制备细胞的方法,其包括以下步骤:在体外、离体或体内将本发明的载体导入细胞中,例如通过转染或转导进行。
[0463] 在另一个方面,本发明提供了制备细胞的方法,其包括在体外、离体或在体内用本发明的一种或多种载体转导细胞的步骤。
[0464] 在一个实施方案中,要用一种或多种载体转导的细胞选自下组:T细胞、淋巴细胞或干细胞,例如造血干细胞或诱导多能干细胞(iPS),任选地,T细胞、所述淋巴细胞或所述干细胞可以选自下组:CD4细胞、CD8细胞、Th0细胞、Tc0细胞、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞、Tc2细胞、Th17细胞、Th22细胞、γ/δT细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、双阴性T细胞、幼稚T细胞、记忆干T细胞、中枢记忆T细胞、效应记忆T细胞、效应T细胞、造血干细胞和多能干细胞。
[0465] 在一个实施方案中,方法包括T细胞编辑的步骤,所述步骤包括用人工核酸酶破坏内源基因,例如编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因,优选地,其中所述人工核酸酶选自下组:锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(transcription activator-like effector nuclease)(TALEN)和CRISPR/Cas系统。
[0466] 在一个实施方案中,方法包括T细胞编辑的步骤,所述步骤包括用人工核酸酶破坏编码TCRα链的内源基因和/或编码TCRβ链的内源基因,优选地,其中所述人工核酸酶选自下组:锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas系统。
[0467] 在一个实施方案中,方法包括将表达盒靶向整合到通过所述人工核酸酶破坏的所述编码TCRα链基因的内源基因和/或所述编码TCRβ链的内源基因中的步骤,其中所述表达盒包含编码本发明的TCR的多核苷酸或本发明的多核苷酸序列。
[0468] 在一个实施方案中,方法包括破坏一个或多个编码MHC的内源基因的步骤,优选地,其中通过所述方法制备的细胞是非同种异体反应性(non-alloreactive)的通用T细胞。
[0469] 在一个实施方案中,方法包括破坏一个或多个内源MHC基因的步骤,优选地,其中通过所述方法制备的细胞是非同种异体反应性的通用T细胞。
[0470] 在一个实施方案中,方法包括以下步骤:破坏一个或多个内源基因以改变持久性、扩充、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能,优选地,其中所述方法包括将表达盒靶向整合到通过人工核酸酶破坏的内源基因中的步骤,所述内源基因涉及持久性、扩充、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能,其中所述表达盒包含编码本发明的TCR的多核苷酸序列,优选其中所述内源基因选自下组:PD1、TIM3、LAG3、2B4、KLRG1、TGFbR、CD160和CTLA4。
[0471] 在另一个方面,本发明提供了本发明的细胞或通过本发明的方法制备的细胞,用于过继(adoptive)细胞转移,优选过继T细胞转移,任选地所述过继T细胞转移可以是同种异体过继T细胞转移、通用非自体反应性T细胞转移、或自体过继T细胞转移。
[0472] 在另一个方面,本发明提供了本发明的TCR、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、本发明的细胞、通过本发明的方法制备的细胞、或本发明的嵌合分子,用于疗法。
[0473] 在另一个方面,本发明提供了本发明的TCR、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、本发明的细胞、通过本发明的方法制备的细胞、或本发明的嵌合分子,用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病。
[0474] 在另一方面,本发明提供了T细胞,其经遗传工程化改造(遗传编辑)以修饰持久性、扩充、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能,其中T细胞表达本发明的TCRα链和/或本发明的TCRβ链。
[0475] 在另一方面,本发明提供了通过方案遗传工程化改造(遗传编辑)的T细胞,所述方案包括将表达盒靶向整合到通过人工核酸酶破坏的涉及持久性、扩充、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他T细胞功能的内源基因中的步骤,其中表达盒包含编码本发明的TCRα链和/或本发明的TCRβ链的多核苷酸序列。
[0476] 在另一方面,本发明提供了用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法,其包括对有此需要的受试者施用本发明的TCR、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、本发明的细胞、通过本发明的方法制备的细胞或本发明的嵌合分子。
[0477] 与WT1表达有关的疾病可以是增殖性病症。优选地,增殖性病症可以选自下组:血液恶性疾病,诸如急性髓样白血病(acute myeloid leukemia)(AML)、慢性髓样白血病(chronic myeloid leukemia)(CML)、成淋巴细胞性白血病(lymphoblastic leukemia)、骨髓增生异常综合征(myelodisplastic syndrome)、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤(non Hodgkin lymphoma)、何杰金淋巴瘤(Hodgkin lymphoma)。增殖性病症可以选自下组:实体瘤,诸如癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌(cholangiocarcinoma)、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤(synovial sarcoma)、血管肉瘤(angiosarcoma)、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤(neuroblastoma)、横纹肌肉瘤(rabdomyosarcoma)、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌(urothelial cancer)、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结直肠癌
[0478] 在一个优选的实施方案中,与WT1表达有关的疾病是急性髓样白血病(AML)。
[0479] 在一个优选的实施方案中,与WT1表达有关的疾病是慢性髓样白血病(CML)。
[0480] 在另一个方面,本发明提供了分离的免疫原性WT1肽,其包含选自下组的氨基酸序列:EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123)YESDNHTTPIL(SEQ ID NO:126),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127),QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118),EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119),SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120),APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117),NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250),DPGGIWAKLGAAEAS(SEQ ID NO:251),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:252),
KRHQRRHTGVKPFQC(SEQ ID NO:253),PSCQKKFARSDELVR(SEQ ID NO:254)和它们各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0481] 附图简述
[0482] 图1:图显示来自10名健康供体的外周血的功能性WT-1特异性T细胞的体外扩充结果
[0483] 用合并的重叠WT1 15聚体肽刺激10名健康供体(HD)的外周血单个核细胞26-30小时,富集CD137+细胞,并扩充9-19天。用加载有无关肽合并物或WT1肽合并物的自体抗原呈递细胞(APC)再刺激扩充的T细胞6小时。另外,阴性对照(未刺激的T细胞)和阳性对照(在PMA和离子霉素存在下培养的T细胞)包括在实验设置中(未显示)。点图指示IFNγ产生和细胞表面上CD107a暴露的胞内染色的结果。用加载有WT1肽合并物的自体APC的几次再刺激后,如前所述通过胞内染色测试T细胞的特异性。结果显示了HD1(a),HD3(c),HD4(d),HD5(e),HD6(f),HD7(g)和HD10(j)的CD8 T细胞区室中和HD2(b),HD8(h)和HD9(i)的CD4 T细胞区室中WT1特异性T细胞的富集。WT1,维尔姆斯肿瘤1;PMA,佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯;IFNγ,干扰素-γ;S,刺激。
[0484] 图2:网格和图显示通过定位网格策略鉴定WT1免疫原性肽
[0485] 通过胞内染色鉴定通过用重叠WT1肽的合并物的重复刺激在体外致敏的T细胞所识别的表位。特别地,评估响应APC上加载的WT1十五肽的亚合并物的定位网格的特异性T细胞的百分比。另外,实验设置中包含阴性对照(未刺激的T细胞和与加载有无关肽合并物的APC共培养的T细胞)和阳性对照(在PMA和离子霉素存在下培养的T细胞)(未显示未刺激和PMA/离子霉素条件的T细胞)。
[0486] (a)解卷积网格,指示与加载有不同亚合并物(表示为SP1-24)的APC共培养后表达IFNγ和CD107a的T细胞的百分比。粗体文本中的IFNγ和CD107a值表示含T细胞识别的WT1表位的亚合并物。报道了相对于T细胞与加载有响应性亚合并物的APC的共培养的代表性点图,指示IFNγ和CD107a的表达。对以下项观察到优势响应:HD1(b),HD3(d),HD6(g),HD7(h),HD10(k)中的亚合并物4、5、16;HD2(c)中的亚合并物6、16、17、20、23;HD4(e)中的亚合并物4、5、6、14、18、21;HD5(f)中的亚合并物5、11、12、21、22;HD8(i)的亚合并物12、14;HD9(j)的亚合并物5、13、21。对于HD7,我们还观察到响应亚合并物7、8、20的IFNγ分泌和CD107a表达增加,尽管与用亚合并物4、5、16观察到的响应相比,百分比更低。SP,亚合并物。WT1,维尔姆斯肿瘤1;APC,抗原呈递细胞;PMA,佛波醇12-肉豆蔻酸酯13-乙酸酯;IFNγ,干扰素-γ。
[0487] 图3:通过用合并的肽致敏产生的WT1特异性T细胞的表位特异性。
[0488] 为了验证WT1免疫原性肽,将从每个HD扩充的T细胞在APC存在下共培养6小时,所述APC加载有在定位网格的解卷积后鉴定的肽并且加载有至少一种无关肽作为阴性对照。另外,阴性(未刺激的T细胞)和阳性对照(在PMA和离子霉素存在下培养的T细胞)包括在实验设置中(未显示)。点图对于每名HD显示IFNγ和/或表面CD107a的胞内染色结果。对与肽
40和41(对于HD1)(a),而非对肽42和43(无关肽);与肽54、77、90(对于HD2)(b)而非对肽42和138(无关肽);肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157,VLD,其是以SEQ ID NO:117所示的肽的九聚体(在图3c中称为“11聚体”))(对于HD3)(c)以及以低响应与肽PVLDFAPPG(SEQ ID NO:158,PVL,其是以SEQ ID NO:117所示的肽的另一种九聚体)和LDFAPPGAS(SEQ ID NO:159,LDF,其是以SEQ ID NO:116所示的肽的九聚体,以前描述为免疫原性肽(Doubrovina,E.et al.(2012)Blood 120:1633–1646));肽17、18、99、100(对于HD4)(d,e)而非对无关肽(15、16、
63-66、101、102和132);肽101(对于HD5)(f)而非对于无关肽(63、107、108、113、119和120);
肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157,VLD,其是以SEQ ID NO:117所示的肽的九聚体(在图3c中称为“11聚体”))(对于HD6)(g)和肽PVLDFAPPG(SEQ ID NO:158,PVL,其是以SEQ ID NO:117所示的肽的另一种九聚体)而非对于肽LDFAPPGAS(SEQ ID NO:159,LDF,其是以SEQ ID NO:
116所示的肽的九聚体,以前描述为免疫原性肽(Doubrovina,E.et al.(2012)Blood 120:
1633–1646));肽101、125、137(对于HD9)(h);肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157,VLD,其是以SEQ ID NO:117所示的肽的九聚体(在图3c中称为“11聚体”))(对于HD10)(i)而非对于无关肽共培养的T细胞分别观察到CD107a和/或IFNγ阳性细胞的富集,由于T细胞的适合度降低,不可能进行功能测试来验证通过定位网格的解卷积预测的肽,即HD7的肽40、41、91、92和HD8的肽24。
[0489] 为了确定对HD4、HD5和HD10 T细胞鉴定的WT1表位的HLA限制,对供体DNA进行测序以确定HLA分型。之后,将WT1特异性T细胞与不同的呈递抗原的EBV-BLCL细胞系共培养,每个细胞系含有特定的感兴趣的HLA等位基因,其通过对HD4、HD5或HD10 DNA进行测序来鉴定。EBV-BLCL细胞用HD4的肽17、HD5的肽101和VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157)肽或用无关对照肽脉冲。共培养6小时后,我们观察到已经与对于HD4的表达HLA-B*3502等位基因并且用肽17脉冲的EBV-BLCL细胞(j)、对于HD5的表达HLA-B*3501等位基因并且用肽101脉冲的EBV-BLCL细胞(k)和对于HD10的表达HLA-A*0201等位基因并且用肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157)脉冲的EBV-BLCL细胞(l)共培养的WT1特异性T细胞对WT1的实质性响应。(m)表显示了被从HD1-HD10扩充的T细胞识别的肽。对于HD3、HD6和HD10,显示了特定的九聚体,其与肽40和41重叠并引发免疫应答。维尔姆斯肿瘤1;APC,抗原呈递细胞;PMA,2;佛波醇12-肉豆蔻酸酯
13-乙酸酯;IFNγ,干扰素-γ;S,刺激。
[0490] 图4:图和曲线图显示了HD1、HD3和HD4的扩充T细胞识别天然加工的WT1表位
[0491] (a)图描绘了在与用WT1合并物脉冲的T2细胞、经遗传修饰以表达HLA-A*0201等位基因并过表达WT1蛋白的K562细胞或用非特异性对照MelanA/MART1合并物作为阴性对照脉冲的T2细胞共培养后从HD1扩充的CD8+T细胞的CD107表达。
[0492] (b)图描绘了确定HD3扩充的T细胞靶向表达WT1的细胞的能力的实验结果。结果表示为消除指数,其计算为与WT1特异性T细胞共培养后仍然存在的靶细胞总数除以单独的靶细胞总数。将HD3 T细胞与用含有引发免疫应答的免疫原性肽的亚合并物16(SP16)脉冲的T2细胞;用MelanA/MART1合并物(Melan A)作为阴性对照脉冲的T2细胞;野生型(K562)或经遗传修饰以表达HLA-A*0201等位基因并且过表达WT1蛋白(K562 A2+WT1+)的K562细胞共培养。
[0493] (c)图描绘了实验结果以确定来自HD4的WT1特异性T细胞消除靶细胞的能力。将HD4 T细胞与从HLA-B*3502患者收获的原代CD33+母细胞以10:1的比率共培养,或者作为对照,与来自不含HLA-B*3502等位基因的患者的白血病细胞共培养。共培养3天后,结果指示在用WT1特异性T细胞(CD3+细胞)接种时,CD33+HLA-B*3502母细胞几乎完全清除。E,效应物;T,靶物。
[0494] 图5:图显示了WT1特异性T细胞的Vβ概况分析的结果
[0495] 用Vβ免疫概况分析试剂盒染色用WT1合并物的几次刺激后从不同HD产生的WT1特异性T细胞,以确定群体的克隆性。特别地,通过FACS分析确定β链的可变(V)基因的表达。结果指示在HD1(TRBV12-3;12-4),HD2(TRBV11-2),HD3(TRBV4-3),HD5(TRBV20-1)中高度显性Vβ基因的表达,而对于HD4、HD6、HD10,没有检测到限定的Vβ的明显富集。HD4 SP14指示用亚合并物14刺激的T细胞,该亚合并物含有引发最高免疫应答的肽17-18。HD4 SP18+21指示用亚合并物18和21刺激的T细胞,所述亚合并物18和21分别含有肽63-64-65-66和99-100-101-102,引发最小的免疫应答,如图3所示。对于HD7、HD8和HD9,由于细胞适合度降低,不可能进行Vβ免疫概况分析。
[0496] 图6:图随时间显示了富集的WT1特异性T细胞的TCR测序结果
[0497] 在用WT1合并物的几次刺激后,通过TCRαβ测序表征从实验设置中包括的每名健康供体产生的T细胞。测序结果指示HD1(a),HD2(b)和HD3(c),HD4(d),HD5(e),HD6(f),HD7(g),HD8(h),HD9(i),HD10(j)的优势克隆型的存在。条形图描述了在每个时间点鉴定的10个最具优势的CDR3氨基酸序列(例如S9对应于第9轮刺激后获得的测序结果)。对于每个柱形,从x轴开始,下面的区段代表最有优势的CDR序列。接下来的9个最有优势的序列堆叠在下面的区段之上,并通过向上降低频率来排序。剩余序列在顶部区段中分组在一起。WT1,维尔姆斯肿瘤1;CDR3,互补决定区3;S,刺激。
[0498] 图7:经遗传修饰的T淋巴细胞的功能活性。
[0499] 用双向慢病毒载体转导从健康个体的PBMC分离的T细胞,该双向慢病毒载体编码从HD1和HD3中分离的TCR的α和β链。作为对照,我们用先前发表的TCR转导T细胞,所述TCR识别HLA-A*0201等位基因呈递时的WT1126-134(RMFPNAPYL;SEQ ID NO:255)肽。转移(TR)T淋巴细胞与以下各项共培养3天:(a)用WT1 126-134肽或VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157)肽脉冲或不脉冲的T2细胞(效应物:靶物比率=1:1);(b)野生型(K562)或经遗传修饰以表达HLA-A*0201等位基因的K562细胞(效应物:靶物比率=1:1);(c)根据HLA-A*0201等位基因和WT1抗原的表达选择的3种不同的原代AML母细胞(效应物:靶物比率=5:1)。对于与T2和K562细胞系的共培养,我们包括未转导的T细胞作为对照。结果指示每种TCR在识别由HLA-A*0201等位基因呈现时的靶肽中的能力(图7a),并且与HD3-TR T细胞相比HD1 TCR转导的T细胞在介导含有HLA*A0201等位基因的K562细胞的特异性且近完全消除中的更大潜力。值得注意的是,在K562 HLA*A0201细胞与WT1 126-134TR T细胞的共培养中,未观察到靶细胞的实质性杀伤(图7b)。共培养实验的结果进一步证实了这些结果,该共培养实验使用源自3名不同AML患者的原代AML母细胞(pAML1母细胞:WT1-/HLA-A*0201+;pAML2和pAML3母细胞:WT1+/HLA-A*0201+)作为靶细胞进行。在此实验设置中,在与靶物共培养之前,用特定的dextramer分选每个个别的T细胞群体,以富集效应细胞的纯度。我们观察到与HD1 TR T细胞共培养后,这两个含有HLA-A*0201等位基因的pAML母细胞的更大的消除,而HD3 T和WT1 
126-134T细胞仅仅识别来自pAML3的母细胞。UT,未转导,pAML,原发性急性髓样白血病;TR,转移;Dx,dextramer。
[0500] 发明详述
[0501] 如本文所用,术语“包含”与“包括”或“含有”同义;并且是包括性的或开放式的,并且不排除其他未叙述的成员、要素或步骤。术语“包含”还包括术语“由...组成”。
[0502] T细胞受体
[0503] 在抗原加工期间,抗原在细胞内部降解,然后被主要组织相容性复合物(MHC)分子携带到细胞表面。T细胞能够识别抗原呈递细胞的表面处的此肽:MHC复合物。MHC分子有两种不同的类别:MHC I和MHC II,每种类别将肽从不同的细胞区室递送到细胞表面。
[0504] T细胞受体(TCR)是一种可以在T细胞表面上发现的分子,其负责识别与MHC分子结合的抗原。天然存在的TCR异二聚体在约95%的T细胞中由alpha(α)和beta(β)链组成,而约5%的T细胞具有由gamma(γ)和delta(δ)链组成的TCR。
[0505] TCR与抗原和MHC的结合导致T淋巴细胞活化,在所述T淋巴细胞上通过相关的酶、共受体和专的辅助分子介导的一系列生化事件来表达TCR。
[0506] 天然TCR的每条链是免疫球蛋白超家族的成员,并拥有一个N端免疫球蛋白(Ig)可变(V)域、一个Ig恒定(C)域、跨膜/跨细胞膜域和C端的短胞质尾。
[0507] TCRα链和β链的可变域具有三个高变或互补决定区(CDR)。TCRα链或β链例如以氨基至羧基末端顺序包含CDR1、CDR2和CDR3。通常,CDR3是负责识别加工抗原的主要CDR,尽管也已显示α链的CDR1与抗原性肽的N端部分相互作用,而β链的CDR1与肽的C端部分相互作用。认为CDR2识别MHC分子。
[0508] TCR的恒定域可以由短连接序列组成,其中半胱氨酸残基形成二硫键,从而在两条链之间形成连接。
[0509] 本发明的TCR的α链可以具有由TRAC基因编码的恒定域。下文显示了由TRAC基因编码的α链恒定域的示例性氨基酸序列:
[0510] IQNPDPAVYQLRDSKSSDKSVCLFTDFDSQTNVSQSKDSDVYITDKTVLDMRSMDFKSNSAVAWSNKSDFACANAFNNSIIPEDTFFPSPESSCDVKLVEKSFETDTNLNFQNLSVIGFRILLLKVAGFNLLMTLRLWSS
[0511] (SEQ ID NO:128)。
[0512] 本发明的TCR可以包含α链,所述α链包含SEQ ID NO:128的氨基酸序列或与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性,优选与其至少75%的序列同一性的其变体。
[0513] 本发明的TCR的β链可以具有由TRBC1或TRBC2基因编码的恒定域。下文显示了由TRBC1基因编码的β链恒定域的示例性氨基酸序列:
[0514] DLNKVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFFPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSVSYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDF
[0515] (SEQ ID NO:129)。
[0516] 下文显示了由TRBC2基因编码的β链恒定域的示例性氨基酸序列:
[0517] DLKNVFPPEVAVFEPSEAEISHTQKATLVCLATGFYPDHVELSWWVNGKEVHSGVSTDPQPLKEQPALNDSRYCLSSRLRVSATFWQNPRNHFRCQVQFYGLSENDEWTQDRAKPVTQIVSAEAWGRADCGFTSESYQQGVLSATILYEILLGKATLYAVLVSALVLMAMVKRKDSRG
[0518] (SEQ ID NO:130)。
[0519] 本发明的TCR可以包含β链,所述β链包含SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:130的氨基酸序列或SEQ ID NO:129,SEQ ID NO:130的与其具有至少75%、至少80%、至少85%、至少90%、至少95%、至少96%、至少97%、至少98%、至少99%序列同一性,优选与其具有至少
75%的序列同一性的变体。
[0520] 本发明的TCR可在α和β链的每个中具有一个或多个额外的半胱氨酸残基,使得TCR可以在恒定域中包含两个或更多个二硫键。
[0521] 结构允许TCR与拥有哺乳动物中的三个独特链(γ、δ和ε)和ζ链的其他分子如CD3缔合。这些辅助分子具有带负电的跨膜区,并且对于将信号从TCR传播到细胞中至关重要。CD3链和ζ链与TCR一起形成所谓的T细胞受体复合物。
[0522] 通过特异性共受体同时结合MHC分子增强来自T细胞复合物的信号。对于辅助T细胞,此共受体是CD4(对于II类MHC特异性);而对于细胞毒性T细胞,此共受体是CD8(对于I类MHC特异性)。共受体允许抗原呈递细胞和T细胞之间的延长的接合,并且募集细胞内参与活化的T淋巴细胞的信号传导的必需分子(例如,LCK)。
[0523] 因此,如本文所用,术语“T细胞受体”(TCR)是指能够识别当由MHC分子呈递时的肽的分子。分子可以是两条链α和β(或任选地γ和δ)的异二聚体或者它可以是单链TCR构建体。本发明的TCR可以是可溶性TCR,例如省去或改变一个或多个恒定域。本发明的TCR可以包含恒定域。
[0524] 本发明还提供了来自此类T细胞受体的α链或β链。
[0525] 本发明的TCR可以是杂合TCR,其包含源自超过一种物种的序列。例如,令人惊讶地发现,在人T细胞中比人TCR更有效表达鼠TCR。因此,TCR可包含人可变区和恒定区内的鼠序列。
[0526] 此方法的缺点是鼠恒定序列可触发免疫应答,导致转移的T细胞排斥。但是,用于使患者准备好过继T细胞疗法的条件化方案可以导致足够的免疫抑制,以允许表达鼠序列的T细胞的植入。
[0527] 互补决定区(CDR)
[0528] TCR中建立与同主要组织相容性复合物(MHC)结合的抗原性肽的大多数接触的部分是互补决定区3(CDR3),其对于每个T细胞克隆是独特的。CDR3区是胸腺中发生并且涉及属于可变(V)、多样性(D,对于β和δ链)和连接(J)基因的非连续基因的体细胞重排事件时产生的。此外,在每个TCR链基因的重排基因座处插入/缺失的随机核苷酸大大增加高度可变CDR3序列的多样性。因此,生物学样品中特定CDR3序列的频率指示特定T细胞群体的丰度。健康的人类中TCR全集的大的多样性针对抗原呈递细胞表面上MHC分子呈递的多种外来抗原提供了广泛的保护。在这方面,值得注意的是,可以在胸腺中生成理论上高达1015种不同的TCR。
[0529] T细胞受体多样性集中在CDR3上,并且此区域主要负责抗原识别。
[0530] 本发明的TCR的CDR3区的序列可以选自下表1中列出的那些。TCR可包含CDR,所述CDR包含下文描述的CDR3α和CDR3β对或由下文描述的CDR3α和CDR3β对组成。
[0531] CDR可以例如包含给定序列的一个、两个或三个取代、添加或缺失,条件是TCR保留结合由MHC分子呈递时的WT1肽的能力。
[0532] 如本文所用,术语“蛋白质”包括单链多肽分子以及多-多肽复合物,其中各个组成多肽通过共价或非共价手段连接。如本文所用,术语“多肽”是指其中的单体是氨基酸并且通过肽或二硫键连接在一起的多聚体。
[0533] 变体、衍生物、类似物、同源物和片段
[0534] 除了本文提及的特定蛋白质和多核苷酸之外,本发明还涵盖其变体、衍生物、类似物、同源物和片段的用途。
[0535] 在本发明的上下文中,任何给定序列的变体是如下的序列,其中残基(无论是氨基酸残基还是核酸残基)的特定序列已经以所讨论的多肽或多核苷酸基本上保留至少一种其内源功能的方式进行了修饰。变体序列可通过天然存在的蛋白质中存在的至少一个残基的添加、缺失、取代、修饰、取代和/或变异获得。
[0536] 称为具有多达三个氨基酸取代、添加或缺失的本发明的变体氨基酸序列可以具有例如一个、两个或三个氨基酸取代、添加或缺失。
[0537] 就本发明的蛋白质或多肽而言,如本文所用,术语“衍生物”包括一个(或多个)氨基酸残基从序列或对序列的任何取代、变异、修饰、替换、缺失和/或添加,条件是所得的蛋白质或多肽基本上保留至少一种其内源功能。
[0538] 就多肽或多核苷酸而言,如本文所用,术语“类似物”包括任何模拟物,即拥有其模拟的多肽或多核苷酸的至少一种内源功能的化合物。
[0539] 用于本发明的蛋白质还可以具有氨基酸残基的缺失、插入或取代,其产生沉默变化并产生功能上等同的蛋白质。可以基于残基的极性、电荷、溶解性、疏水性、亲水性和/或两亲性质的相似性进行有意的氨基酸取代,只要保留内源功能即可。例如,带负电荷的氨基酸包括天冬氨酸和谷氨酸;带正电荷的氨基酸包括赖氨酸和精氨酸;并且具有相似亲水性值的具有不带电荷的极性首基的氨基酸包括天冬酰胺、谷氨酰胺、丝氨酸、苏氨酸和酪氨酸。
[0540] 取代可以涉及将氨基酸替换为相似的氨基酸(保守取代)。相似的氨基酸是具有分组在一起的具有相关特性的侧链部分的氨基酸,例如,如下所示:
[0541] (i)性侧链:赖氨酸(K)、精氨酸(R)、组氨酸(H);
[0542] (ii)酸性侧链:天冬氨酸(D)和谷氨酸(E);
[0543] (iii)不带电荷的极性侧链:天冬酰胺(N)、谷氨酰胺(Q)、丝氨酸(S)、苏氨酸(T)和酪氨酸(Y);或
[0544] (iv)非极性侧链:甘氨酸(G)、丙氨酸(A)、缬氨酸(V)、亮氨酸(L)、异亮氨酸(I)、脯氨酸(P)、苯丙氨酸(F)、甲硫氨酸(M)、色氨酸(W)和半胱氨酸(C)。
[0545] 任何氨基酸变化应维持TCR结合由MHC分子呈递的WT1肽的能力。
[0546] 变体序列可以包含氨基酸取代、添加、缺失和/或插入。变异可以集中在一个或多个区域中,例如α或β链的恒定区、接头或框架区,或者它们可以分布在整个TCR分子中。
[0547] 可以例如根据下表进行保守取代、添加或缺失。第二列中相同中的氨基酸,优选是第三列中同一行中的氨基酸可以彼此取代:
[0548]
[0549]
[0550] 本发明还包括同源取代(例如,取代和替换在本文中均用于指现有氨基酸残基与备选残基的互换),例如同等取代,例如碱性取代为碱性、酸性取代为酸性、极性取代为极性等。也可以发生非同源取代,例如从一类残基到另一类残基,或备选涉及纳入非天然氨基酸,如氨酸。
[0551] 如本文所用,术语“变体”可以指与野生型氨基酸序列或野生型核苷酸序列具有一定同源性的实体。术语“同源性”可以等同于“同一性”。
[0552] 变体序列可以包括与主题序列可以是至少50%,55%,65%,75%,85%或90%相同,优选至少95%,至少97%或至少99%相同的氨基酸序列。通常,变体会包含与主题氨基酸序列相同的活性位点等。尽管也可以根据相似性(即具有相似化学性质/功能的氨基酸残基)考虑同源性,但是在本发明的上下文中,优选根据序列同一性表达同源性。
[0553] 变体序列可以包括可以与主题序列至少40%,45%,50%,55%,65%,75%,85%或90%相同,优选地至少95%,至少97%或至少99%相同的核苷酸序列。尽管也可以根据相似性考虑同源性,但是在本发明的上下文中,优选根据序列同一性表达同源性。
[0554] 优选地,提及与本文详述的任何SEQ ID NO具有百分比同一性的序列是指在所提及的SEQ ID NO的整个长度上具有所述同一性百分比的序列。
[0555] 同一性比较可以通过肉眼进行,或更通常借助容易获得的序列比较程序进行。这些商品化的计算机程序可以计算两个或更多个序列之间的同源性或同一性百分比。
[0556] 可以在连续序列上计算同源性百分比,即,一个序列与另一序列比对,并且一个序列中的每个氨基酸与另一序列中的对应氨基酸直接比较,一次一个残基。这称为“无缺口”比对。通常,仅在相对少量的残基上进行此类无缺口的比对。
[0557] 尽管这是一种非常简单且一致的方法,但是它未能考虑到例如在其他方面相同的序列对中,核苷酸序列中的一个插入或缺失可引起后面的密码子退出比对,因此当进行全局比对时,潜在导致同源性百分比的大大降低。因此,大多数序列比较方法设计为产生最佳比对,其考虑到可能的插入和缺失而不过度惩罚整体同源性得分。这是通过在序列比对中插入“缺口”以努力最大化局部同源性来实现的。
[0558] 但是,这些更复杂的方法将“缺口罚分”分配给比对中出现的每个缺口,以便对于相同数目的相同氨基酸,具有尽可能少的缺口(其反映了两个比较序列之间的更高相关性)的序列比对会比具有许多缺口的比对获得更高的得分。通常使用“仿射缺口成本(Affine gap cost)”,其对于缺口的存在收取相对较高的成本,并对缺口中的每个后续残基收取较小的罚分。这是最常用的缺口评分系统。当然,高缺口罚分将产生具有较少缺口的优化比对。大多数比对程序允许修改缺口罚分。但是,在使用此类软件进行序列比较时,优选使用默认值。例如,当使用GCG Wisconsin Bestfit包时,氨基酸序列的默认缺口罚分是用于缺口的-12和对于每个延伸的-4。
[0559] 因此,最大同源性百分比的计算首先需要产生最佳比对,考虑到缺口罚分。用于进行此类比对的合适的计算机程序是GCG  Wisconsin Bestfit包(University of Wisconsin,U.S.A.;Devereux et al.(1984)Nucleic Acids Res.12:387)。可以进行序列比较的其他软件的实例包括但不限于BLAST包(参见Ausubel et al.(1999)同上–第18章)、FASTA(Atschul et al.(1990)J.Mol.Biol.403-410)和GENEWORKS比较工具套组。BLAST和FASTA都可用于脱机和在线搜索(参见Ausubel et al.(1999)同上,第7-58至7-60页)。但是,对于某些应用,优选使用GCG Bestfit程序。另一种称为BLAST 2Sequences的工具也可用于比较蛋白质和核苷酸序列(参见FEMS Microbiol.Lett.(1999)174:247-50;FEMS 
Microbiol.Lett.(1999)177:187-8)。
[0560] 尽管可以根据同一性来测量最终的同源性百分比,但比对过程本身通常不基于全有或全无对比较。取而代之的是,通常使用缩放的相似性得分矩阵,所述矩阵基于化学相似性或进化距离为每个成对比较分配得分。常用的此类矩阵的一个实例是BLOSUM62矩阵-BLAST程序套件的默认矩阵。若提供的话,GCG Wisconsin程序通常使用公共默认值或自定义符号比较表(关于更多详情,参见用户手册)。对于某些应用,优选对GCG软件包使用公共默认值,或者在其他软件的情况下,优选使用默认矩阵,例如BLOSUM62。
[0561] 一旦软件产生了最佳比对,就可以计算同源性百分比,优选序列同一性百分比。软件通常将这作为序列比较的部分,并生成数字结果。
[0562] “片段”也是变体,并且该术语通常是指功能上或例如在测定法中感兴趣的多肽或多核苷酸的选定区域。因此,“片段”是指作为全长多肽或多核苷酸的一部分的氨基酸或核酸序列。
[0563] 可以使用标准重组DNA技术,例如定点诱变来制备此类变体。在要进行插入的情况下,可以制备编码插入的合成DNA以及与插入位点任一侧的天然存在序列相对应的5’和3’侧翼区。侧翼区会含有与天然存在的序列中的位点相对应的方便的限制性位点,从而可以用适当的酶切割序列,并将合成的DNA连接到切口中。然后,根据本发明表达DNA以制备编码的蛋白质。这些方法仅例示本领域已知的用于操作DNA序列的众多标准技术,并且也可以使用其他已知技术。
[0564] 主要组织相容性复合物(MHC)分子
[0565] 通常,TCR结合作为肽:MHC复合物的部分的肽。
[0566] MHC分子可以是I类或II类MHC分子。复合物可以在抗原呈递细胞如树突状细胞或B细胞,或任何其他细胞,包括癌细胞的表面上,或者它可以通过例如包被在珠或板上而固定。
[0567] 人白细胞抗原系统(HLA)是编码人中的主要组织相容性复合物(MHC)的基因复合物的名称,并且包括HLA I类抗原(A,B和C)和HLA II类抗原(DP,DQ和DR)。HLA等位基因A、B和C呈递主要源自胞内蛋白,例如在细胞内表达的蛋白质的肽。这是特别相关的,因为WT1是一种胞内蛋白。
[0568] 在体内T细胞发育过程中,T细胞经历正向选择步骤以确保识别自身MHC,然后经过负向步骤以除去太强地结合呈递自身抗原的MHC的T细胞。因此,某些T细胞及它们表达的TCR将仅识别由某些类型的MHC分子(即由特定HLA等位基因编码的那些)呈现的肽。这称为HLA限制。
[0569] 感兴趣的HLA等位基因之一是HLA-A*0201,其在绝大多数(>50%)白种人群体中表达。因此,结合由HLA-A*0201编码的MHC呈递的WT1肽的TCR(即受到HLA-A*0201限制)是有利的,因为利用此类TCR的免疫疗法将适合于治疗大部分白种人群体。
[0570] 其他感兴趣的HLA-A等位基因是HLA-A*0101、HLA-A*2402和HLA-A*0301。
[0571] 广泛表达的感兴趣的HLA-B等位基因是HLA-B*3501、HLA-B*0702和HLA-B*3502。
[0572] 本发明的TCR可以是HLA-A*0201限制的。
[0573] 一方面,在本发明的TCR包含含有CGTAWINDYKLSF(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CASRKTGGYSNQPQHF(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0574] 另一方面,在本发明的TCR包含含有CVVNLLSNQGGKLIF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CASSQDYLVSNEKLFF(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0575] 在另一方面,在本发明的TCR包含含有CAANNARLMF(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0576] 在另一方面,在本发明的TCR包含含有CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0577] 在另一方面,在本发明的TCR包含含有CAASGGRDDKIIF(SEQ ID NO:214)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CASSYSRTESTDTQYF(SEQ ID NO:219)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0578] 在另一方面,在本发明的TCR包含含有CAANNARLMF(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0579] 在另一方面,在本发明的TCR包含含有CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0580] 在另一方面,在本发明的TCR包含含有CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0581] 在另一方面,在本发明的TCR包含含有CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0582] 在另一方面,在本发明的TCR包含含有CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0583] 在另一方面,在本发明的TCR包含含有CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-A*0201限制的。
[0584] 在一个实施方案中,HLA-A*0201限制性的本发明的TCR结合WT1肽,其包含氨基酸序列APVLDFAPPGA (SEQ ID NO:117)或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0585] 在一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CGTAWINDYKLSF(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRKTGGYSNQPQHF(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0586] 在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CVVNLLSNQGGKLIF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSQDYLVSNEKLFF(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0587] 在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAANNARLMF(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0588] 在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0589] 在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASGGRDDKIIF(SEQ ID NO:214)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSYSRTESTDTQYF(SEQ ID NO:219)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0590] 在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAANNARLMF(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0591] 在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0592] 在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0593] 在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0594] 在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0595] 在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-A*0201限制性的,且其中WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0596] 另一种感兴趣的广泛表达的HLA等位基因是HLA-B*3501。本发明的TCR可以是HLA-B*3501限制性的。
[0597] 在一方面,在本发明的TCR包含含有CAASMAGAGSYQLTF(SEQ IDNO:75)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CAISVGQGALYEQYF(SEQ ID NO:80)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-B*3501限制的。
[0598] 因此,在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASMAGAGSYQLTF(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CAISVGQGALYEQYF(SEQ ID NO:80)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-B*3501限制性的,且其中WT1肽包含
NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0599] 在一方面,在本发明的TCR包含含有CAASMAGAGSYQLTF(SEQ IDNO:75)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CASSVARDRRNYGYTF(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-B*3501限制的。
[0600] 因此,在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CAASMAGAGSYQLTF(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSVARDRRNYGYTF(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-B*3501限制性的,且其中WT1肽包含
NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0601] 另一种感兴趣的广泛表达的HLA等位基因是HLA-B*3502。本发明的TCR可以是HLA-B*3502限制性的。
[0602] 在一方面,在本发明的TCR包含含有CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3α和含有CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的CDR3β的情况下,TCR是HLA-B*3502限制的。
[0603] 因此,在另一方面,本发明提供了TCR,其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中TCR包含CDR3α和CDR3β,所述CDR3α包含CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,其中TCR是HLA-B*3502限制性的,且其中WT1肽包含
EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0604] 我们已经证明了表达结合包含氨基酸序列EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123)的WT1肽的本发明TCR的T细胞能够选择性消除表达HLA-B*3502等位基因的癌(AML)细胞–参见实施例4和图4c。
[0605] 在一方面,在本发明的TCR结合包含EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的WT1肽,TCR是HLA-B*3502限制性的。
[0606] 在一个实施方案中,在本发明的TCR结合包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的WT1肽,TCR是HLA-B*0201限制性的。
[0607] 在一个实施方案中,在本发明的TCR结合包含NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体的WT1肽,TCR是HLA-B*3501限制性的。
[0608] 维尔姆斯肿瘤1(WT1)蛋白
[0609] 维尔姆斯肿瘤1(WT1)是一种编码在细胞生长和分化中发挥重要作用的锌指转录物的胞内蛋白(Yang,L.et al.Leukemia 21,868-876(2007))。它在多种血液学肿瘤和实体瘤中广泛表达,而在其他组织(性腺、子宫、肾、间皮、不同组织中的祖细胞)中显示有限的表达。最近的证据表明WT1在白血病发生和肿瘤发生中起作用。
[0610] WT1具有几种同种型,其中一些源自编码WT1的mRNA转录物的可变剪接。先前已发表WT1同种型的完整氨基酸序列(Gessler,M.et al.Nature;343(6260):774-778;(1990))。此种特定的同种型由575个氨基酸组成,并包含N端的前126个氨基酸,其在WT1的外显子5+和KTS+同种型中缺乏。
[0611] 示例性WT1蛋白具有在UniProt条目J3KNN9中列出的氨基酸序列。另一个示例型WT1蛋白具有如下列出的氨基酸序列:
[0612] SRQRPHPGALRNPTACPLPHFPPSLPPTHSPTHPPRAGTAAQAPGPRRLLAAILDFLLLQDPASTCVPEPASQHTLRSGPGCLQQPEQQGVRDPGGIWAKLGAAEASAERLQGRRSRGASGSEPQQMGSDVRDLNALLPAVPSLGGGGGCALPVSGAAQWAPVLDFAPPGASAYGSLGGPAPPPAPPPPPPPPPHSFIKQEPSWGGAEPHEEQCLSAFTVHFSGQFTGTAGACRYGPFGPPPPSQASSGQARMFPNAPYLPSCLESQPAIRNQGYSTVTFDGTPSYGHTPSHHAAQFPNHSFKHEDPMGQQGSLGEQQYSVPPPVYGCHTPTDSCTGSQALLLRTPYSSDNLYQMTSQLECMTWNQMNLGATLKGVAAGSSSSVKWTEGQSNHSTGYESDNHTTPILCGAQYRIHTHGVFRGIQDVRRVPGVAPTLVRSASETSEKRPFMCAYPGCNKRYFKLSHLQMHSRKHTGEKPYQCDFKDCERRFSRSDQLKRHQRRHTGVKPFQCKTCQRKFSRSDHLKTHTRTHTGKTSEKPFSCRWPSCQKKFARSDELVRHHNMHQRNMTKLQLAL
[0613] (SEQ ID NO:131)。
[0614] WT1肽
[0615] 如本文所用,术语肽是指通过肽键连接的多个氨基酸残基。如本文所定义,肽可以由约30、小于约25、小于约20、小于19、小于18、小于17、小于16、小于15、小于14、小于13、小于12、小于11、小于10、小于9、小于8、小于7、小于6、或小于5个氨基酸残基的长度组成。优选地,肽的长度为约5至20个氨基酸,更优选地,肽的长度为约8至15个氨基酸残基。
[0616] 本发明的TCR结合当由MHC呈递时的WT1肽。如本文所用,术语WT1肽应当理解为指包含源自WT1蛋白的氨基酸序列的肽。
[0617] 例如,WT1肽可以包含WT1蛋白氨基酸序列的至少5、至少6、至少7、至少8、至少9、至少10、至少11、至少12、至少13、至少14、至少15、至少16、至少17、至少18、至少19、至少20、或至少25个连续氨基酸残基。
[0618] WT1肽可以包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体或由APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体组成。包含氨基酸序列的WT1肽的实例是AAQWAPVLDFAPPGA(SEQ ID NO:115)和APVLDFAPPGASAYG(SEQ ID NO:116)。
[0619] WT1肽可以包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成,所述氨基酸序列选自下组:QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118),EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119),SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120)或SEQ ID NO:118-120各自的具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0620] WT1肽可以包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成,所述氨基酸序列选自下组:EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123)、YESDNHTTPIL(SEQ ID NO:126)或SEQ ID NO:123和126各自的具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。示例性WT1肽可以具有选自下组的氨基酸序列:TCVPEPASQHTLRSG(SEQ ID NO:121),EPASQHTLRSGPGCL(SEQ ID NO:122),
HSTGYESDNHTTPIL(SEQ ID NO:124)和YESDNHTTPILCGAQ(SEQ ID NO:125)。
[0621] WT1肽可以包含NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体或由NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体组成。
[0622] WT1肽可以包含NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体或由NQMNLGATLKG(SEQ IDNO:250)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体组成。示例性WT1肽可以具有选自下组的氨基酸序列:CMTWNQMNLGATLKG(SEQ ID NO:248)和NQMNLGATLKGVAAG(SEQID NO:249)。
[0623] WT1肽可以包含DPGGIWAKLGAAEAS(SEQ ID NO:251)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体或由DPGGIWAKLGAAEAS(SEQ ID NO:251)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体组成。
[0624] WT1肽可以包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成,所述氨基酸序列选自下组:NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:252)、KRHQRRHTGVKPFQC(SEQ ID NO:253)、PSCQKKFARSDELVR(SEQ ID NO:254)和SEQ ID NO:252,253和254各自的具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0625] 在一些实施方案中,对于结合由HLA-A*0201等位基因编码的MHC分子的WT1肽,可以优选肽的第2位氨基酸(即从N端起的第二氨基酸)是亮氨酸或甲硫氨酸,尽管异亮氨酸、缬氨酸、丙氨酸和苏氨酸也可以是优选的。也可以优选的是第9或10位的氨基酸是缬氨酸、亮氨酸或异亮氨酸,尽管丙氨酸、甲硫氨酸和苏氨酸也可以是优选的。Celis et al(Molecular Immunology,Vol.31,1994年12月8日,第1423至1430页)中公开了其它HLA等位基因的优选的MHC结合基序。
[0626] 本发明涵盖本文所述的WT1肽的各种用途。例如,可以对受试者,例如人受试者施用本文中描述的WT1肽。本发明的WT1肽的施用可以引发针对表达或过表达WT1蛋白的细胞的免疫应答,即WT1肽是免疫原性WT1肽。
[0627] 因此,在一方面,本发明提供了分离的免疫原性WT1肽,其包含选自下组的氨基酸序列:EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123),YESDNHTTPIL(SEQID NO:126),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127),QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118),EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ IDNO:119),SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120),APVLDFAPPGA(SEQID NO:117),NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250),DPGGIWAKLGAAEAS(SEQ ID NO:251),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:252),
KRHQRRHTGVKPFQC(SEQ ID NO:253),PSCQKKFARSDELVR(SEQ IDNO:254)和它们各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0628] 可以使用本文中描述的WT1肽,例如包含氨基酸序列的WT1肽筛选和/或鉴定结合WT1细胞的新的TCR序列,所述氨基酸序列选自下组:EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123)和YESDNHTTPIL(SEQ ID NO:126),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127),QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ IDNO:118),EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119),SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120),
APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117),NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250),DPGGIWAKLGAAEAS(SEQID NO:251),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:252),KRHQRRHTGVKPFQC(SEQ ID NO:253)
PSCQKKFARSDELVR(SEQ IDNO:254)和或它们各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。例如,可以用本文中提及的WT1肽脉冲T2细胞,并且与从供体分离的T细胞群体温育。在此方法中,细胞因子,例如CD107a和IFNγ的表达可以指示识别WT1肽的T细胞。
[0629] 因此,在一方面,本发明提供了T细胞受体(TCR),其结合由主要组织相容性复合物(MHC)呈递时的维尔姆斯肿瘤1蛋白(WT1)肽,其中WT1肽包含选自下组的氨基酸序列:EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123),YESDNHTTPIL(SEQ ID NO:126),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127),QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118),EDPMGQQGSLGEQQY(SEQID NO:119),
SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120),APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117),NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250),DPGGIWAKLGAAEAS(SEQ ID NO:251),NHTTPILCGAQYRIH(SEQ IDNO:252),
KRHQRRHTGVKPFQC(SEQ ID NO:253),PSCQKKFARSDELVR(SEQ ID NO:254),和它们各自具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0630] TCR序列
[0631] 我们已经确定结合本文所述的WT1肽的TCR的氨基酸序列。具体地,我们已经确定对于WT1肽识别和结合重要的TCR CDR的氨基酸序列。
[0632] 因此,在一个实施方案中,本发明提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CGTAWINDYKLSF(SEQ ID NO:3)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRKTGGYSNQPQHF(SEQ ID NO:8)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0633] 因此,在一个实施方案中,本发明提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CVVNLLSNQGGKLIF(SEQ ID NO:36)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSQDYLVSNEKLFF(SEQ ID NO:41)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0634] 因此,在一个实施方案中,本发明提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAANNARLMF(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0635] 因此,在一个实施方案中,本发明提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0636] 在一个实施方案中,本发明提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0637] 在一个实施方案中,本发明提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0638] 在一个实施方案中,本发明提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSVGGSGSYNEQFF(SEQ ID NO:169)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0639] 因此,在一个实施方案中,本发明提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAASGGRDDKIIF(SEQ ID NO:214)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSYSRTESTDTQYF(SEQ ID NO:219)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0640] 本发明还提供了TCR,其包含:
[0641] CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0642] CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0643] CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;或
[0644] CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体;
[0645] 其中TCR结合由MHC呈递时的包含氨基酸序列或由氨基酸序列组成的WT1肽,所述氨基酸序列选自下组:QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118),EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119),和SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120)或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0646] 因此,在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ ID NO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0647] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ IDNO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0648] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ IDNO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0649] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0650] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0651] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRLSGSARQLTF(SEQ ID NO:14)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0652] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ IDNO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0653] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ IDNO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0654] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLLGDEQYF(SEQ IDNO:24)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0655] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
QCLSAFTVHFSGQFT(SEQ ID NO:118)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0656] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
EDPMGQQGSLGEQQY(SEQ ID NO:119)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0657] 在一个实施方案中,提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAYRSLKYGNKLVF(SEQ ID NO:19)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLVALQGAGEQYF(SEQ ID NO:30)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含
SQLECMTWNQMNLGA(SEQ ID NO:120)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0658] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CATDAYSGNTPLVF(SEQ ID NO:47)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRAAGLDTEAFF(SEQ ID NO:57)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含EPASQHTLRSG(SEQ ID NO:123)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0659] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASTQTPYEQYF(SEQ IDNO:63)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含YESDNHTTPIL(SEQID NO:126)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0660] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRAEIYNQGGKLIF(SEQ ID NO:52)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSTVGGEDYGYTF(SEQID NO:69)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含YESDNHTTPIL(SEQ ID NO:126)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0661] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAASMAGAGSYQLTF(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CAISVGQGALYEQYF(SEQID NO:80)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0662] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAASMAGAGSYQLTF(SEQ ID NO:75)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSVARDRRNYGYTF(SEQ ID NO:86)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:127)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0663] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVTVGNKLVF(SEQ ID NO:175)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASRGWREQFF(SEQ ID NO:180)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含DPGGIWAKLGAAEAS(SEQID NO:251)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0664] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAARSYNTDKLIF(SEQ ID NO:186)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSWGYQETQYF(SEQ ID NO:196)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含NHTTPILCGAQYRIH(SEQ ID NO:252)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0665] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPTGGEYYGYTF(SEQ IDNO:202)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含KRHQRRHTGVKPFQC(SEQ ID NO:253)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0666] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAASYNNARLMF(SEQ ID NO:191)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSSYPLRTGRYNSYNSPLHF(SEQ ID NO:208)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含PSCQKKFARSDELVR(SEQ ID NO:254)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0667] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAANNARLMF(SEQ ID NO:92)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ IDNO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0668] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSDTRAREQFF(SEQ ID NO:97)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0669] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAASATGNQFYF(SEQ ID NO:266)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSPGQHGELFF(SEQ ID NO:271)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ IDNO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0670] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ IDNO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0671] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ IDNO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0672] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVEATDSWGKLQF(SEQ ID NO:108)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLGLSISQETQYF(SEQ IDNO:288)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0673] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAVRTSYDKVIF(SEQ ID NO:113)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CASSLGLSISQETQYF(SEQ IDNO:288)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含NQMNLGATLKG(SEQ ID NO:250)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0674] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CAERLNTDKLIF(SEQ ID NO:103)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ IDNO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0675] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDSVSGNTIYF(SEQ ID NO:163)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0676] 本发明进一步提供了TCR,其包含CDR3α和CDR3,所述CDR3α包含CATDGDSSYKLIF(SEQ ID NO:277)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述CDR3β包含CSARDVLTGDYGYTF(SEQ ID NO:282)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体,所述TCR结合由MHC呈递时的WT1肽,所述WT1肽包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的氨基酸序列或其具有多达3个氨基酸取代、添加或缺失的变体。
[0677] 表1中提供了本发明的示例性TCR氨基酸序列。
[0678] 表1
[0679] 供体:HD1
[0680]
[0681]
[0682] 供体:HD2
[0683]
[0684]
[0685]
[0686]
[0687] 供体:HD3
[0688]
[0689]
[0690] 供体:HD4
[0691]
[0692]
[0693]
[0694]
[0695]
[0696] 供体:HD5
[0697]
[0698]
[0699]
[0700] 供体:HD6
[0701]
[0702]
[0703]
[0704]
[0705] 供体:HD7
[0706]
[0707]
[0708]
[0709]
[0710]
[0711]
[0712] 供体:HD8
[0713]
[0714]
[0715]
[0716] 供体:HD9
[0717]
[0718]
[0719]
[0720]
[0721] 供体:HD10
[0722]
[0723]
[0724] 因此,本发明提供了包含一个或多个选自SEQ ID NO:1-114和160-222的氨基酸序列的分离的多肽、其片段、变体和同源物。
[0725] 在一方面,本发明提供了一种TCR,其包括选自表1的HD1-HD10α链序列的TCRα链序列和独立地选自HD1-HD10β的TCRβ链序列。表1的链序列减少错配并改善TCR表达
[0726] 本发明的TCR可以在T细胞中表达以改变T细胞的抗原特异性。TCR转导的T细胞可表达至少两条TCRα和两条TCRβ链。内源TCRα/β链形成自我耐受的受体,而引入的TCRα/β链形成对给定靶抗原具有确定特异性的受体。
[0727] 但是,TCR基因疗法需要转移的TCR充分表达。内源TCR的存在可能会稀释转移的TCR,导致肿瘤特异性TCR的表达欠佳。此外,内源链和引入的链之间可能发生错配以形成新的受体,这些受体可能显示出对自身抗原的意外特异性,并在转移到患者体内时引起自身免疫损伤。
[0728] 因此,已经探索了几种策略来减少内源和引入的TCR链之间错配的险。TCR alpha/beta接口的突变是目前用于减少不必要的错误配对的一种策略。例如,在α和β链的恒定域中引入半胱氨酸允许形成二硫键并增强引入的链的配对,同时减少与野生型链的错配。
[0729] 因此,本发明的TCR可在α链/β链界面处包含一个或多个突变,使得当α链和β链在T细胞中表达时,所述链之间的错配频率与内源TCRα和β链减少。在一个实施方案中,一个或多个突变将半胱氨酸残基引入α链和β链中每一个的恒定区域,其中半胱氨酸残基能够在α链和β链之间形成二硫键。
[0730] 减少错配的另一种策略依赖于引入编码siRNA的多核苷酸序列,将其添加到编码肿瘤特异性TCRα和/或β链的基因中,并旨在限制内源TCR基因的表达(冈本S.癌症研究69,9003-9011,2009)。
[0731] 因此,编码本发明TCR的载体或多核苷酸可包含一种或多种siRNA或其他旨在限制或消除内源TCR基因表达的试剂。
[0732] 也可以组合人工核酸酶,例如锌指核酸酶(ZFN),转录激活物样效应核酸酶(TALEN)或CRISPR/Cas系统,旨在靶向内源基因的恒定区,例如TCR基因(TRAC和/或TRBC),以获得内源TCRα和/或β链基因的永久破坏,从而使肿瘤特异性TCR充分表达,从而降低或消除TCR错配的风险。该过程被称为TCR基因编辑,被证明在体外和体内均优于TCR基因转移(Provasi E.,Genovese P.,Nature Medicine May;18(5):807-15;2012)。
[0733] 因此,本发明的TCR可用于通过TCR破坏和肿瘤特异性TCR的遗传添加来编辑T细胞特异性。
[0734] 另外,基因组编辑技术允许将包含编码本发明的TCR的多核苷酸和任选地一个或多个启动子区域和/或其他表达控制序列的表达盒靶向整合到被人工核酸酶破坏的内源基因中(Lombardo A.,Nature biotechnology 25,1298-1306;2007)。
[0735] 因此,本发明的TCR可通过在基因组区域靶向整合编码本发明的TCR的多核苷酸而用于编辑T细胞特异性。整合可以被人工核酸酶靶向。
[0736] 已开发出另一种增加转移的TCR的表达并减少TCR配对错误的策略,包括“鼠化”,其通过鼠对应物代替人TCRα和TCRβ恒定区(例如TRAC,TRBC1和TRBC2区)。TCR恒定区的Murizination描述于例如Sommermeyer和UckertJ Immunol;J.Immunol.Chem.Soc。,1992,6,1897中。2010(184:6223-6231)。因此,本发明的TCR可以被人源化。
[0737] 分离的多核苷酸
[0738] 本发明涉及编码本发明的TCR受体或其部分,例如α链和/或β链,可变域或其一部分的分离的多核苷酸。
[0739] 分离的多核苷酸可以是双链或单链,并且可以是RNA或DNA。
[0740] 本领域技术人员将理解,由于遗传密码的简并性,许多不同的多核苷酸可编码相同的多肽。另外,应当理解,技术人员可以使用常规技术进行不影响本发明多核苷酸编码的多肽序列的核苷酸取代,添加或缺失,以反映任何特定宿主生物的密码子使用。本发明的多肽将被表达。
[0741] 本文所述的多核苷酸可以通过本领域可用的任何方法进行修饰。为了增强本发明的多核苷酸的体内活性或寿命,可以进行这样的修饰。
[0742] 诸如DNA多核苷酸的多核苷酸可以重组,合成或通过本领域技术人员可获得的任何方式产生。它们也可以通过标准技术克隆。
[0743] 通常将使用重组手段,例如使用聚合酶链反应(PCR)克隆技术来产生更长的多核苷酸。这将涉及制备一对期望克隆的靶序列侧翼的引物(例如,约15至30个核苷酸),使引物与从动物或人类细胞获得的Mrna或Cdna接触,进行聚合酶链反应在引起所需区域扩增的条件下,分离扩增的片段(例如通过用琼脂糖凝胶纯化反应混合物)并回收扩增的DNA。可以设计引物以包含合适的限制酶识别位点,从而可以将扩增的DNA克隆到合适的载体中。
[0744] 表2提供了根据本发明的编码TCR的核苷酸序列的实例。
[0745] Table 2
[0746]
[0747]
[0748]
[0749]
[0750]
[0751]
[0752]
[0753]
[0754]
[0755]
[0756]
[0757]
[0758]
[0759]
[0760]
[0761]
[0762]
[0763]
[0764]
[0765]
[0766]
[0767]
[0768]
[0769]
[0770]
[0771]
[0772]
[0773]
[0774]
[0775]
[0776] 因此,本发明提供了分离的多核苷酸,其包含一个或多个选自SEQ ID NO:132-156、223-247和292-299的核苷酸序列,或与其具有至少40%,至少50%,至少60%,至少
70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%,或至少99%的序列同一性的其变体。
[0777] 本发明还提供了TCR,其包含由选自下组的核苷酸序列编码的α链:SEQ ID NO:132、135、138、141、144、147、152、223、226、227、228、233、236、237、238、245、292、295及与其具有至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%或至少99%的序列同一性的其变体。
[0778] 本发明还提供了TCR,其包含由选自下组的核苷酸序列编码的β链:SEQ ID No:133、134、136、137、139、140、142、143、145、146、148、149、150、151、153、154、155、156、224、
225、229、230、231、232、234、235、239、240、241、242、243、244、246、247、293、294、296-299,与其具有至少40%,至少50%,至少60%,至少70%,至少75%,至少80%,至少85%,至少
90%,至少95%,至少96%,至少97%,至少98%或至少99%的序列同一性的其变体。
[0779] 本发明进一步提供了源自表2中存在的序列的分离的多核苷酸序列。例如,本发明提供了编码根据本发明的TCR的可变区的分离的多核苷酸,其中分离的多核苷酸包含SEQ ID No:132-156、223-247和292-299中任一项的核苷酸的区段。
[0780] 变体序列可以具有一个或多个碱基的添加、缺失或取代。若变异涉及一个或多个添加或缺失,则它们可以以三个一组(in threes)出现或是平衡的(即,每个缺失一个添加),使得变异不引起序列的剩余部分的翻译的移码。
[0781] 一些或所有变异就它们由于遗传密码的简并性而不影响编码蛋白质的序列而言可以是“沉默的”。
[0782] 如上文解释,一些或所有变体可以产生保守的氨基酸取代、添加或缺失。变异可以集中在一个或多个区域中,例如编码α或β链的恒定区、接头或框架区的区域,或者它们可以分布在整个分子中。
[0783] 变体序列应保留编码与WT1肽结合的TCR氨基酸序列的全部或部分的能力。
[0784] 密码子优化
[0785] 用于本发明的多核苷酸可以是密码子优化的。密码子优化先前已经记载于WO 1999/41397和WO 2001/79518。不同的细胞在其特定密码子的选择上不同。此密码子偏倚对应于细胞类型中特定tRNA的相对丰度的偏倚。通过改变序列中的密码子,使得它们适合于与相应tRNA的相对丰度匹配,可以增加表达。同样,可以通过有意选择已知在特定细胞类型中罕见的相应tRNA的密码子来减少表达。因此,可获得额外程度的翻译控制。
[0786] 许多病毒(包括HIV和其他慢病毒)使用大量罕见的密码子,并通过将这些改变为对应于常用的哺乳动物密码子,可以实现哺乳动物生产细胞中包装组分的表达增加。密码子选择表在本领域中对于哺乳动物细胞以及多种其他生物体是已知的。
[0787] 密码子优化还可涉及除去mRNA不稳定基序和隐蔽剪接位点。
[0788] 载体
[0789] 本发明提供了包含本文所述的多核苷酸的载体。
[0790] 载体是一种允许或促进实体从一种环境转移到另一种环境的工具。根据本发明,并且举例来说,重组核酸技术中使用的一些载体允许将实体,诸如核酸区段(例如异源DNA区段,如异源Cdna区段)转移到靶细胞中。载体可以用于在细胞内维持异源核酸(DNA或RNA),促进包含核酸区段的载体的复制,或促进核酸区段编码的蛋白质的表达的目的。载体可以是非病毒或病毒的。重组核酸技术中使用的载体的实例包括但不限于质粒、染色体、人工染色体和病毒。载体可以是单链或双链的。它可以是线性的,并且任选地,载体包含一个或多个同源臂。载体也可以是例如裸核酸(例如DNA)。以其最简单的形式,载体本身可以是感兴趣的核苷酸。
[0791] 本发明中使用的载体可以是例如质粒或病毒载体,并且可以包含用于表达多核苷酸的启动子和任选地启动子的调节物。
[0792] 可以使用本领域已知的多种技术,例如转化、转染和转导,将包含用于本发明的多核苷酸的载体导入细胞中。几种技术是本领域已知的,例如用重组病毒载体的转导,例如逆转录病毒、慢病毒、腺病毒、腺相关病毒、杆状病毒和单纯疱疹病毒载体、Sleeping Beauty载体;核酸的直接注射和生物射弹转化。
[0793] 非病毒递送系统包括但不限于DNA转染方法。在此,转染包括使用非病毒载体将基因递送至靶细胞的过程。典型的转染方法包括电穿孔、DNA生物射弹、脂质介导的转染、紧密DNA介导的转染、脂质体、免疫脂质体、脂质转染、阳离子试剂介导的转染、阳离子面两亲物(cationic facial amphiphile,CFA)(Nature Biotechnology 1996 14;556)及其组合。
[0794] 术语“转染”应理解为包括通过病毒和非病毒递送两者将多核苷酸递送至细胞。
[0795] 另外,本发明可以采用基因靶向方案,例如DNA修饰剂的递送。
[0796] 术语“载体”包括表达载体,即能够在体内或体外/离体表达的构建体,表达可以受到载体序列控制,或者例如在插入靶位点的情况下,表达可以受到靶序列控制。载体可以整合或拴系到细胞的DNA。
[0797] 病毒递送系统包括但不限于腺病毒载体、腺相关病毒(AAV)载体、疱疹病毒载体、逆转录病毒载体、慢病毒载体和杆状病毒载体。
[0798] 逆转录病毒是具有与裂解病毒的生命周期不同的生命周期的RNA病毒。在这方面,逆转录病毒是通过DNA中间体复制的感染性实体。当逆转录病毒感染细胞时,其基因组通过逆转录酶转换为DNA形式。DNA拷贝充当模板,用于生产新的RNA基因组和组装感染性病毒颗粒必需的病毒编码蛋白。
[0799] 存在有许多逆转录病毒,例如鼠白血病病毒(MLV)、人免疫缺陷病毒(HIV)、传染性贫血病毒(EIAV)、小鼠乳腺肿瘤病毒(MMTV)、劳斯肉瘤病毒(RSV)、藤南(Fujinami)肉瘤病毒(FuSV)、莫洛尼鼠白血病病毒(Mo-MLV)、FBR鼠骨肉瘤病毒(FBR MSV)、莫洛尼鼠肉瘤病毒(Mo-MSV)、Abelson鼠白血病病毒(A-MLV)、禽髓细胞瘤病病毒29型(MC29)和禽成红细胞增多病病毒(AEV)和所有其他逆转录病毒,包括慢病毒。
[0800] 逆转录病毒的详细列表可以参见Coffin et al(“Retroviruses”1997Cold Spring Harbour Laboratory Press Eds:JM Coffin,SM Hughes,HE Varmus pp758-763)。
[0801] 慢病毒也属于逆转录病毒家族,但是它们可以感染分裂细胞和非分裂细胞两者(Lewis et al(1992)EMBO J.3053-3058)。
[0802] 载体可以能够将编码本文所述的WT1特异性TCR的核苷酸序列转移至细胞,例如T细胞,以使细胞表达WT1特异性TCR。优选地,载体将能够在T细胞中持续高水平表达,从而导入的TCR可以与内源TCR成功竞争有限的CD3分子库。
[0803] 增加CD3分子的供应可增加TCR的表达,例如,在已经以表达本发明的TCR的方式进行了修饰的细胞中。因此,本发明的载体可以进一步包含一种或多种编码CD3-gamma、CD3-delta、CD3-epsilon和/或CD3-zeta的基因。在一个实施方案中,本发明的载体包含编码CD3-zeta的基因。载体可以包含编码CD8的基因。载体可以编码选择标志物或自杀基因,以增加遗传工程化细胞的安全性概况,例如本发明的细胞或经修饰以表达本发明的TCR的细胞(Bonini,Science 1997,Ciceri,Bonini Lancet Oncol.2009,Oliveira et al.,STM2015)。本发明的载体中包含的基因可以通过自我切割序列,例如2A自我切割序列连接。
[0804] 或者,可以提供一种或多种编码CD3基因的分开载体,以与本发明的一种或多种本发明载体,例如一种或多种编码本发明TCR的载体同时、顺序或分开共转移至细胞。
[0805] 细胞
[0806] 本发明涉及包含根据本发明的多核苷酸或载体的细胞。
[0807] 细胞可以是T细胞、淋巴细胞或干细胞。T细胞、淋巴细胞或干细胞可以选自下组:CD4细胞、CD8细胞、幼稚T细胞、记忆干T细胞、中央记忆T细胞、双阴性T细胞、效应记忆T细胞、效应T细胞、Th0细胞、Tc0细胞、Th1细胞、Tc1细胞、Th2细胞、Tc2细胞、Th17细胞、Th22细胞、gamma/delta T细胞、自然杀伤(NK)细胞、自然杀伤T(NKT)细胞、造血干细胞和多能干细胞。
[0808] 可以选择细胞的类型以提供期望的且有利的体内持久性,并为本发明的细胞提供期望的且有利的功能和特性。
[0809] 细胞可以已经从受试者分离。
[0810] 可以提供本发明的细胞用于过继细胞转移。如本文所用,术语“过继细胞转移”是指向患者施用细胞群体。通常,细胞是T细胞,其从受试者分离,然后进行遗传修饰和体外培养,以便在施用于患者之前表达本发明的TCR。
[0811] 过继细胞转移可以是同种异体的或自体的。
[0812] 通过“自体细胞转移”应理解,起始细胞群体(其然后根据本发明的方法转导,或用根据本发明的载体转导)从与接收经转导的T细胞群体施用的受试者相同的受试者获得。自体转移是有利的,因为它避免了与免疫学不相容性相关的问题,并且无论遗传匹配供体的可用性如何都可用于受试者。
[0813] “同种异体细胞转移”应理解为起始细胞群体(其然后根据本发明的方法转导或用根据本发明的载体转导)从与接受经转导的细胞群体施用的受试者不同的受试者获得。优选地,将供体与接受细胞施用的受试者遗传匹配以最小化免疫学不相容的风险。或者,供体可以是与患者错配且无关。
[0814] 经转导的细胞群体的合适剂量例如在治疗和/或预防上是有效的。待施用的剂量可以取决于受试者和待治疗的状况,并且可以由技术人员容易地确定。
[0815] 细胞可以源自从受试者分离的T细胞。T细胞可以是从受试者分离的混合细胞群体的部分,例如外周血淋巴细胞(PBL)群体。可以通过本领域已知的方法来活化PBL群体内的T细胞,例如使用抗CD3和/或抗CD28抗体或与抗CD3和/或抗CD28抗体缀合的细胞大小的珠。
[0816] T细胞可以是CD4+辅助T细胞或CD8+细胞毒性T细胞。细胞可以在CD4+辅助T细胞/CD8+细胞毒性T细胞的混合群体中。多克隆活化(例如任选与抗CD28抗体组合使用抗CD3抗体)将触发CD4+和CD8+T细胞的增殖。
[0817] 可以从要接受经遗传修饰的细胞过继转移的受试者分离细胞。在这方面,可以通过从受试者分离T细胞,任选地活化T细胞,离体将TCR基因转移到细胞来制备细胞。然后可以通过过继转移经TCR转导的细胞来进行受试者的后续免疫疗法。如本文所用,此过程指自体T细胞转移,即将经TCR转导的细胞施用到最初衍生T细胞的同一受试者。
[0818] 或者,可以从不同的受试者分离T细胞,使得它是同种异体的。T细胞可以从供体受试者分离。例如,若受试者正在进行同种异体造血干细胞移植(Allo-HSCT)或实体器官移植或细胞移植或干细胞疗法,则细胞可源自衍生器官、组织或细胞的供体。供体和经历治疗的受试者可以是兄弟姐妹。
[0819] 或者,细胞可以是或可以源自干细胞,例如造血干细胞(HSC)。由于干细胞不表达CD3分子,因此基因转移到HSC不导致细胞表面的TCR表达。但是,当干细胞分化为迁移到胸腺的淋巴样前体时,CD3表达的启动导致胸腺细胞中导入的TCR的表面表达。
[0820] 此种方法的优点在于,一旦产生,成熟的T细胞仅表达导入的TCR和很少的内源TCR链或不表达内源TCR链,因为导入的TCR链的表达抑制内源TCR基因区段的重排以形成功能性TCRα和β基因。另一个优点是,经基因修饰的干细胞是具有期望抗原特异性的成熟T细胞的连续来源。因此,细胞可以是经基因修饰的干细胞,优选经基因修饰的造血干细胞,其在分化后产生表达本发明TCR的T细胞。
[0821] 本领域已知的其他方法可用于减少、限制、防止、沉默或消除本发明细胞或通过本发明方法制备的细胞中内源基因的表达。
[0822] 如本文所用,术语“破坏”是指减少、限制、防止、沉默或消除基因的表达。本领域技术人员能够使用本领域已知的任何方法来破坏内源基因,例如,用于基因组编辑、基因沉默、基因敲低或基因敲除的任何合适方法。
[0823] 例如,内源基因可以用人工核酸酶破坏。人工核酸酶是例如经工程化改造以选择性靶向特定多核苷酸序列(例如编码感兴趣的基因)并在所述多核苷酸序列中诱导双链断裂的人工限制性酶。通常,双链断裂(DSB)将通过易错的非同源末端连接(NHEJ)进行修复,从而导致不能表达内源基因的非功能性多核苷酸序列的形成。
[0824] 在一些实施方案中,人工核酸酶选自下组:锌指核酸酶(ZFN)、转录激活物样效应物核酸酶(TALEN)和CRISPR/Cas(例如CRISPR/Cas9)。
[0825] 本发明的制备细胞(例如T细胞)的方法可以包括将表达盒靶向整合到内源基因(例如内源TCRα链基因和/或内源TCRβ链基因)中的步骤。如本文所用,术语表达盒是指包含编码一个或多个感兴趣基因的一个或多个多核苷酸序列的多核苷酸序列(例如DNA多核苷酸序列),使得所述感兴趣的基因能够表达。内源序列可以促进从表达盒的表达和/或表达盒内的转录控制序列可以促进表达。例如,表达盒可包含与表达控制序列,例如启动子或增强子序列可操作地连接的本发明的多核苷酸序列或编码本发明的TCR的多核苷酸序列。一个或多个感兴趣基因可以位于一组或多组限制性位点之间。合适地,限制性位点可以促进表达盒整合到例如载体、质粒或基因组DNA(例如宿主细胞基因组DNA)中。
[0826] 例如,可以通过使用一种或多种合适的限制酶“切割”,例如切除表达盒,并且将表达盒“粘贴”,例如整合到第二多核苷酸序列中将本发明的表达盒从第一多核苷酸序列(例如在载体上)转移到另一个。
[0827] 表达盒可以包含本发明的多核苷酸。表达盒可包含编码本发明的一种或多种TCR的多核苷酸。表达盒可以进一步包含抗生素抗性基因或其他选择标志物基因,其允许鉴定已经成功将表达盒整合入其DNA中的细胞。可以将表达盒中包含的多核苷酸序列可操作地连接至表达控制序列,例如合适的启动子或增强子序列。本领域技术人员将能够选择合适的表达控制序列。
[0828] 本发明还考虑表达本发明TCR的细胞,该细胞已经经工程化改造以破坏一个或多个内源MHC基因。内源MHC基因的破坏可以减少或阻止工程化细胞表面上MHC的表达。因此,此类具有降低的MHC表达或无MHC表达的工程化细胞将具有有限的在其细胞表面上呈递抗原的能力或无该能力。此类细胞对于过继细胞转移特别有利,因为细胞将是非同种异体反应性的,例如,细胞将不呈递可被接受过继转移的细胞的受试者的免疫系统识别的抗原。因此,转移的细胞不会被识别为“非自身”,并且可以避免对该细胞的不利的免疫应答。此类细胞称为“通用细胞”,因为它适合于过继转移到多种不同的宿主,不管HLA类型如何。
[0829] 因此,本发明提供了制备表达本发明的TCR的非自体反应性通用T细胞的方法。本发明进一步提供了非自体反应性通用T细胞,其表达本发明的TCR。
[0830] 本发明进一步考虑已经经过工程化改造以破坏一个或多个内源基因以修饰细胞,从而增强细胞的有利特性、特征或功能和/或降低不期望的特性、特征或功能的细胞。例如,通过破坏内源细胞,可以修改持久性、扩充、活性、对耗竭/衰老/抑制信号的抗性、归巢能力或其他细胞功能。如在此上下文中所使用,术语“修改”是指相对于等同的未修饰细胞,例如,尚未破坏内源基因的细胞,一个或多个特征的变化。例如,变化可以是相对于等同的未修饰细胞的细胞特征或功能的增加、增强或引入。或者,变化可以是相对于等同的未修饰细胞的细胞特征或功能的减少、抑制或消除。
[0831] 本发明的多核苷酸和载体可以转移到特定的T细胞亚组中,包括CD4和或CD8、幼稚、记忆干T细胞、中枢记忆、效应记忆或效应细胞,或在其他细胞亚组中,例如以在本发明的细胞中促进不同的体内持久性长度和功能。
[0832] 本发明的多核苷酸和载体也可以转移到T细胞亚组中,例如幼稚、记忆干T细胞、中央记忆细胞、效应记忆细胞、效应物。
[0833] 根据最适合于靶向特定肿瘤类型的细胞因子背景,本发明的多核苷酸和载体还可以转移到具有不同极化的T细胞亚组中,例如Th0/Tc0、Th1/Tc1、Th2/Tc2、Th17、Th22等。
[0834] 此外,编码本发明TCR的抗原特异性区域的本发明的多核苷酸和载体可以在其他细胞亚组中转移,包括γ/δT细胞、NK细胞、NKT细胞、造血干细胞或其他细胞,以获得治疗效果。
[0835] 本发明进一步提供了制备细胞的方法,其包括用本发明的载体体外或离体转导细胞的步骤。用载体转导细胞的各种方法是本领域已知的(参见例如Sambrook等)。
[0836] 本发明还提供了产生表达本发明的TCR的T细胞的方法,其通过诱导包含本发明的多核苷酸或载体的干细胞的分化。
[0837] 可以针对表现出特定表型或特征的细胞以及从不表现出该表型或特征或在较小程度上表现出该表型或特征的其他细胞选择性纯化细胞群体。例如,可以从起始细胞群中纯化表达特定标志物(例如CD3,CD4,CD8,CD25,CD127,CD152,CXCR3或CCR4)的细胞群体。或者或另外,可以纯化不表达另一种标志物的细胞群体。
[0838] 通过对细胞群体“富集”某种类型的细胞,应当理解该类型的细胞的浓度在群体内增加。其他类型细胞的浓度可以伴随降低。
[0839] 纯化或富集可以导致细胞群是其他类型细胞的基本上纯的。
[0840] 纯化或富集表达特定标志物(例如CD3,CD4,CD8,CD25,CD127,CD152,CXCR3或CCR4)的细胞群体可以通过使用与该标志物结合,优选与该标志物实际上特异性结合的试剂实现。特异性结合细胞标志物的试剂可以是抗体,例如结合CD3,CD4,CD8,CD25,CD127,CD152,CXCR3或CCR4的抗体。
[0841] 术语“抗体”是指能够结合所选定的靶物的完整抗体或抗体片段,包括Fv、ScFv、F(ab')和F(ab')2、单克隆和多克隆抗体、工程化抗体,包括嵌合抗体、植入CDR的抗体和人源化抗体,以及使用噬菌体展示或备选技术产生的人工选择的抗体。
[0842] 另外,经典抗体的备选也可以用于本发明中,例如“avibodies”、“avimers”、“anticalins”、“纳米抗体”和“DARPins”。
[0843] 可以标记与特定标志物结合的试剂,以便可使用本领域已知的多种技术中的任一种进行鉴定。试剂可以是固有标记的,或者可以通过与其缀合标记物修饰。通过“缀合”,应理解试剂和标记物是可操作连接的。这意味着试剂和标记物以使两者基本上不受阻碍地发挥它们的功能(例如结合标志物,允许荧光鉴定或允许当置于磁场时分离)的方式连接在一起。合适的缀合方法在本领域中是公知的,并且本领域技术人员将容易鉴定。
[0844] 例如,标记物可以允许从其环境中纯化(例如,可以用磁珠或亲和标签如抗生物素蛋白标记试剂)和/或检测经标记的试剂和与它结合的任何细胞。适合用作标记物的可检测标记物包括荧光团(例如绿色、樱桃色、青色和橙色荧光蛋白)和肽标签(例如His标签、Myc标签、FLAG标签和HA标签)。
[0845] 分离表达特定标志物的细胞群体的许多技术是本领域已知的。这些包括基于磁珠的分离技术(例如,基于闭合回路磁珠的分离)、流式细胞仪、荧光激活细胞分选(FACS)、亲和标签纯化(例如,使用亲和柱或珠,例如生物素柱来分离抗生物素蛋白标记的试剂)和基于显微镜术的技术。
[0846] 也可以使用不同技术的组合来进行分离,例如基于磁珠的分离步骤,然后通过流式细胞术对所得细胞群体分选一种或多种另外的(阳性或阴性)标志物。
[0847] 例如,可以使用 系统(Miltenyi)进行临床等级分离。这是基于闭合回路磁珠的分离技术的实例。
[0848] 还设想可以使用染料排除特性(例如侧群体或罗丹明标记)或酶促活性(例如ALDH活性)富集HSC。
[0849] 嵌合分子
[0850] 在另一方面,本发明提供了嵌合分子,其包含与非细胞底物缀合的本发明的TCR、由本发明的多核苷酸编码的TCR或其部分。缀合可以是共价的或非共价的。
[0851] 非细胞底物可以是纳米颗粒、外来体(exosome)或本领域已知的任何非细胞底物。
[0852] 本发明的嵌合分子可以是可溶的。
[0853] 在另一方面,本发明提供了嵌合分子,其包含与毒素或抗体缀合的本发明的TCR、由本发明的多核苷酸编码的TCR或其部分。
[0854] 毒素或抗体可以是细胞毒性的。毒素可以是细胞毒性分子或化合物,例如放射性分子或化合物。嵌合分子的TCR部分可以赋予识别表达WT1蛋白或肽的细胞的能力。因此,嵌合分子可以特异性识别和/或结合表达WT1的肿瘤细胞。因此,本发明的嵌合分子可以提供细胞毒性毒素、抗体和/或化合物的WT1靶向性递送。
[0855] WT1相关疾病
[0856] WT1在多种血液肿瘤和实体瘤中广泛表达,而在各种健康组织(例如性腺、子宫、肾、间皮、不同组织中的祖细胞)中显示有限的表达。本发明人已经鉴定并确定识别WT1肽的TCR的氨基酸序列。此外,他们已经证明,表达根据本发明的TCR的T细胞靶向并杀死呈递WT1肽或过表达WT1蛋白的细胞。
[0857] 因此,本发明提供了用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法,该方法包括对有此需要的受试者施用本发明的TCR、分离的多核苷酸、载体或细胞的步骤。本发明还提供了用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法,其包括对有此需要的受试者施用通过本发明的方法制备的细胞的步骤。
[0858] 本发明还提供本发明的TCR、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、根据本发明的细胞或通过本发明的方法制备的细胞,用于在治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病中的用途。
[0859] 术语“预防”意图指避免、延迟、阻止或阻碍染上疾病。治疗可以例如预防或减少发展或染上与WT1表达有关的疾病的可能性。
[0860] 如本文所用,“治疗”是指照顾患病的受试者,以改善、治愈或减轻疾病的症状,或以减轻、阻止或延迟疾病的进展。
[0861] 受试者可以是人受试者。人受试者可以是儿童。例如,儿童可以小于10岁龄、小于9岁龄、小于8岁龄、小于7岁龄、小于6岁龄、小于5岁龄、小于小于4岁龄、小于3岁龄或小于2岁龄。人受试者可以是婴儿。
[0862] 基于WT1的表达,先前可以已经确定受试者需要本发明的TCR、分离的多核苷酸、载体或细胞,或通过本发明的方法制备的细胞。例如,受试者可以具有相对于健康对照细胞群体表现出增加的WT1表达的细胞群体。可以使用本领域中已知的多种技术来确定WT1的表达,例如,定量RT-PCR可用于确定WT1 RNA转录物的量,其指示WT1蛋白表达。本领域技术人员还将理解,可以通过使用对WT1特异性的商品化抗体进行western印迹来确定WT1蛋白表达。
[0863] 受试者也可以先前已经鉴定为在WT1基因中具有改变(例如,突变或缺失)。此类改变可以是遗传性的。因此,与WT1表达有关的疾病可以是遗传性疾病。与WT1表达有关的遗传性疾病的实例包括但不限于WAGR(维尔姆斯肿瘤-无虹膜-泌尿生殖系统畸形-延缓)综合征、Denys-Drash综合征(DDS)、Frasier综合征(FS)、泌尿生殖系统异常(生殖和泌尿系统异常)综合征。
[0864] 具有与WT1表达相关的遗传性疾病的受试者可以有较高的形成增殖性病症(例如癌症)的风险。
[0865] 与WT1表达有关的疾病可以是增殖性病症。
[0866] 增殖性病症可以是血液恶性疾病或实体瘤。血液恶性疾病可以选自下组:急性髓样白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、成淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤。
[0867] 实体瘤可以选自下组:肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤,横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结肠直肠癌。
[0868] 与WT1表达相关的疾病可以选自下组:急性髓样白血病(AML)、慢性髓样白血病(CML)、成淋巴细胞性白血病、骨髓增生异常综合征、淋巴瘤、多发性骨髓瘤、非何杰金淋巴瘤和何杰金淋巴瘤、肺癌、乳腺癌、食道癌、胃癌、结肠癌、胆管癌、胰腺癌、卵巢癌、头颈癌、滑膜肉瘤、血管肉瘤、骨肉瘤、甲状腺癌、子宫内膜癌、神经母细胞瘤,横纹肌肉瘤、肝癌、黑素瘤、前列腺癌、肾癌、软组织肉瘤、尿路上皮癌、胆道癌、胶质母细胞瘤、间皮瘤、宫颈癌和结肠直肠癌。
[0869] 药物组合物
[0870] 本发明的TCR、本发明的多核苷酸、本发明的载体、本发明的细胞、通过本发明的方法制备的细胞、本发明的嵌合分子或本发明的混合细胞群体可以用药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂配制以对受试者施用。合适的载体和稀释剂包括等张盐水溶液,例如磷酸盐缓冲盐水,并潜在含有人血清白蛋白
[0871] 优选地,细胞疗法产品的处理按照FACT-JACIE国际细胞疗法标准进行。
[0872] 治疗方法
[0873] 在另一方面,本发明提供了用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法,其包括对有此需要的受试者施用本发明的TCR、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、本发明的细胞、通过本发明的方法制备的细胞、本发明的嵌合分子或本发明的混合细胞群体的步骤。
[0874] 受试者可以是人类受试者。受试者可以是非人动物受试者。
[0875] 受试者可以患有与WT1表达相关的疾病。受试者可以有风险形成与WT1表达相关的疾病。先前可以已经确定受试者有风险形成与WT1表达相关的疾病。受试者可以具有增加的形成与WT1有关的疾病的风险。
[0876] 增加的风险可以已经通过遗传筛查和/或通过回顾受试者的家族史来确定。受试者可以表达指示增加的形成与WT1表达相关的疾病的风险的遗传标志物。
[0877] 适当地,本领域技术人员将知道与增加的形成与WT1有关的疾病的风险有关的遗传风险因素(例如遗传标志物)。技术人员可以能够使用本领域已知的任何合适的方法或技术来确定受试者是否具有增加的形成与WT1表达相关的疾病的风险。
[0878] 受试者先前可以已经接受了与WT1表达有关的疾病的治疗。受试者可以在消退中。受试者可以对化学疗法有抗性。受试者可以对抗WT1疗法有抗性。
[0879] 在一个实施方案中,用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法包括对受试者施用化学疗法的步骤。化学疗法可以与本发明的TCR、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、本发明的细胞、通过本发明的方法制备的细胞或本发明的嵌合分子同时,顺序或分开对受试者施用。
[0880] 在另一方面,本发明提供了治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的方法,其包括施用混合细胞群体的步骤,其中混合细胞群体包括各自表达本发明的不同TCR的多个细胞群体。
[0881] 在另一方面,本发明提供了混合细胞群体,其包含各自表达本发明的不同TCR的多个细胞群体。
[0882] 在另一方面,本发明提供了制备混合细胞群体的方法,该混合细胞群体包含各自表达本发明不同TCR的多个细胞群体,其中方法包括用本发明的载体体外或离体转导细胞的步骤。
[0883] 在另一方面,本发明提供了用于治疗和/或预防与WT1表达有关的疾病的混合细胞群体,其中混合细胞群体包含各自表达本发明的不同TCR的多个细胞群体。
[0884] 例如,混合细胞群体可以包含表达本发明的第一TCR的第一细胞群体和表达本发明的第二TCR的第二细胞群体。例如,混合细胞群体可以包含表达本发明的第一TCR的第一细胞群体、表达本发明的第二TCR的第二细胞群体和表达本发明的第三TCR的第三细胞群体,等等。
[0885] 混合细胞群体中的每个细胞群体可以例如仅表达本发明的单一TCR。混合细胞群中细胞群体的内源TCR基因可能被破坏或缺失。混合细胞群体中细胞的内源TCR基因的表达可以被破坏,例如通过用人工核酸酶进行基因编辑。
[0886] 在另一方面,本发明提供了本发明的TCR、本发明的分离的多核苷酸、本发明的载体、本发明的细胞、通过本发明的方法制备的细胞、本发明的嵌合分子或本发明的混合细胞群体用于制备药物的用途,所述药物用于治疗与WT1表达有关的疾病。
[0887] 人和兽医治疗均在本发明的范围内。
[0888] 除非另有说明,否则本发明的实施将采用细胞生物学、分子生物学、组织学、免疫学、肿瘤学的常规技术,它们在本领域普通技术人员的能力范围内。在文献中解释了这些技术。
[0889] 参见例如Sambrook,J.,Fritsch,E.F.and Maniatis,T.(1989)Molecular Cloning:A Laboratory Manual,第2版,Cold Spring Harbor Laboratory Press;
Ausubel,F.M.et al.(1995及定期增补)Current Protocols in Molecular Biology,第9,
13和16章,John Wiley&Sons;Roe,B.,Crabtree,J.and Kahn,A.(1996)DNA Isolation and Sequencing:Essential Techniques,John Wiley&Sons;Polak,J.M.and McGee,J.O’D.(1990)In Situ Hybridization:Principles and Practice,Oxford University Press;
Gait,M.J.(1984)Oligonucleotide Synthesis:APractical Approach,IRL Press;和
Lilley,D.M.and Dahlberg,J.E.(1992)Methods in Enzymology:DNA Structures Part A:Synthesis and Physical Analysis of DNA,Academic Press。这些中的每篇通用教科书通过引用并入本文。
[0890] 现在将通过非限制性实施例描述本发明的各种优选特征和实施方案。实施例
[0891] 实施例1:从健康供体(HD)产生功能性WT1特异性细胞毒性T淋巴细胞(CTL)
[0892] 为了鉴定对限制于不同HLA等位基因的WT1表位特异性的新型TCR,我们用具有跨越WT1蛋白的完整序列的11个氨基酸的重叠的十五肽(15聚体)(参见材料和方法)的合并物刺激来自10名不同HD的外周血单个核细胞(PBMC)。此种肽设计确保对CD4+和CD8+T细胞的最佳刺激。
[0893] 刺激26-30小时后,我们富集表达CD137的T细胞。CD137是在T细胞受体结合后上调的分子,并且先前已经显示是一种可靠的标志物,用于快速鉴定、分离和体外扩充抗原特异性记忆以及幼稚CD4+和CD8+T细胞。进一步对CD137阴性级份消减CD3级份,然后以30Gy照射,并用作CD137+级份的抗原呈递细胞(APC)。分选的CD137+细胞在体外扩充约9天,并每7-14天用由经CD3消减的细胞或由加载有肽合并物的永生化自体B细胞呈递的自体APC再刺激。如图1(a-j)中呈现的细胞荧光结果所示,此程序导致WT1特异性T淋巴细胞的富集。在不同的时间点进行T细胞的功能表征。更详细地,将T细胞与加载有肽合并物的自体APC共培养,并且在共培养6小时后,通过胞内染色鉴定T细胞群体中CD107a和IFNγ的表达。遇到抗原后CD107a的表达指示抗原诱导的脱粒和溶解潜力。
[0894] 用作为阴性对照的无关肽合并物刺激细胞。对照刺激导致源自每名健康供体的T细胞的IFNγ和CD107a的最小分泌。
[0895] 实施例2:引发T细胞应答的WT1表位的定位
[0896] 为了鉴定T细胞识别的WT1表位,在WT1刺激/富集的T细胞与自体APC进行体外共培养6小时后定量IFNγ分泌,所述自体APC加载有肽亚合并物,每个肽亚合并物根据定位网格含有多达12个肽。定位网格由24个亚合并物组成,所述亚合并物具有两个相交的亚合并物内独特含有的每个肽(Doubrovina,E.et al.Blood 120,1633–1646(2012))。图2a中汇总了结果。
[0897] FACS分析显示了用亚合并物4、5和16刺激后,HD1、HD3、HD6、HD7、HD10衍生的T细胞的IFNγ和CD107a的实质性表达(图2b、d、g、h、k)。对亚合并物6、16、17和20刺激的HD2衍生的T细胞观察到IFNγ的实质性表达(图2c),而亚合并物4、5、6、14、18、21刺激HD4衍生的T细胞的IFNγ和CD107a的表达(图2e),并且亚合并物5、11、12、21、22刺激HD5中的IFNγ表达(图2f)。对于HD7,我们在用亚合并物7、8、20刺激后另外观察到IFNγ和CD107a的表达增加,尽管与用亚合并物4、5和16观察到的水平相比水平更低(图2h)。此外,我们观察到用亚合并物12和14刺激HD8衍生的T细胞(图2i)和用亚合并物5、13、21刺激HD9衍生的T细胞(图2j)后,IFNγ和CD107a的表达增加。
[0898] 此后,用APC刺激HD衍生的T细胞6小时,所述APC用由引发最高免疫应答的亚合并物共享的单一十五肽并且用至少一种无关的15聚体脉冲。FACS分析指示对于肽40和41在HD1 T细胞中(图3a),肽54、77、90对于HD2 T细胞(图3b),肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157;其是以SEQ ID NO:117所示的肽的九聚体)对于HD3 T细胞(图3c),肽17、18、99、100对于HD4(图3d,e),肽101对于HD5(图3f),肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157;其是以SEQ ID NO:117所示的肽的九聚体)对于HD6 T细胞(图3g),肽101、125和137对于HD9 T细胞(图3h),肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157;其是以SEQ ID NO:117所示的肽的九聚体)对于HD10 T细胞(图
3i)的CD107a和/或IFNγ表达增加。以此种方式,鉴定出优势的免疫原性序列。与无关的对照肽共培养后,未观察到相关的免疫应答(即CD107a和/或IFNγ的表达增加)。对于HD7和HD8,由于细胞适合性降低,不可能进行培养实验以鉴定免疫原性肽。不过,我们可以通过定位网格的解卷积来预测识别的肽。我们鉴定出HD7的肽41和42(源自SP4、5、16)的重叠序列以及肽91和92(源自SP7、8、20)的重叠序列和HD8的肽24。
[0899] 为了确定被从HD4,HD5和HD10扩充的T细胞识别的WT1免疫原性肽的HLA限制,将来自这些的T细胞与一组各种表达不同HLA或HLA-B等位基因的不同靶EBV-BLCL细胞共培养6小时,所述细胞已经用相关肽(HD4的肽17;HD5的肽101;HD10的肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157))或无关对照肽脉冲。实验结果显示了肽17由HLA-B*3502等位基因呈递并被源自HD4的T细胞识别(图3j),肽101由HLA-B*3501呈递并被源自HD5的T细胞识别(图3k);肽VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157)由HLA-A*0201呈递并被源自HD10的T细胞识别(图3l)。
[0900] 由从HD1-HD10扩充的WT1特异性T细胞识别的WT1肽的序列显示在下表3中。
[0901] 表3
[0902]
[0903]
[0904] 实施例3:WT1特异性T细胞选择性消除表达WT1的细胞
[0905] 为了确定WT1特异性T细胞的HLA限制及其消除表达WT1的细胞的能力,将T细胞与不同的靶细胞共培养。
[0906] HD1衍生的T细胞
[0907] 意识到HD1含有HLA-A*0201等位基因,我们将富集的WT1特异性T细胞与不同的靶细胞共培养:用包含肽40和41的重叠肽合并物脉冲的T2细胞(参见表3);用MelanA/MART1合并物作为阴性对照(T2 MelanA/MART1合并物)脉冲的T2细胞;或经遗传修饰以既表达HLA-A*0201等位基因又过表达WT1蛋白的K562细胞(K562 HLA-A*0201WT1)。
[0908] 共培养6小时后,通过FACS建立CD107a的表达。HD1的结果指示了在与用WT1合并物脉冲的T2细胞共培养后,>60%的CD8+T细胞中CD107a的表达(图4a)。类似地,WT1特异性T细+胞与经遗传修饰的K562细胞(表达HLA-A*0201等位基因和WT1蛋白)的共培养导致CD8T细胞的CD107a表达超过60%(图4a)。
[0909] 相反,与用阴性对照MelanA/MART1合并物脉冲的T2细胞共培养的CD8+T细胞的CD107a表达是最小的(图4a)。
[0910] 这些结果证明了当由HLA-A*0201等位基因编码的MHC分子呈递时,分离的HD1衍生的T细胞特异性识别包含序列APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的WT1肽。此外,结果显示了HD1衍生的T细胞能够特异性靶向过表达WT1蛋白的细胞。因此,这些实验数据证明了由HD1衍生的T细胞表达的TCR特异性结合包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)氨基酸序列的肽,并且此类TCR是HLA-A*0201限制性的。
[0911] HD3衍生的T细胞
[0912] 意识到HD3含有HLA-A*0201等位基因,我们将富集的WT1特异性T细胞与不同的靶细胞共培养:用亚合并物16脉冲的T2细胞,先前确定所述亚合并物16含有引发免疫应答的免疫原性肽(T2-SP16);用MelanA/MART1合并物作为阴性对照脉冲的T2细胞(T2-Melan A);野生型K562细胞(K562)作为阴性对照;或经过遗传修饰以既表达HLA-A*0201等位基因又过表达WT1蛋白的K562细胞(K562 A2+WT1+)。
[0913] 共培养4天后,将HD3衍生的T细胞杀死靶细胞的能力表示为消除指数-以与WT1特异性T细胞共培养后仍然存在的靶细胞总数除以单独靶细胞总数计算。
[0914] 结果证明了WT1特异性T细胞消除表达所鉴定的特定WT1表位的靶细胞的能力(图4b)。特别地,HD3衍生的T细胞消除用包含APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)氨基酸序列的WT1肽(亚合并物16;SP16)脉冲的T2细胞的约95%。此外,HD3衍生的T细胞消除表达由HLA-A*
0201等位基因编码的MHC分子并且过表达WT1蛋白的K562细胞的约78%。相比之下,用阴性对照MelanA/MART1合并物脉冲的T2细胞无一被HD3衍生的T细胞消除。类似地,存在有对照野生型K562细胞的最小清除(图4b)。
[0915] 这些结果证明了分离的HD3衍生的T细胞特异性识别包含氨基酸序列APVLDFAPPGA(SEQ ID NO:117)的WT1肽。此外,结果显示了HD3衍生的T细胞能够通过HLA-A*0201编码的MHC进行的肽呈递而特异性靶向并杀死过表达WT1蛋白的细胞。因此,这些实验数据证明了WT1肽对由HD3衍生的T细胞表达的TCR的特异性,并且HD3衍生的TCR是HLA-A*0201限制性的。
[0916] HD4衍生的T细胞
[0917] 通过将T4细胞与从急性髓样白血病(AML)患者中分离的原代白血病母细胞(CD33+细胞)共培养来评估HD4衍生的T细胞消除靶细胞的能力,所述患者是根据高的WT1抗原表达和HLA分型(HLA-B*3502)选择的。作为阴性对照,将HD4衍生的T细胞与来自不表达HLA-B*3502等位基因的AML患者的白血病母细胞共培养。
[0918] 在以效应物与靶物比率10:1进行三天共培养后,FACS分析显示了与HD4WT1特异性T细胞(CD3+细胞)共培养后从表达HLA-B*3502等位基因的AML患者中收获的白血病母细胞(CD33+)的几乎完全清除(图4c,上图)。实际上,仅剩余的总细胞群体的0.54%对CD33表达呈阳性。
[0919] 相反,将WT1特异性T细胞与无关的对照AML母细胞共培养后,未观察到CD33+细胞的清除(图4c,下图)。实际上,在对照样品中,与HD4衍生的WT1特异性T细胞共培养后,总细胞群体的7.9%对CD33表达呈阳性。
[0920] 重要的是,这些结果证明了源自HD4的WT1特异性T细胞特异性靶向和杀死过表达WT1和由HLA-B*3502编码的MHC的白血病母细胞(AML癌细胞)的能力。因此,源自HD4的TCR能够以HLA-B*3502限制的方式特异性靶向并杀死癌细胞。
[0921] 实施例4:WT1特异性T细胞的Vβ序列的免疫概况分析
[0922] 为了更好地鉴定参与来自HD1-6和10的WT1特异性T细胞的抗原识别的TCR(对于HD7、HD8和HD9,由于细胞适合性降低,不可能进行Vβ免疫概况分析),我们首先进行了多参数FACS分析,以定量确定TCRVβ全集。因此,为了确定扩充的WT1特异性T细胞的克隆性,我们根据制造商的推荐使用IOTest Beta Mark TCR V beta全集试剂盒。此试剂盒允许检测8个个别管中24种不同的V beta基因表达。特别地,通过使用此方法确保整个V beta全集的
75%的覆盖。FACS染色的结果指示HD1、HD2、HD3、HD5的特异性Vβ的更大普遍-参见图5。对于HD4、HD6和HD10,占优势的Vβ的彻底测定是不可能的,可能是由于试剂盒的固有的局限性,该试剂盒包含覆盖75%现有Vβ蛋白的抗体。
[0923] 实施例5:从WT1特异性T细胞分离的TCRα和β链的高通量测序
[0924] 在共培养时间框架内的不同时间点收集WT1特异性T细胞,并通过使用Arcturus Pico Pure RNA提取试剂盒提取其RNA。通过使用改良的RACE方法扩增WT1特异性T细胞的CDR3序列,其中在cDNA合成后包括磁性捕获,以提高反应的特异性并消除不需要的模板(Ruggiero et al.Nat.Commun.6,8081(2015))。使用IlluminaMiSeq测序仪对样品进行测序,并使用MiXTCR软件鉴定CDR3克隆型(Bolotin,DA et al.Nature Methods 12,380–381(2015))。此外,使用IMGT V-quest工具进一步确定CDR1、CDR2和CDR3(Brochet,X.et al.,Nucl.Acids Res.36,W503-508(2008).PMID:18503082;Giudicelli,V.,Brochet,X.,Lefranc,M.-P.,Cold Spring Harb Protoc.2011Jun 1;2011(6).pii:pdb.prot5633.doi:
10.1101/pdb.prot5633.PMID:21632778摘要,还于自ColdSpring Harbor(CSH)方案的友情提供的IMGT小册子)。
[0925] 测序结果证明了对于HD1-10中的这两条TCR链,在WT1特异性T细胞群体中特定的CDR3克隆型的优势性随时间而增加。图6提供了占优势的α和β链基因型以及CDR3序列。
[0926] 此外,确定了源自HD1-10的TCR的全长α和β链氨基酸序列-参见表1。还确定了相应的核苷酸序列-参见表2。
[0927] 实施例6:新鉴定的TCR的功能性验证
[0928] 从HD1和HD3分离并识别由HLA-A*0201等位基因呈递时的WT1VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157)肽的TCRα和β序列在双向启动子的控制下克隆到慢病毒载体中,以增强经转导的淋巴细胞中这两种TCR链的稳健且协同的表达。用编码HD1 TCR或HD3 TCR的病毒载体转导来自健康个体的T细胞。作为对照,我们还用WT1 126-134TCR转导细胞。通过以如下表示的不同靶细胞共培养在功能上验证经转导的T细胞:用2种公认的肽(对于HD1和HD3 TCR为VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157);对于WT1 126-134TCR为RMFPNAPYL(SEQ ID NO:255))之一脉冲的T2细胞(图7a),野生型或经工程化改造以表达HLA-A*0201等位基因的K562细胞(图
7b),源自3名AML患者并且根据HLA-A*0201等位基因表达和WT1表达选择的原代AML母细胞(图7c)。共培养3天后,我们观察到每个转导的T细胞群体在特异性识别由HLA-A*0201等位基因呈现时的靶肽中的能力(图7a)以及HD1 T细胞在介导工程化K562细胞的几乎完全消除中的更大潜力。与pAML母细胞共培养的结果进一步证实了HD1 TCR在识别靶抗原中的更高效力。在这里,我们观察到与使用HD3 TR和WT1 126-134TR T淋巴细胞作为效应细胞的条件相比,与HD1 TR T细胞共培养时,这两种含有HLA-A*0201等位基因的pAML母细胞的更大消除。
[0929] 材料和方法
[0930] 使用先前由Gessler et al.(Gessler,M.et al.(1990)Nature 343:774-778)发表的WT1蛋白序列设计用于刺激和分离WT1特异性T细胞的肽。此序列含有575个氨基酸,并且在WT1的(外显子5+,KTS+)同种型中缺少的N端前126个氨基酸。我们设计了跨越WT1蛋白的整个序列的141个十五肽,每个与下一个重叠11个氨基酸。
[0931] 通过PRIMM以验证序列的规格,70%纯度,无菌性和内毒素缺乏合成肽。这些肽在WT1合并物中以每种肽的浓度1μg/ml等量混合。此外,生成了24个亚合并物,根据特定的定位矩阵,每个亚合并物含有多达12个肽(4.17μg/ml/每个肽),以便在仅两个重叠亚合并物中包括每个肽,如表4中显示(参见Doubrovina,E.et al.Blood120,1633–1646(2012)中的定位网格策略)。
[0932] 表4
[0933]
[0934] 外周血单个核细胞的分离
[0935] 在知情同意后,从San Raffaele医院的10名健康供体获得外周血。使用Ficoll-Hypaque密度梯度离心分离外周血单个核细胞。
[0936] 永生化的B细胞
[0937] 使用CD19微珠(Miltenyi Biotech)从健康供体的PBMC中分离自体B细胞,然后用含有BCL-6/BCL-XL转基因(Kwakkenbos,M.J.et al.Nat.Med.16,123(2009))和H/F甲型(Lévy,C.et al.Molecular Therapy 20 9,1699–1712,(2012))的慢病毒载体转导细胞,并在补充有10%胎血清(FBS)、青霉素-链霉素和10ng/ml的IL21(Miltenyi Biotech)的IMDM中培养。通过与经照射(50Gy)的表达CD40L的小鼠L细胞纤维细胞(3T3-CD40L)以10:1的B细胞:3T3-CD40L比率共培养,每5天再刺激B细胞。
[0938] 细胞系
[0939] 我们在补充有青霉素、链霉素、谷氨酰胺和10%FBS(BioWhittaker)的RPMI 1640(GIBCO-BRL)中培养T2和K562细胞系。
[0940] 白血病细胞
[0941] 原发性AML细胞获自San Raffaele Hospital(OSR)白血病生物库,并根据通过定量PCR得到的WT1表达和HLA分型进行选择。在OSR的HLA实验室以高分辨率对所有EBV-BLCL和原发性白血病细胞进行HLA-A、HLA-B、HLA-C、HLA-DR和HLA-DQ等位基因分型。
[0942] 流式细胞术
[0943] 我们使用缀合有FITC-,PE-,PerCP-,APC-,PE-细胞色素7–,APCCychrome 7-,Pacific Blue和Brillant Violet的针对人CD3,CD4,CD8,CD107a,IFNγ,TNFα,CD33,
CD117,CD34,CD14,Vβ21.3,Vβ8,Vβ7.2和HLA-A2的抗体。按照制造商的说明使用APC荧光标记的WT1 VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157)和PE荧光标记的WT1 RMFPNAPYL(SEQ ID NO:255)
dextramer。将细胞与抗体在4℃温育15分钟,并用含1%FBS的磷酸盐缓冲盐水洗涤。样品通过荧光激活细胞分选仪(FACS)Canto II流式细胞仪(BD Biosciences)运行,并通过Flow Jo软件(Tree star Inc)分析数据。为了胞内评估细胞因子分泌和脱粒标志物的表达,根据制造商的说明使用Fix/Perm缓冲液组(Biolegend)。
[0944] WT1特异性T细胞的刺激、分离和扩充
[0945] 将新鲜分离的PBMC重悬于补充有5%人AB血清、2mM谷氨酰胺和1μg/ml CD28单克隆抗体的X-VIVO中,以107个细胞/ml的密度接种,并用WT1重叠肽合并物刺激,每种肽以1μg/ml的浓度存在。
[0946] 在26-30小时后通过CD137表达分离抗原特异性T细胞。更具体地,将细胞用缀合有PE的CD137抗体染色,并使用抗PE微珠(Miltenyi Biotech)进行分选。使用CD3-微珠(Miltenyi Biotech)对CD137-级份消减CD3细胞,30Gy照射,并且在与CD137+级份以100:1(在可能时)或至少20:1的比率和5x106个细胞/ml的最终密度共培养中用作加载有肽的
APC。补充有5%人AB血清、5ng/ml IL7、5ng/ml IL15和10ng/ml IL21的X-VIVO用作培养基。
每2-3天更换包含细胞因子的培养基。
[0947] 再刺激扩充的抗原特异性T细胞
[0948] 每7-14天用经WT1脉冲的自体APC(经PBMC CD3消减的细胞;永生化的B细胞)再刺激细胞。在最初的再刺激中,将细胞在2天前洗涤并在无细胞因子的培养基中铺板。用30Gy照射APC,用肽合并物脉冲过夜,然后在X-VIVO中与效应细胞共培养,所述X-VIVO补充有5%人AB血清、1μg/ml CD28单克隆抗体和IL7(5ng/ml)、IL15(5ng/ml)、IL21(10ng/ml)。
[0949] 评估T细胞响应
[0950] 通过将效应细胞与用期望抗原(WT1肽合并物,WT1亚合并物,WT1个别肽,无关肽合并物作为对照)脉冲的自体APC(至少1:1的比率)进行6小时共培养来测量对WT1肽合并物响应的T细胞百分比。将共培养物接种在补充有5%人AB血清并补充有CD28单克隆抗体(1μg/ml)、Golgi Stop(BD)和CD107a-FITC抗体的X-VIVO中,以评估脱粒。然后将细胞固定,透化并在胞内染色以确定表达IFNγ和CD107a的CD3+CD8+或CD3+CD4+细胞的百分比。
[0951] 免疫原性肽的定位
[0952] 将用WT1合并物刺激的T细胞接种到不同的孔中,并以至少1:1的比率与加载有每个WT1亚合并物之一的自体APC共培养。如先前通过FACS分析所述,测量对每个亚合并物的T细胞响应。定位网格的解卷积对于确定哪些共享肽引发T细胞应答是至关重要的。一旦确定免疫原性肽,就用加载有个别肽的APC进一步刺激T细胞,以确认其免疫原性。
[0953] 评估T细胞识别WT1表达细胞的能力
[0954] 用不同的实验程序测量T细胞识别靶细胞的WT1特异性和HLA限制能力。对于源自HD1的T细胞,与靶细胞共培养6小时后,通过FACS分析确定CD107a的分泌;对于源自HD3的T细胞,消除指数计算为与WT1特异性T细胞共培养4天后仍然存在的靶细胞总数除以单独的靶细胞总数。对于源自HD4的T细胞,通过细胞荧光分析评估与CD3+WT1特异性T细胞共培养3天后仍存在的CD33+靶细胞(含有感兴趣的HLA等位基因的AML原代细胞和作为对照,不含特定HLA等位基因的AML原代细胞)的百分比。
[0955] T细胞克隆性的评估
[0956] 为了确定扩充的WT1特异性T细胞的克隆性,根据制造商的推荐使用IOTest Beta Mark TCR V beta全集。
[0957] TCR全集测序
[0958] 在共培养时间框架内的不同时间点收集WT1特异性T细胞,并通过使用Arcturus Pico Pure RNA提取试剂盒提取RNA。通过使用改良的RACE方法(Ruggiero,E.et al.Nat.Commun.6,8081(2015))扩增WT1特异性T细胞的互补决定区(CDR)3序列。通过使用IlluminaMiSeq测序仪对样品进行测序,并使用MiXCR软件(Bolotin,DA et al.Nature Methods 12,380–381(2015))鉴定CDR3克隆型。
[0959] 慢病毒载体
[0960] 从HD1和HD3分离的TCRα和β链基因进行密码子优化,半胱氨酸修饰,并在双向启动子下在慢病毒载体(LV)中克隆。氨基酸(aa)和核苷酸(nt)序列为:
[0961]
[0962]
[0963]
[0964]
[0965] LV由具有整合酶能力的第三代构建体包装,并由水疱性口炎病毒(VSV)包膜假型化。作为对照,我们包括编码识别RMFPNAPYL(SEQ ID NO:255)肽的WT1 126-134TCR的LV。
[0966] 载体转导
[0967] 为了用WT1-TCR慢病毒载体进行转导,活化从健康个体分离的T淋巴细胞,并使用与CD3和CD28抗体(ClinExVivo CD3/CD28;Invitrogen)缀合的磁珠按照制造商的说明分选,并在补充有青霉素、链霉素、10%FBS和各5ngml-1的IL-7和IL-15(PeproTech)的Iscove改良Dulbecco培养基(IMDM)(GIBCO-BRL)中培养。为了进行转导,将T淋巴细胞以2.5x106个细胞ml-1分配并用LV感染24小时。之后,将T细胞以106个细胞ml-1培养并扩充。通过测量表达特异性dextramer的CD3T细胞的百分比来确定转导效率。使用抗APC或抗PE微珠(Miltenyi Biotec)按照制造商的说明,使用APC或对VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157)或RMFPNAPYL(SEQ ID NO:255)肽(Immudex)特异性的PE荧光标记的HLA-A*0201dextramer对细胞进行分选。
[0968] 功能测定
[0969] 在与以下各项共培养后测量HD1、HD3和WT1 126-134TCR转移的T细胞识别WT1表达靶细胞的能力:用WT1 126-134肽或VLDFAPPGA(SEQ ID NO:157)肽脉冲的T2细胞(效应物:靶物比率=1:1);(b)野生型(K562)或经过遗传修饰以表达HLA-A*0201等位基因的K562细胞(效应物:靶物比率=1:1);(c)根据HLA-A*0201等位基因表达和WT1抗原表达选择的3种不同的原代AML母细胞(效应物:靶物比率=5:1)。对于与T2和K562细胞系的共培养,我们包括未转导的T细胞作为对照。培养3天后,通过细胞荧光分析评估靶细胞的百分比。消除指数如下计算:1-(与WT1特异性T细胞共培养3天后仍存在的靶细胞总数/仅靶细胞总数)。
[0970] 以上说明书中提及的所有出版物均通过引用并入本文。在不脱离本发明的范围和精神的情况下,所描述的本发明的各种修改和变化对本领域技术人员将是显而易见的。尽管已经结合具体的优选实施方案描述了本发明,但是应当理解,所要求保护的发明不应过度限于此类具体的实施方案。实际上,对于细胞生物学、免疫学、免疫疗法、分子生物学、肿瘤学或相关领域的技术人员来说明显的、用于实施本发明的所述模式的各种修改意图在所附权利要求书的范围内。
高效检索全球专利

专利汇是专利免费检索,专利查询,专利分析-国家发明专利查询检索分析平台,是提供专利分析,专利查询,专利检索等数据服务功能的知识产权数据服务商。

我们的产品包含105个国家的1.26亿组数据,免费查、免费专利分析。

申请试用

分析报告

专利汇分析报告产品可以对行业情报数据进行梳理分析,涉及维度包括行业专利基本状况分析、地域分析、技术分析、发明人分析、申请人分析、专利权人分析、失效分析、核心专利分析、法律分析、研发重点分析、企业专利处境分析、技术处境分析、专利寿命分析、企业定位分析、引证分析等超过60个分析角度,系统通过AI智能系统对图表进行解读,只需1分钟,一键生成行业专利分析报告。

申请试用

QQ群二维码
意见反馈