技术领域
[0001] 本
发明涉及
生物农药技术领域，具体涉及一种具有杀线虫功能的生防制剂及其制备方法。
背景技术
[0002] 根结线虫(Meloidogyne)是一种高度专化型的杂食性
植物病原线虫，雌雄异体。幼虫呈细长蠕虫状，危害蔬菜，寄主范围广泛，在无寄主条件下可存活一年。被害株的上部生长矮小、缓慢、叶色异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。已知危害蔬菜的线虫主要有高弓根结线虫、花生根结线虫、北方根结线虫及南方根结线虫。线虫寄主范围广泛，常为害瓜类、茄果类、豆类及萝卜、胡萝卜、莴苣、白菜等30多种蔬菜，还能传播一些
真菌和细菌性病害。根结线虫主要危害各种蔬菜的根部，表现为侧根和须根较正常增多，并在幼根的须根上形成球形或圆锥形大小不等的白色根瘤，有的呈念珠状。被害株的上部生长矮小、缓慢、叶色异常，结果少，产量低，甚至造成植株提早死亡。
[0003] 目前防治根结线虫的方法多是化学药剂防治，即在作物
土壤中施用克线磷、阿维菌素
乳油、辛硫磷乳油、噻虫嗪
水分散粒剂等化合物，但
化学防治对土壤环境往往会造成不可修复的损害，化学的杀虫方法造成环境污染，危害人类健康。采用田间
轮作和使用非寄主植物或抗病植物是防治根结线虫的主要管理措施，但其具有一定局限性，如大多数根结线虫种类具有较广的寄主范围，同时，田间病源根结线虫种群大部分是几个种的混合群体，防治效果难以持续。其他措施如日晒、淹水，使用无病苗木、
土壤改良在某些情况下虽能取得一些防治效果，但效果甚微或有较大的局限性。因此，采用以
生物防治为核心的无公害可持续治理方法成为控制根结线虫病害主要方向。
发明内容
[0004] 针对上述
现有技术的不足，本发明的目的在于提供一种具有杀线虫功能的生防制剂及其制备方法，本发明提供的生防制剂的主要活性成分是枝顶孢霉菌的培养分泌物，其具有良好的杀线虫效果，所提供的枝顶孢霉菌的制备方法简单易实施，可以工业化生产。
[0005] 为了达到上述目的，本发明的技术方案是：
[0006] 一种具有杀线虫功能的生防制剂，其成分及重量份如下：草木灰3-7份、
硼砂8-18份、枝顶孢霉菌培养液冻干粉5-10份，该枝顶孢霉分类为Acremonium yunnanensis，于2016年4月21日在中国
微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心保藏，保藏编号为CGMCC No.12374，保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研究所。
[0007] 进一步，上述的具有杀线虫功能的生防制剂是粉剂。
[0008] 上述的具有杀线虫功能的生防制剂可以应用于杀灭作物根结线虫。
[0009] 进一步，上述的具有杀线虫功能的生防制剂在杀灭作物根结线虫中的应用方法为：每50g生防制剂加入2L的水，混匀后浇灌于作物根部土壤。
[0010] 本发明还提供上述具有杀线虫功能的生防制剂的制备方法，包括以下步骤：
[0011] ①培养枝顶孢霉菌
[0012] 将枝顶孢霉菌接种于PDA平板培养基上，
温度为28℃，培养5-7天，在超净
工作台中，将培养在PDA平板培养基上的枝顶孢霉接种至100mL LB液体培养基中，转速为180rpm，温度为28℃摇晃培养三天，将培养所得菌液每100mL接种于1L无菌LB液体培养基中，转速为180rpm，温度为28℃摇晃培养三天；
[0013] ②获得培养液冻干粉
[0014] 将步骤①所得枝顶孢霉菌液进行离心，转速12000rpm，时间10min，离心后保留上清液，去除沉淀，将上清液用0.45μm滤器过滤后，低温
冷冻干燥至
含水量低于13％；
[0015] ③获得生防制剂
[0016] 取步骤②所得的枝顶孢霉菌的培养液冻干粉5-10份，与3-7份草木灰、8-18份硼砂，即得具有杀线虫功能的生防制剂。
[0017] 有益效果：
[0018] (1)本发明的生防制剂是以培养过枝顶孢霉菌的培养液冻干粉为主要活性成分，其中不含活性菌，对作物原有土壤的菌群影响少，适用于土壤环境菌群适宜不需要改变但需要杀灭根结线虫的作物培育；
[0019] (2)本发明的生防制剂中添加了草木灰和硼砂，有助于其中的活性物质发挥作用，平衡土壤pH值；
[0020] (3)实验证明枝顶孢霉菌的培养液稀释20倍后对根结线虫的杀死率是100％，随稀释倍数增加，根结线虫的死亡率下降，表明枝顶孢霉菌在生长增殖过程中分泌了能杀死根结线虫的活性物质；枝顶孢霉培养液培养番茄根结线虫48小时后，线虫变直，内部有空腔，线虫开始死亡，其培养液具有杀灭根结线虫的作用；
[0021] (4)本发明的生防制剂未添加化学成分，对环境污染小，符合可持续发展的现代农业理念。
附图说明
[0022] 图1枝顶孢霉培养液杀线虫展示图
[0023] 图中，A是正常番茄根结线虫图片；B是枝顶孢霉培养液培养番茄根结线虫48小时后的图片，其中箭头所指为番茄根结线虫体内出现的空腔。
[0024] 图2是线虫死亡率统计图。
具体实施方式
[0025] 为使本发明
实施例的目的、技术方案和优点更加清楚，下面将结合本发明的实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述。基于本发明中的实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都属于本发明保护的范围。
[0026] 实施例一：一种具有杀线虫功能的生防制剂的制备
[0027] ①培养枝顶孢霉菌
[0028] 将枝顶孢霉菌接种于PDA平板培养基上，温度为28℃，培养5-7天，在超净工作台中，将培养在PDA平板培养基上的枝顶孢霉接种至100mL LB液体培养基中，转速为180rpm，温度为28℃摇晃培养三天，将培养所得菌液每100mL接种于1L无菌LB液体培养基中，转速为180rpm，温度为28℃摇晃培养三天；
[0029] ②获得培养液冻干粉
[0030] 将步骤①所得枝顶孢霉菌液进行离心，转速12000rpm，时间10min，离心后保留上清液，去除沉淀，将上清液用0.45μm滤器过滤后，低温冷冻干燥至含水量低于13％；
[0031] ③获得生防制剂
[0032] 取步骤②所得的枝顶孢霉菌的培养液冻干粉5-10份，与3-7份草木灰和8-18份硼砂，即得具有杀线虫功能的生防制剂。
[0033] 实施例一所制得的生防制剂是粉剂，将其兑水浇灌于作物根部土壤便可起到杀线虫作用，所得生防制剂最好储存于4℃以下环境中。
[0034] 实施例二：枝顶孢霉菌的培养液杀虫作用研究
[0035] 1分离培养线虫
[0036] a.将含有根结线虫的番茄根冲洗干净后用
剪刀尽量剪碎，放入
粉碎机里使其充分打碎。
[0037] b.将打碎后的根部材料倒入筛线虫的分样筛(上边的为320目，下边的为500目，两个叠放在一
块)中筛取线虫卵，并在适量流水中冲洗粉碎的根部材料(将筛子倾斜冲水)5分钟，线虫卵块便漏到第二个筛子中，再用洗瓶将500目筛子中的线虫卵冲洗到培养皿中，重复筛一次。
[0038] c.在体视镜下观察是否筛到线虫卵及卵的数量，若有线虫卵，即可放入28℃温箱中培养，定期加水、待线虫孵化4-7天，观察线虫卵孵化情况，此时大部分线虫已孵化，若数量充足，便可进行下一步实验。
[0039] 2获得枝顶孢霉培养液
[0040] a.培养枝顶孢霉
[0041] 在超净工作台中，将培养在PDA平板培养基上(培养5-7天)的枝顶孢霉接种至100mL LB液体培养基中，于180rpm，28℃摇床中培养三天。将培养所得菌液接种于1L无菌LB液体培养基中，转速为180rpm，温度为28℃摇晃扩大培养三天，三天后观察菌生长情况。
[0042] b.提取枝顶孢霉培养液
[0043] 将培养三天的枝顶孢霉放入大离心机中(12000rpm，10min)离心，离心后弃沉淀留上清，并用5mL
注射器吸取上清液用大滤头过滤，收集过滤的枝顶孢霉菌提取液，放入4℃
冰箱中保存备用。
[0044] 3枝顶孢霉培养液培养线虫
[0045] 用步骤2中得到的枝顶孢霉培养液培养线虫，观察线虫生长情况
[0046] a.对枝顶孢霉培养液进行稀释，稀释倍数分别为：10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、1000倍19个浓度。将稀释好的菌液按浓度顺序放入24孔板中，每个孔中放入1mL稀释好的培养液，最后一组加入1mL无菌水作为对照。
[0047] b.用10uL移液枪吸取培养皿中的线虫至放有稀释好的菌液中培养，并保证每次吸取线虫的条数大概相等，每1mL溶液中大概加入50条左右的线虫。不同浓度溶液线虫放入后，放在体视镜下检测线虫数量是否合适，如果数量合适，即可放入28℃
培养箱中培养，并定期观察线虫生长情况。
[0048] c.定期观察线虫在枝顶孢霉菌提取液中的生长情况，48小时后，对线虫的死亡率进行统计。
[0049] 3结果
[0050] 如图1所示，A图为未加枝顶孢霉菌培养液，正常状态下的线虫形态，B图是在枝顶孢霉菌培养液中培养48小时后的线虫形态，箭头指向线虫中出现的空腔，线虫在培养后身体变直，内部有空腔，线虫开始死亡；如图2所示，稀释倍数在10和20倍时，线虫死亡率接近100％，随着稀释倍数的增加，线虫死亡率降低，但和对照相比，培养液稀释液仍有明显的杀线虫作用。
[0051] 实施例二通过用枝顶孢霉菌培养液培养线虫实验，证明了枝顶孢霉菌培养液中含有枝顶孢霉菌分泌的具有杀线虫功能的活性物质，添加了枝顶孢霉菌培养液冻干粉的生防制剂具有杀线虫的效果。
[0052] 本发明未详述之处，均为本技术领域技术人员的公知技术。最后说明的是，以上实施例仅用于说明解释本发明的技术方案而非限制，对本发明的技术方案进行
修改或者等同替换，而不脱离本发明技术方案的宗旨和范围，其均应涵盖在本发明的
权利要求范围当中。
