改善对氨基硫醇及其类似物的保护和递送的方法
阅读：933发布：2020-06-18
专利汇可以提供改善对氨基硫醇及其类似物的保护和递送的方法专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且一方面，本 申请 涉及式(I)的 氨 基硫醇-偶联物：其中，核接头R1、R2、R3、m、n和p如上所述。本 发明 还涉及使用式(I)的氨基硫醇-偶联物 治疗 需要氨基硫醇疗法的受试者的方法。，下面是改善对氨基硫醇及其类似物的保护和递送的方法专利的具体信息内容。
1.一种式(I)的氨基硫醇-偶联物：
其中
是原子、分子或大分子；
是接头基团其中所述接头基团是聚合物、聚合物的一部分、聚合物的臂、共聚物的臂或树枝状聚合物的分支；
R1、R2和R3独立地选自氢和C1-6烷基；
m为1至100,000；
n为1至10；并且
p为0至2500。
2.根据权利要求1所述的氨基硫醇-偶联物，其中 是聚合物核、树枝状聚合物核、具有内部树枝状结构(即分支)的树枝状聚合物核、治疗剂或治疗剂的衍生物。
3.根据权利要求1所述的氨基硫醇-偶联物，其中 选自由
叶酸、叶酸衍生物、精胺聚合物和
精胺聚合物衍生物组成的组，其中a为0至2500；b为0至2500；c为0至2500；d为0至2500；R独立地选自氢、C1-6烷基和卤素；X是原子、分子或大分子；Y是多价基团。
4.根据权利要求3所述的氨基硫醇-偶联物，其中X为O、S、C(R4)2或NR4，其中R4为氢或C1-6烷基。
5.根据权利要求1所述的氨基硫醇-偶联物，其具有以下结构：
其中k为1至2500。
6.一种药物组合物，其包含根据权利要求1所述的氨基硫醇-偶联物。
7.根据权利要求6所述的药物组合物，其还包含：
细胞内递送系统。
8.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述细胞内递送系统选自由以下组成的组：
(a)包含细胞穿透剂的系统，(b)pH响应型载体，(c)C2-链霉亲和素递送系统，(d)CH(3)-TDDS药物递送系统，(e)疏水性生物活性载体，(f)外泌体，(g)基于脂质的递送系统，(h)基于脂质体的递送系统，(i)胶束递送系统，(j)微粒，(k)分子载体，(l)纳米载体，(m)纳米多元载体，(n)纳米凝胶，(o)由两种或更多种微粒递送系统的组分组成的混合纳米载体系统，(p)纳米颗粒，(q)基于肽的药物递送系统，和(r)基于聚合物或共聚物的递送系统。
9.根据权利要求7所述的药物组合物，其中所述细胞内递送系统是纳米颗粒。
10.根据权利要求7所述的药物组合物，其还包含：表面活性剂。
11.根据权利要求7所述的药物组合物，其还包含：还原剂。
12.一种组合物，其包含根据权利要求1所述的一种或多种氨基硫醇-偶联物。
13.一种试剂盒，其包含根据权利要求1所述的一种或多种氨基硫醇-偶联物。
14.根据权利要求13所述的试剂盒，其还包含一种或多种附加治疗剂。
15.一种治疗需要氨基硫醇疗法的受试者的方法，所述方法包括：
向所述受试者施用所述氨基硫醇-偶联物或包含如权利要求1-12中任一项所述的氨基硫醇-偶联物的药物组合物。
16.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者选自由需要用抗病毒剂、化学保护剂、细胞保护剂、辐射防护剂、抗纤维化剂、抗肿瘤剂或抗氧化剂治疗的受试者组成的组。
17.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者感染病毒，并且在有效治疗所述病毒的条件下施用所述氨基硫醇-偶联物或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物。
18.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者感染HIV、正粘病毒、流感病毒或腺病毒。
19.根据权利要求18所述的方法，其中所述流感病毒是选自由H1N1和H3N2组成的组的类型。
20.根据权利要求18所述的方法，其中所述腺病毒是选自由B、C和E组成的组的种类。
21.根据权利要求17所述的方法，其中所述受试者未感染HIV。
22.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者患有肿瘤病状，并且在有效治疗所述肿瘤病状的条件下施用所述氨基硫醇-偶联物或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物。
23.根据权利要求22所述的方法，其中所述肿瘤病状选自由乳房肿瘤、卵巢肿瘤、子宫颈肿瘤、结肠肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤(恶性黑素瘤)、淋巴网状内皮细胞肿瘤及其组合组成的组。
24.根据权利要求22所述的方法，其中所述肿瘤病状是骨髓增生异常病状。
25.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者接受放射疗法、化学疗法或其组合，并且在有效减少或降低所述放射疗法、化学疗法或其组合的不利或不良副作用的条件下施用所述氨基硫醇-偶联物或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物。
26.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者需要抗微生物疗法，并且在有效杀伤所述受试者中的一种或多种病原性微生物的条件下施用所述氨基硫醇-偶联物或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物。
27.根据权利要求26所述的方法，其中所述微生物选自由细菌、酵母、真菌或寄生虫组成的组。
28.根据权利要求27所述的方法，其中所述寄生虫是细胞内寄生虫。
29.根据权利要求27所述的方法，其中所述寄生虫是细胞外寄生虫。
30.根据权利要求15所述的方法，其中所述受试者是哺乳动物。
31.根据权利要求30所述的方法，其中所述哺乳动物是人。
32.根据权利要求1所述的氨基硫醇-偶联物，其中m为2至100,000。
改善对氨基硫醇及其类似物的保护和递送的方法
[0002] 本发明涉及氨基硫醇-偶联物、组合物及其制备和使用方法。所述偶联物可用于治疗需要氨基硫醇疗法的受试者(例如，需要用抗病毒剂、化学保护剂、细胞保护剂、辐射防护剂、抗纤维化剂、抗肿瘤剂、抗氧化剂或抗微生物剂或抗寄生虫剂治疗的那些受试者)。
[0003] 发明背景
[0004] 在目前被称为硫代磷酸酯的氨基硫醇药物调配物中，生物活性氨基硫醇部分的保护依赖于氨基硫醇与磷酸基团的偶联。在该调配物中，磷酸基团与氨基硫醇的巯基部分键合，并且其作用是在药物递送至靶细胞和非靶细胞的过程中保护活性代谢产物免于偶然反应。在细胞膜附近，磷酸基团被细胞膜结合的碱性磷酸酶去除。然后活性代谢产物(氨基硫醇)通过被动扩散或在一些情况下，通过多胺运输系统进行主动运输进入细胞。
[0005] 硫代磷酸酯向正常细胞的递送成功，因为许多/大多数非应激/非病变细胞产生位于细胞膜内的碱性磷酸酶。然而，由于多种原因，相同前药对于治疗应激或病变细胞不是同样有效或无效，这些原因包括(i)从循环中快速清除，(ii)一些细胞并且特别是应激或病变细胞无法将硫代磷酸酯代谢为其活性形式，(iii)易于在靶细胞远端代谢，以及(iv)易转化为毒性副产物(Block等人，“Commentary:the Pharmacological Antioxidant Amifostine--Implications of Recent Research for Integrative Cancer Care,”
Integr.Cancer Ther.4:329-351(2005)；Calabro-Jones等人，“The Limits to
Radioprotection of Chinese Hamster V79 cells by WR-1065 under Aerobic
Conditions,”Radiat.Res.149:550-559(1998)；Meier等人，“Degradation of 2-(3-aminopropylamino)-ethanethiol(WR-1065)by Cu-dependent Amine Oxidases and
Influence on Glutathione Status of Chinese Hamster Ovary Cells,”
Biochem.Pharmacol.50:489-496(1995)，其各自据此通过引用整体并入)。其它限制包括(i)无法利用多种不同的药物吸收机制，这些机制在病变细胞与正常细胞之间以及具有不同病理的病变细胞之间可以不同，(ii)无法靶向细胞摄取或运输系统以增强进入细胞的药物摄取，(iii)无法靶向或排除特定细胞类型，(iv)无法改变药物循环或保留时间，以及(v)无法靶向或排除特定药物清除机制。需要氨基硫醇的新药物调配物来克服这些问题和限制。
Integr.Cancer Ther.4:329-351(2005)；Calabro-Jones等人，“The Limits to
Radioprotection of Chinese Hamster V79 cells by WR-1065 under Aerobic
Conditions,”Radiat.Res.149:550-559(1998)；Meier等人，“Degradation of 2-(3-aminopropylamino)-ethanethiol(WR-1065)by Cu-dependent Amine Oxidases and
Influence on Glutathione Status of Chinese Hamster Ovary Cells,”
Biochem.Pharmacol.50:489-496(1995)，其各自据此通过引用整体并入)。其它限制包括(i)无法利用多种不同的药物吸收机制，这些机制在病变细胞与正常细胞之间以及具有不同病理的病变细胞之间可以不同，(ii)无法靶向细胞摄取或运输系统以增强进入细胞的药物摄取，(iii)无法靶向或排除特定细胞类型，(iv)无法改变药物循环或保留时间，以及(v)无法靶向或排除特定药物清除机制。需要氨基硫醇的新药物调配物来克服这些问题和限制。
[0006] 本发明旨在克服本领域中的这些和其它不足。发明概要
[0007] 本发明的一方面涉及式(I)的氨基硫醇-偶联物：
[0008]
[0009] 其中 是原子、分子或大分子；
[0010] 是接头基团，其中所述接头基团是聚合物、聚合物的一部分、聚合物的臂、共聚物的臂、树枝状聚合物的分支或分子；
[0011] R1、R2和R3独立地选自氢和C1-6烷基；
[0012] m为1至100,000；
[0013] n为1至10；并且
[0014] p为0至2500。
[0015] 本发明的另一方面涉及治疗需要氨基硫醇疗法的受试者的方法。该方法包括向受试者施用(i)式(I)的氨基硫醇-偶联物：
[0016]
[0017] 其中 是原子、分子或大分子；
[0018] 是接头基团，其中所述接头基团是聚合物、聚合物的一部分、聚合物的臂、共聚物的臂、树枝状聚合物的分支、原子或分子；
[0019] R1、R2和R3独立地选自氢和C1-6烷基；
[0020] m为1至100,000；
[0021] n为1至10；并且
[0022] p为0至2500，
[0023] 或(ii)包含所述氨基硫醇-偶联物的药物组合物。
[0024] 本公开总体上涉及涉及药物递送领域，药物递送涉及使用其中载体分子与目标分子共价键合的聚合载体。该药物递送系统的一般目的是实现以下一项或多项：(i)增加水溶性，(ii)针对降解酶的稳定性或减少网状内皮系统的摄取，(iii)靶向递送药物到特定部位。还涉及为了保护一个或多个活性部分并增强重新配制的实体的药代动力学和药效学以供递送给人和其它动物的目的而重新配制氨基硫醇药物。如以下实施例中所述，对于本文描述的氨基硫醇-偶联物已显示出意想不到的药物作用。
[0026] 图1显示氨磷汀(amifostine)的活性部分WR1065的结构。线性式为NH2(CH2)3NH(CH2)2SH。
[0027] 图2显示phosphonol的活性部分WR255591的结构。线性式为CH3NH(CH2)3NH(CH2)2SH。
[0028] 图3A-3B显示氨基硫醇(及其类似物)的两种通用结构，其中X选自由-PO3H2、氢、巯基、硫、乙酰基、异丁酰基、新戊酰基和苯甲酰基组成的组，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自氢和C1-6烷基，其中n为1至10的整数，并且(在图3B中)其中n'为1至10的整数。图3A-3B中所示的通用氨基硫醇的活性部分的两个示例性结构是其中X为氢。
[0029] 图4显示聚乙二醇(聚环氧乙烷)的通用结构，其中‘n’可以是1或更大的任何整数。线性式为H-(O-CH2-CH2)n-OH，其中‘n’可以是任何整数，1至2500的范围对于此处呈现的应用是最理想的。常用变体包括单甲氧基PEG或二羟基PEG。参见例如，Sigmaaldrich.com上合适的单甲氧基聚(乙二醇)或二羟基聚(乙二醇)，其据此通过引用整体并入。
[0030] 图5A-5B显示硫醇封端的聚乙二醇(聚环氧乙烷)的通用结构，其中‘n’可以是1至2500的任何整数。参见例如，Sigmaaldrich.com上合适的聚(乙二醇)二硫醇，同型双官能PEG，其据此通过引用整体并入。
[0031] 图6显示了4-臂、硫醇封端的星形聚乙二醇的通用结构，其中‘n’可以是任何整数，1至2500的范围对于此处呈现的应用是最理想的。参见例如，Sigmaaldrich.com上合适的PEG聚合物和树枝状聚合物，PEG树枝状聚合物和多臂PEG，其据此通过引用整体并入。
[0032] 图7显示通过二硫键与氨基硫醇偶联的硫醇封端的聚乙二醇的通用结构，其中‘n1’可以是1至4的任何整数并且‘n2’可以是1至4的任何整数。参见例如，Sigmaaldrich.com上合适的PEG聚合物和树枝状聚合物，PEG树枝状聚合物和多臂PEG，其据此通过引用整体并入。如本文所述，根据本发明某些实施方案的偶联物是通过二硫键与氨基硫醇偶联的4-臂、硫醇封端的星形聚乙二醇，并具有图7所示的结构，其中‘n2’为4。
[0033] 图8显示6臂-PEG的通用结构。参见例如，Sigmaaldrich.com上合适的PEG聚合物和树枝状聚合物，PEG树枝状聚合物和多臂PEG，其据此通过引用整体并入。注意，例如该通用设计可以进一步扩展以创建8臂星形PEG支架。
[0034] 图9显示叶酸(叶酸)的通用结构。线性式为C19H19N7O6。通过将末端羧基改变为适当的部分(例如SH)，然后分别实现氨基硫醇或PEG的添加，可以合成叶酸与氨基硫醇或PEG的偶联物(Chen等人，“Folate-mediated intracellular drug delivery increases the anticancer efficacy of nanoparticulate formulation of arsenic trioxide,”Mol Cancer Ther 8(7):1955-63(2009)；Kang等人，“Folic acid-tethered Pep-1peptide-conjugated liposomal nanocarrier for enhanced intracellular drug delivery to cancer cells:conformational characterization and in vitro cellular uptake evaluation,”Int J Nanomed 8:1155-65(2013)，其各自据此通过引用整体并入)。叶酸偶联物提供了可与细胞表面上的叶酸受体相互作用并引发前药向细胞胞液主动运输的优点。
[0035] 图10显示精胺聚合物的通用结构。线性式为NH2C2H4(NC3H6NHC4H8)n-NHC3H6NH2，其中‘n’可以是等于或大于1的任何整数。通过将末端NH-基团改变为适当的部分(例如SH)，然后分别实现氨基硫醇或PEG的添加，可以合成精胺与氨基硫醇或PEG的偶联物。精胺聚合物偶联物提供了可与细胞表面上的聚胺受体相互作用并引发前药向细胞胞液主动运输的优点。(Zhang和Vinogradov，“Short biodegradable polyamine for gene delivery and
transfection of brain capillary endothelial cells”,J Control Release 143:359-
366(2010)，其据此通过引用整体并入)
transfection of brain capillary endothelial cells”,J Control Release 143:359-
366(2010)，其据此通过引用整体并入)
[0036] 图11A-11B显示如本文所描述的氨基硫醇-偶联物的通用结构。注意偶联物可以包括如图3至10所示的任何结构，并且可以随药物递送和药物活化条件以及需要治疗性干预的应激状况或疾病的需要而变化。还要注意两种偶联物可以组合；例如叶酸可以与含PEG的聚合物连接，然后含PEG的聚合物通过二硫键与氨基硫醇连接。还考虑到其中硫部分和氨基硫醇的第一个氮之间的碳链长度可以在长度上变化的实施方案(参见图3B，同上)，如图11B所示。
[0037] 图12显示暴露于单独的4SP65、氨磷汀或WR1065的肿瘤细胞的剂量反应曲线(所有结果的平均值)。
具体实施方式
[0038] 本申请涉及实现对硫代磷酸酯化合物的活性部分(即氨基硫醇)的保护，受保护化合物的递送以及在人和动物体内所需部位的活化的改进方法。
[0039] 本申请还涉及实现药效增加和毒性降低的方法。本申请涉及通过使用本文描述的氨基硫醇偶联物实现氨基硫醇类、其代谢产物、其类似物、二聚体和异二聚体的疗效提高而毒性更低的方法。此类受保护的药物可以在不使用附加递送方法或模块的情况下递送，或者可以与实现细胞内、细胞质内、主动或被动靶向细胞递送或排除和/或亚细胞内细胞器递送的药物递送系统组合。
[0040] 如本文所用，“活性部分”是指反应基团例如-SH和/或-NH以及带有这些基团的化合物，其构成氨磷汀、phosphonol及结构相关化合物和类似物的活性代谢产物的结构的一部分。
[0041] 如本文所用，“氨磷汀”是指给予WR-1065的硫代磷酸酯形式的名称，WR-1065是氨磷汀的生物活性部分和生理代谢产物。
[0042] 如本文所用，“氨基硫醇”是指具有图3所示结构的任何分子。
[0043] 如本文所用，“氨基硫醇前药”是指部分由通过生物可还原的二硫键键合至偶联物分子的氨基硫醇或氨基硫醇类似物组成的无治疗活性的前药。在适当的条件下，二硫键被还原，导致氨基硫醇的释放，从而可以实现其治疗益处。
[0044] 如本文所用，“生物可还原的”或“生物可还原的二硫键”是指可以通过在体内、器官系统中和/或细胞内存在的过程、酶、反应或其它机制还原的键或二硫键。
[0045] 如本文所用，“偶联物”是指与治疗活性氨基硫醇或氨基硫醇类似物键合或偶联的任何合成或天然存在的聚合物、共聚物、树枝状聚合物、其它偶联物、分子、化学品或前述的组合。
[0046] 如本文所用，“树枝状聚合物”是指具有分支、树状构造的任何合成聚合物。
[0047] 如本文所用，“PEG”是‘聚乙二醇’的缩写形式。
[0048] 如本文所用，“phosphonol”是指给予硫代磷酸酯WR-3789的名称，WR-255591是phosphonol的生物活性部分和代谢产物。
[0049] 如本文所用，“硫代磷酸酯”是指给予具有与巯基部分键合的磷酸基团的氨基硫醇的通用名称。
[0050] 如本文所用，“聚乙二醇”(也称为聚(乙二醇)；聚环氧乙烷)是给予具有H-(O-CH2-CH2)n-OH通用结构的分子的名称。注意，PEG(见下文)可以具有替代基团，例如巯基部分，在该通式中未将其示出(还请参见en.wikipedia.org/wiki/Polyethylene_glycol)。其它此类替代基团的实例包括–COOH、–OH和NH2。
[0051] 如本文所用，“前药”是指在细胞和/或体内并且优选在作用部位转化为活性形式的非活性药物衍生物。一个实例是式(I)的氨基硫醇-偶联物(参见图11A)。另一个实例是图11B所示的实例。
[0052] 如本文所用，“4SP65”是用于指明由WR-1065通过二硫键与4-臂星形PEG偶联组成的前药的三氟乙酸盐(分子量10,000道尔顿)的缩写(参见SigmaAldrich.com，PEG树枝状聚合物和多臂PEG，其据此通过引用整体并入)。
[0053] 如本文所用，“WR-1065”是给予氨磷汀的活性部分的名称。在此用作硫代磷酸酯药物活性部分的代表。
[0054] 如本文所用，“WR-2721”是氨磷汀的同义词。
[0055] 如本文所述，硫代磷酸酯的代谢产物包括描述为氨基硫醇、拴系形式的氨基硫醇、半胱胺和胱胺的化合物。氨基硫醇包括但不限于称为氨磷汀(WR-2721)、phosphonol(WR-3689)、WR-131527的硫代磷酸酯的活性代谢产物，结构相关的硫代磷酸酯，氨基硫醇或硫代磷酸酯的类似物，其去磷酸化活性代谢产物及如Stogniew的美国专利第6,489,312号描述的试剂，所述专利据此通过引用整体并入。
[0056] 本申请还涉及在递送过程中保护这些药物的巯基部分的方法。例如，本申请涉及全部或部分由聚乙二醇(PEG)组成的聚合物或共聚物，其它偶联物或其组合(因此被称为‘偶联物’)的用途。这些偶联物的分子量可根据需要变化以优化用于特定目的的药物调配物，并且聚合物可以具有任何形状，包括线形、多臂(星形)或分支，树状(如在树枝状聚合物中)(Balogh“, Dendrimer 101”Adv.Exp.Med.Biol.620:136-155(2007)；Mintzer等人，“Exploiting Dendrimer Multivalency to Combat Emerging and Re-Emerging Infectious Diseases,”Molecular Pharmaceutics 9:342-354(2012)，其各自据此通过引用整体并入)，或者可以具有不规则形状。还可以针对偶联物与细胞表面受体相互作用的能力和/或通过细胞介导的主动运输系统增强化合物摄取的能力来对其进行选择。偶联物通过与氨基硫醇的巯基部分形成二硫键而与氨基硫醇键合。二硫键在适当的细胞内条件、酶、反应途径或其组合的存在下是生物可还原的。
[0057] 本发明的一方面涉及式(I)的氨基硫醇-偶联物：
[0058]
[0059] 其中 是原子、分子或大分子；
[0060] 是接头基团，其中所述接头基团是聚合物、聚合物的一部分、聚合物的臂、共聚物的臂、树枝状聚合物的分支、原子或分子；
[0061] R1、R2和R3独立地选自氢和C1-6烷基；
[0062] m为1至100,000；
[0063] n为1至10；并且
[0064] p为0至2500。
[0065] 本发明的另一方面涉及图11B所示的式(式IV)的氨基硫醇-偶联物，其中 是原子、分子或大分子；
[0066] 是接头基团，其中所述接头基团是聚合物、聚合物的一部分、聚合物的臂、共聚物的臂、树枝状聚合物的分支、原子或分子；
[0067] R1、R2和R3独立地选自氢和C1-6烷基；
[0068] m为1至100,000；
[0069] n为1至10；
[0070] n'为1至10；并且
[0071] p为0至2500。
[0072] 术语“烷基”是指链中具有约1至约6个碳原子，可以是直链或支链的脂族烃基。支链意指一个或多个低级烷基例如甲基、乙基或丙基附连到直链烷基链上。示例性的烷基基团包括甲基、乙基、正丙基、异丙基、正丁基、叔丁基、正戊基和3-戊基。
[0073] 术语“卤代”或“卤素”意指氟、氯、溴或碘。
[0074] 示例性的氨基硫醇-偶联物包括以下：
[0075]
[0076]
[0077] 在一个实施方案中，氨基硫醇-偶联物的分子量为100,000道尔顿或更小。氨基硫醇-偶联物的分子量可为约100,000道尔顿；20,000道尔顿；10,000道尔顿；5,000道尔顿；3,000道尔顿；2,000道尔顿；或1,000道尔顿。在一个实施方案中，氨基硫醇-偶联物的分子量为约10,000道尔顿。在某些实施方案中，氨基硫醇-偶联物的分子量为约9,000至约11,000道尔顿。在某些实施方案中，氨基硫醇-偶联物的分子量为约9,000至约11,000道尔顿。
[0078] 根据本发明， 是接头基团，其中所述接头基团是聚合物、聚合物的一部分、聚合物的臂、共聚物的臂或树枝状聚合物的分支、原子或分子。在某些实施方案中，聚合物的部分是指聚合物的重复单元。
[0079] 接头可以是分子量为100,000道尔顿或更小；20,000道尔顿或更小；10,000道尔顿或更小；5,000道尔顿或更小；3,000道尔顿或更小；2,000道尔顿或更小；1,000道尔顿或更小；500道尔顿或更小；400道尔顿或更小；或200道尔顿或更小的部分。接头可以是分子量为200道尔顿至100,000道尔顿；200道尔顿至20,000道尔顿；200道尔顿至10,000道尔顿；200道尔顿至5,000道尔顿；200道尔顿至3,000道尔顿；200道尔顿至2,000道尔顿；200道尔顿至
1,000道尔顿；200道尔顿至500道尔顿；或200道尔顿至400道尔顿的部分。接头可以是分子量为400道尔顿至100,000道尔顿；400道尔顿至20,000道尔顿；400道尔顿至10,000道尔顿；
400道尔顿至5,000道尔顿；400道尔顿至3,000道尔顿；400道尔顿至2,000道尔顿；400道尔顿至1,000道尔顿；或400道尔顿至500道尔顿的部分。接头可以是分子量为500道尔顿至
100,000道尔顿；500道尔顿至20,000道尔顿；500道尔顿至10,000道尔顿；500道尔顿至5,
000道尔顿；500道尔顿至3,000道尔顿；500道尔顿至2,000道尔顿；或500道尔顿至1,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为1,000道尔顿至100,000道尔顿；1,000道尔顿至20,000道尔顿；1,000道尔顿至10,000道尔顿；1,000道尔顿至5,000道尔顿；1,000道尔顿至3,000道尔顿；或1,000道尔顿至2,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为2,000道尔顿至100,000道尔顿；2,000道尔顿至20,000道尔顿；2,000道尔顿至10,000道尔顿；2,000道尔顿至5,000道尔顿；或2,000道尔顿至3,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为3,000道尔顿至100,
000道尔顿；3,000道尔顿至20,000道尔顿；3,000道尔顿至10,000道尔顿；或3,000道尔顿至
5,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为5,000道尔顿至100,000道尔顿；5,000道尔顿至
20,000道尔顿；或5,000道尔顿至10,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为10,000道尔顿至100,000道尔顿；10,000道尔顿至20,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为20,000道尔顿至100,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为约100,000道尔顿；20,000道尔顿；10,000道尔顿；5,000道尔顿；3,000道尔顿；2,000道尔顿；1,000道尔顿；500道尔顿；400道尔顿；或
200道尔顿的部分。
1,000道尔顿；200道尔顿至500道尔顿；或200道尔顿至400道尔顿的部分。接头可以是分子量为400道尔顿至100,000道尔顿；400道尔顿至20,000道尔顿；400道尔顿至10,000道尔顿；
400道尔顿至5,000道尔顿；400道尔顿至3,000道尔顿；400道尔顿至2,000道尔顿；400道尔顿至1,000道尔顿；或400道尔顿至500道尔顿的部分。接头可以是分子量为500道尔顿至
100,000道尔顿；500道尔顿至20,000道尔顿；500道尔顿至10,000道尔顿；500道尔顿至5,
000道尔顿；500道尔顿至3,000道尔顿；500道尔顿至2,000道尔顿；或500道尔顿至1,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为1,000道尔顿至100,000道尔顿；1,000道尔顿至20,000道尔顿；1,000道尔顿至10,000道尔顿；1,000道尔顿至5,000道尔顿；1,000道尔顿至3,000道尔顿；或1,000道尔顿至2,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为2,000道尔顿至100,000道尔顿；2,000道尔顿至20,000道尔顿；2,000道尔顿至10,000道尔顿；2,000道尔顿至5,000道尔顿；或2,000道尔顿至3,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为3,000道尔顿至100,
000道尔顿；3,000道尔顿至20,000道尔顿；3,000道尔顿至10,000道尔顿；或3,000道尔顿至
5,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为5,000道尔顿至100,000道尔顿；5,000道尔顿至
20,000道尔顿；或5,000道尔顿至10,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为10,000道尔顿至100,000道尔顿；10,000道尔顿至20,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为20,000道尔顿至100,000道尔顿的部分。接头可以是分子量为约100,000道尔顿；20,000道尔顿；10,000道尔顿；5,000道尔顿；3,000道尔顿；2,000道尔顿；1,000道尔顿；500道尔顿；400道尔顿；或
200道尔顿的部分。
[0080] 如本文所述的聚合物包括聚乙二醇(PEG)、支化PEG、聚唾液酸(PSA)、多糖、普鲁兰糖(pullulane)、壳聚糖、透明质酸、硫酸软骨素、硫酸皮肤素、淀粉、葡聚糖、羧甲基葡聚糖、聚环氧烷(PAO)、聚环氧烷共聚物、泊洛沙姆(polyoxamer)(例如PLURONIC)、聚亚烷基二醇(PAG)、聚丙二醇(PPG)、聚噁唑啉、聚丙烯酰吗啉、聚乙烯醇(PVA)、聚羧酸酯、聚乙烯吡咯烷酮、聚磷腈、聚乙烯-马来酸酐共聚物、聚苯乙烯-马来酸酐共聚物、聚(1-羟甲基亚乙基羟甲基甲缩醛)(PHF)和2-甲基丙烯酰氧基-2'-乙基三甲基磷酸铵(MPC))、精胺聚合物(Zhang和Vinogradov“Short biodegradable polyamine for gene delivery and transfection of brain capillary endothelial cells”J Control Release 143:359-366(2010)，其据此通过引用整体并入)和其它聚合物。
[0081] 在一些实施方案中，接头选自由聚乙二醇(聚环氧乙烷)；硫醇封端的聚乙二醇(聚环氧乙烷)；叶酸衍生物；叶酸衍生物与PEG的偶联物；精胺；和精胺聚合物组成的组。
[0082] 在一些实施方案中，接头为聚乙二醇(聚环氧乙烷)或聚乙二醇(聚环氧乙烷)衍生物(参见例如，图4)。在一个实施方案中，接头为聚乙二醇(聚环氧乙烷)，其中‘n’可以是1或更大的任何整数。线性式为H-(O-CH2-CH2)n-OH，其中‘n’可以是任何整数，1至2500的范围对于此处呈现的应用是最理想的。PEG可以包括末端基团，例如，PEG可以以羟基、硫醇、甲氧基或其它烷氧基基团、甲基或其它烷基基团、芳基基团、羧酸、胺、酰胺、乙酰基、胍基或咪唑封端。考虑到的其它末端基团包括叠氮化物、炔烃、马来酰亚胺、醛、酰肼、羟胺或烷氧基胺部分。
[0083] 合适的接头也可以是硫醇封端的聚乙二醇(聚环氧乙烷)，其中‘n’可以是1至2500的任何整数(参见图5A-5B所示的示例性结构)。示例性的合适聚(乙二醇)二硫醇在Sigmaaldrich.com,Homobifunctional PEGs中有描述，其据此通过引用整体并入。图4显示了聚乙二醇(聚环氧乙烷)的通用结构，并且图5A-5B显示硫醇封端的聚乙二醇(聚环氧乙烷)的通用结构，其中‘n’可以是1至2500的任何整数。
[0084] 如上所述，接头和/或核也可以是有或无PEG的叶酸衍生物的偶联物。叶酸(叶酸)的通用结构如图9所示。通过将末端羧基改变为适当的部分(例如SH)，然后分别实现氨基硫醇或PEG的添加，可以合成叶酸与氨基硫醇或PEG的偶联物(Chen等人，“Folate-mediated intracellular drug delivery increases the anticancer efficacy of nanoparticulate formulation of arsenic trioxide,”Mol Cancer Ther 8(7):1955-63(2009)；Kang等人，“Folic acid-tethered Pep-1 peptide-conjugated liposomal nanocarrier for enhanced intracellular drug delivery to cancer cells:
conformational characterization and in vitro cellular uptake evaluation,”Int J Nanomed 8:1155-65(2013)，其各自据此通过引用整体并入)。叶酸偶联物提供了可与细胞表面上的叶酸受体相互作用并引发前药向细胞胞液主动运输的优点。
conformational characterization and in vitro cellular uptake evaluation,”Int J Nanomed 8:1155-65(2013)，其各自据此通过引用整体并入)。叶酸偶联物提供了可与细胞表面上的叶酸受体相互作用并引发前药向细胞胞液主动运输的优点。
[0085] 如上所述，接头和/或核也可以是精胺或精胺聚合物。通过将末端NH(2)基团改变为适当的部分(例如SH)，然后分别实现氨基硫醇或PEG的添加，可以合成精胺聚合物与氨基硫醇或PEG的偶联物。精胺聚合物的通用结构如图10所示。线性式为NH2C2H4(NC3H6NHC4H8)n-NHC3H6NH2，其中‘n’可以是等于或大于1的任何整数。精胺聚合物偶联物提供了可与细胞表面上的聚胺受体相互作用并引发前药向细胞胞液主动运输的优点。
[0086] 在某些实施方案中，接头可以附连至核形成巯基封端的聚乙二醇(参见例如，图6和8)。在某些实施方案中，接头可以附连至核形成巯基封端的多臂聚乙二醇的一条臂(参见例如，图6和8)。在某些实施方案中，氨基硫醇-偶联物是具有1至8条臂的硫醇封端的星形聚乙二醇。例如，接头可以附连至核形成硫醇封端的2臂PEG、3臂PEG、4臂PEG、6臂PEG和8臂PEG。参见例如，Sigmaaldrich.com上合适的PEG聚合物和树枝状聚合物，PEG树枝状聚合物和多臂PEG，其据此通过引用整体并入。
[0087] 图7中显示了通过二硫键与氨基硫醇偶联的硫醇封端的聚乙二醇的示例性结构，其中‘n1’可以是1至2500的任何整数并且‘n2’可以是可以容纳在核周围而不会引起不良空间位阻或干扰的任何数量的臂。在一个实施方案中，‘n1’可以是1至2500的任何整数并且‘n2’可以是1至8的任何整数。在某些实施方案中，图7中显示了通过二硫键与氨基硫醇偶联的硫醇封端的聚乙二醇，其中‘n1’可以是1至4的任何整数并且‘n2’可以是1至4的任何整数。参见例如，Sigmaaldrich.com上合适的PEG聚合物和树枝状聚合物，PEG树枝状聚合物和多臂PEG，其据此通过引用整体并入。在一个实施方案中，氨基硫醇-偶联物是通过二硫键与氨基硫醇偶联的4-臂、硫醇封端的星形聚乙二醇。在该实施方案中，通过二硫键与氨基硫醇偶联的4-臂、硫醇封端的星形聚乙二醇具有图7所示的结构，其中‘n2’为4。
[0088] 如本文所述，本文描述的前药是氨基硫醇-偶联物。式I的氨基硫醇-偶联物的氨基硫醇部分具有下式：
[0089]
[0090] 其中每个R1、R2和R3独立地选自氢和C1-6烷基，并且其中n为1至10的整数。可用于合成本文描述的氨基硫醇-偶联物的氨基硫醇(及其类似物)包括图3A和3B中所示的示例性通用结构的那些。例如，氨基硫醇的通用结构为：
[0091]
[0092] 其中X选自由-PO3H2、氢、巯基、硫、乙酰基、异丁酰基、新戊酰基和苯甲酰基组成的组；并且R1、R2和R3中的每一个独立地选自氢和C1-6烷基，并且其中n为1至10的整数。此外，可用于合成本文描述的氨基硫醇-偶联物的图3A-3B中所示通用氨基硫醇的活性部分的两个示例性结构其中X为氢。在某些实施方案中，氨基硫醇是氨磷汀(NH2(CH2)3NH(CH2)2SH)或phosphonol(CH3NH(CH2)3NH(CH2)2SH)的活性部分。
[0093] 本发明的另一方面涉及氨基硫醇-偶联物，其中 是聚合物核、树枝状聚合物核、具有内部树枝状结构(即分支)的树枝状聚合物核、治疗剂或治疗剂的衍生物。
[0094] 在一个实施方案中，核的分子量为100,000道尔顿或更小。
[0095] 树枝状聚合物已作为递送治疗剂的媒介物或作为体内成像的载体受到广泛研究(Lee等人，“Designing Dendrimers for Biological Applications,”Nat.Biotech.23(12):1517–26(2005)；Esfand和Tomalia，“Poly(amidoamine)(PAMAM)Dendrimers:From Biomimicry to Drug Delivery and Biomedical Applications,”Drug Discov.Today 6(8):427–36(2001)；Sadler&Tam,“Peptide Dendrimers:Applications and Synthesis,”Rev.Mol.Biotechnol.90:195–229(2002)；Cloninger,“Biological Applications of Dendrimers,”Curr.Opin.Chem.Biol.6:742–48(2002)；Niederhafner等人，“Peptide Dendrimers,”J.Peptide Sci.11:757–88(2005)；Tekade等人，“Dendrimers in Oncology:An Expanding Horizon,”Chem.Rev.109(1):49–87(2009)，其各自据此通过引用整体并入)。树枝状聚合物是具有明确定义的三维构造的高度支化大分子(GEORGE R.NEWKOME等人，DENDRIMERS AND DENDRONS:CONCEPTS,SYNTHESIS,APPLICATIONS(2001)，其据此通过引用整体并入)。树枝状聚合物的吸引力在于其独特的完美分支构造，这赋予了它们与相同组成和分子量的相应线性聚合物不同的特性(Lee等人，“Designing Dendrimers for
Biological Applications,”Nat.Biotech.23(12):1517–26(2005)，其据此通过引用整体并入)。随着树枝状聚合物代数的增加，它们会以指数形式增加末端的数量，而半径只会线性增加；因此，末端变得更加密集，使整个结构为球形，其中末端从中央核向外辐射。本领域已经描述了各种类型的酰胺树枝状聚合物核。合适的核包括Tarallo等人，Int’l
J.Nanomed.8:521–34(2013)；Carberry等人，Chem.Eur.J.1813678–85(2012)；Jung等人，Macromolecules 44:9075–83(2011)；Ornelas等人，J.Am.Chem.Soc.132:3923–31(2010)；
Ornelas等人，Chem.Commun.5710–12(2009)；Goyal等人，Adv.Synth.Catal.350:1816–22(2008)；和Yoon等人，Org.Lett.9:2051–54(2007)描述的那些，其各自据此通过引用整体并入。
Biological Applications,”Nat.Biotech.23(12):1517–26(2005)，其据此通过引用整体并入)。随着树枝状聚合物代数的增加，它们会以指数形式增加末端的数量，而半径只会线性增加；因此，末端变得更加密集，使整个结构为球形，其中末端从中央核向外辐射。本领域已经描述了各种类型的酰胺树枝状聚合物核。合适的核包括Tarallo等人，Int’l
J.Nanomed.8:521–34(2013)；Carberry等人，Chem.Eur.J.1813678–85(2012)；Jung等人，Macromolecules 44:9075–83(2011)；Ornelas等人，J.Am.Chem.Soc.132:3923–31(2010)；
Ornelas等人，Chem.Commun.5710–12(2009)；Goyal等人，Adv.Synth.Catal.350:1816–22(2008)；和Yoon等人，Org.Lett.9:2051–54(2007)描述的那些，其各自据此通过引用整体并入。
[0096] 考虑到了使用任何类型的树枝状聚合物，包括但不限于聚(酰胺基胺)(PAMAM)树枝状聚合物(例如致密星形聚合物和星放射状聚合物)、聚(酰胺基胺-有机硅)(PAMAMOS)树枝状聚合物、(聚(丙烯亚胺))(PPI)树枝状聚合物、舟形树枝状聚合物(tecto dendrimer)、多语言树枝状聚合物(multilingual dendrimer)、手性树枝状聚合物、混合树枝状聚合物/线性聚合物、两亲性树枝状聚合物、胶束树枝状聚合物和Fréchet型树枝状聚合物。
[0097] 本发明的另一方面涉及根据权利要求1所述的氨基硫醇-偶联物，其中 选自由
叶酸、叶酸衍生物、精胺聚合物和
精胺聚合物衍生物组成的组，其中a为0至2500；b为0至2500；c为0至2500；d为0至2500；R独立地选自氢、C1-6烷基和卤素；X是原子、分子或大分子；Y是多价基团、分子或原子。
叶酸、叶酸衍生物、精胺聚合物和
精胺聚合物衍生物组成的组，其中a为0至2500；b为0至2500；c为0至2500；d为0至2500；R独立地选自氢、C1-6烷基和卤素；X是原子、分子或大分子；Y是多价基团、分子或原子。
[0098] 本发明的另一方面涉及氨基硫醇-偶联物，其中X为O、S、C(R4))2或NR4，其中R4为氢或C1-6烷基。
[0099] 本发明的再一方面涉及具有以下结构的氨基硫醇-偶联物：
[0100]
[0101] 其中k为1至2500。
[0102] 本发明的另一方面涉及根据式I的氨基硫醇-偶联物，其中m为2至100,000。
[0103] 在一个实施方案中，氨基硫醇偶联物具有以下结构：
[0104]
[0105] 在某些实施方案中，根据本发明的氨基硫醇-偶联物不是下面式(V)或式(VI)的化合物：
[0106]
[0107] 其中X选自由-PO3H2、氢、乙酰基、异丁酰基、新戊酰基和苯甲酰基组成的组，其中R1、R2和R3中的每一个独立地选自由氢和C1-6烷基组成的组，其中n是值为1至10的整数。在一个实施方案中，根据本发明的氨基硫醇-偶联物不是氨磷汀。
[0108] 在某些实施方案中，根据本发明的氨基硫醇-偶联物不是式(V)或式(VI)的化合物，其中X是选自由以下组成的组的细胞内可裂解的保护基团：肽、含硫氨基酸、谷胱甘肽、含硫抗氧化剂、含氧抗氧化剂、光可逆性硫醇标签和(R)-叔丁基-2-[(叔丁氧基羰基)氨基]-3-(三苯甲基硫烷基)丙酸酯。
[0109] 在某些实施方案中，根据本发明的氨基硫醇-偶联物不是式(V)或式(VI)的化合物，其中X是受硫醇保护形式的氨基硫醇，其选自由氨基硫醇的同型二聚体、氨基硫醇和不同氨基硫醇的异二聚体和半胱胺组成的组。
[0110] 改进的巯基保护基团与氨基硫醇、其代谢产物和/或其类似物向需要治疗效果的细胞的细胞内药物递送系统组合应满足三个条件。第一，保护基团应该能够防止药物递送期间氨基硫醇的偶然反应；第二，保护基团应该可以通过靶细胞中并且特别是在细胞内环境和/或溶酶体内可用的系统或过程去除；并且第三，保护基团应该对动物和人细胞无毒。可以满足的其它所需条件包括(i)增加药物循环时间，(ii)使药物适于经由不适用于单独的氨基硫醇的机制进行细胞吸收，(iii)使药物适于通过细胞受体运输系统进行细胞内摄取(叶酸和聚胺运输系统是两个实例)及(iii)改变药物从循环和/或人体或动物体内清除的机制。
[0111] 氨基硫醇及其类似物容易与蛋白质和核酸反应，因此需要在需要反应的部位或附近释放活性部分，以达到药物的治疗效果。因为已经证实这些药物的治疗效果在细胞内发生而不是在细胞外，所以细胞内递送代表最佳递送部位。细胞内递送将优化活性药物代谢产物与靶细胞元件的反应机会，而不是与和治疗效果不相关的靶标(包括但不限于细胞外靶标)反应。
[0112] 为了改变相应硫代磷酸酯的药代动力学和药效学，将治疗性氨基硫醇与另一种分子偶联是可用于改变或增强氨基硫醇向应激或病变细胞的递送及其在应激或病变细胞中的活化的方法。为满足这些目标，可以使用完全或部分由PEG或同等生物相容性材料组成的聚合物或共聚物，包括树枝状聚合物，所述聚合物或共聚物被设计用于改变和改善药物药代动力学和药效学，并且也适于细胞摄取和细胞内递送氨基硫醇。下文介绍了通过使用由与本文描述的偶联物键合的氨基硫醇部分组成的药物调配物来解决这些问题的方法。此类调配物可以单独使用或者可以与另外的方法组合以实现最佳的胞质内药物递送和药物功效。
[0113] 已经由其他人开发了细胞内递送方法和组合物用于实现其它药物分子的细胞内递送。那些方法和组合物中的一些(例如，本文明确描述或引用的那些)可用于实现氨基硫醇的细胞内递送。然而，据信先前没有人提出将此类组合物和方法连同氨基硫醇一起使用。因此，其他人已经描述的用于保护活性药物实体的巯基的组合物和方法可用于促进氨基硫醇化合物的细胞内递送，即使那些组合物和方法不在本公开明确描述的那些之中。
[0114] 作为称为硫代磷酸酯的药物类别的代表，氨磷汀是由治疗活性氨基硫醇WR1065和通过键与氨基硫醇的巯基基团偶联的磷酸基团组成的非活性前药。这种前药具有特定的药代动力学和药效学特征，使其适合递送至人和其它动物的许多但非全部正常细胞(即非应激或病变细胞)并由其活化。然而，这些特征不适于将前药递送至大多数应激或病变细胞并由其活化。因此，为了实现氨基硫醇的治疗益处，需要含有氨基硫醇并且可以在应激和/或疾病的生理条件下向应激或患病细胞释放氨基硫醇的新前药。
[0115] 在下面的讨论中，术语‘氨磷汀’和‘WR-1065’(氨磷汀的活性部分)将用作所有硫代磷酸酯、氨基硫醇、其类似物和母体药物(前药)的活性代谢产物的代表性实例。
[0116] 氨磷汀是一种在体内代谢为其活性部分WR-1065的硫代磷酸酯(Grdina等人，“Thiol and Disulfide Metabolites of the Radiation Protector and Potential Chemopreventive Agent WR-2721 are Linked to Both its Anti-Cytotoxic and Anti-Mutagenic Mechanisms of Action,”Carcinogenesis 16:767-774(1995)；Purdie等人，“Interaction of Cultured Mammalian Cells with WR-2721 and its Thiol,WR-1065:
Implications for Mechanisms of Radioprotection ,”
Int.J.Radiat.Biol.Relat.Stud.Phys.Chem.Med.43:517-527(1983)；Shaw等人，
“Pharmacokinetic Profile of Amifostine,”Semin.Oncol.23:18-22(1996)，其各自据此通过引用整体并入)。WR1065的巯基部分参与其治疗效果(Grdina等人，“Amifostine:
Mechanisms of Action Underlying Cytoprotection and Chemoprevention,”Drug
Metabol.Drug Interact.16:237-279(2000)；Grdina等人，“Differential Activation of Nuclear Transcription Factor Kappab,Gene Expression,and Proteins by
Amifostine's Free Thiol in Human Microvascular Endothelial and Glioma Cells,”Semin.Radiat.Oncol.12:103-111(2002)；Grdina等人，“Relationships between
Cytoprotection and Mutation Prevention by WR-1065,”Mil Med 167:51-53(2002)；
Grdina等人，“Radioprotectors:Current Status and New Directions,”
Radiat.Res.163:704-705(2002)，其据此通过引用整体并入)，并且因此，该部分在药物递送期间需要保护免于偶然反应并且直至药物被吸收到细胞内环境中，并且在氨磷汀的情况下这种保护由磷酸基团提供。使药物靠近细胞质膜和/或药物被吸收到质膜中时，磷酸基团被去除。去磷酸化步骤通过膜结合碱性磷酸酶进行，所述碱性磷酸酶是由许多但非所有人和动物细胞产生的酶。去除磷酸基团后，活性部分被吸收到细胞内环境中，从中可将其进一步分配到亚细胞器或其它细胞中，并在那里诱导治疗效果。许多但非所有形式的氨基硫醇的细胞摄取都是通过被动扩散而发生的，但是一些药物形式是通过聚胺运输系统的主动运输吸收的，并且其它药物形式的主动运输可能在一些药物浓度下发生，但在其它药物浓度下不会发生(Grdina等人，“Differential Activation of Nuclear Transcription
Factor Kappab,Gene Expression,and Proteins By Amifostine's Free Thiol in
Human Microvascular Endothelial and Glioma Cells,”Semin.Radiat.Oncol.12:103-
111(2002)；Grdina等人，“Relationships between Cytoprotection and Mutation Prevention by WR-1065,”Mil Med167:51-53(2002)；Grdina等人，“Radioprotectors:
Current Status and New Directions,”Radiat.Res.163:704-705(2002)，其各自据此通过引用整体并入)。对于不能吸收药物和/或不能代谢药物的细胞，可以通过细胞和组织分布过程将活性形式递送至这些细胞。先前已知的用于向人或动物施用硫代磷酸酯的方法包括但不限于口服递送、腹膜内注射、皮下注射、静脉内注射、吸入、并入纳米颗粒中
(Pamujula等人，“Oral Delivery of Spray Dried PLGA/Amifostine Nanoparticles,”J.Pharm.Pharmacol.56:1119-1125(2004)；Pamujula等人，“Preparation and In Vitro Characterization of Amifostine Biodegradable Microcapsules,”
Eur.J.Pharm.Biopharm.57:213-218(2004)；Pamujula等人，“Radioprotection in Mice Following Oral Delivery of Amifostine Nanoparticles,”Int.J.Radiat.Biol.81:
251-257(2005)，其各自据此通过引用整体并入)，或使用其它药物递送系统(Gu等人，“Tailoring Nanocarriers for Intracellular Protein Delivery,”Chem.Soc.Rev.40:
3638-3655(2011)；Hoffman等人，“The Origins and Evolution of“Controlled”Drug Delivery Systems,”J.of Controlled Release 132:153-163(2008)；Imbuluzqueta等人，“Novel Bioactive Hydrophobic Gentamicin Carriers for the Treatment of
Intracellular Bacterial Infections,”Acta.Biomater.7:1599-1608(2011)；Leucuta等人，“Systemic and Biophase Bioavailability and Pharmacokinetics of
Nanoparticulate Drug Delivery Systems,”Curr.Drug Del.10:208-240(2013)；Patel等人，“Recent Developments in Protein and Peptide Parenteral Delivery
Approaches,”Ther.Delivery 5:337-365(2014)；Patel等人，“Particle Engineering to Enhance or Lessen Particle Uptake by Alveolar Macrophages and to Influence the Therapeutic Outcome,”Eur.J.Pharm.Biopharm.89:163-174(2015)；Sakagami,
“Systemic Delivery of Biotherapeutics through the Lung:Opportunities and
Challenges for Improved Lung Absorption,”Ther.Del.4:1511-1525(2013)；
Torchilin,“Recent Approaches to Intracellular Delivery of Drugs and DNA and Organelle Targeting,”Ann.Rev.Biomed.Eng.8:343-375(2006)，其各自据此通过引用整体并入)。
Implications for Mechanisms of Radioprotection ,”
Int.J.Radiat.Biol.Relat.Stud.Phys.Chem.Med.43:517-527(1983)；Shaw等人，
“Pharmacokinetic Profile of Amifostine,”Semin.Oncol.23:18-22(1996)，其各自据此通过引用整体并入)。WR1065的巯基部分参与其治疗效果(Grdina等人，“Amifostine:
Mechanisms of Action Underlying Cytoprotection and Chemoprevention,”Drug
Metabol.Drug Interact.16:237-279(2000)；Grdina等人，“Differential Activation of Nuclear Transcription Factor Kappab,Gene Expression,and Proteins by
Amifostine's Free Thiol in Human Microvascular Endothelial and Glioma Cells,”Semin.Radiat.Oncol.12:103-111(2002)；Grdina等人，“Relationships between
Cytoprotection and Mutation Prevention by WR-1065,”Mil Med 167:51-53(2002)；
Grdina等人，“Radioprotectors:Current Status and New Directions,”
Radiat.Res.163:704-705(2002)，其据此通过引用整体并入)，并且因此，该部分在药物递送期间需要保护免于偶然反应并且直至药物被吸收到细胞内环境中，并且在氨磷汀的情况下这种保护由磷酸基团提供。使药物靠近细胞质膜和/或药物被吸收到质膜中时，磷酸基团被去除。去磷酸化步骤通过膜结合碱性磷酸酶进行，所述碱性磷酸酶是由许多但非所有人和动物细胞产生的酶。去除磷酸基团后，活性部分被吸收到细胞内环境中，从中可将其进一步分配到亚细胞器或其它细胞中，并在那里诱导治疗效果。许多但非所有形式的氨基硫醇的细胞摄取都是通过被动扩散而发生的，但是一些药物形式是通过聚胺运输系统的主动运输吸收的，并且其它药物形式的主动运输可能在一些药物浓度下发生，但在其它药物浓度下不会发生(Grdina等人，“Differential Activation of Nuclear Transcription
Factor Kappab,Gene Expression,and Proteins By Amifostine's Free Thiol in
Human Microvascular Endothelial and Glioma Cells,”Semin.Radiat.Oncol.12:103-
111(2002)；Grdina等人，“Relationships between Cytoprotection and Mutation Prevention by WR-1065,”Mil Med167:51-53(2002)；Grdina等人，“Radioprotectors:
Current Status and New Directions,”Radiat.Res.163:704-705(2002)，其各自据此通过引用整体并入)。对于不能吸收药物和/或不能代谢药物的细胞，可以通过细胞和组织分布过程将活性形式递送至这些细胞。先前已知的用于向人或动物施用硫代磷酸酯的方法包括但不限于口服递送、腹膜内注射、皮下注射、静脉内注射、吸入、并入纳米颗粒中
(Pamujula等人，“Oral Delivery of Spray Dried PLGA/Amifostine Nanoparticles,”J.Pharm.Pharmacol.56:1119-1125(2004)；Pamujula等人，“Preparation and In Vitro Characterization of Amifostine Biodegradable Microcapsules,”
Eur.J.Pharm.Biopharm.57:213-218(2004)；Pamujula等人，“Radioprotection in Mice Following Oral Delivery of Amifostine Nanoparticles,”Int.J.Radiat.Biol.81:
251-257(2005)，其各自据此通过引用整体并入)，或使用其它药物递送系统(Gu等人，“Tailoring Nanocarriers for Intracellular Protein Delivery,”Chem.Soc.Rev.40:
3638-3655(2011)；Hoffman等人，“The Origins and Evolution of“Controlled”Drug Delivery Systems,”J.of Controlled Release 132:153-163(2008)；Imbuluzqueta等人，“Novel Bioactive Hydrophobic Gentamicin Carriers for the Treatment of
Intracellular Bacterial Infections,”Acta.Biomater.7:1599-1608(2011)；Leucuta等人，“Systemic and Biophase Bioavailability and Pharmacokinetics of
Nanoparticulate Drug Delivery Systems,”Curr.Drug Del.10:208-240(2013)；Patel等人，“Recent Developments in Protein and Peptide Parenteral Delivery
Approaches,”Ther.Delivery 5:337-365(2014)；Patel等人，“Particle Engineering to Enhance or Lessen Particle Uptake by Alveolar Macrophages and to Influence the Therapeutic Outcome,”Eur.J.Pharm.Biopharm.89:163-174(2015)；Sakagami,
“Systemic Delivery of Biotherapeutics through the Lung:Opportunities and
Challenges for Improved Lung Absorption,”Ther.Del.4:1511-1525(2013)；
Torchilin,“Recent Approaches to Intracellular Delivery of Drugs and DNA and Organelle Targeting,”Ann.Rev.Biomed.Eng.8:343-375(2006)，其各自据此通过引用整体并入)。
[0117] 氨磷汀在被细胞膜结合的碱性磷酸酶代谢之前是无活性的，碱性磷酸酶去除了磷酸基团，从而释放WR1065及其游离巯基以摄入细胞内(Capizzi“,The Preclinical Basis for Broad-Spectrum Selective Cytoprotection of Normal Tissues from Cytotoxic Therapies by Amifostine(Ethyol),”Eur.J.Cancer 32A:增刊4:S5-16(1996)；Shaw等人，“Pharmacokinetic Profile of Amifostine,”Semin.Oncol.23:18-22(1996)；Yu等人，“The Radioprotective Agent,Amifostine,Suppresses the Reactivity of Intralysosomal Iron,”Redox Report:Communications in Free Radical Research 8:
347-355(2003)，其各自据此通过引用整体并入)。氨磷汀在病变或应激细胞中几乎没有活性，因为包括病原体感染的细胞、肿瘤细胞和转移细胞微环境中的细胞在内的许多病变细胞几乎不产生膜结合的酶，但可以并且常常确实产生了大量各种碱性磷酸酶同功酶
(Guerreiro等人，“Distinct Modulation of Alkaline Phosphatase Isoenzymes by
17beta-Estradiol and Xanthohumol in Breast Cancer MCF-7Cells”,
Clin.Biochem.40:268-273(2007)；Kato等人，“Effect of Hyperosmolality on Alkaline Phosphatase and Stress-Response Protein 27 of MCF-7 Breast Cancer Cells,”
Breast Cancer Res Treat.23:241-249(1992)；Van Hoof等人，“Interpretation and Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzyme Patterns,”Crit.Rev.in Clin.Lab.Sci.31:197-293(1994)；Walach等人，“Leukocyte Alkaline Phosphatase,CA15-3,CA125,and CEA in Cancer Patients,”Tumori 84:360-363，其各自据此通过引用整体并入)，所述碱性磷酸酶同功酶释放到细胞外环境或循环中，使得氨磷汀生物活化距靶细胞较远。质膜结合的碱性磷酸酶是由一些但非全部细胞类型表达的GPI锚定蛋白(Marty等人，“Effect of Anti-Alkaline Phosphatase Monoclonal Antibody on B Lymphocyte Function,”Immunol.Lett.38:87-95(1993)，其据此通过引用整体并入)。GPI锚定蛋白合成中的缺陷可由GPI锚定蛋白合成所必需的关键基因的突变或表观遗传学改变引起并且高比率的突变诱导和表观遗传学改变在癌症中常见并已报道发生在关键GPI锚定蛋白合成基因中(Dobo等人，“Defining EMS and ENU Dose-Response Relationships using the Pig-a Mutation Assay in Rats,”Mutat.Res.725:13-21(2011)；Dobrovolsky等人，“Detection of In Vivo Mutation in the Hprt and Pig-a Genes of Rat Lymphocytes,”Methods Mol.Biol.1044:79-95(2013)，其各自据此通过引用整体并入)。碱性磷酸酶也存在于细胞内的粗面内质网中(碱性磷酸酶在粗面内质网中合成)，可以发生额外加工的高尔基体中，高尔基体来源的囊泡中，一些溶酶体中以及核膜周围(Tokumitsu等人，“Alkaline
Phosphatase Biosynthesis in the Endoplasmic Reticulum and its Transport
Through the Golgi Apparatus to the Plasma Membrane:Cytochemical Evidence,”J.Histochem.Cytochem.31:647-655(1983)，其据此通过引用整体并入)。其定位随活化B淋巴细胞中的细胞周期而变化(Souvannavong等人，“Expression and Visualization
During Cell Cycle Progression of Alkaline Phosphatase in B Lymphocytes from C3H/HeJ Mice,”J.Leukocyte Biol.55:626-632(1994)，其据此通过引用整体并入)，合成大致发生在细胞周期的有丝分裂期(Tokumitsu等人，“Immunocytochemical
Demonstration of Intracytoplasmic Alkaline Phosphatase in HeLa TCRC-1Cells,”J.Histochem.Cytochem.29:1080-1087(1981)，其据此通过引用整体并入)。质膜结合的碱性磷酸酶依赖于正确的微管组织以实现其在细胞膜中的正确定向(Gilbert等人，
“Microtubular Organization and its Involvement in the Biogenetic Pathways of Plasma Membrane Proteins in Caco-2 Intestinal Epithelial Cells,”
J.Cell.Biol.113:275-288(1991)，其据此通过引用整体并入)，并且微管组织在癌细胞和病毒感染的细胞中可以改变(Nyce,“Drug-Induced DNA Hypermethylation and Drug Resistance in Human Tumors,”Cancer Res.49:5829-5836(1989)；Oshimura等人，
“Chemically Induced Aneuploidy in Mammalian Cells:Mechanisms and Biological Significance in Cancer,”Environ.Mutagen.8:129-159(1986)，其据此通过引用整体并入)。
347-355(2003)，其各自据此通过引用整体并入)。氨磷汀在病变或应激细胞中几乎没有活性，因为包括病原体感染的细胞、肿瘤细胞和转移细胞微环境中的细胞在内的许多病变细胞几乎不产生膜结合的酶，但可以并且常常确实产生了大量各种碱性磷酸酶同功酶
(Guerreiro等人，“Distinct Modulation of Alkaline Phosphatase Isoenzymes by
17beta-Estradiol and Xanthohumol in Breast Cancer MCF-7Cells”,
Clin.Biochem.40:268-273(2007)；Kato等人，“Effect of Hyperosmolality on Alkaline Phosphatase and Stress-Response Protein 27 of MCF-7 Breast Cancer Cells,”
Breast Cancer Res Treat.23:241-249(1992)；Van Hoof等人，“Interpretation and Clinical Significance of Alkaline Phosphatase Isoenzyme Patterns,”Crit.Rev.in Clin.Lab.Sci.31:197-293(1994)；Walach等人，“Leukocyte Alkaline Phosphatase,CA15-3,CA125,and CEA in Cancer Patients,”Tumori 84:360-363，其各自据此通过引用整体并入)，所述碱性磷酸酶同功酶释放到细胞外环境或循环中，使得氨磷汀生物活化距靶细胞较远。质膜结合的碱性磷酸酶是由一些但非全部细胞类型表达的GPI锚定蛋白(Marty等人，“Effect of Anti-Alkaline Phosphatase Monoclonal Antibody on B Lymphocyte Function,”Immunol.Lett.38:87-95(1993)，其据此通过引用整体并入)。GPI锚定蛋白合成中的缺陷可由GPI锚定蛋白合成所必需的关键基因的突变或表观遗传学改变引起并且高比率的突变诱导和表观遗传学改变在癌症中常见并已报道发生在关键GPI锚定蛋白合成基因中(Dobo等人，“Defining EMS and ENU Dose-Response Relationships using the Pig-a Mutation Assay in Rats,”Mutat.Res.725:13-21(2011)；Dobrovolsky等人，“Detection of In Vivo Mutation in the Hprt and Pig-a Genes of Rat Lymphocytes,”Methods Mol.Biol.1044:79-95(2013)，其各自据此通过引用整体并入)。碱性磷酸酶也存在于细胞内的粗面内质网中(碱性磷酸酶在粗面内质网中合成)，可以发生额外加工的高尔基体中，高尔基体来源的囊泡中，一些溶酶体中以及核膜周围(Tokumitsu等人，“Alkaline
Phosphatase Biosynthesis in the Endoplasmic Reticulum and its Transport
Through the Golgi Apparatus to the Plasma Membrane:Cytochemical Evidence,”J.Histochem.Cytochem.31:647-655(1983)，其据此通过引用整体并入)。其定位随活化B淋巴细胞中的细胞周期而变化(Souvannavong等人，“Expression and Visualization
During Cell Cycle Progression of Alkaline Phosphatase in B Lymphocytes from C3H/HeJ Mice,”J.Leukocyte Biol.55:626-632(1994)，其据此通过引用整体并入)，合成大致发生在细胞周期的有丝分裂期(Tokumitsu等人，“Immunocytochemical
Demonstration of Intracytoplasmic Alkaline Phosphatase in HeLa TCRC-1Cells,”J.Histochem.Cytochem.29:1080-1087(1981)，其据此通过引用整体并入)。质膜结合的碱性磷酸酶依赖于正确的微管组织以实现其在细胞膜中的正确定向(Gilbert等人，
“Microtubular Organization and its Involvement in the Biogenetic Pathways of Plasma Membrane Proteins in Caco-2 Intestinal Epithelial Cells,”
J.Cell.Biol.113:275-288(1991)，其据此通过引用整体并入)，并且微管组织在癌细胞和病毒感染的细胞中可以改变(Nyce,“Drug-Induced DNA Hypermethylation and Drug Resistance in Human Tumors,”Cancer Res.49:5829-5836(1989)；Oshimura等人，
“Chemically Induced Aneuploidy in Mammalian Cells:Mechanisms and Biological Significance in Cancer,”Environ.Mutagen.8:129-159(1986)，其据此通过引用整体并入)。
[0118] 在所有细胞类型或所有细胞状态或条件下，碱性磷酸酶定位和表达都不一致，而是高度可变的。一些需要药物递送的细胞不会产生膜结合的碱性磷酸酶，或仅在有限条件下产生，或者仅在持续时间有限的发育阶段产生。在一些疾病状态下，例如炎症、感染或肿瘤转化期间，膜结合的碱性磷酸酶的表达和定位改变。碱性磷酸酶在一些感染性条件期间作为对病原体的一般响应而释放到细胞外环境中(Murthy等人，“Alkaline Phosphatase Band-10 Fraction as a Possible Surrogate Marker for Human Immunodeficiency Virus Type 1 Infection in Children,”Arch.Path.&Lab.Med.118:873-877(1994)，其据此通过引用整体并入)。活化B淋巴细胞可使碱性磷酸酶流入周围细胞环境中(Burg等人，“Late Events in B Cell Activation.Expression Of Membrane Alkaline Phosphatase Activity,”J.Immunol.142:381-387(1989)，其据此通过引用整体并入)并且碱性磷酸酶也存在于血清中。碱性磷酸酶在静止的B淋巴细胞中不表达；在活性和非活性T淋巴细胞中也不表达。碱性磷酸酶释放到细胞外环境中可导致硫代磷酸酯在距细胞膜一定距离处代谢成其活性代谢产物。这种现象减少了细胞的摄取，增加了代谢产物参与非治疗性反应的可用性，并使活性部分可用于进一步代谢成具有细胞毒性作用的醛和其它化合物。
[0119] 氨磷汀的活性形式(WR-1065)必须存在于细胞内才能观察到有益效果。WR-2721(氨磷汀)、WR-1065、WR-33278、WR-1065-半胱氨酸和母体化合物WR-2721的其它二硫化物形式如果存在于V79细胞外，则未显示出活性迹象(Smoluk等人，“Radioprotection of Cells in Culture by WR-2721 and Derivatives:Form of the Drug Responsible for Protection,”Cancer Res.48:3641-3647(1988)，其据此通过引用整体并入)。相反，WR-
1065的细胞内水平与对γ-辐射的显著防护相关。HeLa细胞、me-180细胞、卵巢2008细胞、HT-29/SP-1d细胞和Colo 395肿瘤细胞系的结果类似(Smoluk等人，“Radioprotection of Cells in Culture by WR-2721 and Derivatives:Form of the Drug Responsible for Protection,”Cancer Res.48:3641-3647(1988)，其据此通过引用整体并入)。为了最佳的细胞保护，足够且持续的WR-1065(氨磷汀的活性形式)的细胞内水平是必需的(Souid等人，“Determination of the Cytoprotective Agent WR-2721(Amifostine,Ethyol)and its Metabolites in Human Blood using Monobromobimane Fluorescent Labeling and
High-Performance Liquid Chromatography,”Cancer Chemother.Pharmacol.42:400-406(1998)，其据此通过引用整体并入)。如果在暴露于辐射之前将细胞转移到无药培养基中4小时，则WR-1065和WR-33278的细胞内水平随着免于辐射损伤的细胞保护而显著降低
(Grdina等人，“Thiol and Disulfide Metabolites of the Radiation Protector and Potential Chemopreventive Agent WR-2721 are Linked to Both its Anti-Cytotoxic and Anti-Mutagenic Mechanisms of Action,”Carcinogenesis 16:767-774(1995)，其据此通过引用整体并入)。WR-1065的体内组织水平在猴和人中相似，并且药物的组织水平为细胞保护作用提供了信息(Cassatt等人，“Preclinical Modeling of Improved
Amifostine(Ethyol)use in Radiation Therapy,”Semin.Radiat.Oncol.12:97-102
(2002)；Shaw等人，“Metabolic pathways of WR-2721(ethyol,amifostine)in the BALB/c mouse,”Drug Metab Dispos.22:895-902(1994)，其各自据此通过引用整体并入)。
1065的细胞内水平与对γ-辐射的显著防护相关。HeLa细胞、me-180细胞、卵巢2008细胞、HT-29/SP-1d细胞和Colo 395肿瘤细胞系的结果类似(Smoluk等人，“Radioprotection of Cells in Culture by WR-2721 and Derivatives:Form of the Drug Responsible for Protection,”Cancer Res.48:3641-3647(1988)，其据此通过引用整体并入)。为了最佳的细胞保护，足够且持续的WR-1065(氨磷汀的活性形式)的细胞内水平是必需的(Souid等人，“Determination of the Cytoprotective Agent WR-2721(Amifostine,Ethyol)and its Metabolites in Human Blood using Monobromobimane Fluorescent Labeling and
High-Performance Liquid Chromatography,”Cancer Chemother.Pharmacol.42:400-406(1998)，其据此通过引用整体并入)。如果在暴露于辐射之前将细胞转移到无药培养基中4小时，则WR-1065和WR-33278的细胞内水平随着免于辐射损伤的细胞保护而显著降低
(Grdina等人，“Thiol and Disulfide Metabolites of the Radiation Protector and Potential Chemopreventive Agent WR-2721 are Linked to Both its Anti-Cytotoxic and Anti-Mutagenic Mechanisms of Action,”Carcinogenesis 16:767-774(1995)，其据此通过引用整体并入)。WR-1065的体内组织水平在猴和人中相似，并且药物的组织水平为细胞保护作用提供了信息(Cassatt等人，“Preclinical Modeling of Improved
Amifostine(Ethyol)use in Radiation Therapy,”Semin.Radiat.Oncol.12:97-102
(2002)；Shaw等人，“Metabolic pathways of WR-2721(ethyol,amifostine)in the BALB/c mouse,”Drug Metab Dispos.22:895-902(1994)，其各自据此通过引用整体并入)。
[0120] 总之，依赖于称为硫代磷酸酯的药物调配物来递送其治疗活性代谢产物氨基硫醇与几个重要问题相关，包括(1)一些细胞类型，包括但不限于应激或病变细胞，无法将药物代谢成其活性形式，(2)在一些生理或疾病条件下无法活化/代谢药物，(3)在不需要其活性的环境中活化药物，(4)在距最佳细胞或亚细胞环境的一定距离处活化药物，(5)在产物易代谢为毒素的环境中活化，以及(6)缺乏实现靶向细胞递送或靶向细胞排除的能力。这些问题对在应激或病变细胞中获得疗效的能力有不利影响。
[0121] 总之，这些发现支持下述结论：依赖于磷酸基团在递送期间保护氨基硫醇的巯基部分和依赖于碱性磷酸酶将母体药物代谢为其活性部分具有可能对药物效力有不利影响的显著缺点。上述考虑证明需要新的药物调配物。本文描述了用于实现这些结果的方法。
[0122] 应该满足三个标准才能解决上述问题。巯基是高度反应性部分，其将与活生物体体内和细胞内存在的各种部分形成共价键。因此，含有一个或多个在那些药物的药理作用中起作用的巯基的治疗性药物需要在递送期间保护巯基部分以防止和与药物预期疗效无关的邻近分子反应。为了实现这种保护，可以使用任何分子基团，只要其满足以下要求：(i)在递送期间达到预期保护效果，(ii)易于细胞摄取到细胞溶质内，(iii)可以在细胞内去除，(iv)对细胞无毒(在从活性氨基硫醇部分去除之前或之后)，并且(v)鉴于前药在循环中的半衰期，在可以实现的一定时间范围内(即在可接受的时间范围内)达到细胞内治疗性氨基硫醇水平。
[0123] 在可接受的时间范围内以治疗性细胞内水平实现细胞内药物递送的任何方法(包括但不限于递送至细胞内细胞器)将用于将氨基硫醇药物递送至需要其活性并且它们将具有有益作用的环境中。也就是说，在本公开中进行的观察重要地涉及认识到细胞内递送细胞内可裂解的氨基硫醇保护部分偶联物对氨基硫醇的施用具有有益影响。在本公开中进行的观察还涉及认识到，相对于细胞外递送氨基硫醇化合物的相应硫代磷酸酯，细胞内递送(不管用何种方法实现的)具有反应活性部分的氨基硫醇化合物是有利的。
[0124] 由于氨基硫醇公认的毒性，靶向细胞递送和/或靶向细胞排除是期望的。对于通过某些方法递送例如口服递送或吸入递送，递送方法或系统应该是能够保护药物免于药物将会通过的器官内腔中发现的酶降解和/或与之反应的递送方法或系统。因此，对于口服递送，所述方法必须实现对胃肠道的内腔酶和因子的防护，并且对于吸入递送，所述方法必须防止被呼吸道渗出物/分泌物的降解。
[0125] 靶向药物递送可以是被动的或主动的(Banerjee等人，“Poly(ethylene glycol)-prodrug conjugates:concept,design,and applications,”J Drug Deliv 2012:1-17(2012)，其据此通过引用整体并入)。高渗透长滞留(EPR)效应通过释放药物或导致药物在靶位点外积聚而实现被动药物靶向，并且其依赖于改变的环境条件。EPR效应利用肿瘤和发炎区域的高渗透性脉管系统和减少的淋巴引流来增加这些区域的药物积聚，从而提供被动靶向。主动靶向基于利用配体-受体、抗原-抗体、酶底物(生物对)之间的潜在相互作用。靶向剂通过偶联化学附连至前药的表面。常见靶向部分的实例包括具有作为其生物对的受体、选择蛋白、抗原或由细胞或器官表达的mRNA的肽配体、糖残基、抗体或适配体。例如，促黄体激素释放激素肽用于靶向由几种癌细胞过表达的受体。添加的基团可以是充当受体的配体和/或触发受体介导的内吞作用的基团。
[0126] 最后，为了实现药物活化，任何用于保护氨基硫醇的巯基的基团必须是一旦药物成功递送至靶细胞和/或非靶细胞的细胞质中就可以释放或去除的基团。
[0127] 如本文所述，药物的活性形式在递送期间受到保护，并且希望一旦递送完成就获得氨基硫醇的释放。一般而言，可以使用在递送期间提供对氨基硫醇巯基的保护，在递送至所需部位之后导致药物活性形式在细胞内释放并且产生治疗性细胞内药物水平的任何组合物或方法。在细胞内递送之前保护氨基硫醇的巯基部分对于获得这些药物的治疗益处是必需的。因为保护系统应具有一旦实现细胞质内递送就能够释放药物的活性部分的特征，所以一起讨论了解决递送期间的保护和递送之后的释放的系统。
[0128] 对于本文描述的偶联物，共同特征包括以下。氨基硫醇通过介于氨基硫醇的巯基和偶联物上的巯基之间，或在多臂聚合物/共聚物的一条或多条臂的末端处，或在分支树枝状聚合物的一个或多个分支的末端处的生物可还原二硫键与偶联物键合。二硫键可通过硫醇-二硫化物交换反应还原，该反应主要在细胞溶质和靶细胞的细胞溶质条件中起作用，但在细胞外或循环条件下不起作用(Navath等人，“Stimuli-Responsive Star Poly(Ethylene Glycol)Drug Conjugates for Improved Intracellular Delivery of the Drug in Neuroinflammation,”J.Controlled Release 142:447-456(2010)，其据此通过引用整体并入)。可以使用连接氨基硫醇与偶联物的并且可以通过细胞过程、反应、酶或其它元素还原的与巯基形成的键。二硫键或其它连接键的还原导致氨基硫醇释放，从而可以实现其疗效。基于聚合物/共聚物中重复单元的数量和/或树枝状聚合物中分支和重复单元的数量，偶联物可以具有线性、分支或树枝状构造并且偶联物的分子量可以从低到高变化。
偶联物可能有或可能没有生物活性。
偶联物可能有或可能没有生物活性。
[0129] 满足这些条件的偶联物包括以下物质：
[0130] (i)完全或部分由聚环氧乙烷(PEG)组成的偶联物(Bondar等人，“Lipid-Like Trifunctional Block Copolymers of Ethylene Oxide and Propylene Oxide:Effective and Cytocompatible Modulators of Intracellular Drug Delivery,”
Int.J.Pharm.461:97-104.(2014)；Khorsand等人，“Intracellular Drug Delivery Nanocarriers of Glutathione-Responsive Degradable Block Copolymers Having
Pendant Disulfide Linkages,”Biomacromolecules 14:2103-2111(2013)，其各自据此通过引用整体并入)。如上所述的其它特征适用。
Int.J.Pharm.461:97-104.(2014)；Khorsand等人，“Intracellular Drug Delivery Nanocarriers of Glutathione-Responsive Degradable Block Copolymers Having
Pendant Disulfide Linkages,”Biomacromolecules 14:2103-2111(2013)，其各自据此通过引用整体并入)。如上所述的其它特征适用。
[0131] (ii)完全或部分由叶酸组成的偶联物。
[0132] (iii)完全或部分由精胺或精胺聚合物组成的偶联物。
[0133] (iv)含有巯基部分的生物相容性部分，巯基部分可以通过可还原二硫键与氨基硫醇的巯基偶联。应该注意的是，可以与氨基硫醇的巯基部分偶联并且可以满足上述条件和要求的不同部分的数量可能非常大，并且由于新研究可以在未来继续扩大。从这一大类看，具有以下特征的部分可以充当与治疗性氨基硫醇偶联的保护基团：(a)分子量为100,000道尔顿或更小的部分，(b)由生物相容性、无毒材料组成的部分，(c)易于细胞摄取的部分，在6
前药的循环半衰期内其比率达到每10个细胞1微摩尔或更低范围的细胞内氨基硫醇水平，和(d)在产生氨基硫醇疗效的剂量水平下不易转化为毒素或具有低毒性的部分。
前药的循环半衰期内其比率达到每10个细胞1微摩尔或更低范围的细胞内氨基硫醇水平，和(d)在产生氨基硫醇疗效的剂量水平下不易转化为毒素或具有低毒性的部分。
[0134] (v)应该注意的是，上面列出的药物递送系统可以彼此组合使用。还可以对其进一步工程改造以提供靶向细胞或组织类型递送或靶向细胞/组织类型排除。另外，正在频繁开发新的纳米递送系统，并且用于形成纳米药物递送媒介物的各种材料正在迅速扩大。
[0135] 下文描述了由氨基硫醇或氨基硫醇类似物和PEG聚合物、含PEG的共聚物或树枝状聚合物组成的前药的合成方法。
[0136] 一般而言，必须完成以下步骤才能使偶联物与氨基硫醇或氨基硫醇类似物的巯基键合。首先，必须保护氨基硫醇的胺基免于反应；这个过程被称为‘bocing’，并且可以使用各种不同的保护基团进行。必须满足的一个条件是作为合成的最后一步，保护基团必须可通过不损害聚合物、共聚物或树枝状聚合物或前药的氨基硫醇组分的机制去除。在第二步中，氨基硫醇的巯基通过偶联物的巯基和氨基硫醇的巯基之间的二硫键与中间体键合。在第三步中，该二硫化物与聚合物、共聚物或树枝状聚合物反应。这些偶联物必须在分子的一端(对于线性聚合物或共聚物而言)或在一条或多条臂的末端(对于多臂聚合物或共聚物而言)或在树枝状聚合物分支的末端具有至少一个巯基。在最后一步中，必须使用不损害新合成的前药结构的方法去除胺保护基团。
[0137] 本发明的氨基硫醇-偶联物可以根据下面概述的方案制备。
[0138] 方案1.
[0139]
[0140] i)二硫吡啶(TP-TP)(2)；ii)4-臂-PEG-硫醇(MW 10kDal)(4)。
[0141]
[0142] 方案1中示出了4-星-PEG-S-S-WR1065偶联物(5)的合成。WR1065二盐酸盐(1)与二硫吡啶(TP-TP)(2)在室温下反应形成WR1065-S-TP。中间体(3)与4-臂-PEG-硫醇(MW 10kDal)(4)反应形成分子量为10.536kDal的4-星-PEG-S-S-WR1065偶联物(5)。以上方案未示出在合成4-星-PEG-S-S-WR1065偶联物(5)期间保护WR1065中的氮，然后使其去保护的步骤。必须保护WR1065(1)上的氮并且在最后一步必须去除保护基团(方案2-5)。
[0143] 方案2.
[0144]
[0145] i)引入保护基团(PG)；ii)与二硫吡啶(TP-TP)(2)反应；iii)与4-臂-PEG-硫醇(MW 10kDal)(4)反应；iv)去保护。
[0146]
[0147] PG是任何合适的保护基团。
[0148] 方案3.
[0149]
[0150] i)引入保护基团(PG)；ii)与二硫吡啶(TP-TP)(2)反应；iii)与4-臂-PEG-硫醇(Mw 10kDal)(4)反应；iv)去保护。
[0151]
[0152] PG和PG1都是合适的保护基团。PG和PG1可以相同或不同。
[0153] 方案4.
[0154]
[0155] i)引入保护基团(PG)(2)；ii)与二硫吡啶(TP-TP)反应；iii)与4-臂-PEG-硫醇(Mw 10kDal)(4)反应；iv)去保护。
[0156]
[0157] PG是任何合适的保护基团。
[0158] 方案5.
[0159]
[0160] i)引入保护基团(PG)(2)；ii)与二硫吡啶(TP-TP)反应；iii)与4-臂-PEG-硫醇(Mw 10kDal)(4)反应；iv)去保护。
[0161]
[0162] PG和PG1都是合适的保护基团。PG和PG1可以相同或不同。
[0163] 方案1-5描述了式(I)的示例性氨基硫醇-偶联物的合成。可以修改方案1-5中描述的合成以制备式(I)的氨基硫醇-偶联物，其中 R1、R2、R3、m、n和p不同于上面方案中例示的那些。因此，式(I)的氨基硫醇-偶联物也可以使用由方案6中描述的方法修改的方法来制备。
[0164] 本发明的氨基硫醇-偶联物可以根据已知方法生成。例如，式(I)的氨基硫醇-偶联物可以根据下面概述的方案6制备。
[0165] 方案6.
[0166]
[0167] X和Y各自为H、合适的离去基团或合适的活化基团。X和Y可以相同或不同。
[0168] 二硫化物(II)与胺化合物(III)的反应导致形成氨基硫醇-偶联物(I)。该反应可以在各种溶剂中，例如在水、缓冲液、甲醇(MeOH)、乙醇(EtOH)、二甲基甲酰胺(DMF)或其它此类溶剂中或在此类溶剂的混合物中进行。该反应可以在0℃至100℃的温度下，在0℃至40℃的温度下或在0℃至25℃的温度下进行。在反应过程中，式III的化合物中的氨基可以通过合适的保护基团保护，如果需要，稍后可以选择性地去除保护基团。对这些基团及其选择和化学性质的详细描述包含在“The Peptides，第3卷”,Gross和Meinenhofer编辑，Academic Press,New York,1981中，其据此通过引用整体并入。因此，对氨基有用的保护基团是苄氧羰基(Cbz)、叔丁氧羰基(Boc)、2,2,2-三氯乙氧羰基(Troc)、叔戊氧羰基、4-甲氧苄氧羰基、2-(三氯甲硅烷基)乙氧羰基、9-芴基甲氧基羰基(Fmoc)、邻苯二甲酰基、乙酰基(Ac)、甲酰基、三氟乙酰基等。根据本发明可以使用任何合适的市售二硫化物(II)。可选地，可以根据已知方法制备二硫化物(II)。
[0169] 用作偶联WR1065的支架的PEG-SH分子可以是不同长度和分子量的线性PEG聚合物或具有不同臂数(例如，如上所示的4臂(4)或6臂、8臂等)和分子量的多臂聚合物。
[0170] 示例性的氨基硫醇-偶联物包括以下：
[0171]
[0172]
[0173] 根据本发明， 是接头基团，其中所述接头基团是聚合物、聚合物的一部分、聚合物的臂、共聚物的臂、树枝状聚合物的分支、原子或分子。在某些实施方案中，聚合物的部分是指聚合物的重复单元。
[0174] 偶联的前药(或其活性部分)可以经细胞内或细胞质内递送至细胞(例如靶细胞)。一般而言，可以使用文献中描述的或未来开发的具有允许通过任何生物或细胞机制释放氨基硫醇的特征的任何方法。因此，为了实现增强的药物递送，偶联的前药可以与如下所示的其它药物递送模块组合递送。靶向药物递送和靶向药物排除是期望的，但不是必需的。
[0175] 已经开发和/或描述了多种用于细胞内药物递送的微粒载体。纳米颗粒也称为纳米囊泡、纳米载体或纳米胶囊并且包括溶酶体、胶束、胶囊、聚合物囊泡(polymersomes)、纳米凝胶、树枝状和大分子药物偶联物以及纳米级核酸复合物。有时将纳米颗粒分类的汇总包括以下(1)-(18)项。
[0176] (1)细胞穿透剂如两亲性聚脯氨酸螺旋P11LRR(例如Li等人，“Cationic Amphiphilic Polyproline Helix P11LRR Targets Intracellular Mitochondria,”
J.Controlled Release 142:259-266(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)或肽功能化量子点，例如在下述文献中描述的那些(Liu等人，“Cell-Penetrating Peptide-Functionalized Quantum Dots for Intracellular Delivery,”
J.Nanosci.Nanotechnol.10:7897-7905(2010)，其据此通过引用整体并入)。
J.Controlled Release 142:259-266(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)或肽功能化量子点，例如在下述文献中描述的那些(Liu等人，“Cell-Penetrating Peptide-Functionalized Quantum Dots for Intracellular Delivery,”
J.Nanosci.Nanotechnol.10:7897-7905(2010)，其据此通过引用整体并入)。
[0177] (2)pH响应型载体，例如碳酸磷灰石(Hossain等人，“Carbonate Apatite-Facilitated Intracellularly Delivered siRNA for Efficient Knockdown of
Functional Genes,”J.Controlled Release 147:101-108(2010)，其据此通过引用整体并入)。
Functional Genes,”J.Controlled Release 147:101-108(2010)，其据此通过引用整体并入)。
[0178] (3)已经用于促进药物递送至巨噬细胞和T-白血病细胞的C2-链霉亲和素递送系统(例如在Fahrer等人，“The C2-Streptavidin Delivery System Promotes the Uptake of Biotinylated Molecules in Macrophages and T-leukemia cells,”Biol.Chem.391,1315-1325(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0179] (4)CH(3)-TDDS递送系统。
[0180] (5)疏水性生物活性载体(例如在Imbuluzqueta等人，“Novel Bioactive Hydrophobic Gentamicin Carriers for the Treatment of Intracellular Bacterial Infections,”Acta.Biomater.7:1599-1608(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0181] (6)外泌体(例如在Lakhal等人，“Intranasal Exosomes for Treatment of Neuroinflammation？Prospects and Limitations,”Mol.Ther.19:1754-1756(2011)；
Zhang等人，“Newly Developed Strategies for Multifunctional Mitochondria-
Targeted Agents In Cancer Therapy,”Drug Discovery Today 16:140-146(2011)中描述的那些，其各自据此通过引用整体并入)。
Zhang等人，“Newly Developed Strategies for Multifunctional Mitochondria-
Targeted Agents In Cancer Therapy,”Drug Discovery Today 16:140-146(2011)中描述的那些，其各自据此通过引用整体并入)。
[0182] (7)基于脂质的递送系统(例如在以下文献中描述的那些：Bildstein等人，“Transmembrane Diffusion of Gemcitabine by a Nanoparticulate Squalenoyl
Prodrug:An Original Drug Delivery Pathway,”J.Controlled Release 147:163-170(2010)；Foged“,siRNA Delivery with Lipid-Based Systems:Promises and Pitfalls,”Curr.Top.Med.Chem.12:97-107(2012)；Holpuch等人，“Nanoparticles for Local Drug Delivery to the Oral Mucosa:Proof of Principle Studies,”Pharm.Res.27:1224-
1236(2010)；Kapoor等人，“Physicochemical Characterization Techniques for Lipid Based Delivery Systems for siRNA,”Int.J.of Pharm.427,35-57(2012)，其各自据此通过引用整体并入)，包括微管，例如在以下文献中描述的那些(Kolachala等人，“The Use of Lipid Microtubes as a Novel Slow-Release Delivery System for Laryngeal
Injection,”The Laryngoscope 121:1237-1243(2011)，其据此通过引用整体并入)。
Prodrug:An Original Drug Delivery Pathway,”J.Controlled Release 147:163-170(2010)；Foged“,siRNA Delivery with Lipid-Based Systems:Promises and Pitfalls,”Curr.Top.Med.Chem.12:97-107(2012)；Holpuch等人，“Nanoparticles for Local Drug Delivery to the Oral Mucosa:Proof of Principle Studies,”Pharm.Res.27:1224-
1236(2010)；Kapoor等人，“Physicochemical Characterization Techniques for Lipid Based Delivery Systems for siRNA,”Int.J.of Pharm.427,35-57(2012)，其各自据此通过引用整体并入)，包括微管，例如在以下文献中描述的那些(Kolachala等人，“The Use of Lipid Microtubes as a Novel Slow-Release Delivery System for Laryngeal
Injection,”The Laryngoscope 121:1237-1243(2011)，其据此通过引用整体并入)。
[0183] (8)脂质体或基于脂质体的递送系统。
[0184] (9)胶束，包括二硫化物交联胶束，例如在以下文献中描述的那些(Li等人，“Delivery of Intracellular-Acting Biologics in Pro-Apoptotic Therapies,”
Curr.Pharm.Des.17:293-319(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。可以配制具有二硫键的载体，使得一个或多个二硫键连接到氨基硫醇。已经描述了各种胶束，例如用于肺部递送的磷脂-聚天冬氨酰胺胶束。
Curr.Pharm.Des.17:293-319(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。可以配制具有二硫键的载体，使得一个或多个二硫键连接到氨基硫醇。已经描述了各种胶束，例如用于肺部递送的磷脂-聚天冬氨酰胺胶束。
[0185] (10)微粒，例如在以下文献中描述的那些(Ateh等人，“The Intracellular Uptake of CD95 Modified Paclitaxel-Loaded Poly(Lactic-Co-Glycolic Acid)
Microparticles,”Biomater.32:8538-8547(2011)，其据此通过引用整体并入)。
Microparticles,”Biomater.32:8538-8547(2011)，其据此通过引用整体并入)。
[0186] (11)分子载体，例如在以下文献中描述的那些(Hettiarachchi等人，“Toxicology and Drug Delivery by Cucurbit[n]uril Type Molecular Containers,”PloS One 5:e10514(2010)，其据此通过引用整体并入)。
[0187] (12)称为‘纳米载体’的纳米颗粒，例如在以下文献中描述的那些(Gu等人，“Tailoring Nanocarriers for Intracellular Protein Delivery,”Chem.Soc.Rev.40:
3638-3655(2011)，其据此通过引用整体并入)，其中一些已经配制用于向HIV感染的细胞递送药剂，例如在以下文献中描述的那些(Gunaseelan等人，“Surface Modifications of Nanocarriers for Effective Intracellular Delivery of Anti-HIV Drugs,”Adv.Drug Delivery Rev.62:518-531(2010)，其据此通过引用整体并入)。
3638-3655(2011)，其据此通过引用整体并入)，其中一些已经配制用于向HIV感染的细胞递送药剂，例如在以下文献中描述的那些(Gunaseelan等人，“Surface Modifications of Nanocarriers for Effective Intracellular Delivery of Anti-HIV Drugs,”Adv.Drug Delivery Rev.62:518-531(2010)，其据此通过引用整体并入)。
[0188] (13)纳米多元载体。
[0189] (14)纳米凝胶(例如在以下文献中描述的那些：Zhan等人，“Acid-Activatable Prodrug Nanogels for Efficient Intracellular Doxorubicin Release,”Biomacromolecules 12:3612-3620(2011)和Zhang等人，“Folate-Mediated poly(3-
hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate)Nanoparticles for Targeting Drug
Delivery,”Eur.J.Pharm.Biopharm.76:10-16(2010)，其各自据此通过引用整体并入)。
hydroxybutyrate-co-3-hydroxyoctanoate)Nanoparticles for Targeting Drug
Delivery,”Eur.J.Pharm.Biopharm.76:10-16(2010)，其各自据此通过引用整体并入)。
[0190] (15)混合纳米载体系统，其由两种或更多种微粒递送系统的组分组成(例如在以下文献中描述的那些：Pittella等人，“Enhanced Endosomal Escape of siRNA-Incorporating Hybrid Nanoparticles from Calcium Phosphate and PEG-Block
Charge-Conversional Polymer for Efficient Gene Knockdown With Negligible
Cytotoxicity,”Biomater.32:3106-3114(2011)，其据此通过引用整体并入)。共聚物胶束纳米载体(例如在Chen等人，“pH and Reduction Dual-Sensitive Copolymeric Micelles for Intracellular Doxorubicin Delivery,”Biomacromolecules 12:3601-3611(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)；脂质体纳米载体(例如在以下文献中描述的那些(Kang等人，“Design of a Pep-1 Peptide-Modified Liposomal Nanocarrier System for Intracellular Drug Delivery:Conformational Characterization and Cellular Uptake Evaluation,”J.of Drug Targeting 19:497-505(2011)，其据此通过引用整体并入)。
Charge-Conversional Polymer for Efficient Gene Knockdown With Negligible
Cytotoxicity,”Biomater.32:3106-3114(2011)，其据此通过引用整体并入)。共聚物胶束纳米载体(例如在Chen等人，“pH and Reduction Dual-Sensitive Copolymeric Micelles for Intracellular Doxorubicin Delivery,”Biomacromolecules 12:3601-3611(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)；脂质体纳米载体(例如在以下文献中描述的那些(Kang等人，“Design of a Pep-1 Peptide-Modified Liposomal Nanocarrier System for Intracellular Drug Delivery:Conformational Characterization and Cellular Uptake Evaluation,”J.of Drug Targeting 19:497-505(2011)，其据此通过引用整体并入)。
[0191] (16)纳米颗粒可以用多种纳米材料构建(例如在以下文献中描述的那些：Adeli等人，“Synthesis of New Hybrid Nanomaterials:Promising Systems for Cancer Therapy,”Nanomed.Nanotechnol.Biol.Med.7:806-817(2011)；Al-Jamal等人，“Enhanced Cellular Internalization and Gene Silencing with a Series of Cationic
Dendron-Multiwalled Carbon Nanotube:siRNA Complexes,”FASEB J 24:4354-4365
(2010)；Bulut等人，“Slow Release and Delivery of Antisense Oligonucleotide Drug by Self-Assembled Peptide Amphiphile Nanofibers,”Biomacromolecules 12:3007-
3014(2011)，其各自据此通过引用整体并入)。
Dendron-Multiwalled Carbon Nanotube:siRNA Complexes,”FASEB J 24:4354-4365
(2010)；Bulut等人，“Slow Release and Delivery of Antisense Oligonucleotide Drug by Self-Assembled Peptide Amphiphile Nanofibers,”Biomacromolecules 12:3007-
3014(2011)，其各自据此通过引用整体并入)。
[0192] (17)基于肽的药物递送系统，其包括多种细胞穿透肽并且包括(但不限于)基于TAT的递送系统(例如在Johnson等人，“Therapeutic Applications of Cell-Penetrating Peptides,”Methods Mol.Biol.683:535-551(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0193] (18)基于聚合物或共聚物的递送系统，例如在以下文献中描述的那些(Edinger等人，“Bioresponsive Polymers for the Delivery of Therapeutic Nucleic Acids,”Wiley Interdiscip.Rev.Nanomed.and Nanobiotechnol.3:33-46(2011)，其据此通过引用整体并入)。
[0194] 可视为属于纳米颗粒类别的其它细胞内药物输送系统包括以下(a)-(u)项。
[0195] (a)适配体(例如在Orava等人，“Delivering Cargoes into Cancer Cells Using DNA Aptamers Targeting Internalized Surface Portals,”Biochim.Biophys.Acta.1798:2190-2200(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0196] (b)细菌药物递送系统(例如在Pontes等人,“Lactococcus Lactis as a Live Vector:Heterologous Protein Production and DNA Delivery Systems,”Protein Expression Purif.79:165-175(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0197] (c)基于蛋白质的自组装细胞内细菌细胞器(细菌壳)(例如在Corchero等人，“Self-Assembling,Protein-Based Intracellular Bacterial Organelles:Emerging Vehicles for Encapsulating,Targeting And Delivering Therapeutical Cargoes,”Microb.Cell Factories 10:92(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0198] (d)掺混系统(例如在Lee等人，“Lipo-Oligoarginines as Effective Delivery Vectors to Promote Cellular Uptake,”Mol.Biosyst.6:2049-2055(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0199] (e)共价修饰蛋白(例如在Muller“, Oral Delivery of Protein Drugs:Driver for Personalized Medicine,”Curr.Molec.Bio.13:13-24(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0200] (f)载药辐照肿瘤细胞(例如在Kim等人，“Delivery of Chemotherapeutic Agents Using Drug-Loaded Irradiated Tumor Cells to Treat Murine Ovarian
Tumors,”J.Biomed.Sci.17:61(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
Tumors,”J.Biomed.Sci.17:61(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0201] (g)使用胶束复合物(micellplexes)的双重负载(例如在Yu等人，“Overcoming Endosomal Barrier by Amphotericin B-Loaded Dual pH-Responsive PDMA-b-PDPA Micelleplexes for siRNA Delivery,”ACS Nano 5:9246-9255(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0202] (h)醇质体(ethosome)(例如在Godin等人，“Ethosomes:New Prospects in Transdermal Delivery,”Crit.Rev.Ther.Drug Carrier Syst.20:63-102(2003)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0203] (i)基于吸入的输送系统(例如在Patton等人，“The Particle Has Landed--Characterizing the Fate of Inhaled Pharmaceuticals,”J.of Aerosol Medicine and Pul.Drug Del.23:增刊2:S71-87(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0204] (j)基于辐照肿瘤细胞的递送系统(例如在Kim等人，“Delivery of Chemotherapeutic Agents Using Drug-Loaded Irradiated Tumor Cells to Treat
Murine Ovarian Tumors,”J.Biomed.Sci.17:61(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
Murine Ovarian Tumors,”J.Biomed.Sci.17:61(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0205] (k)基于脂质的载体。
[0206] (I)脂质球，如声学活性脂质球。
[0207] (m)微胶囊化药物递送(例如在Oettinger等人，“Microencapsulated Drug Delivery:A New Approach to Pro-Inflammatory Cytokine Inhibition,”
J.Microencapsulation(2012)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
J.Microencapsulation(2012)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0208] (n)称为分子伞(molecular umbrella)的递送系统(例如，在Cline等人，“A Molecular Umbrella Approach to the Intracellular Delivery of Small
Interfering RNA,”Bioconjugate Chem.22:2210-2216(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
Interfering RNA,”Bioconjugate Chem.22:2210-2216(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0209] (o)类脂质体(niosome)(基于非离子表面活性剂的脂质体)。
[0210] (p)光活化药物递送系统。
[0211] (q)聚合物微胶囊(例如在Pavlov等人，“Neuron Cells Uptake of Polymeric Microcapsules and Subsequent Intracellular Release,”Mac.Bio.11:848-854(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0212] (r)自乳化药物递送系统(例如在Lei等人，“Development of a Novel Self-Microemulsifying Drug Delivery System for Reducing HIV Protease Inhibitor-
Induced Intestinal Epithelial Barrier Dysfunction,”Mol.Pharmaceutics 7:844-
853(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
Induced Intestinal Epithelial Barrier Dysfunction,”Mol.Pharmaceutics 7:844-
853(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0213] (s)特洛伊木马(Trojan horse)递送系统。
[0214] (t)囊泡，包括但不限于还原敏感性囊泡(例如在Park等人，“Reduction-Sensitive,Robust Vesicles with a Non-Covalently Modifiable Surface as a
Multifunctional Drug-Delivery Platform,”Small 6:1430-1441(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
Multifunctional Drug-Delivery Platform,”Small 6:1430-1441(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0215] (u)病毒载体和病毒样系统(例如在以下文献中描述的那些：Bacman等人，“Organ-Specific Shifts in mtDNA Heteroplasmy Following Systemic Delivery of a Mitochondria-Targeted Restriction Endonuclease,”Gene Ther.17:713-720(2010)；
Chailertvanitkul等人，“Adenovirus:a Blueprint for Non-Viral Gene Delivery,”Curr.Opin.Biotech.21:627-632(2010)，其各自据此通过引用整体并入)。
Chailertvanitkul等人，“Adenovirus:a Blueprint for Non-Viral Gene Delivery,”Curr.Opin.Biotech.21:627-632(2010)，其各自据此通过引用整体并入)。
[0216] 应该注意的是，上面列出的药物递送系统可以彼此组合使用。还可以对其进一步工程改造以提供靶向细胞或组织类型递送或靶向细胞/组织类型排除。另外，正在频繁开发新的纳米递送系统，并且用于形成纳米药物递送媒介物的各种材料正在迅速扩大。
[0217] 以上递送系统可以与增强的递送技术组合使用。此类技术的实例包括以下(I)-(XV)项。
[0218] (I)两性霉素B(Amphotercin B)介导的药物递送增强。
[0219] (II)超声介导的技术(例如在以下文献中描述的那些：Grimaldi等人，“Ultrasound-Mediated Structural Changes in Cells Revealed by FTIR
Spectroscopy:a Contribution to the Optimization of Gene and Drug Delivery,”Spectrochim.Acta Part A 84:74-85(2011)；Yudina等人，“Ultrasound-Mediated
Intracellular Drug Delivery Using Microbubbles and Temperature-Sensitive
Liposomes,”J.Controlled Release 155:442-448(2011)，其各自据此通过引用整体并入)。
Spectroscopy:a Contribution to the Optimization of Gene and Drug Delivery,”Spectrochim.Acta Part A 84:74-85(2011)；Yudina等人，“Ultrasound-Mediated
Intracellular Drug Delivery Using Microbubbles and Temperature-Sensitive
Liposomes,”J.Controlled Release 155:442-448(2011)，其各自据此通过引用整体并入)。
[0220] (III)温度敏感型递送和/或释放系统。
[0221] (IV)pH敏感型递送和/或释放系统。
[0222] (V)氧化还原响应型递送系统，例如在以下文献中描述的那些(Zhao等人，“A Novel Human Derived Cell-Penetrating Peptide in Drug Delivery,”Mol.Biol.Rep.38:2649-2656(2011)，其据此通过引用整体并入)。
[0223] (VI)生物可还原递送系统(例如在Liu等人，“Bioreducible Micelles Self-Assembled from Amphiphilic Hyperbranched Multiarm Copolymer for Glutathione-Mediated Intracellular Drug Delivery,”Biomacromolecules 12:1567-1577(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0224] (VII)增强内溶酶体逃逸的方法(例如在Paillard等人，“The Importance of Endo-Lysosomal Escape with Lipid Nanocapsules for Drug Subcellular Bioavailability,”Biomaterials 31:7542-7554(2010)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0225] (VIII)吸入方法(例如在Zhuang等人，“Treatment of Brain Inflammatory Diseases by Delivering Exosome Encapsulated Anti-Inflammatory Drugs from the Nasal Region to the Brain,”Mol.Ther.19:1769-1779(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0226] (IX)增强口服递送的方法(例如在Muller,“Oral Delivery of Protein Drugs:Driver for Personalized Medicine,”Curr.Molec.Bio.13:13-24(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0227] (X)靶向细胞递送系统，其中一些已经开发用于递送抗HIV药物(例如在以下文献中描述的那些：Bronshtein等人，“Cell Derived Liposomes Expressing CCR5 as a New Targeted Drug-Delivery System for HIV Infected Cells,”J.Controlled Release 151:139-148(2011)；Gunaseelan等人，“Surface Modifications of Nanocarriers for Effective Intracellular Delivery of Anti-HIV Drugs,”Adv.Drug Delivery Rev.62:
518-531(2010)；Kelly等人，“Targeted Liposomal Drug Delivery to Monocytes and Macrophages.,”J.Drug Delivery 727241(2011)，其各自据此通过引用整体并入)。
518-531(2010)；Kelly等人，“Targeted Liposomal Drug Delivery to Monocytes and Macrophages.,”J.Drug Delivery 727241(2011)，其各自据此通过引用整体并入)。
[0228] (XI)缓慢或按需释放系统(例如在Hu等人，“Multifunctional Nanocapsules for Simultaneous Encapsulation of Hydrophilic and Hydrophobic Compounds and On-Demand Release,”ACS Nano 6:2558-2565(2012)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0229] (XII)靶向递送至一种或多种受体(例如在Ming,“Cellular Delivery of siRNA and Antisense Oligonucleotides via Receptor-Mediated Endocytosis,”Expert Opin.on Drug Delivery8:435-449(2011)中描述的那些，其据此通过引用整体并入)。
[0230] (XIII)靶向递送至一种或多种不同的亚细胞器(例如在以下文献中描述的那些：Paulo等人，“Nanoparticles for Intracellular-Targeted Drug Delivery,”
Nanotechnol.22:494002(2011)；Zhang等人，“Newly Developed Strategies for
Multifunctional Mitochondria-Targeted Agents In Cancer Therapy,”Drug
Discovery Today 16:140-146(2011)，其据此通过引用整体并入)。
Nanotechnol.22:494002(2011)；Zhang等人，“Newly Developed Strategies for
Multifunctional Mitochondria-Targeted Agents In Cancer Therapy,”Drug
Discovery Today 16:140-146(2011)，其据此通过引用整体并入)。
[0231] (XIV)改善或调节药物摄取的方法(例如在以下文献中描述的那些：Lorenz,S等人，“The Softer and More Hydrophobic the Better:Influence of the Side Chain Of Polymethacrylate Nanoparticles for Cellular Uptake,”Macromol.Bioscience 10:1034-1042(2010)；Ma等人，“Distinct Transduction Modes of Arginine-Rich Cell-Penetrating Peptides for Cargo Delivery into Tumor Cells,”Int.J.Pharm.419:
200-208(2011)，其各自据此通过引用整体并入)。
200-208(2011)，其各自据此通过引用整体并入)。
[0232] (XV)使用红细胞作为药物载体的方法，如同在例如Millan等人，“Drug,Enzyme and Peptide Delivery using Erythrocytes As Carriers,”J.Control Release 95:27-49(2004)中所述，其据此通过引用整体并入。
[0233] 虽然先前已报道使用纳米颗粒递送氨磷汀(硫代磷酸酯)(Pamujula等人，“Oral Delivery of Spray Dried PLGA/Amifostine Nanoparticles,”J.Pharm.Pharmacol.56:1119-1125(2004)；Pamujula等人，“Preparation and In Vitro Characterization of Amifostine Biodegradable Microcapsules,”Eur.J.Pharm.Biopharm.57:213-218
(2004)；Pamujula等人，“Radioprotection in Mice Following Oral Delivery of Amifostine Nanoparticles,”Int.J.Radiat.Biol.81:251-257(2005)；(Pamujula等人，“Radioprotection of mice following oral administration of WR-1065.PLGA
nanoparticles,”Int.J.Radiat.Biol.84:900-908(2008)，其据此通过引用整体并入)，但是该递送系统不同于本文描述的氨基硫醇-偶联物和组合物，并且未解决与依赖碱性磷酸酶进行药物活化相关的问题。与本文描述的氨基硫醇-偶联物不同，此类递送系统未解决循环中的偶然药物反应或靶细胞远端的药物释放问题。此前的尝试也未能解决与细胞外药物活化相关的潜在毒性问题。
(2004)；Pamujula等人，“Radioprotection in Mice Following Oral Delivery of Amifostine Nanoparticles,”Int.J.Radiat.Biol.81:251-257(2005)；(Pamujula等人，“Radioprotection of mice following oral administration of WR-1065.PLGA
nanoparticles,”Int.J.Radiat.Biol.84:900-908(2008)，其据此通过引用整体并入)，但是该递送系统不同于本文描述的氨基硫醇-偶联物和组合物，并且未解决与依赖碱性磷酸酶进行药物活化相关的问题。与本文描述的氨基硫醇-偶联物不同，此类递送系统未解决循环中的偶然药物反应或靶细胞远端的药物释放问题。此前的尝试也未能解决与细胞外药物活化相关的潜在毒性问题。
[0234] 可用于改变或改善药物递送和/或摄取的其它方法包括使用表面活性剂，如Stogniew的美国专利第6,489,312号中所述，其据此通过引用整体并入。
[0235] 在某些实施方案中，氨基硫醇(或其类似物)的活性形式在细胞质内释放以实现疗效。通常可以使用任何药物递送系统和/或药物保护方法，其包括在细胞质内递送之后释放药物的活性形式的能力。选择上述一种或多种保护和递送系统的关键是认识到，一旦药物已经递送到靶细胞的细胞质中，所述递送/保护方法就必须允许释放氨基硫醇。因此，必须进行偶联物与氨基硫醇的键合以便产生可还原(生物可还原)的二硫键(Benham等人，“Disulfide Bonding Patterns and Protein Topologies,”Protein Sci.2:41-54
(1993)；Liu等人，“Disulfide Bond Structures of IgG Molecules:Structural
Variations,Chemical Modifications and Possible Impacts to Stability and
Biological Function,”mAbs 4:17-23(2012)，其各自据此通过引用整体并入)。
(1993)；Liu等人，“Disulfide Bond Structures of IgG Molecules:Structural
Variations,Chemical Modifications and Possible Impacts to Stability and
Biological Function,”mAbs 4:17-23(2012)，其各自据此通过引用整体并入)。
[0236] 本发明的另一方面涉及治疗需要氨基硫醇疗法的受试者的方法。该方法涉及向有需要的受试者施用一种或多种本文描述的氨基硫醇-偶联物。该方法可涉及向受试者施用(i)如上所述的式(IV)的氨基硫醇-偶联物。该方法可涉及向受试者施用(i)如上所述的式(I)的氨基硫醇-偶联物。
[0237] 如本文所用，治疗意指改善或以其它方式有益地改变疾病或病症的一种或多种症状的任何方式。如本文所述的氨基硫醇-偶联物的治疗有效量可以是，例如足以预防疾病状态发作或缩短疾病状态持续时间或降低一种或多种症状的严重程度的量。治疗包括例如受试者中的病毒或病原性微生物的抑制和减毒。
[0238] 已证实氨磷汀、phosphonol和结构相关的硫代磷酸酯和类似物在用作化学保护剂、细胞保护剂、辐射防护剂、抗纤维化剂，具有抗转移、抗侵入和抗诱变作用的抗肿瘤剂，抗氧化剂、自由基清除剂、抗病毒剂以及作为防止肿瘤诱导，减缓肿瘤细胞生长，具有抗肿瘤/抗癌作用和/或增强抗癌剂功效的药剂时具有治疗功效(Grdina等人，“Differential Activation of Nuclear Transcription Factor Kappab,Gene Expression,and Proteins By Amifostine's Free Thiol in Human Microvascular Endothelial and Glioma Cells,”Semin.Radiat.Oncol.12:103-111(2002)；Grdina等人，“Relationships between Cytoprotection and Mutation Prevention by WR-1065,”Mil Med 167:51-53(2002)；Grdina等人，“Radioprotectors:Current Status and New Directions,”
Radiat.Res.163:704-705(2002)；Poirier等人，“Antiretroviral Activity of the Aminothiol WR1065 Against Human Immunodeficiency Virus(HIV-1)in Vitro and
Simian Immunodeficiency Virus(SIV)Ex Vivo,”AIDS Res.Ther.6:24(2009)；Walker等人，“WR1065Mitigates AZT-ddI-Induced Mutagenesis and Inhibits Viral
Replication,”Environ.Mol.Mutagen.50:460-472(2009)，其各自据此通过引用整体并入)。实验结果表明，氨磷汀的活性代谢产物WR-1065对HIV、A和B型流感病毒以及三种腺病毒表现出抗病毒功效。后来的研究也证明了针对SIV的功效(Poirier等人，
“Antiretroviral Activity of the Aminothiol WR1065 Against Human
Immunodeficiency Virus(HIV-1)in Vitro and Simian Immunodeficiency Virus(SIV)Ex Vivo,”AIDS Res.Ther.6:24(2009)，其据此通过引用整体并入)并且NIAID/DMID承包实验室证明了对埃博拉病毒(Ebola virus)的功效。
Radiat.Res.163:704-705(2002)；Poirier等人，“Antiretroviral Activity of the Aminothiol WR1065 Against Human Immunodeficiency Virus(HIV-1)in Vitro and
Simian Immunodeficiency Virus(SIV)Ex Vivo,”AIDS Res.Ther.6:24(2009)；Walker等人，“WR1065Mitigates AZT-ddI-Induced Mutagenesis and Inhibits Viral
Replication,”Environ.Mol.Mutagen.50:460-472(2009)，其各自据此通过引用整体并入)。实验结果表明，氨磷汀的活性代谢产物WR-1065对HIV、A和B型流感病毒以及三种腺病毒表现出抗病毒功效。后来的研究也证明了针对SIV的功效(Poirier等人，
“Antiretroviral Activity of the Aminothiol WR1065 Against Human
Immunodeficiency Virus(HIV-1)in Vitro and Simian Immunodeficiency Virus(SIV)Ex Vivo,”AIDS Res.Ther.6:24(2009)，其据此通过引用整体并入)并且NIAID/DMID承包实验室证明了对埃博拉病毒(Ebola virus)的功效。
[0239] 在某些实施方案中，受试者是需要用抗病毒剂、化学保护剂、细胞保护剂、辐射防护剂、抗纤维化剂、抗肿瘤剂、抗氧化剂或其组合治疗的受试者。
[0240] 在某些实施方案中，受试者未感染HIV。
[0241] 在某些实施方案中，受试者需要抗微生物疗法并且在有效杀伤所述受试者中的一种或多种病原性微生物的条件下施用所述氨基硫醇-偶联物或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物。微生物可以是例如细菌、酵母、真菌或寄生虫。寄生虫可以是细胞内寄生虫或细胞外寄生虫。
[0242] 在一个实施方案中，受试者感染病毒并且在有效治疗病毒的条件下施用氨基硫醇-偶联物(或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物)。在某些实施方案中，本文描述的氨基硫醇-偶联物的治疗有效量是足以降低受试者中靶病毒的病毒载量的量。
[0243] 受试者可以是感染了HIV、正粘病毒、流感病毒、腺病毒或其组合的受试者。在一个实施方案中，受试者未感染HIV。
[0244] 在一个实施方案中，受试者是感染了流感的受试者。流感病毒可以是例如H1N1或H3N2。
[0245] 在一个实施方案中，受试者是感染了腺病毒的受试者。腺病毒可以是B、C或E种。
[0246] 在一个实施方案中，受试者是感染了埃博拉病毒的受试者。
[0247] 如上所述，本发明的一方面涉及通过在有效治疗肿瘤性病状的条件下施用本文描述的氨基硫醇-偶联物或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物来治疗患有肿瘤性病状的受试者的方法。本发明的另一方面涉及通过在有效降低发展肿瘤性病状的风险的条件下施用本文描述的氨基硫醇-偶联物或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物来治疗处于发展肿瘤性病状的风险的受试者的方法。处于发展肿瘤性病状的风险中的此类受试者包括，例如接受重复诊断性辐射暴露的受试者。
[0248] 例如，通过体外研究鉴定的敏感性肿瘤类型包括：乳腺癌、卵巢癌、恶性黑素瘤(Brenner等人，“Variable Cytotoxicity of Amifostine in Malignant and Non-Malignant Cell Lines,”Oncol.Rep.10(5):1609-13(2003)，其据此通过引用整体并入)；
卵巢癌(Calabro-Jones等人，“The Limits to Radioprotection of Chinese Hamster V79 Cells by WR-1065 Under Aerobic Conditions,”Radiat.Res.149:550-559(1998)(“Calabro-Jones”)，其据此通过引用整体并入)；宫颈癌细胞(HeLa细胞和Me-180-VCII)(参见Calabro-Jones)；结肠癌(参见Calabro-Jones)；肺癌(A549cells and H1299):
(verbal communication from Dr.A.Kajon；Pataer等人，“Induction of Apoptosis in Human Lung Cancer Cells Following Treatment With Amifostine and an Adenoviral Vector Containing Wild-Type p53,”Cancer Gene Ther.13(8):806-14(2006)，其各自据此通过引用整体并入)；和骨髓增生异常综合征(Ribizzi等人，“Amifostine Cytotoxicity and Induction of Apoptosis in a Human Myelodysplastic Cell Line,”Leuk.Res.24(6):519-25(2000)，其据此通过引用整体并入)。通过体内研究鉴定的敏感性肿瘤类型包括例如转移性黑素瘤(Glover等人，“WR-2721 and High-Dose Cisplatin:An Active
Combination in the Treatment of Metastatic Melanoma,”J.Clin.Oncol.5(4):574-8(1987)，其据此通过引用整体并入)；辐射诱导肿瘤类型(Grdina等人，“Protection Against Late Effects of Radiation by S-2-(3-aminopropylamino)-
ethylphosphorothioic Acid,”Cancer Res.51(16):4125-30(1991)，其据此通过引用整体并入)(报道称对于小鼠中各种不同辐射诱导肿瘤类型而言，氨磷汀减少了代表160个肿瘤分类代码的所有肿瘤的发生)；淋巴网状内皮细胞肿瘤(例如纤维肉瘤-淋巴结、组织细胞白血病、组织细胞淋巴瘤、淋巴细胞-淋巴母细胞性淋巴瘤、骨髓性白血病、浆细胞瘤、未分化性白血病、未分化性淋巴瘤、未分类淋巴瘤、混合组织细胞-淋巴细胞性白血病和混合组织细胞-淋巴细胞性淋巴瘤)(Grdina等人，“Protection Against Late Effects of
Radiation by S-2-(3-aminopropylamino)-ethylphosphorothioic Acid,”Cancer
Res.51(16):4125-30(1991)，其据此通过引用整体并入)；辐射诱导的乳腺肿瘤(Inano等人，“Inhibitory Effects of WR-2721 and Cysteamine on Tumor Initiation in
Mammary Glands of Pregnant Rats by Radiation,”Radiat Res.153(1):68-74(2000)，其据此通过引用整体并入)；辐射诱导的肉瘤(Milas等人“Inhibition of Radiation Carcinogenesis in Mice by S-2-(3-aminopropylamino)-ethylphosphorothioic
Acid,”Cancer Res.44(12Pt 1):5567-9(1984)，其据此通过引用整体并入)；中子诱导的肿瘤发生(Grdina等人，“Protection by WR-151327 Against Late-Effect Damage From Fission-Spectrum Neutrons,”Radiat.Res.128(增刊1):S124-7(1991)(报告称WR1065类似物WR151327在照射前30分钟施用时减少了雄性和雌性小鼠中裂变谱中子诱导的肿瘤诱导)和Carnes等人，“In Vivo Protection by the Aminothiol WR-2721 Against
Neutron-Induced Carcinogenesis,”Int.J.Radiat.Biol.61(5):567-76(1992)(报告称WR2721防止雄性和雌性B6C3F1小鼠中中子诱导的肿瘤诱导)，其各自据此通过引用整体并入)；骨髓增生异常综合征(Mathew等人，“A Phase II Study of Amifostine in Children With Myelodysplastic Syndrome:A Report From the Children's Oncology Group
Study(AAML0121),”Pediatr.Blood Cancer 57(7):1230-2(2011)，其据此通过引用整体并入)；及动物模型中由辐射或化学疗法诱导的继发性肿瘤(Grdina等人，“Protection Against Late Effects of Radiation by S-2-(3-aminopropylamino)-
ethylphosphorothioic Acid,”Cancer Res.51(16):4125-30(1991)；Grdina等人，
“Radioprotectants:Current Status and new Directions,”Oncology 63(增刊2):2-10(2002)；Grdina等人，“Radioprotectors in Treatment Therapy to Reduce Risk in Secondary Tumor Induction,”Pharmacol.Ther.39(1-3):21-5(1988)，其各自据此通过引用整体并入)。
卵巢癌(Calabro-Jones等人，“The Limits to Radioprotection of Chinese Hamster V79 Cells by WR-1065 Under Aerobic Conditions,”Radiat.Res.149:550-559(1998)(“Calabro-Jones”)，其据此通过引用整体并入)；宫颈癌细胞(HeLa细胞和Me-180-VCII)(参见Calabro-Jones)；结肠癌(参见Calabro-Jones)；肺癌(A549cells and H1299):
(verbal communication from Dr.A.Kajon；Pataer等人，“Induction of Apoptosis in Human Lung Cancer Cells Following Treatment With Amifostine and an Adenoviral Vector Containing Wild-Type p53,”Cancer Gene Ther.13(8):806-14(2006)，其各自据此通过引用整体并入)；和骨髓增生异常综合征(Ribizzi等人，“Amifostine Cytotoxicity and Induction of Apoptosis in a Human Myelodysplastic Cell Line,”Leuk.Res.24(6):519-25(2000)，其据此通过引用整体并入)。通过体内研究鉴定的敏感性肿瘤类型包括例如转移性黑素瘤(Glover等人，“WR-2721 and High-Dose Cisplatin:An Active
Combination in the Treatment of Metastatic Melanoma,”J.Clin.Oncol.5(4):574-8(1987)，其据此通过引用整体并入)；辐射诱导肿瘤类型(Grdina等人，“Protection Against Late Effects of Radiation by S-2-(3-aminopropylamino)-
ethylphosphorothioic Acid,”Cancer Res.51(16):4125-30(1991)，其据此通过引用整体并入)(报道称对于小鼠中各种不同辐射诱导肿瘤类型而言，氨磷汀减少了代表160个肿瘤分类代码的所有肿瘤的发生)；淋巴网状内皮细胞肿瘤(例如纤维肉瘤-淋巴结、组织细胞白血病、组织细胞淋巴瘤、淋巴细胞-淋巴母细胞性淋巴瘤、骨髓性白血病、浆细胞瘤、未分化性白血病、未分化性淋巴瘤、未分类淋巴瘤、混合组织细胞-淋巴细胞性白血病和混合组织细胞-淋巴细胞性淋巴瘤)(Grdina等人，“Protection Against Late Effects of
Radiation by S-2-(3-aminopropylamino)-ethylphosphorothioic Acid,”Cancer
Res.51(16):4125-30(1991)，其据此通过引用整体并入)；辐射诱导的乳腺肿瘤(Inano等人，“Inhibitory Effects of WR-2721 and Cysteamine on Tumor Initiation in
Mammary Glands of Pregnant Rats by Radiation,”Radiat Res.153(1):68-74(2000)，其据此通过引用整体并入)；辐射诱导的肉瘤(Milas等人“Inhibition of Radiation Carcinogenesis in Mice by S-2-(3-aminopropylamino)-ethylphosphorothioic
Acid,”Cancer Res.44(12Pt 1):5567-9(1984)，其据此通过引用整体并入)；中子诱导的肿瘤发生(Grdina等人，“Protection by WR-151327 Against Late-Effect Damage From Fission-Spectrum Neutrons,”Radiat.Res.128(增刊1):S124-7(1991)(报告称WR1065类似物WR151327在照射前30分钟施用时减少了雄性和雌性小鼠中裂变谱中子诱导的肿瘤诱导)和Carnes等人，“In Vivo Protection by the Aminothiol WR-2721 Against
Neutron-Induced Carcinogenesis,”Int.J.Radiat.Biol.61(5):567-76(1992)(报告称WR2721防止雄性和雌性B6C3F1小鼠中中子诱导的肿瘤诱导)，其各自据此通过引用整体并入)；骨髓增生异常综合征(Mathew等人，“A Phase II Study of Amifostine in Children With Myelodysplastic Syndrome:A Report From the Children's Oncology Group
Study(AAML0121),”Pediatr.Blood Cancer 57(7):1230-2(2011)，其据此通过引用整体并入)；及动物模型中由辐射或化学疗法诱导的继发性肿瘤(Grdina等人，“Protection Against Late Effects of Radiation by S-2-(3-aminopropylamino)-
ethylphosphorothioic Acid,”Cancer Res.51(16):4125-30(1991)；Grdina等人，
“Radioprotectants:Current Status and new Directions,”Oncology 63(增刊2):2-10(2002)；Grdina等人，“Radioprotectors in Treatment Therapy to Reduce Risk in Secondary Tumor Induction,”Pharmacol.Ther.39(1-3):21-5(1988)，其各自据此通过引用整体并入)。
[0249] 此外，氨基硫醇(例如，氨磷汀(WR2721)和WR1065)的抗癌作用已得到确认。示例性抗癌作用包括抗肿瘤性转化、正常细胞中的抗诱变、抗血管生成、抑制或减少肿瘤细胞生长、抑制或减少肿瘤细胞侵袭以及抑制或减少肿瘤细胞转移。通过体外或体内研究鉴定的示例性抗癌作用总结如下。
[0250] 抗肿瘤性转化：在体外实验中，用γ射线照射V79细胞并同时暴露于1毫摩尔WR1065，并且评估肿瘤性转化的发生率(Hill等人，“2-[(Aminopropyl)amino]ethanethiol(WR1065)is Anti-Neoplastic and Anti-Mutagenic When Given During 60Co Gamma-Ray Irradiation,”Carcinogenesis 7(4):665-8(1986)，其据此通过引用整体并入)。即使细胞活力未改变，肿瘤性转化也显著降低。在体外实验中，经证实各1毫摩尔的WR1065和WR151326保护C3H/10T1/2细胞免于因暴露于裂变中子而诱导的肿瘤性转化，并且在两种不同的辐射暴露方案中观察到这种效应(Balcer-Kubiczek等人，“Effects of WR-1065 and WR-151326 on Survival and Neoplastic Transformation in C3H/10T1/2 Cells
Exposed to TRIGA or JANUS Fission Neutrons,”Int.J.Radiat.Biol.63(1):37-46
(1993)，其据此通过引用整体并入)。在辐射暴露之前、期间和之后将细胞暴露于WR1065或WR151326。WR1065的防护因数为3.23，而WR151326的防护因数为1.8。在体内实验中，以100微克/克体重施用的WR2721保护幼年大鼠免于辐射诱导的肝脏病灶的形成；这种效应在雌性大鼠中更为明显，性别对肝细胞病灶形成最敏感(Grdina等人,“Protective Effect of S-2-(3-aminopropylamino)ethylphosphorothioic Acid Against Induction of
Altered Hepatocyte Foci in Rats Treated Once With Gamma-Radiation Within one day After Birth,”Cancer Res.45(11Pt 1):5379-81(1985)，其据此通过引用整体并入)。
在体内实验中，WR2721暴露抑制小鼠模型中辐射诱导的细胞转化，其中26％的小鼠接受WR2721加辐射发展肿瘤，相比87％单独接受辐射的小鼠(Milas等人“Inhibition of
Radiation Carcinogenesis in Mice by S-2-(3-aminopropylamino)-
ethylphosphorothioic Acid,”Cancer Res.44(12Pt 1):5567-9(1984)，其据此通过引用整体并入)。进行体内研究以确定在小鼠模型中WR2721是否可以保护免疫系统细胞免受全身照射加化学疗法与环磷酰胺的损伤作用(肺部定植和因使用纤维肉瘤提高的肿瘤摄入/接种能力)(Milas等人，“Protection by S-2-(3-aminopropylamino)
ethylphosphorothioic Acid Against Radiation-and Cyclophosphamide-Induced
Attenuation in Antitumor Resistance,”Cancer Res.44(6):2382-6(1984)，其据此通过引用整体并入)。作者发现WR2721几乎完全消除了C3Hf/Kam小鼠中全身照射的肿瘤摄取增强作用。在体内实验中，将雌性C57/BL/6JANL x BALB/cJANLF1小鼠暴露于0、206cGyγ射线、417cGyγ射线或相同剂量的辐射与400mg/kg WR2721；动物终身保持(Grdina等人，“Protection Against Late Effects of Radiation by S-2-(3-aminopropylamino)-ethylphosphorothioic Acid,”Cancer Res.51(16):4125-30(1991)，其据此通过引用整体并入)。90％的受辐照动物死于肿瘤；对于用206cGy照射的经WR2721处理的小鼠观察到显著保护作用。淋巴网状内皮细胞肿瘤对保护作用特别敏感；总预期寿命延长65天。在体内实验中，已经证实氨磷汀可以减少妊娠大鼠中辐射诱导的乳腺肿瘤(Grdina等人，“Amifostine:
Mechanisms of Action Underlying Cytoprotection and Chemoprevention,”Drug
Metabol.Drug Interact.16(4):237-79(2000)，其据此通过引用整体并入)。
Exposed to TRIGA or JANUS Fission Neutrons,”Int.J.Radiat.Biol.63(1):37-46
(1993)，其据此通过引用整体并入)。在辐射暴露之前、期间和之后将细胞暴露于WR1065或WR151326。WR1065的防护因数为3.23，而WR151326的防护因数为1.8。在体内实验中，以100微克/克体重施用的WR2721保护幼年大鼠免于辐射诱导的肝脏病灶的形成；这种效应在雌性大鼠中更为明显，性别对肝细胞病灶形成最敏感(Grdina等人,“Protective Effect of S-2-(3-aminopropylamino)ethylphosphorothioic Acid Against Induction of
Altered Hepatocyte Foci in Rats Treated Once With Gamma-Radiation Within one day After Birth,”Cancer Res.45(11Pt 1):5379-81(1985)，其据此通过引用整体并入)。
在体内实验中，WR2721暴露抑制小鼠模型中辐射诱导的细胞转化，其中26％的小鼠接受WR2721加辐射发展肿瘤，相比87％单独接受辐射的小鼠(Milas等人“Inhibition of
Radiation Carcinogenesis in Mice by S-2-(3-aminopropylamino)-
ethylphosphorothioic Acid,”Cancer Res.44(12Pt 1):5567-9(1984)，其据此通过引用整体并入)。进行体内研究以确定在小鼠模型中WR2721是否可以保护免疫系统细胞免受全身照射加化学疗法与环磷酰胺的损伤作用(肺部定植和因使用纤维肉瘤提高的肿瘤摄入/接种能力)(Milas等人，“Protection by S-2-(3-aminopropylamino)
ethylphosphorothioic Acid Against Radiation-and Cyclophosphamide-Induced
Attenuation in Antitumor Resistance,”Cancer Res.44(6):2382-6(1984)，其据此通过引用整体并入)。作者发现WR2721几乎完全消除了C3Hf/Kam小鼠中全身照射的肿瘤摄取增强作用。在体内实验中，将雌性C57/BL/6JANL x BALB/cJANLF1小鼠暴露于0、206cGyγ射线、417cGyγ射线或相同剂量的辐射与400mg/kg WR2721；动物终身保持(Grdina等人，“Protection Against Late Effects of Radiation by S-2-(3-aminopropylamino)-ethylphosphorothioic Acid,”Cancer Res.51(16):4125-30(1991)，其据此通过引用整体并入)。90％的受辐照动物死于肿瘤；对于用206cGy照射的经WR2721处理的小鼠观察到显著保护作用。淋巴网状内皮细胞肿瘤对保护作用特别敏感；总预期寿命延长65天。在体内实验中，已经证实氨磷汀可以减少妊娠大鼠中辐射诱导的乳腺肿瘤(Grdina等人，“Amifostine:
Mechanisms of Action Underlying Cytoprotection and Chemoprevention,”Drug
Metabol.Drug Interact.16(4):237-79(2000)，其据此通过引用整体并入)。
[0251] 正常细胞中的抗诱变：在体外实验中，使用4毫摩尔的WR1065和同时γ射线照射V79细胞，HPRT突变显著降低并且细胞活力增加(Hill等人，“2-[(Aminopropyl)amino]ethanethiol(WR1065)is Anti-Neoplastic and Anti-Mutagenic When Given During 60Co Gamma-Ray Irradiation,”Carcinogenesis 7(4):665-8(1986)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，4毫摩尔的剂量导致细胞谷胱甘肽水平和半胱氨酸水平显著增加，并且这些与显著的细胞保护和对60Coγ-光子和中子辐射的抗诱变相关(Grdina等人，
“Thiol and Disulfide Metabolites of the Radiation Protector and Potential Chemopreventive Agent WR-2721 are Linked to Both its Anti-Cytotoxic and Anti-Mutagenic Mechanisms of Action,”Carcinogenesis 16(4):767-74(1995)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，WR1065保护G0T淋巴细胞免受因电离辐射引起的突变诱导，在非循环细胞中显示出保护作用(Clark等人，“Hprt Mutations in Human T-Lymphocytes Reflect Radioprotective Effects of the Aminothiol,WR-1065,”Carcinogenesis 17(12),2647-2653(1996)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，在G0T淋巴细胞中，WR1065降低了对指示总体结构改变的突变的诱导(Clark等人，“The Aminothiol WR-1065 Protects T Lymphocytes From Ionizing Radiation-Induced Deletions of the HPRT Gene,”Cancer Epidemiol.Biomarkers.Prev.6(12):1033-7(1997)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，氨磷汀使小鼠脾细胞中HPRT基因中的环磷酰胺诱导的突变降低8倍(Grdina等人，“Chemopreventive Doses of Amifostine Confer no Cytoprotection to Tumor Nodules Growing in the Lungs of Mice Treated With Cyclophosphamide,”Semin.Oncol.26(2增刊7):22-7(1999)，其据此通过引用整体并入)。在使用静脉注射纤维肉瘤细胞意在定殖肺部的小鼠模型IV的体外实验中，评价了WR1065防止因环磷酰胺暴露而引起的HPRT突变的能力(Kataoka等人，“Antimutagenic Effects of Amifostine:
Clinical Implications,”Semin.Oncol.23(4增刊8):53-7(1996)，其据此通过引用整体并入)。在100mg/kg时，WR1065未降低环磷酰胺的抗癌效果，但的确显著降低了由这种化学治疗剂诱导的HPRT突变频率。在体外实验中，发现浓度为4毫摩尔的WR1065针对由于暴露于化学治疗剂顺式-DDP引起的HPRT基因中的突变诱导提供了显著防护(Nagy等人，“Protection Against cis-diamminedichloroplatinum Cytotoxicity and Mutagenicity in V79
Cells by 2-[[(aminopropyl)amino]ethanethiol,”Cancer Res.46(3):1132-5(1986)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，评估4毫摩尔的WR1065防止HPRT基因中的突变诱导，单链断裂的诱导以及博来霉素、氮芥、顺式-DDP或X射线辐射引起的细胞杀伤的能力(Nagy等人，“Protective Effects of 2-[(aminopropyl)amino]Ethanethiol Against Bleomycin and Nitrogen Mustard-Induced Mutagenicity in V79 Cells,”
Int.J.Radiat.Oncol.12(8):1475-8(1986)，其据此通过引用整体并入)。WR1065可以防护每种试剂的所有这些影响，但防护程度因试剂而异。在体外实验中，测试了WR1065和
WR151326防止因暴露于裂变光谱中子而在HPRT基因处突变诱导的能力(Grdina等人，
“Protection by WR1065 and WR151326 Against Fission-Neutron-Induced Mutations at the HGPRT Locus in V79 Cells,”Radiat.Res.117(3):500-10(1989)，其据此通过引用整体并入)。两种试剂都防护突变诱导，在防止突变方面WR1065比WR151326更有效。在使用B6C3F1雄性小鼠的体内实验中，评估了400mg/kg剂量的WR2721防护由JANUS裂变谱中子引起的突变诱导的能力(Grdina等人，“The Radioprotector WR-2721 Reduces Neutron-Induced Mutations at the hypoxanthine-guanine Phosphoribosyl Transferase
Locus in Mouse Splenocytes When Administered Prior to or Following
Irradiation,”Carcinogenesis 13(5):811-4(1992)，其据此通过引用整体并入)。WR1065在照射前、期间或之后施用时降低突变频率。然而，当施用剂量为50mg/kg而不是400mg/kg时，获得最高降低因数。
“Thiol and Disulfide Metabolites of the Radiation Protector and Potential Chemopreventive Agent WR-2721 are Linked to Both its Anti-Cytotoxic and Anti-Mutagenic Mechanisms of Action,”Carcinogenesis 16(4):767-74(1995)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，WR1065保护G0T淋巴细胞免受因电离辐射引起的突变诱导，在非循环细胞中显示出保护作用(Clark等人，“Hprt Mutations in Human T-Lymphocytes Reflect Radioprotective Effects of the Aminothiol,WR-1065,”Carcinogenesis 17(12),2647-2653(1996)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，在G0T淋巴细胞中，WR1065降低了对指示总体结构改变的突变的诱导(Clark等人，“The Aminothiol WR-1065 Protects T Lymphocytes From Ionizing Radiation-Induced Deletions of the HPRT Gene,”Cancer Epidemiol.Biomarkers.Prev.6(12):1033-7(1997)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，氨磷汀使小鼠脾细胞中HPRT基因中的环磷酰胺诱导的突变降低8倍(Grdina等人，“Chemopreventive Doses of Amifostine Confer no Cytoprotection to Tumor Nodules Growing in the Lungs of Mice Treated With Cyclophosphamide,”Semin.Oncol.26(2增刊7):22-7(1999)，其据此通过引用整体并入)。在使用静脉注射纤维肉瘤细胞意在定殖肺部的小鼠模型IV的体外实验中，评价了WR1065防止因环磷酰胺暴露而引起的HPRT突变的能力(Kataoka等人，“Antimutagenic Effects of Amifostine:
Clinical Implications,”Semin.Oncol.23(4增刊8):53-7(1996)，其据此通过引用整体并入)。在100mg/kg时，WR1065未降低环磷酰胺的抗癌效果，但的确显著降低了由这种化学治疗剂诱导的HPRT突变频率。在体外实验中，发现浓度为4毫摩尔的WR1065针对由于暴露于化学治疗剂顺式-DDP引起的HPRT基因中的突变诱导提供了显著防护(Nagy等人，“Protection Against cis-diamminedichloroplatinum Cytotoxicity and Mutagenicity in V79
Cells by 2-[[(aminopropyl)amino]ethanethiol,”Cancer Res.46(3):1132-5(1986)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，评估4毫摩尔的WR1065防止HPRT基因中的突变诱导，单链断裂的诱导以及博来霉素、氮芥、顺式-DDP或X射线辐射引起的细胞杀伤的能力(Nagy等人，“Protective Effects of 2-[(aminopropyl)amino]Ethanethiol Against Bleomycin and Nitrogen Mustard-Induced Mutagenicity in V79 Cells,”
Int.J.Radiat.Oncol.12(8):1475-8(1986)，其据此通过引用整体并入)。WR1065可以防护每种试剂的所有这些影响，但防护程度因试剂而异。在体外实验中，测试了WR1065和
WR151326防止因暴露于裂变光谱中子而在HPRT基因处突变诱导的能力(Grdina等人，
“Protection by WR1065 and WR151326 Against Fission-Neutron-Induced Mutations at the HGPRT Locus in V79 Cells,”Radiat.Res.117(3):500-10(1989)，其据此通过引用整体并入)。两种试剂都防护突变诱导，在防止突变方面WR1065比WR151326更有效。在使用B6C3F1雄性小鼠的体内实验中，评估了400mg/kg剂量的WR2721防护由JANUS裂变谱中子引起的突变诱导的能力(Grdina等人，“The Radioprotector WR-2721 Reduces Neutron-Induced Mutations at the hypoxanthine-guanine Phosphoribosyl Transferase
Locus in Mouse Splenocytes When Administered Prior to or Following
Irradiation,”Carcinogenesis 13(5):811-4(1992)，其据此通过引用整体并入)。WR1065在照射前、期间或之后施用时降低突变频率。然而，当施用剂量为50mg/kg而不是400mg/kg时，获得最高降低因数。
[0252] 抗血管生成：氨磷汀在与毒性迹象无关的剂量下降低了鸡胚绒毛尿囊膜中VEGF同种型VEGF(165)和VEGF(190)的mRNA水平和血管生成(Giannopoulou等人，“Amifostine has Antiangiogenic Properties in Vitro by Changing the Redox Status of Human Endothelial Cells,”Free Radic.Res.37(11):1191-9(2003)，其据此通过引用整体并入)。WR2721还降低了诱导型一氧化氮合酶的mRNA水平，并且还降低了相同模型中的层粘连蛋白和胶原蛋白沉积量“而不影响相应基因的表达”。参见同上。MMP-2蛋白水平不受影响，但基因表达降低。最后，纤溶酶活性由于氨磷汀而增加。作者得出结论，这些效应显示了WR1065抑制血管生成的证据。在另一项研究中，经证实氨磷汀使血清血管抑素水平增加4倍(Grdina等人，“Inhibition of Spontaneous Metastases Formation by Amifostine,”Int.J.Cancer 97(2):135-41(2002)，其据此通过引用整体并入)。使用Grdina等人使用的相同体内小鼠模型系统(Grdina等人，“Inhibition of Spontaneous Metastases
Formation by Amifostine,”Int.J.Cancer 97(2):135-41(2002)，其据此通过引用整体并入)，作者发现200mg/ml的WR2721剂量(而不是50mg/ml)不会改变血管抑素水平(Grdina等人，“Antimetastatic Effectiveness of Amifostine Therapy Following Surgical Removal of Sa-NH Tumors in Mice,”Semin.Oncol.29(6增刊19):22-8(2002)，其据此通过引用整体并入)。作者得出结论，这些效应的机制是氧化还原驱动的过程。
Formation by Amifostine,”Int.J.Cancer 97(2):135-41(2002)，其据此通过引用整体并入)，作者发现200mg/ml的WR2721剂量(而不是50mg/ml)不会改变血管抑素水平(Grdina等人，“Antimetastatic Effectiveness of Amifostine Therapy Following Surgical Removal of Sa-NH Tumors in Mice,”Semin.Oncol.29(6增刊19):22-8(2002)，其据此通过引用整体并入)。作者得出结论，这些效应的机制是氧化还原驱动的过程。
[0253] 抑制或减少肿瘤细胞生长：在与辐射诱导的肉瘤有关的研究中，使一半小鼠暴露于氨磷汀并在30分钟后，使所有小鼠(对照和经氨磷汀处理的)的右后腿暴露于3400至5700拉德(Milas等人“Inhibition of Radiation Carcinogenesis in Mice by S-2-(3-aminopropylamino)-ethylphosphorothioic Acid,”Cancer Res.44(12Pt 1):5567-9
(1984)，其据此通过引用整体并入)。在WR-2721加辐射暴露的小鼠中肿瘤细胞生长速率与仅暴露于辐射的小鼠相比降低。在与Sa-NH肉瘤细胞有关的研究中，为C3Hf/Kam小鼠注射Sa-NH肉瘤细胞，并且在肿瘤生长的同时，每隔一天用50mg/kg的WR2721处理6天；然后通过截肢去除肿瘤并在手术后立即施用WR2721，并在2天后再次施用(Grdina等人，“Inhibition of Spontaneous Metastases Formation by Amifostine,”Int.J.Cancer 97(2):135-41(2002)，其据此通过引用整体并入)。关于这一点的结果表明，氨磷汀能够诱导肿瘤生长稍微延迟，12至13天肿瘤达到截除的理想大小。在使用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)的研究中，WR1065m以4毫摩尔施用于中国仓鼠卵巢细胞时引起G2/M期的细胞周期延迟(Grdina等人，“Inhibition of Topoisomerase II Alpha Activity in CHO K1 Cells by 2-
[(aminopropyl)amino]ethanethiol(WR-1065),”Radiat.Res.138(1):44-52(1994)，其据此通过引用整体并入)。在与CHO细胞有关的进一步研究中，在4μM至4mM范围内WR1065暴露
30分钟引起细胞在G2中积聚(Murley等人，“WR-1065,An Active Metabolite of the Cytoprotector Amifostine,Affects Phosphorylation of Topoisomerase II Alpha Leading to Changes in Enzyme Activity and Cell Cycle Progression in CHO AA8 Cells,”Cell Prolif.30(6-7):283-94(1997)，其据此通过引用整体并入)。此外，已经表明WR1065诱导的拓扑异构酶II-α的抑制可引起整个细胞周期中细胞群体分布的改变
(Kataoka等人，“Activation of the Nuclear Transcription Factor kappaB(NFkappaB)and Differential Gene Expression in U87 Glioma Cells After Exposure to the Cytoprotector Amifostine,”Int.J.Radiat.53(1):180-9(2002)，其据此通过引用整体并入)。
(1984)，其据此通过引用整体并入)。在WR-2721加辐射暴露的小鼠中肿瘤细胞生长速率与仅暴露于辐射的小鼠相比降低。在与Sa-NH肉瘤细胞有关的研究中，为C3Hf/Kam小鼠注射Sa-NH肉瘤细胞，并且在肿瘤生长的同时，每隔一天用50mg/kg的WR2721处理6天；然后通过截肢去除肿瘤并在手术后立即施用WR2721，并在2天后再次施用(Grdina等人，“Inhibition of Spontaneous Metastases Formation by Amifostine,”Int.J.Cancer 97(2):135-41(2002)，其据此通过引用整体并入)。关于这一点的结果表明，氨磷汀能够诱导肿瘤生长稍微延迟，12至13天肿瘤达到截除的理想大小。在使用中国仓鼠卵巢细胞(CHO细胞)的研究中，WR1065m以4毫摩尔施用于中国仓鼠卵巢细胞时引起G2/M期的细胞周期延迟(Grdina等人，“Inhibition of Topoisomerase II Alpha Activity in CHO K1 Cells by 2-
[(aminopropyl)amino]ethanethiol(WR-1065),”Radiat.Res.138(1):44-52(1994)，其据此通过引用整体并入)。在与CHO细胞有关的进一步研究中，在4μM至4mM范围内WR1065暴露
30分钟引起细胞在G2中积聚(Murley等人，“WR-1065,An Active Metabolite of the Cytoprotector Amifostine,Affects Phosphorylation of Topoisomerase II Alpha Leading to Changes in Enzyme Activity and Cell Cycle Progression in CHO AA8 Cells,”Cell Prolif.30(6-7):283-94(1997)，其据此通过引用整体并入)。此外，已经表明WR1065诱导的拓扑异构酶II-α的抑制可引起整个细胞周期中细胞群体分布的改变
(Kataoka等人，“Activation of the Nuclear Transcription Factor kappaB(NFkappaB)and Differential Gene Expression in U87 Glioma Cells After Exposure to the Cytoprotector Amifostine,”Int.J.Radiat.53(1):180-9(2002)，其据此通过引用整体并入)。
[0254] 抑制或减少肿瘤细胞侵袭：在使用鸡胚绒毛尿囊膜的模型中的体外实验中，与毒性迹象无关的剂量下的WR1065，减少了MMP-2(与肿瘤细胞侵袭相关的酶)的基因表达，但蛋白质水平不受影响(Giannopoulou等人，“Amifostine has Antiangiogenic Properties in Vitro by Changing the Redox Status of Human Endothelial Cells,”Free Radic.Res.37(11):1191-9(2003)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，WR2721使基质金属蛋白酶(MMP)-2和-9的活性降低30-40％。WR2721也以剂量依赖性方式抑制Sa-NH细胞通过基质胶(Matrigel)的迁移(Grdina等人，“Inhibition of Spontaneous Metastases Formation by Amifostine,”Int.J.Cancer 97(2):135-41(2002)，其据此通过引用整体并入)。在体内实验中，为C3Hf/Kam小鼠注射Sa-NH肉瘤细胞，并且在肿瘤生长的同时，每隔一天用50mg/kg的WR2721处理6天；然后通过截肢去除肿瘤并在手术后立即施用WR2721，并在2天后再次施用(Grdina等人，“Inhibition of Spontaneous Metastases Formation by Amifostine,”Int.J.Cancer 97(2):135-41(2002)，其据此通过引用整体并入)。
[0255] 抑制或减少肿瘤细胞转移：为了研究WR1065的抗转移作用，为C3Hf/Kam小鼠注射Sa-NH肉瘤细胞，并且在肿瘤生长的同时，每隔一天用50mg/kg的WR2721处理6天；然后通过截肢去除肿瘤并在手术后立即施用WR2721，并在2天后再次施用(Grdina等人，“Inhibition of Spontaneous Metastases Formation by Amifostine,”Int.J.Cancer 97(2):135-41(2002)，其据此通过引用整体并入)。氨磷汀减少了有转移的动物的数量和每只动物的转移数量。在另一项研究中，经证实氨磷汀具有奇异效果；在施用50mg/kg的动物中肺转移显著减少。在该研究中，100mg/kg的剂量不太有效并且200mg/kg对转移无效(Grdina等人，“Antimetastatic Effectiveness of Amifostine Therapy Following Surgical Removal of Sa-NH Tumors in Mice,”Semin.Oncol.29(6增刊19):22-8(2002)，其据此通过引用整体并入)。在进一步的研究中，发现WR2721几乎完全消除了C3Hf/Kam小鼠全身照射的肿瘤摄取增强作用，并显著减少了5天前接受有或无环磷酰胺的WBI的小鼠的肺结节形成(Milas等人，“Protection by S-2-(3-aminopropylamino)ethylphosphorothioic Acid Against Radiation-and Cyclophosphamide-Induced Attenuation in Antitumor
Resistance,”Cancer Res.44(6):2382-6(1984)，其据此通过引用整体并入)。此外，在患有转移性黑素瘤患者中观察到的部分响应中，53％发生在先前接受过化学疗法的患者中，并且响应的转移部位包括皮下部位、淋巴结、肺和肝(Glover等人，“WR-2721and High-Dose Cisplatin:An Active Combination in the Treatment of Metastatic Melanoma,”
J.Clin.Oncol.5(4):574-8(1987)，其据此通过引用整体并入)。平均响应时间为4.5个月。
Resistance,”Cancer Res.44(6):2382-6(1984)，其据此通过引用整体并入)。此外，在患有转移性黑素瘤患者中观察到的部分响应中，53％发生在先前接受过化学疗法的患者中，并且响应的转移部位包括皮下部位、淋巴结、肺和肝(Glover等人，“WR-2721and High-Dose Cisplatin:An Active Combination in the Treatment of Metastatic Melanoma,”
J.Clin.Oncol.5(4):574-8(1987)，其据此通过引用整体并入)。平均响应时间为4.5个月。
[0256] 除了上述抗癌作用之外，已证实氨基硫醇(例如氨磷汀(WR2721)和WR1065)对其它抗癌疗法也有影响。对其它抗癌疗法的示例性影响包括增强其它抗癌疗法(例如增强化学治疗剂的细胞毒性，增强放射疗法的细胞毒性效应，改善对化学疗法的的响应，对非癌细胞的选择性放射保护效应)。通过体外或体内研究鉴定的对其它抗癌疗法的示例性影响总结如下。
[0257] 增强抗癌疗法：在体外实验中，WR1065增强化学治疗剂博来霉素在处于细胞周期的G0期的人淋巴细胞中的细胞毒性(Hoffmann等人，“Structure-Activity Analysis of the Potentiation by Aminothiols of the Chromosome-Damaging Effect of Bleomycin in G0 Human Lymphocytes,”Environ.Mol.Mutagen.37(2):117-27(2001)，其据此通过引用整体并入)。在体外实验中，WR2721与马磷酰胺(mafosfamide)组合引起正常髓系和红系祖细胞存活，同时增加白血病细胞的细胞死亡程度(List“, Use of Amifostine in Hematologic Malignancies,Myelodysplastic Syndrome,and Acute Leukemia,”
Semin.Oncol.26(2增刊7):61-5(1999)，其据此通过引用整体并入)。在体内实验中，WR2721和顺铂(cisplatin)的组合引起在晚期恶性黑素瘤患者中与单独的顺铂相比部分响应改善(部分响应分别为53％与10％)(Glover等人，“WR-2721 and High-Dose Cisplatin:An Active Combination in the Treatment of Metastatic Melanoma,”J.Clin.Oncol.5(4):574-8(1987)，其据此通过引用整体并入。在36名患者中的另外3名(8％)中观察到轻微响应。在犬肉瘤研究中的体内实验中，发现有证据表明WR2721增强了放射疗法对一个亚类的肿瘤的细胞毒性作用，而不影响放射对其余肿瘤的细胞毒性(Koukourakis,
“Amifostine:Is There Evidence of Tumor Protection？”Semin.Oncol.30(6增刊18):
18-30(2003)，其据此通过引用整体并入)。在体内实验中，WR2721在与产生氧自由基的化学治疗剂组合施用给小鼠时具有协同的细胞毒性。在用WR2721处理的小鼠中，谷胱甘肽合成途径似乎失活。另外，发现WR33278对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(其是谷胱甘肽合成中的限速酶)具有强烈的抑制作用。对半胱胺和氧自由基得到了类似结果。氧自由基增加了WR1065氧化成WR33278的速率(Schor,“Mechanisms of Synergistic Toxicity of the
Radioprotective Agent,WR2721,and 6-hydroxydopamine,”Biochem.Pharmacol.37(9):
1751-62(1988)，其据此通过引用整体并入)。在体内实验中，在全身照射30分钟前给予的WR2721显著增加了8mm直径纤维肉瘤的局部放射治愈率(Milas等人，“Protection by S-2-(3-aminopropylamino)ethylphosphorothioic Acid Against Radiation-and
Cyclophosphamide-Induced Attenuation in Antitumor Resistance,”Cancer Res.44(6):2382-6(1984)，其据此通过引用整体并入)。在携带皮下人卵巢癌异种移植物OVCAR-3的小鼠中的体内实验中，WR2721增强了卡铂(carboplatin)的抗肿瘤功效(Treskes等人,“Effects of the Modulating Agent WR2721 on Myelotoxicity and Antitumour
Activity in Carboplatin-Treated Mice,”Eur.J.Cancer.30A(2):183-7(1994)，其据此通过引用整体并入)。在两种不同肿瘤类型的小鼠模型中的体内实验中，当氨磷汀与MISO组合时，观察到相加的毒性作用(Rojas等人，“Interaction of Misonidazole and WR-
2721--II.Modification of Tumour Radiosensitization,”Br.J.Cancer 47(1):65-72(1983)，其据此通过引用整体并入)。药物的作用似乎与肿瘤的氧状态有关，并且MISO可以作为氧模拟物来降低WR2721的辐射防护。在体内实验中，经证实氨磷汀会增强一些化学治疗剂如顺铂、卡铂和紫杉醇(paclitaxel)的细胞毒性作用(Kurbacher等人，
“Chemoprotection in Anticancer Therapy:The Emerging Role of Amifostine(WR-
2721),”Anticancer Res.18(3C):2203-10(1998)，其据此通过引用整体并入)。
Semin.Oncol.26(2增刊7):61-5(1999)，其据此通过引用整体并入)。在体内实验中，WR2721和顺铂(cisplatin)的组合引起在晚期恶性黑素瘤患者中与单独的顺铂相比部分响应改善(部分响应分别为53％与10％)(Glover等人，“WR-2721 and High-Dose Cisplatin:An Active Combination in the Treatment of Metastatic Melanoma,”J.Clin.Oncol.5(4):574-8(1987)，其据此通过引用整体并入。在36名患者中的另外3名(8％)中观察到轻微响应。在犬肉瘤研究中的体内实验中，发现有证据表明WR2721增强了放射疗法对一个亚类的肿瘤的细胞毒性作用，而不影响放射对其余肿瘤的细胞毒性(Koukourakis,
“Amifostine:Is There Evidence of Tumor Protection？”Semin.Oncol.30(6增刊18):
18-30(2003)，其据此通过引用整体并入)。在体内实验中，WR2721在与产生氧自由基的化学治疗剂组合施用给小鼠时具有协同的细胞毒性。在用WR2721处理的小鼠中，谷胱甘肽合成途径似乎失活。另外，发现WR33278对γ-谷氨酰半胱氨酸合成酶(其是谷胱甘肽合成中的限速酶)具有强烈的抑制作用。对半胱胺和氧自由基得到了类似结果。氧自由基增加了WR1065氧化成WR33278的速率(Schor,“Mechanisms of Synergistic Toxicity of the
Radioprotective Agent,WR2721,and 6-hydroxydopamine,”Biochem.Pharmacol.37(9):
1751-62(1988)，其据此通过引用整体并入)。在体内实验中，在全身照射30分钟前给予的WR2721显著增加了8mm直径纤维肉瘤的局部放射治愈率(Milas等人，“Protection by S-2-(3-aminopropylamino)ethylphosphorothioic Acid Against Radiation-and
Cyclophosphamide-Induced Attenuation in Antitumor Resistance,”Cancer Res.44(6):2382-6(1984)，其据此通过引用整体并入)。在携带皮下人卵巢癌异种移植物OVCAR-3的小鼠中的体内实验中，WR2721增强了卡铂(carboplatin)的抗肿瘤功效(Treskes等人,“Effects of the Modulating Agent WR2721 on Myelotoxicity and Antitumour
Activity in Carboplatin-Treated Mice,”Eur.J.Cancer.30A(2):183-7(1994)，其据此通过引用整体并入)。在两种不同肿瘤类型的小鼠模型中的体内实验中，当氨磷汀与MISO组合时，观察到相加的毒性作用(Rojas等人，“Interaction of Misonidazole and WR-
2721--II.Modification of Tumour Radiosensitization,”Br.J.Cancer 47(1):65-72(1983)，其据此通过引用整体并入)。药物的作用似乎与肿瘤的氧状态有关，并且MISO可以作为氧模拟物来降低WR2721的辐射防护。在体内实验中，经证实氨磷汀会增强一些化学治疗剂如顺铂、卡铂和紫杉醇(paclitaxel)的细胞毒性作用(Kurbacher等人，
“Chemoprotection in Anticancer Therapy:The Emerging Role of Amifostine(WR-
2721),”Anticancer Res.18(3C):2203-10(1998)，其据此通过引用整体并入)。
[0258] 此外，已经表明在正常细胞中没有或具有最低细胞毒性作用的药物剂量下出现抗癌效应，所述细胞包括牛动脉内皮细胞(参见Brenner等人，“Variable Cytotoxicity of Amifostine in Malignant and Non-Malignant Cell Lines,”Oncol.Rep.10(5):1609-13(2003)，其据此通过引用整体并入)；肝(体内)(Shaw等人，“Metabolic Pathways of WR-2721(ethyol,amifostine)in the BALB/c Mouse,”Drug Metab.Dispos.22(6):895-902(1994)(在>7400皮摩尔/10(6)个细胞下未观察到细胞毒性)；肾(体内)(Shaw等人，
“Metabolic Pathways of WR-2721(ethyol,amifostine)in the BALB/c Mouse,”Drug Metab.Dispos.22(6):895-902(1994)(在>17,000皮摩尔/10(6)个细胞下未观察到细胞毒性)；小肠(体内)(Shaw等人，“Metabolic Pathways of WR-2721(ethyol,amifostine)in the BALB/c Mouse,”Drug Metab.Dispos.22(6):895-902(1994)(在>3000皮摩尔/10(6)个细胞下未观察到细胞毒性)。上述参考文献中的每一个据此通过引用整体并入。
“Metabolic Pathways of WR-2721(ethyol,amifostine)in the BALB/c Mouse,”Drug Metab.Dispos.22(6):895-902(1994)(在>17,000皮摩尔/10(6)个细胞下未观察到细胞毒性)；小肠(体内)(Shaw等人，“Metabolic Pathways of WR-2721(ethyol,amifostine)in the BALB/c Mouse,”Drug Metab.Dispos.22(6):895-902(1994)(在>3000皮摩尔/10(6)个细胞下未观察到细胞毒性)。上述参考文献中的每一个据此通过引用整体并入。
[0259] 因此，根据本发明的受试者可以是患有肿瘤病状的受试者并且在有效治疗所述肿瘤病状的条件下施用所述氨基硫醇-偶联物或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物。如本文所述，治疗可以包括在受试者中的任何抗癌作用(例如，抗肿瘤性转化、正常细胞中的抗诱变、抗血管生成、抑制或减少肿瘤细胞生长、抑制或减少肿瘤细胞侵袭以及抑制或减少肿瘤细胞转移)。
[0260] 在一个实施方案中，所述肿瘤病状选自由乳房肿瘤、卵巢肿瘤、子宫颈肿瘤、结肠肿瘤、肺肿瘤、皮肤肿瘤(恶性黑素瘤)、淋巴网状内皮细胞肿瘤及其组合组成的组。在一个实施方案中，所述肿瘤病状是骨髓增生异常病状。
[0261] 在一个实施方案中，所述受试者是接受放射疗法、化学疗法或其组合的受试者，并且在有效减少或降低放射疗法、化学疗法或其组合的不利或不良副作用的条件下施用所述氨基硫醇-偶联物或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物。
[0262] 在一个实施方案中，所述受试者是接受癌症疗法(例如放射疗法、化学疗法或其组合)的受试者并且在有效增强癌症疗法功效的条件下施用所述氨基硫醇-偶联物或包含氨基硫醇-偶联物的药物组合物。
[0264] 在一个实施方案中，哺乳动物是人。在一个实施方案中，哺乳动物是非人动物。
[0265] 上述改善的药物递送系统可以使用已知的或未来描述的任何适当的药物施用方法施用，包括但不限于静脉内、皮下、口服、腹膜内、鼻内、直肠内、局部、通过吸入和/或透皮贴片。可以将药物封装在任何递送模块中，其通过封装或掺入到纳米颗粒、胶束、脂质体、纳米凝胶或其它(参见上文)中实现向预期靶细胞的药物递送。
[0266] 药物剂量水平应基于正在递送的氨基硫醇(或其类似物)的水平。因此，下面的讨论考虑了正在施用的氨基硫醇的剂量，而不是正在施用的前药的总量。前药的总量将根据正在施用的前药的性质而变化。活性部分(氨基硫醇)可以按选择为60kg体重的成人提供910mg/m2或更低当量的剂量施用。对于60kg体重的成人而言，该剂量相当于24.3mg/kg体重(或对于60kg体重的成人而言总剂量为1456mg)。给予儿童总剂量达2700mg/m2的胺磷汀形式的氨基硫醇。
[0267] 当需要或期望重复给药时，可能需要以低于该水平的剂量施用氨基硫醇。另外，可能需要使用初始高剂量(推注剂量)施用化合物，然后逐渐减量至较低剂量，以每周重复多次或每天施用一次。740mg/m2剂量的氨基硫醇或氨基硫醇当量与较少副作用相关(List等人，“Stimulation of Hematopoiesis by Amifostine in Patients with Myelodysplastic Syndrome,”Blood 90:3364-3369(1997)，其据此通过引用整体并入)并且通常优选这样。对于每日给药，通常优选200-340mg/m2的氨磷汀(对于60kg体重的成人而言总剂量为544mg)(Santini等人，“The Potential of Amifostine:from Cytoprotectant to Therapeutic Agent,”Haematologica 84:1035-1042(1999)；Schuchter“,Guidelines for the Administration of Amifostine,”Semin Oncol 23:40-43(1996)，其各自据此通过引用整体并入)。按500-910mg/m2通过注射给予的WR2065的血浆T1/2为约10分钟并且血浆峰值水平为约100μM。
[0268] 啮齿动物研究表明使用更高的剂量。例如，小鼠中WR-1065(呈氨磷汀形式)的最大耐受剂量(MTD)为腹膜内施用432mg/kg体重和口服施用720mg/kg体重，并且100％有效辐射防护剂量为MTD的约一半。对于呈phosphonol形式递送的氨基硫醇，MTD为腹膜内施用893mg/kg体重和口服施用1488mg/kg体重，并且100％有效辐射防护剂量为MTD的约一半。所有氨基硫醇在啮齿动物中的MTD都高于400mg/kg体重。
[0269] 包括WR-1065在内的氨基硫醇在非常低的浓度下可以是有效的，例如，在一些体外研究中低至0.4微摩尔浓度。
[0270] 虽然通常优选配制用于口服施用的氨基硫醇-偶联物药物，但是可以配制药物以允许它们通过其它途径施用。在某些实施方案中可能需要配制用于静脉施用的药物以使功效最大化。由于WR-1065和WR-255591之间的结构相似性，特别是分子巯基末端的相似性，预计WR-255591的表现方式类似于WR-1065。
[0271] 氨基硫醇并且特别是WR1065的罕见特征是可以测定氨基硫醇的细胞内水平(Bai等人，“New Liquid Chromatographic Assay with Electrochemical Detection for the M e a s u r e m e n t o f A m i f o s t i n e a n d W R 1 0 6 5 ,”J.Chromatogr.B.Analyt.Technol.Biomed.Life.Sci.772:257-265(2002)；Elas等人，“Oral Administration is as Effective as Intraperitoneal Administration of Amifostine in Decreasing Nitroxide EPR Signal Decay In
Vivo.Biochim.Biophys.Acta.1637:151-155(2003)；Shaw等人，“Pharmacokinetic
Profile of Amifostine,”Semin.Oncol.23:18-22(1996)，其各自据此通过引用整体并入)。这使得可能使用细胞内氨基硫醇水平作为药物施用的指导。对于抗癌作用，推荐按产生30至100纳摩尔氨基硫醇/106个细胞的水平施用前药。对于某些肿瘤类型，较低的细胞内水平同样有效且可以使用。对于与MDA-MB-468细胞属于相同类别和/或具有相同或相似遗
6
传、表观遗传和基因表达变化的乳腺癌，在0.001至30纳摩尔氨基硫醇/10个细胞的范围内的细胞内水平是有效的。对于抗病毒作用，推荐按产生在0.001至30纳摩尔氨基硫醇/106个细胞的范围内的细胞内水平的剂量水平施用前药。
Vivo.Biochim.Biophys.Acta.1637:151-155(2003)；Shaw等人，“Pharmacokinetic
Profile of Amifostine,”Semin.Oncol.23:18-22(1996)，其各自据此通过引用整体并入)。这使得可能使用细胞内氨基硫醇水平作为药物施用的指导。对于抗癌作用，推荐按产生30至100纳摩尔氨基硫醇/106个细胞的水平施用前药。对于某些肿瘤类型，较低的细胞内水平同样有效且可以使用。对于与MDA-MB-468细胞属于相同类别和/或具有相同或相似遗
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传、表观遗传和基因表达变化的乳腺癌，在0.001至30纳摩尔氨基硫醇/10个细胞的范围内的细胞内水平是有效的。对于抗病毒作用，推荐按产生在0.001至30纳摩尔氨基硫醇/106个细胞的范围内的细胞内水平的剂量水平施用前药。
[0272] 为了获得氨基硫醇的最佳疗效，可能需要不止一次施用前药。于多日或多周给药，推荐按产生0.000001至30纳摩尔氨基硫醇/106个细胞的剂量水平施用前药。对于所有其它疗效，包括辐射防护和细胞保护作用，可以按产生在1至100纳摩尔氨基硫醇/106个细胞的范围内的细胞内水平的剂量水平施用前药。
[0273] 应该注意的是，所施用的前药的水平将基于前药的结构和要寻求疗效的靶细胞的性质变化甚大。对于表达聚胺或叶酸运输系统的靶细胞，设计利用这些主动运输系统的前药通常可以按较低的量施用，所述量为使用不会主动运输到细胞内的前药获得相当细胞内水平所需的量。另外，主动运输系统的表达水平可以在病变或应激细胞之间变化，并且可以受到前药治疗的影响，结果是随着时间的推移施用多个剂量时，较低的前药剂量可能足以获得疗效。
[0274] 还涵盖了包括本文描述的氨基硫醇-偶联物前药和一种或多种其它药剂的联合疗法。本文描述的前药可以与用于获得氨基硫醇的治疗益处的其它药剂组合施用。此类联合疗法的益处之一是可以施用较低剂量的治疗剂和/或可以实现更大的疗效。对于已知具有基因毒性和线粒体毒性的抗逆转录病毒药物，此类较低剂量可能特别有利。
[0275] 可以将本文描述的氨基硫醇-偶联物(包括其衍生物、异构体、代谢产物或药学上可接受的酯、盐和溶剂化物)掺入药学上可接受的载体中，包括掺入纳米颗粒中，用于施用给需要氨基硫醇疗效的个体。
[0276] 本发明的一方面涉及包含如本文所述的氨基硫醇-偶联物的药物组合物。在一个实施方案中，如上所述，氨基硫醇-偶联物具有式(IV)。在一个实施方案中，如上所述，氨基硫醇-偶联物具有式(I)。
[0277] 该药物组合物还可包括细胞内递送系统。所述细胞内递送系统可选自：(a)包含细胞穿透剂的系统，(b)pH响应型载体，(c)C2-链霉亲和素递送系统，(d)CH(3)-TDDS药物递送系统，(e)疏水性生物活性载体，(f)外泌体，(g)基于脂质的递送系统，(h)基于脂质体的递送系统，(i)胶束递送系统，(j)微粒，(k)分子载体，(l)纳米载体，(m)纳米多元载体，(n)纳米凝胶，(o)由两种或更多种微粒递送系统的组分组成的混合纳米载体系统，(p)纳米颗粒，(q)基于肽的药物递送系统，和(r)基于聚合物或共聚物的递送系统。在某些实施方案中，细胞内递送系统是纳米颗粒。
[0278] 在某些实施方案中，药物组合物不包括纳米颗粒递送系统。
[0279] 该药物组合物还可包含表面活性剂。
[0280] 药物组合物还可包含还原剂。
[0281] 本发明的另一方面涉及包含如本文所述的一种或多种不同氨基硫醇-偶联物的组合物。在某些实施方案中，所述一种或多种不同的氨基硫醇-偶联物的平均分子量为100,000道尔顿或更小。在某些实施方案中，所述一种或多种不同的氨基硫醇-偶联物的平均分子量为约100,000道尔顿、20,000道尔顿、10,000道尔顿、5,000道尔顿、3,000道尔顿、2,000道尔顿或1000道尔顿。在某些实施方案中，平均分子量为约9,000至约11,000道尔顿。在某些实施方案中，平均分子量为约9,000至约11,000道尔顿。在一个实施方案中，平均分子量为约10,000道尔顿。在一个实施方案中，平均分子量为约10,500道尔顿。
[0282] 本发明的另一方面涉及包含如本文所述的一种或多种不同氨基硫醇-偶联物的试剂盒。
[0283] 本发明的再一方面涉及还包含一种或多种附加治疗剂的试剂盒。
[0284] 因为一些氨基硫醇-偶联物前药可能对氧化敏感，所以可能需要将前药与还原剂组合施用，所述还原剂包括但不限于维生素C和维生素E。其它还原剂包括有机醛、含羟基的醛和还原糖如葡萄糖、甘露糖、半乳糖、木糖、核糖和阿拉伯糖。可以采用其它含有半缩醛或酮基类的还原糖，例如麦芽糖、蔗糖、乳糖、果糖和山梨糖。其它还原剂包括醇，优选多元醇如甘油、山梨醇、二醇，特别是乙二醇和丙二醇，以及聚二醇如聚乙二醇和聚丙二醇。
[0285] 本文描述的氨基硫醇-偶联物及其部分还包括其药学上可接受的盐。如本文使用的术语“药学上可接受的盐”和“其药学上可接受的盐”是广义的术语，并且将赋予本领域普通技术人员理解的一般普通含义(并且不限于特殊或定制含义)，并且是指(不限于)由药学上可接受的无毒酸或碱制备的盐。合适的药学上可接受的盐包括金属盐，例如铝盐、锌盐，碱金属盐例如锂盐、钠盐和钾盐，碱土金属盐例如钙盐和镁盐；有机盐，例如赖氨酸、N,N’-二苄基乙二胺、氯普鲁卡因(chloroprocaine)、胆碱、二乙醇胺、乙二胺、葡甲胺(N-甲基葡糖胺)、普鲁卡因(procaine)和tris的盐；游离酸和碱的盐；三氟乙酸盐；无机盐，例如硫酸盐、盐酸盐和氢溴酸盐；以及目前广泛用于药物用途且列于本领域技术人员熟知的来源例如The Merck Index.中的其它盐。可以选择任何合适的组成部分来制备本文讨论的治疗剂的盐，只要它是无毒的并且基本上不干扰所需活性。除了盐以外，还可以采用化合物的药学上可接受的前体和衍生物。药学上可接受的酰胺、低级烷基酯和受保护的衍生物也适合用于组合物中。虽然可能以药学上可接受的盐形式施用优选实施方案的化合物，但通常优选以中性形式施用化合物。
[0286] 通常优选口服施用优选实施方案的化合物；然而，也考虑了其它的施用途径。考虑到的施用途径包括但不限于口服、肠胃外、静脉内、皮下、直肠内、鼻内、透皮和通过吸入。前药可以配制成用于例如口服施用的液体制剂。合适的形式包括混悬剂、糖浆剂、酏剂等。特别优选用于口服施用的单位剂型包括片剂和胶囊。
[0287] 前药的药物组合物优选与受者的血液或其它体液等渗。组合物的等渗性可以用酒石酸钠、丙二醇或其它无机或有机溶质来得到。特别优选氯化钠。可以采用缓冲剂，例如乙酸和盐、柠檬酸和盐、硼酸和盐，以及磷酸和盐。胃肠外媒介物包括氯化钠溶液、林格氏葡萄糖(Ringer's dextrose)、葡萄糖和氯化钠、乳酸林格氏液或不挥发性油。静脉内媒介物包括流体和营养补充剂、电解质补充剂(如基于林格氏葡萄糖的补充剂)等。在某些实施方案中，可能需要将活性化合物保持为还原态。因此，可能需要在调配物中包括还原剂，例如维生素C、维生素E或制药领域已知的其它还原剂。
[0288] 使用药学上可接受的增稠剂可将药物组合物的粘度保持在选定水平。优选甲基纤维素，因为它容易获得且在经济上可用并且易于使用。其它合适的增稠剂包括例如黄原胶、羧甲基纤维素、羟丙基纤维素、卡波姆(carbomer)等。增稠剂的优选浓度将取决于所选择的增稠剂。优选使用将达到选定粘度的量。通常通过添加此类增稠剂由溶液制备粘稠组合物。
[0289] 药学上可接受的防腐剂可用于增加药物组合物的保质期。苄醇可以是合适的，尽管也可以采用各种防腐剂，包括例如对羟基苯甲酸酯、硫柳汞、氯丁醇或苯扎氯铵。按组合物总重量计防腐剂的合适浓度通常为约0.02％至约2％，尽管根据所选择的试剂，较大或较小的量也可能是满足需要的。如上所述，还原剂可以有利地用于保持调配物的良好保质期。
[0290] 前药可以与合适的载体、稀释剂或赋形剂如无菌水、生理盐水、葡萄糖等混合，并且根据施用途径和所需制剂，可以含有辅助物质如润湿剂或乳化剂、pH缓冲剂、胶凝添加剂或增强粘度的添加剂、防腐剂、调味剂、着色剂等。参见例如“Remington:The Science and Practice of Pharmacy”,Lippincott Williams&Wilkins；第20版(2003年6月1日)and“Remington’s Pharmaceutical Sciences,”Mack Pub.Co.；第18和第19版(分别为1985年12月和1990年6月)。此类制剂可以包括络合剂；金属离子；聚合化合物如聚乙酸、聚乙醇酸、水凝胶、葡聚糖等；脂质体、微乳剂、胶束、单层或多层囊泡、红细胞血影或原生质球(spheroblast)。适于脂质体调配物的脂质包括但不限于甘油单酯、甘油二酯、硫苷脂、溶血卵磷脂、磷脂、皂苷、胆汁酸等。此类附加组分的存在可以影响物理状态、溶解度、稳定性、体内释放速率和体内清除速率，并且因此根据预期应用来选择，使得载体的特性适于所选施用途径。
[0291] 对于口服施用，药物组合物可以作为片剂、水性或油性混悬剂、可分散的粉末或颗粒、乳剂、硬或软胶囊、糖浆或酏剂提供。可以根据本领域已知用于制造药物组合物的任何方法制备预期用于口服使用的组合物并且可以包括以下试剂中的一种或多种：甜味剂、调味剂、着色剂和防腐剂。水性混悬液可含有与适于制造水性混悬液的赋形剂混合的活性成分。
[0292] 供口服使用的调配物也可以作为硬明胶胶囊提供，其中活性成分与惰性固体稀释剂例如碳酸钙、磷酸钙或高岭土混合，或作为软明胶胶囊提供。在软胶囊中，活性化合物可溶解或悬浮于合适的液体中，例如水或油介质，如花生油、橄榄油、脂肪油、液体石蜡或液体聚乙二醇。也可以使用配制用于口服施用的稳定剂和微球。胶囊可包括由明胶制成的推入式(push-fit)胶囊以及由明胶和增塑剂如甘油或山梨糖醇制成的软密封胶囊。推入式胶囊可含有活性成分，混合有填充剂如乳糖、粘合剂如淀粉和/或润滑剂如滑石或硬脂酸镁且任选含有稳定剂。在需要将优选实施方案的化合物保持为还原形式的情况下(在某些活性代谢产物的情况下)，可能需要在胶囊或其它剂型中包括还原剂。
[0293] 片剂可以无包衣或通过已知技术进行包衣，以延迟在胃肠道中的崩解和吸收并由此在较长时间段内提供持续作用。例如，可以使用延时材料，例如甘油单硬脂酸酯。当以固体形式(例如片剂形式)施用时，固体形式通常包含约0.001重量％或更少至约50重量％或更多的活性成分，优选约0.005、0.01、0.02、0.03、0.04、0.05、0.06、0.07、0.08、0.09、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9或1重量％至约2、3、4、5、6、7、8、9、10、15、20、25、30、
35、40或45重量％。
35、40或45重量％。
[0294] 片剂可含有与无毒的药学上可接受的赋形剂(包括惰性材料)混合的活性成分。例如，片剂可以通过压制或模制，任选地与一种或多种附加成分制备。压制片剂可通过在适合机器中压制任选与粘合剂、润滑剂、惰性稀释剂、表面活性剂或分散剂混合的呈自由流动形式(诸如粉末或颗粒)的活性成分来制备。可通过在合适机器中模制用惰性液体稀释剂润湿的粉末状化合物的混合物来制备模制片剂。
[0295] 优选地，每个片剂或胶囊含有约10mg或更少至约1,000mg或更多的所选前药，更优选约20、30、40、50、60、70、80、90或100mg至约150、200、250、300、350、400、450、500、550、600、650、700、750、800或900mg。最优选地，以一定剂量范围提供片剂或胶囊以容许施用分开剂量。因此可以方便地选择适于患者的剂量和每日施用的剂量数量。对于某些应用，可以优选将两种或更多种要施用的前药掺入单一片剂或其它剂型中(例如，在联合疗法中)；然而，对于其它应用，可以优选以单独剂型提供治疗剂。
[0296] 合适的惰性物质包括稀释剂如碳水化合物、甘露醇、乳糖、无水乳糖、纤维素、蔗糖、改性葡聚糖、淀粉等；或无机盐如三磷酸钙、磷酸钙、磷酸钠、碳酸钙、碳酸钠、碳酸镁和氯化钠。在调配物中可包括崩解剂或成粒剂，例如淀粉如玉米淀粉、海藻酸、羟基乙酸淀粉钠、安伯来特(Amberlite)、羧甲基纤维素钠、超支链淀粉、海藻酸钠、明胶、橙皮、酸性羧甲基纤维素、天然海绵和膨润土、不溶性阳离子交换树脂、粉状树胶如琼脂、刺梧桐树胶或黄蓍胶或海藻酸或其盐。
[0297] 粘合剂可用于形成硬片剂。粘合剂包括来自天然产物的物质，例如阿拉伯胶、黄蓍胶、淀粉和明胶、甲基纤维素、乙基纤维素、羧甲基纤维素、聚乙烯吡咯烷酮、羟丙基甲基纤维素等。
[0299] 也可以采用表面活性剂，例如阴离子洗涤剂如月桂基硫酸钠、二辛基磺基琥珀酸钠和二辛基磺酸钠，阳离子洗涤剂如苯扎氯铵或苄索氯铵，或非离子洗涤剂如聚氧乙烯氢化蓖麻油、甘油单硬脂酸酯、聚山梨酯、蔗糖脂肪酸酯、甲基纤维素或羧甲基纤维素。也可使用Stogniew的美国专利第6,489,312号(其据此通过引用整体并入)所述的表面活性剂。
[0301] 可以使用包衣，例如，非肠溶性物质如甲基纤维素、乙基纤维素、羟乙基纤维素、甲基羟乙基纤维素、羟丙基纤维素、羟丙基甲基纤维素、羧甲基纤维素钠、聚维酮和聚乙二醇，或肠溶性物质如邻苯二甲酸酯。可添加染料或色素用于标识或表征活性化合物剂量的不同组合。
[0302] 当以液体形式口服施用时，可以向活性成分中添加液体载体如水、石油、动物或植物来源的油如花生油、矿物油、大豆油或芝麻油，或合成油。生理盐水溶液、葡萄糖或其它糖溶液或二醇类例如乙二醇、丙二醇或聚乙二醇也是合适的液体载体。所述药物组合物也可以是水包油乳液的形式。油相可为植物油例如橄榄油或花生油，可以是矿物油例如液体石蜡，或其混合物。适合的乳化剂包括天然存在的树胶，诸如阿拉伯树胶和黄蓍胶；天然存在的磷脂，诸如大豆卵磷脂，由脂肪酸和己糖醇酐衍生的酯类或偏酯类，诸如单油酸山梨醇酐酯；以及这些偏酯与环氧乙烷的缩合物，诸如聚氧乙烯山梨糖醇酐单油酸酯。所述乳液还可含甜味剂和调味剂。
[0303] 当所选前药通过静脉内、肠胃外或其它注射施用时，其优选为无热原、肠胃外可接受的水溶液或油性混悬液的形式。混悬液可以根据本领域熟知的方法，使用合适的分散或润湿剂和悬浮剂来配制。具有合适的pH、等渗性、稳定性等的可接受水溶液的制备在本领域技术范围内。优选的注射用药物组合物优选含有等渗媒介物如1,3-丁二醇、水、等渗氯化钠溶液、林格氏液、葡萄糖溶液、葡萄糖和氯化钠溶液、乳酸林格氏溶液或本领域已知的其它媒介物。另外，无菌不挥发性油可以常规地用作溶剂或悬浮介质。出于这个目的，可以采用任何温和不挥发性油，包括合成的单甘油酯或二甘油酯。另外，脂肪酸(例如油酸)同样可以用于形成可注射制剂。药物组合物还可以含有稳定剂、防腐剂、缓冲剂、抗氧化剂或本领域技术人员已知的其它添加剂。
[0304] 注射的持续时间可以根据各种因素进行调整，并且可以包括在几秒或更短的时间过程中施用的单次注射至0.5、0.1、0.25、0.5、0.75、1、2、3、4、5、6、7、8、9、10、11、12、13、14、15、16、17、18、19、20、21、22、23或24小时或更长时间的连续静脉施用。
[0305] 由一种或多种所选前药组成的药物组合物可另外采用按照惯例在药物组合物中以其本领域确定的方式和以其本领域确定的水平存在的辅助组分。因此，例如，所述组合物可以含有用于联合疗法的附加相容性药物活性物质(例如补充性抗微生物剂、止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂、抗炎剂、还原剂等)，或者可以含有用于物理配制优选实施方案的各种剂型的物质，例如赋形剂、染料、增稠剂、稳定剂、防腐剂或抗氧化剂。
[0306] 前药可以呈试剂盒的形式提供给主治医师或其它医疗保健专业人员。试剂盒是封装容器的包装，该容器容纳呈合适药物组合物的化合物以及向受试者施用该药物组合物的说明书。试剂盒还可任选地含有一种或多种附加治疗剂。例如，可以提供含有一种或多种组合物的试剂盒，所述组合物包含与一种或多种附加治疗剂(抗微生物剂、止痒剂、收敛剂、局部麻醉剂、抗炎剂、还原剂等)组合的一种或多种前药，或者可以提供单独的药物组合物，其含有一种或多种所选前药和附加治疗剂。该试剂盒还可以含有用于连续或依次施用的单独剂量的前药。试剂盒可任选地含有一个或多个诊断工具和使用说明书。试剂盒可以含有合适的递送装置，例如注射器等，连同施用化合物和任何其它治疗剂的说明书。试剂盒可以任选地含有储存、复水(如适用)以及施用所包括的任何或所有治疗剂的说明书。试剂盒可以包括多个反映要给予受试者的施用次数的容器。
[0307] 可以预防性施用前药以预防需要此类治疗的个体的细胞中对应激状态或疾病状态的诱导。可选地，优选在应激状态或疾病状态的体征和症状发作后尽可能早地开始治疗。施用途径、施用量和施用频率将根据患者的年龄、感染的严重程度以及任何相关病状变化。
用于治疗疾病状态例如癌症或微生物病原体感染的前药的预期量、剂量和施用途径类似于针对常规抗癌剂和抗病毒剂确定的那些。关于常规抗逆转录病毒剂的施用和剂量的详细信息可以在Physician’s Desk Reference，第47版中找到，其据此通过引用整体并入。这些信息可以用于设计利用前药的治疗方案。
用于治疗疾病状态例如癌症或微生物病原体感染的前药的预期量、剂量和施用途径类似于针对常规抗癌剂和抗病毒剂确定的那些。关于常规抗逆转录病毒剂的施用和剂量的详细信息可以在Physician’s Desk Reference，第47版中找到，其据此通过引用整体并入。这些信息可以用于设计利用前药的治疗方案。
[0308] 所考虑的用于口服施用以治疗癌症、病原体/微生物感染或用于细胞保护的前药的量的范围为约每24小时或更短时间到约每6小时或更长时间(或每天约1次至每天约6次)施用约10mg或更少至约2000mg或更多，持续约5天或更短时间至约10天或更长时间(40mg/天或更少至约15,000mg/天或更多)，或直至病状有显著改善。对于抑制易感个体中癌症或感染发作的抑制疗法，每天一次、两次或多次口服施用约10mg或更少至约1000mg或更多的剂量，通常长达约12个月，或者在某些情况下无限期地施用(约10mg/天至约1,000mg/天)。当长期治疗时，可能需要改变剂量，在治疗早期采用较高剂量，而在治疗后期采用较低剂量。
[0309] 文献中记载的向成人施用的氨磷汀单一最高剂量为1330mg/m2。儿童接受单次剂量达2700mg/m2的氨磷汀，无不良反应。文献指出，已在24小时内安全施用多个剂量(达740至910mg/m2推荐单剂量三倍)。在起始剂量后两小时和四小时重复施用氨磷汀似乎不会导致副作用增加，尤其是恶心、呕吐或低血压。看来由施用氨磷汀引起的最显著的有害副作用是低血压。
[0310] 所考虑的对于患有AIDS的个体的优选实施方案的化合物的量、施用方法和治疗方案通常与上述用于治疗HIV的那些类似。
[0311] 氨磷汀的已知副作用包括收缩压降低、恶心和呕吐。如果对于所施用的特定硫代磷酸酯观察到此类副作用，通常优选在硫代磷酸酯之前或连同硫代磷酸酯一起施用止吐药物。合适的止吐药物包括抗组胺药(例如，安其敏(buclizine)、赛克利嗪(cyclizine)、茶苯海明(dimenhydrinate)、苯海拉明(diphenhydramine)、美克洛嗪(meclizine))，抗胆碱能药(例如东莨菪碱(scopolamine))，多巴胺拮抗剂(例如氯丙嗪(chlorpromazine)、氟哌利多(droperidol)、甲氧氯普胺(metoclopramide)、丙氯拉嗪(prochlorperazine)、异丙嗪(promethazine))，血清素拮抗剂(例如多拉司琼(dolasetron)、格拉司琼(granisetron)、昂丹司琼(ondansetron))或其它试剂(例如地塞米松(dexamethasone)、甲基泼尼松龙(methylprednisolone)、曲美苄胺(trimethobenzamide))。
[0312] 实施例
[0313] 实施例1-在六种肿瘤细胞系中4-臂星形-PEG-WR1065(与WR1065偶联的4-臂-PEG)的细胞毒性作用
[0314] 为了评价与WR-1065(4SP65)偶联的4-臂星形聚乙二醇的抗癌活性，在NIH/NCI使用的一些相同细胞系中测定了4SP65的抗癌功效，并且使用的方法与NCI用于评价当前使用的化学治疗剂的方法相同(O'Connor等人，“Characterization of the p53 Tumor Suppressor Pathway in Cell Lines of the National Cancer Institute Anticancer Drug Screen and Correlations With the Growth-Inhibitory Potency of 123
Anticancer Agents,”Cancer Res.57(19):4285-300(1997)，其据此通过引用整体并入)。
完成了6种癌症类型的测试：(i)乳腺癌(MDA-MB-231细胞)，(ii)肺癌(A549)，(iii)恶性黑素瘤(SK-MEL-28)，(iv)骨髓性白血病(HL60细胞)，(v)卵巢癌(SK-OV-3)和(vi)前列腺癌(DU-145)。表1呈现了每种细胞系的生长抑制剂量50％。
Anticancer Agents,”Cancer Res.57(19):4285-300(1997)，其据此通过引用整体并入)。
完成了6种癌症类型的测试：(i)乳腺癌(MDA-MB-231细胞)，(ii)肺癌(A549)，(iii)恶性黑素瘤(SK-MEL-28)，(iv)骨髓性白血病(HL60细胞)，(v)卵巢癌(SK-OV-3)和(vi)前列腺癌(DU-145)。表1呈现了每种细胞系的生长抑制剂量50％。
[0315] 为了比较，使正常人乳腺上皮细胞生长减少50％所需的4SP65的生长抑制剂量高于300微摩尔。由于4SP65在以超过300微摩尔的浓度存在时在培养基中形成水凝胶，所以确切的值尚未确定。
[0316] 表1：
[0317] 暴露于4SP65 48小时后体外细胞生长减少50％所需的平均生长抑制剂量
[0318]
[0319] 用于获得表1中呈现的EC(50)值的方法如下。按照ATCC推荐的或按照文献中对于该细胞系介绍的，使每个细胞系在培养基中生长。所有细胞在隔水式培养箱中在36-37℃下并且在5％CO2的存在下培养。为确保最佳生长和活力，使所有细胞在涂有FNC(InVitrogen)的平板上生长。每周两次为细胞重新补给生长培养基直至其达到60-70％汇合度。此时，将培养基更换为补充有剂量范围为0至300微摩尔的4SP65的生长培养基。使细胞在这种补充培养基的存在下生长48小时，然后通过胰蛋白酶化将其去除，用台盼蓝(Trypan Blue)染色并在血细胞计数器中计数。每个实验每个剂量组进行三至4个重复。通过比较暴露于4SP65的存活细胞的平均数量与存活的假暴露细胞的平均数量来确定细胞死亡百分比。表1呈现了测试的每个细胞系的平均生长抑制剂量50％(EC(50))(微摩尔)。应该注意的是，所用方法不能很好地区分细胞杀伤与细胞生长停滞，因此EC(50)表示诱导一种或两种效应所需的药物剂量。
[0320] 实施例2-药物抗癌功效的意外变化
[0321] 这些关于4SP65抗癌活性的研究发现了意想不到的药物效应。简而言之，这些效应是(i)4SP65与单独的氨磷汀或WR1065相比，比可以基于每摩尔药物的可用WR1065分子数量预测的抗癌活性更高，(ii)在氨磷汀无活性或具有肿瘤保护作用的细胞类型中有细胞毒性活性，以及(iii)在肿瘤类型中的活性范围比对于已知抗癌剂而言在NIH-NCI60筛选中看到的更窄。图12显示了测试的所有肿瘤(见表1)，以及一种肿瘤类型(HL60细胞)中的氨磷汀和WR1065效应的平均结果。氨磷汀和WR1065在其它肿瘤类型中的结果与图12中显示的类似。
[0322] 据报道的研究发现WR-1065作为氨磷汀(WR-2721)递送时，对表1列出的所有肿瘤都有体外和/或体内抗癌活性，前列腺癌除外。文献没有表明的是，按摩尔比计，与活性部分WR-1065或WR-2721相比，用硫醇化4-臂星形PEG分子取代氨磷汀的-PO3部分增加了药物功效。4SP65的活性范围比WR-1065高8至12倍，比氨磷汀高100倍至数千倍，在特定肿瘤类型之间注意到有差异。按摩尔比计，对于每一个WR-1065或WR-2721分子，每摩尔4-臂星形PEG-WR1065(4SP65)具有四个WR1065分子，因此人们预计与WR-1065或氨磷汀相比，活性最多仅增加4倍。
[0323] 无法预料这种增加的活性的其它原因包括以下几点。WR1065和氨磷汀分别具有134.25和214.2道尔顿的低分子量。因此，它们主要经由通过细胞膜的被动扩散进入细胞(Lipinski等人，“Experimental and Computational Approaches to Estimate
Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings,”
Adv.Drug Deliv.Rev.46(1-3):3-26(2001)，其据此通过引用整体并入)，其中WR-1065比氨磷汀更容易被动扩散。一些研究人员发现有证据表明以低细胞浓度存在时，WR-1065经由聚胺运输系统被主动运输到细胞内(Mitchell等人，“Involvement of the Polyamine
Transport System in Cellular Uptake of the Radioprotectants WR-1065 and WR-
33278,”Carcinogenesis.16(12):3063-8(1995)；Mitchell等人，“Mammalian Cell Polyamine Homeostasis is Altered by the Radioprotector WR1065,”Biochem.J.335(Pt 2):329-34(1998)，其各自据此通过引用整体并入)，但并非所有研究者都同意这些数据(Newton等人，“Transport of Aminothiol Radioprotectors Into Mammalian Cells:
Passive Diffusion Versus Mediated Uptake,”Radiat.Res.146(2):206-15(1996)，其据此通过引用整体并入)。药物4SP65的分子量为约10,584道尔顿，该大小妨碍通过细胞膜的被动扩散，因此细胞内摄取必须通过其它机制例如内吞作用/胞饮作用进行(Lipinski等人，“Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings,”Adv.Drug
Deliv.Rev.46(1-3):3-26(2001)，其据此通过引用整体并入)。由于后者与被动扩散或主动运输相比是一个缓慢的过程，所以预计4SP65的摄取量将显著低于WR-1065或氨磷汀。较低的摄取量导致药物功效降低，而药物活性未增加。
Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings,”
Adv.Drug Deliv.Rev.46(1-3):3-26(2001)，其据此通过引用整体并入)，其中WR-1065比氨磷汀更容易被动扩散。一些研究人员发现有证据表明以低细胞浓度存在时，WR-1065经由聚胺运输系统被主动运输到细胞内(Mitchell等人，“Involvement of the Polyamine
Transport System in Cellular Uptake of the Radioprotectants WR-1065 and WR-
33278,”Carcinogenesis.16(12):3063-8(1995)；Mitchell等人，“Mammalian Cell Polyamine Homeostasis is Altered by the Radioprotector WR1065,”Biochem.J.335(Pt 2):329-34(1998)，其各自据此通过引用整体并入)，但并非所有研究者都同意这些数据(Newton等人，“Transport of Aminothiol Radioprotectors Into Mammalian Cells:
Passive Diffusion Versus Mediated Uptake,”Radiat.Res.146(2):206-15(1996)，其据此通过引用整体并入)。药物4SP65的分子量为约10,584道尔顿，该大小妨碍通过细胞膜的被动扩散，因此细胞内摄取必须通过其它机制例如内吞作用/胞饮作用进行(Lipinski等人，“Experimental and Computational Approaches to Estimate Solubility and Permeability in Drug Discovery and Development Settings,”Adv.Drug
Deliv.Rev.46(1-3):3-26(2001)，其据此通过引用整体并入)。由于后者与被动扩散或主动运输相比是一个缓慢的过程，所以预计4SP65的摄取量将显著低于WR-1065或氨磷汀。较低的摄取量导致药物功效降低，而药物活性未增加。
[0324] 所报道的文献也未显示4SP65将在氨磷汀无活性或其具有细胞保护作用而非细胞毒性作用的细胞中具有活性。已知氨磷汀的活性至少部分取决于细胞膜结合碱性磷酸酶的表达水平，但单独的这一信息不足以能够预测药物活性(Shen等人，“Binding of the Aminothiol WR-1065to Transcription Factors Influences Cellular Response to Anticancer Drugs,”J.Pharmacol.Exp.Ther.297(3):1067-73(2001)，其据此通过引用整体并入)。例如，氨磷汀在许多肿瘤类型中无活性，尽管药物最初由内皮细胞从循环中吸收，内皮细胞产生足量的膜结合的碱性磷酸酶，并且可以将药物代谢成WR-1065并将其传递给相邻的肿瘤细胞。文献报道将氨磷汀描述为对前列腺癌细胞具有辐射防护作用(Quinones等人，“Selective Exclusion by the Polyamine Transporter as a Mechanism for Differential Radioprotection of Amifostine Derivatives,”Clin.Cancer Res.8(5):1295-300(2002)，其据此通过引用整体并入)，但4SP65对体外DU-145细胞具有细胞毒性作用。这些相反作用的原因无法从现有文献中确定，因此，无法提前预测4SP65对原型前列腺癌细胞系的细胞的抗癌功效。
[0325] 还应该注意的是，向蛋白质、药物或药物的活性部分添加PEG不能用作增加药物功效的可预测方法。这种添加或取代可导致活性增加、活性降低或对活性没有影响(Mehvar,“Modulation of the Pharmacokinetics and Pharmacodynamics of Proteins by Polyethylene Glycol Conjugation,”J.Pharm.Pharm.Sci.3(1):25-36(2000)，其据此通过引用整体并入)。
[0326] 基于O’Connor(O'Connor等人，“Characterization of the p53 Tumor Suppressor Pathway in Cell Lines of the National Cancer Institute Anticancer Drug Screen and Correlations With the Growth-Inhibitory Potency of
123Anticancer Agents,”Cancer Res.57(19):4285-300(1997)，其据此通过引用整体并入)，从最敏感到最不敏感的肿瘤细胞类型，四种常用化学治疗剂的EC(50)测量范围约为
100倍。对于4SP65，这个范围仅为约5倍。这种差异的原因未知，并且无法从可用文献中预测。
123Anticancer Agents,”Cancer Res.57(19):4285-300(1997)，其据此通过引用整体并入)，从最敏感到最不敏感的肿瘤细胞类型，四种常用化学治疗剂的EC(50)测量范围约为
100倍。对于4SP65，这个范围仅为约5倍。这种差异的原因未知，并且无法从可用文献中预测。
[0327] 实施例3-4-臂-PEG-WR1065在感染小鼠柯萨奇B型病毒(Mouse Coxsackie B Virus)的细胞中的抗病毒作用(先知)
[0328] 将70-80％汇合度的小鼠心肌细胞接种在生长培养基中并使接种下来(plate down)并进入生长周期24小时。然后，将去除生长培养基并且使细胞暴露于含有小鼠柯萨奇B型病毒稀释液的培养基30分钟。在这段时间结束时，将去除含有病毒的培养基并且为细胞补给补充了4-臂-PEG-WR1065的培养基，其中-4臂-PEG-WR1065的剂量范围为0.5-20微摩尔。对照细胞平板将暴露于含有柯萨奇B型病毒稀释液的培养基，然后在6小时时重新补给未补充的生长培养基。所有平板每三天将再次补给各自的培养基。在72小时和之后每三天，将去除培养基并通过RT-PCR测定病毒复制。与对照、感染病毒的细胞相比，预计在暴露后6天病毒复制减少90％至99％。预计病毒复制的程度在暴露后10天会持续下降。
[0329] 实施例4-4-臂-PEG-WR1065(4SP65)对细菌、酵母和真菌的细胞毒性作用(先知)[0330] 将针对Stogniew和Bourthis(“Stogniew和Bourthis”)的标题为“Pharmaceutical Compositions Comprising Amifostine and Related Compounds”的美国申请公开号2008/0027030中描述的细菌、酵母和真菌测试4SP65的抗微生物活性，所述申请据此通过引用整体并入。将进行如本文所述的实验，其中有待测试的抗微生物剂将是4SP65而不是氨磷汀。4SP65的生长抑制活性将单独测试，并还与其它药物组合测试。预测4SP65的抗微生物作用比Stogniew和Bourthis中对于氨磷汀描述的抗微生物作用至少高8至12倍。
[0331] 实施例5-4-臂-PEG-WR1065在暴露于环磷酰胺的细胞中的细胞保护作用
[0332] 将处于对数期生长的TK6人淋巴母细胞以50-60％汇合度接种在生长培养基中并使其增殖24小时。然后去除生长培养基并更换为补充有以下三种培养基之一的培养基：(i)补充有1毫摩尔环磷酰胺的生长培养基，(ii)补充有1毫摩尔环磷酰胺加上100-400微摩尔4-臂-PEG-WR1065的生长培养基，(iii)未补充的生长培养基(对照)。48和72小时后评价板的细胞死亡证据。使用对照板作为参考，基于台盼蓝拒染法，暴露于1毫摩尔环磷酰胺的细胞在72小时时的细胞死亡是70％，而对于暴露于1毫摩尔环磷酰胺加上100-400微摩尔4-臂-PEG-WR1065的细胞，细胞死亡为约19％。
[0333] 实施例6-4-臂-PEG-WR1065对正常人乳腺上皮细胞(M99005)的细胞毒性作用
[0334] 如实施例1所述，除了生长培养基为MEBM(购自美国模式培养物保藏所(American Type Tissue Culture Collection))外，使正常人乳腺上皮细胞生长。当细胞达到50-60％时，去除生长培养基，并向含有细胞的每个孔中添加含有0-300微摩尔4SP65的培养基。在48小时时，通过胰蛋白酶化去除细胞，用台盼蓝染色并使用血细胞计数器计数。除了在100微摩尔暴露水平下之外，在任何药物浓度下均未观察到对细胞生长的抑制。细胞生长受到约22％至40％的抑制。高于100微摩尔和高达300微摩尔，没有观察到细胞生长抑制的证据。因此，结果显示了未达到50％生长抑制的双相曲线。先前已经报道了WR-1065双相生长抑制曲线的发现(Calabro-Jones等人，“The limits to radioprotection of Chinese hamster V79 cells by WR-1065 under aerobic conditions.”Radiat Res.149:550-559(1998)，其据此通过引用整体并入)。
[0335] 实施例7-4-臂-PEG-WR-1065对寨卡病毒(Zika virus)和/或其它正链RNA病毒的抗病毒作用(先知)
[0336] 将如上所述，使Vero细胞或其它容许寨卡病毒感染的细胞生长(参见实施例1)直到50-70％汇合。然后将用4SP65处理细胞长达48小时，药物水平范围从0至100微摩尔。在此暴露期结束时，将去除补充有4SP65的生长培养基并更换为含有不同感染单位的寨卡病毒的生长培养基。在病毒暴露后的多个时间点评估病毒诱导的细胞毒性作用的证据，以测定4SP65减少或预防病毒感染的能力。在类似的实验中，细胞将被病毒感染30分钟，然后暴露于0至100微摩尔剂量范围的4SP65并持续范围为0至48小时的时间段。将测定4SP65的抗病毒治疗功效并且预计落在0.1至13微摩尔范围内。将使用相同的实验设计来测试4SP65针对关系到人或动物的其它病毒病原体的抗病毒功效。预计对于所有实验而言会观察到在0.1至13微摩尔范围内的抗病毒功效。
[0337] 实施例8-化合物7的制备
[0338] 步骤1.Boc保护
[0339]
[0340] 将底物1(呈二盐酸盐，1.21mmol)溶于无水二氯甲烷(5ml)中。添加三乙胺(6个当量)和boc酸酐(2.1个当量)并将反应物在环境温度下在正氮气气氛下搅拌过夜。第二天，用二氯甲烷稀释反应物并用盐水洗涤。有机层经硫酸镁干燥并真空浓缩，得到呈透明油状物的化合物2，收率为85％。该化合物不经纯化即用于下一步骤。
[0341] 步骤2.与二硫化物偶合
[0342]
[0343] 将底物2(1.03mmol)溶于1/1水/甲醇(10ml)中并添加二硫化物3(2个当量)。在环境温度和氮气下搅拌反应物过夜。第二天，将反应物真空浓缩并用二氯甲烷稀释。用盐水洗涤并经硫酸镁干燥。用硅胶和己烷/乙酸乙酯梯度通过柱色谱法纯化产物4。产物以46％收率得到分离。
[0344] 步骤3.与星形聚合物偶合
[0345]
[0346] 向星形聚合物5(0.75g，平均分子量10,000)于PBS(8ml，pH7.4)中的溶液添加二硫化物5(0.45mmol)于乙醇(2ml)中的溶液。在环境温度下搅拌反应物4小时，然后冻干过夜。将粗产物溶于水(4ml)和DMSO(2ml)中并用水透析48小时，换四次水。之后，将该溶液冻干并分离出814mg偶联物6。
[0347] 步骤4.去保护以提供偶联物7
[0348]
[0349] 用1/1TFA/二氯甲烷(5ml)处理偶联物6(814mg)30分钟。真空去除溶剂并在真空泵上干燥残留物过夜。第二天，用乙醚洗涤残留物(两次)并进一步在真空泵上干燥过夜。获得750mg偶联物7。MALDI分析显示平均质量为10,531.95，这表明平均掺入了四个WR1065单元。
[0350] 尽管本文已经详细描绘和描述了某些实施方案，但对于相关领域的技术人员显而易见的是可在不脱离本发明的精神的情况下进行各种修改、添加、替换等，并且因此，这些修改、添加、替换等被视为在如以下权利要求书中定义的本发明的范围内。
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