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用于控制植物病毒感染的方法和组合物

阅读:84发布:2020-05-11

专利汇可以提供用于控制植物病毒感染的方法和组合物专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 提供用于局部 治疗 和 预防 植物 中的番茄斑萎病毒属和/或双生病毒组 疾病 的方法。本发明进一步提供用于治疗植物中的番茄斑萎病毒属和/或双生病毒组疾病的组合物,以及用于减少番茄斑萎病毒属和/或双生病毒组基因的表达和用于鉴定适用于调节植物病毒中的基因表达的多核苷酸的方法。,下面是用于控制植物病毒感染的方法和组合物专利的具体信息内容。

1.一种治疗预防植物中的番茄斑萎病毒属感染的方法,其包括:向所述植物局部地施用包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物,其中所述双链RNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中病毒感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的,其中所述双链RNA多核苷酸为SEQ ID NO:448,所述转移剂为Silwet L-77,且所述植物为胡椒。
2.如权利要求1所述的方法,其中所述组合物包含超过一种双链RNA多核苷酸,所述双链RNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列、所述必需的番茄斑萎病毒属基因序列的RNA转录物、或其片段的全部或一部分互补。
3.如权利要求1所述的方法,其中所述番茄斑萎病毒属选自由以下组成的组:豆坏死花叶病毒、辣椒萎黄病病毒、落花生芽坏死病毒、落花生环斑病毒、落花生黄斑病毒、仙花坏死斑病毒、鸢尾黄斑病毒、甜瓜黄斑病毒、花生芽坏死病毒、花生黄斑病毒、大豆叶脉坏死相关病毒、番茄褪绿斑病毒、番茄坏死环斑病毒、番茄斑萎病毒、番茄带斑病毒、西瓜芽坏死病毒、西瓜色斑驳病毒以及绿皮密生西葫芦致命萎黄病病毒。
4.如权利要求1所述的方法,其中所述必需的番茄斑萎病毒属基因选自由以下组成的组:核衣壳基因(N)、外壳蛋白基因(CP)、毒因子NSm和NSs、以及RNA依赖性RNA聚合酶L节段(RdRp/L节段)。
5.如权利要求4所述的方法,其中所述必需的番茄斑萎病毒属基因选自由SEQ ID NO:
13-46组成的组。
6.如权利要求1所述的方法,其中所述组合物是通过喷雾、撒粉来局部施用,或作为基质包裹的RNA施用于植物表面。
7.一种包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物,其中所述双链RNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中所述组合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的,其中所述双链RNA多核苷酸为SEQ ID NO:448,所述转移剂为Silwet L-77,且所述植物为胡椒。
8.如权利要求7所述的组合物,其中所述必需的基因序列选自由SEQ ID NO:13-46组成的组。
9.一种减少必需的番茄斑萎病毒属基因表达的方法,其包括将番茄斑萎病毒属颗粒与包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物接触,其中所述双链RNA多核苷酸与所述番茄斑萎病毒属中的必需基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的,其中所述双链RNA多核苷酸为SEQ ID NO:448,所述转移剂为Silwet L-77,且所述植物为胡椒。
10.如权利要求9所述的方法,其中所述必需的基因序列选自由SEQ ID NO:13-46组成的组。
11.一种鉴定当局部地治疗植物时适用于调节番茄斑萎病毒属基因表达的双链RNA多核苷酸的方法,其包括:a)提供包含与必需的番茄斑萎病毒属基因或其RNA转录物的全部或一部分互补的区域的多个双链RNA多核苷酸;b)用所述双链RNA多核苷酸中的一个或多个和转移剂局部地治疗所述植物;c)分析所述植物或提取物用于调节番茄斑萎病毒属感染的症状;以及d)选择能调节番茄斑萎病毒属感染的症状或发生的双链RNA多核苷酸,其中所述双链RNA多核苷酸为SEQ ID NO:448,所述转移剂为Silwet L-77,且所述植物为胡椒。
12.一种包含双链RNA多核苷酸和农药的混合物的农业化学组合物,其中所述双链RNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中所述组合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的,其中所述双链RNA多核苷酸为SEQ ID NO:448,所述转移剂为Silwet L-77,且所述植物为胡椒。
13.如权利要求12所述的农业化学组合物,其中所述农药选自由以下组成的组:抗病毒化合物、杀虫剂、杀真菌剂、线虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学绝育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂以及生物杀虫剂。

说明书全文

用于控制植物病毒感染的方法和组合物

[0001] 本申请是申请日为2013年10月16日、申请号为201380062693.0、发明名称为“用于控制植物病毒感染的方法和组合物”的发明专利申请的分案申请。
[0002] 相关申请的交叉引用
[0003] 本申请要求2012年10月16日提交的美国临时专利申请号61/714,733和2013年3月14日提交的美国临时专利申请号61/786,032的权益,这些专利以引用的方式整体并入本文。
[0004] 序列表的合并
[0005] 包含在名称为“MONS317WOsequencelisting.txt”的文件中的序列表如在Microsoft Windows操作系统中所测量是251千字节且在2013年10月11日生成,所述序列表与此一起以电子方式提交并且以引用的方式并入本文。

技术领域

[0006] 所述方法和组合物大体上涉及植物疾病控制领域。更具体地说,本发明涉及用于治疗预防与植物番茄斑萎病毒属或双生病毒组感染有关的症状的方法和组合物。

背景技术

[0007] 番茄斑萎病毒属和双生病毒组的植物病毒在经济学上是重要的,它们导致减少的植物产量和感染植物的死亡。设法保护其作物不受番茄斑萎病毒属侵害的种植者在传统上试图以杀虫剂施用或用反光膜或塑料盖防护其作物不受昆虫媒介的危害。因为这些策略取得了有限的成功,并且是昂贵和劳动密集型的,所以需要用于控制番茄斑萎病毒属和双生病毒组感染的替代性策略。

发明内容

[0008] 本文所述的实施方案涉及用于预防或治疗植物中的病毒感染的方法和组合物,其包括向植物局部施用包含至少18个与病毒基因基本上相同或基本上互补的连续核苷酸的多核苷酸。多核苷酸可以是单链DNA(ssDNA)、双链DNA(dsDNA)、单链RNA(ssRNA)或双链RNA(dsRNA)。
[0009] 一方面,本发明提供一种治疗或预防植物中的番茄斑萎病毒属感染的方法,其包括:向所述植物局部地施用包含反义单链DNA多核苷酸和转移剂的组合物,其中所述反义单链DNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中病毒感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一些实施方案中,反义单链DNA多核苷酸包含至少18个与选自由SEQ ID NO:13-46组成的组的序列基本上互补的连续核苷酸。在一个实施方案中,转移剂是有机表面活性剂组合物或包含在其中的化合物。在另一实施方案中,所述组合物包含超过一种反义单链DNA多核苷酸,所述反义单链DNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列、所述必需的番茄斑萎病毒属基因序列的RNA转录物、或其片段的全部或一部分互补。在另一实施方案中,反义单链DNA多核苷酸选自由SEQ NO:1-12或其片段组成的组。在另一实施方案中,所述番茄斑萎病毒属选自由以下组成的组:豆坏死花叶病毒、辣椒萎黄病病毒、落花生芽坏死病毒、落花生环斑病毒、落花生黄斑病毒、仙花坏死斑病毒、鸢尾黄斑病毒、甜瓜黄斑病毒、花生芽坏死病毒、花生黄斑病毒、大豆叶脉坏死相关病毒、番茄褪绿斑病毒、番茄坏死环斑病毒、番茄斑萎病毒、番茄带斑病毒、西瓜芽坏死病毒、西瓜色斑驳病毒以及绿皮密生西葫芦致命萎黄病病毒。在另一实施方案中,必需的番茄斑萎病毒属基因选自由以下组成的组:核衣壳基因(N)、外壳蛋白基因(CP)、毒因子NSm和NSs、以及RNA依赖性RNA聚合酶L节段(RdRp/L节段)。在另一实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:13-46组成的组。在另一实施方案中,组合物通过喷雾、撒粉来局部施用,或作为基质包裹的DNA施用于植物表面。
[0010] 另一方面,本发明提供一种包含反义单链DNA多核苷酸和转移剂的组合物,其中所述反义单链DNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中所述组合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一些实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:13-46组成的组,或转移剂是有机硅组合物,或反义单链DNA多核苷酸选自由SEQ ID NO:1-12组成的组。
[0011] 另一方面,本发明提供一种减少必需的番茄斑萎病毒属基因表达的方法,其包括将番茄斑萎病毒属颗粒与包含反义单链DNA多核苷酸和转移剂的组合物接触,其中所述反义单链DNA多核苷酸与所述番茄斑萎病毒属中必需的基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:13-46组成的组。在另一实施方案中,转移剂是有机硅化合物。在另一实施方案中,反义单链DNA多核苷酸选自由SEQ ID NO:1-12或其片段组成的组。
[0012] 另一方面,本发明提供一种鉴定当局部地治疗植物时适用于调节番茄斑萎病毒属基因表达的反义单链DNA多核苷酸的方法,其包括:a)提供包含与必需的番茄斑萎病毒属基因或其RNA转录物的全部或一部分互补的区域的多个反义单链DNA多核苷酸;b)用所述反义单链DNA多核苷酸中的一个或多个和转移剂局部地治疗所述植物;c)分析所述植物或提取物用于调节番茄斑萎病毒属感染的症状;以及d)选择能调节番茄斑萎病毒属感染的症状或发生的反义单链DNA多核苷酸。在一个实施方案中,转移剂是有机硅化合物。
[0013] 另一方面,本发明提供一种包含反义单链DNA多核苷酸和农药的混合物的农业化学组合物,其中所述反义单链DNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中所述组合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中,农药选自由以下组成的组:抗病毒化合物、杀虫剂、杀真菌剂、线虫剂、杀菌剂杀螨剂、生长调节剂、化学绝育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂以及生物杀虫剂。
[0014] 另一方面,本发明提供一种治疗或预防植物中的番茄斑萎病毒属感染的方法,其包括:向所述植物局部地施用包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物,其中所述双链RNA包含与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分基本上互补的多核苷酸,其中病毒感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一些实施方案中,双链RNA包含与选自由SEQ ID NO:13-46组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一个实施方案中,转移剂是有机硅表面活性剂组合物或包含在其中的化合物。在另一实施方案中,所述组合物包含超过一种双链RNA,所述双链RNA包含与必需的番茄斑萎病毒属基因序列、所述必需的番茄斑萎病毒属基因序列的RNA转录物、或其片段的全部或一部分互补的多核苷酸。在另一实施方案中,双链RNA多核苷酸包含与如SEQ NO:47-103、448-483中所列举的核苷酸序列或其片段基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一些实施方案中,dsRNA的反义多核苷酸包含悬突在3’端上的与靶基因互补的二(2)核苷酸。在另一实施方案中,所述番茄斑萎病毒属选自由以下组成的组:豆坏死花叶病毒、辣椒萎黄病病毒、落花生芽坏死病毒、落花生环斑病毒、落花生黄斑病毒、风仙花坏死斑病毒、鸢尾黄斑病毒、甜瓜黄斑病毒、花生芽坏死病毒、花生黄斑病毒、大豆叶脉坏死相关病毒、番茄褪绿斑病毒、番茄坏死环斑病毒、番茄斑萎病毒、番茄带斑病毒、西瓜芽坏死病毒、西瓜银色斑驳病毒以及绿皮密生西葫芦致命萎黄病病毒。在另一实施方案中,必需的番茄斑萎病毒属基因选自由以下组成的组:核衣壳基因(N)、外壳蛋白基因(CP)、毒力因子NSm和NSs、以及RNA依赖性RNA聚合酶L节段(RdRp/L节段)。在另一实施方案中,必需的番茄斑萎病毒属基因选自由SEQ ID NO:13-46组成的组。在另一实施方案中,组合物通过喷雾、撒粉来局部施用,或作为基质包裹的RNA施用于植物表面。
[0015] 另一方面,本发明提供一种包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物,其中所述双链RNA多核苷酸与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中所述组合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:13-46组成的组。在另一实施方案中,转移剂是有机硅组合物。在另一实施方案中,双链RNA包含与选自由SEQ NO:47-103和448-483组成的组的核苷酸序列基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一些实施方案中,dsRNA的反义多核苷酸包含悬突在3’端上的与靶基因互补的二(2)核苷酸。
[0016] 另一方面,本发明提供一种减少必需的番茄斑萎病毒属基因表达的方法,其包括:将番茄斑萎病毒属颗粒与包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物接触,其中所述双链RNA包含与所述番茄斑萎病毒属中必需的基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补的多核苷酸,其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物简而言之减少或排除的。在一个实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:13-46组成的组。在另一实施方案中,转移剂是有机硅化合物。在另一实施方案中,双链RNA包含与选自由SEQ ID NO:47-103、448-483或其片段组成的组的核苷酸序列基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一些实施方案中,dsRNA的反义多核苷酸包含悬突在3’端上的与靶基因互补的二(2)核苷酸。
[0017] 另一方面,本发明提供一种鉴定当局部地治疗植物时适用于调节番茄斑萎病毒属基因表达的双链RNA多核苷酸的方法,其包括:a)提供包含与必需的番茄斑萎病毒属基因或其RNA转录物的全部或一部分互补的区域的多个双链RNA多核苷酸;b)用所述双链RNA多核苷酸中的一个或多个和转移剂局部地治疗所述植物;c)分析所述植物或提取物用于调节番茄斑萎病毒属感染的症状;以及d)选择能调节番茄斑萎病毒属感染的症状或发生的双链RNA多核苷酸。在一个实施方案中,转移剂是有机硅化合物。在一些实施方案中,双链RNA包含与选自由SEQ ID NO:13-46组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的多核苷酸。
[0018] 另一方面,本发明提供一种包含双链RNA多核苷酸和农药的混合物的农业化学组合物,其中所述双链RNA包含与必需的番茄斑萎病毒属基因序列或其RNA转录物的全部或一部分基本上互补的多核苷酸,其中所述组合物局部地施用于植物并且其中番茄斑萎病毒属感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中,农药选自由以下组成的组:抗病毒化合物、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学绝育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂以及生物杀虫剂。
[0019] 又一方面,本发明提供一种治疗或预防植物中的双生病毒组感染的方法,其包括:向所述植物局部地施用包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物,其中所述双链RNA包含与必需的双生病毒组基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补的多核苷酸,其中病毒感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中,转移剂是有机硅表面活性剂组合物或包含在其中的化合物。在另一实施方案中,组合物包含超过一种双链RNA,所述双链RNA包含与必需的双生病毒组基因序列、所述必需的双生病毒组基因序列的RNA转录物、或其片段的全部或一部分基本上互补的多核苷酸。在另一实施方案中,双链RNA包含与选自由SEQ NO:104-268或其片段组成的组的序列的至少18个核苷酸基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在另一实施方案中,双生病毒组选自由以下组成的组:大麦黄矮病病毒、黄瓜花叶病毒、茄瓜花叶病毒、花缩叶病毒、番茄黄色缩叶病毒、番茄金色花叶病毒、铃薯黄化叶病毒、胡椒缩叶病毒、豆金色花叶病毒、豆金色花叶病毒、番茄斑驳病毒。又一方面,必需的双生病毒组基因选自由以下组成的组:核衣壳基因(N)、外壳蛋白基因(CP)、毒力因子NSm和NSs、以及RNA依赖性RNA聚合酶L节段(RdRp/L节段)、沉默抑制基因、移动蛋白(MP)、Nia、CP-N、三基因、CP-P3、MP-P4、C2以及AC2。在另一实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:269-447组成的组。在另一实施方案中,组合物通过喷雾、撒粉来局部施用,或作为基质包裹的RNA施用于植物表面。
[0020] 另一方面,本发明提供一种包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物,其中所述双链RNA包含与必需的双生病毒组基因序列如由SEQ ID NO:104-268、269-447所列举的一个或其RNA转录物的全部或一部分基本上互补的多核苷酸,其中所述组合物局部地施用于植物并且其中双生病毒组感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:269-447组成的组。在另一实施方案中,转移剂是有机硅组合物。在另一实施方案中,双链RNA多核苷酸选自由SEQ NO:104-268组成的组。
[0021] 另一方面,本发明提供一种减少必需的双生病毒组基因表达的方法,其包括:将双生病毒组颗粒与包含双链RNA多核苷酸和转移剂的组合物接触,其中所述双链RNA包含与所述双生病毒组中必需的基因序列或其RNA转录物的全部或一部分基本上互补的多核苷酸,其中双生病毒组感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:269-447组成的组。在另一实施方案中,转移剂是有机硅化合物。在另一实施方案中,双链RNA包含与选自由SEQ NO:104-268或其片段组成的组的序列的至少18个核苷酸基本上相同或基本上互补的多核苷酸。
[0022] 又一方面,本发明提供一种鉴定当局部地治疗植物时适用于调节双生病毒组基因表达的双链RNA多核苷酸的方法,其包括:a)提供包含与必需的双生病毒组基因或其RNA转录物的全部或一部分互补的区域的多个双链RNA多核苷酸;b)用所述双链RNA多核苷酸中的一个或多个和转移剂局部地治疗所述植物;c)分析所述植物或提取物用于调节双生病毒组感染的症状;以及d)选择能调节双生病毒组感染的症状或发生的双链RNA多核苷酸。在一个实施方案中,转移剂是有机硅化合物。在一些实施方案中,双链RNA包含与选自由SEQ ID NO:269-447组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一些实施方案中,双生病毒组是黄瓜花叶病毒并且双链RNA包含与选自由SEQ ID NO:
269-316组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一些实施方案中,双生病毒组是茄瓜花叶病毒并且双链RNA包含与选自由SEQ ID NO:317-
349组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一些实施方案中,双生病毒组是番茄黄色缩叶病毒并且双链RNA包含与选自由SEQ ID NO:386-
421组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的多核苷酸。在一些实施方案中,双生病毒组是棉花缩叶病毒并且双链RNA包含与选自由SEQ ID NO:422-441组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上相同或基本上互补的多核苷酸。
[0023] 另一方面,本发明提供一种包含双链RNA多核苷酸和农药的混合物的农业化学组合物,其中所述双链RNA包含与必需的双生病毒组基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补的多核苷酸,其中所述组合物局部地施用于植物并且其中双生病毒组感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中,农药选自由以下组成的组:抗病毒化合物、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学绝育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂以及生物杀虫剂。
[0024] 一方面,本发明提供一种治疗或预防植物中的双生病毒组感染的方法,其包括:向所述植物局部地施用包含反义单链DNA多核苷酸和转移剂的组合物,其中所述反义单链DNA多核苷酸与必需的双生病毒组基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中病毒感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一些实施方案中,反义单链DNA多核苷酸包含至少18个与选自由SEQ ID NO:104-268组成的组的序列基本上互补的连续核苷酸。在一些实施方案中,反义单链DNA多核苷酸包含至少18个与选自由SEQ ID NO:269-447组成的组的序列基本上互补的连续核苷酸。在一个实施方案中,转移剂是有机硅表面活性剂组合物或包含在其中的化合物。在另一实施方案中,组合物包含超过一种反义单链DNA多核苷酸,所述反义单链DNA多核苷酸与必需的双生病毒组基因序列、所述必需的双生病毒组基因序列的RNA转录物、或其片段的全部或一部分互补。在另一实施方案中,双生病毒组选自由以下组成的组:大麦黄矮病病毒、黄瓜花叶病毒、茄瓜花叶病毒、棉花缩叶病毒、番茄黄色缩叶病毒、番茄金色花叶病毒、马铃薯黄化叶病毒、胡椒缩叶病毒、豆金色花叶病毒、豆金色花叶病毒以及番茄斑驳病毒。又一方面,必需的双生病毒组基因选自由以下组成的组:核衣壳基因(N)、外壳蛋白基因(CP)、毒力因子NSm和NSs、以及RNA依赖性RNA聚合酶L节段(RdRp/L节段)、沉默抑制基因、移动蛋白(MP)、Nia、CP-N、三基因块、CP-P3、MP-P4、C2以及AC2。在另一实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:269-447组成的组。在另一实施方案中,组合物通过喷雾、撒粉来局部施用,或作为基质包裹的RNA施用于植物表面。
[0025] 另一方面,本发明提供一种包含反义单链DNA多核苷酸和转移剂的组合物,其中所述反义单链DNA多核苷酸与必需的双生病毒组基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中所述组合物局部地施用于植物并且其中双生病毒组感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一些实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:104-447组成的组,或转移剂是有机硅组合物。
[0026] 另一方面,本发明提供一种减少必需的双生病毒组基因表达的方法,其包括:将双生病毒组颗粒与包含反义单链DNA多核苷酸和转移剂的组合物接触,其中所述反义单链DNA多核苷酸与所述双生病毒组中必需的基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中双生病毒组感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中,必需的基因序列选自由SEQ ID NO:104-447组成的组。在另一实施方案中,转移剂是有机硅化合物。
[0027] 另一方面,本发明提供一种鉴定当局部地治疗植物时适用于调节双生病毒组基因表达的反义单链DNA多核苷酸的方法,其包括:a)提供包含与必需的双生病毒组基因或其RNA转录物的全部或一部分互补的区域的多个反义单链DNA多核苷酸;b)用所述反义单链DNA多核苷酸中的一个或多个和转移剂局部地治疗所述植物;c)分析所述植物或提取物用于调节双生病毒组感染的症状;以及d)选择能调节双生病毒组感染的症状或发生的反义单链DNA多核苷酸。在一个实施方案中,转移剂是有机硅化合物。在一些实施方案中,反义单链DNA与选自由SEQ ID NO:269-447组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上互补。在一些实施方案中,双生病毒组是黄瓜花叶病毒并且反义单链DNA与选自由SEQ ID NO:269-316组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上互补。在一些实施方案中,双生病毒组是茄瓜花叶病毒并且反义单链DNA与选自由SEQ ID NO:317-349组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上互补。在一些实施方案中,双生病毒组是番茄黄色缩叶病毒并且反义单链DNA与选自由SEQ ID NO:386-421组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上互补。在一些实施方案中,双生病毒组是棉花缩叶病毒并且反义单链DNA与选自由SEQ ID NO:422-441组成的组的序列的至少18个连续核苷酸基本上互补。
[0028] 另一方面,本发明提供一种包含反义单链DNA多核苷酸和农药的混合物的农业化学组合物,其中所述反义单链DNA多核苷酸与必需的双生病毒组基因序列或其RNA转录物的全部或一部分互补,其中所述组合物局部地施用于植物并且其中双生病毒组感染的症状或症状的发展在所述植物中相对于当在相同条件下生长时不用所述组合物治疗的植物是减少或排除的。在一个实施方案中,农药选自由以下组成的组:抗病毒化合物、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学绝育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂以及生物杀虫剂。附图说明
[0029] 以下附图形成本说明书的一部分并且被纳入以进一步说明组合物和方法的功能的某些方面。所述功能可参考这些附图中的一个或多个联合本文所提供的具体实施方案的详细说明被更好地理解。所述功能可从附图的以下描述中被更充分地理解:
[0030] 图1:示出描绘用反义单链(ss)DNA寡核苷酸(oligo)局部治疗莴苣(SVR3606 L4)植物的结果的图。将气生组织鲜重(以克为单位)相对在第-1天感染、第0天感染和第+1天感染进行的治疗绘图。
[0031] 图2:示出在病毒接种之后18天莴苣(SVR3606 L4)植物上的症状发展。(A)在病毒接种之后几小时使用喷枪在20psi下用反义ssDNA寡核苷酸对右边的植物进行喷雾。左边示出仅用风仙花坏死斑病毒(INSV)接种的对照植物。用孔穿刺术对叶片进行穿刺用于ELISA分析。(B)描绘在无治疗或用反义ssDNA治疗的植物中INSV症状发展的目测评分的结果的图。
[0032] 图3:示出在莴苣叶片中用反义ssDNA进行的局部治疗对减少病毒积聚的作用的ELISA分析结果的图。测量单位是在450nm光密度(OD)下的蛋白质吸光率。圆形代表从对照植物(仅有病毒,没有多核苷酸)处收集的数据点。三形代表从用反义ssDNA寡核苷酸的混合物(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)治疗的植物处收集的数据点。
[0033] 图4:图A、B和D示出描绘用反义ssDNA寡核苷酸治疗之后第5天(A)、第8天(B)和第14天(D)莴苣植物提取物的光密度(OD 450nm)的图。(C)示出用反义ssDNA寡核苷酸治疗之后第13天植物的目测评价结果的图。
[0034] 图5:示出用反义ssDNA寡核苷酸的局部治疗对莴苣植物的作用的结果。图A和B示出分别在治疗之后第5天和第14天的OD 450nm ELISA数据。图C示出在用反义ssDNA寡核苷酸治疗之后第21天通过便携式叶绿素荧光计测定的光合体系Ⅱ(PSII)的平均有效产额的图。图D示出在治疗之后第21天无治疗或用反义ssDNA治疗的植物的气生组织鲜重(以克为单位)的图。
[0035] 图6:示出其中番茄和胡椒植物用针对番茄斑萎病毒(TSWV)的反义ssDNA寡核苷酸治疗的现场试验种植计划和第60天的照片。
[0036] 图7:示出未治疗的(用圆圈标记的)和用针对TSWV的反义ssDNA寡核苷酸局部治疗的番茄植物。
[0037] 图8:示出用反义ssDNA寡核苷酸治疗番茄植物的作用结果的图。图A、B和D示出描绘在治疗后第15天(A)、第60天(B)和第78天(D)仅用缓冲液治疗或用反义ssDNA寡核苷酸喷雾一次或两次的植物的OD 450nm ELISA数据的图。图C示出治疗后第78天针对番茄植物症状的目测评分结果的图。
[0038] 图9:示出用反义ssDNA寡核苷酸治疗胡椒植物的作用结果的图。图A、B和D示出描绘在治疗后第15天(A)、第60天(B)和第78天(D)仅用缓冲液治疗或用反义ssDNA寡核苷酸喷雾一次或两次的胡椒植物的OD 450nm ELISA数据的图。图C示出治疗后第78天针对胡椒植物症状的目测评分结果的图。
[0039] 图10:示出寡核苷酸治疗对减少胡椒叶片上的病毒积聚的作用的图。测量OD 450nm以评定存在的病毒的量。点代表从对照植物(仅有病毒,没有寡核苷酸治疗)处收集的数据点。菱形(SEQ ID NO:5-8)和三角形(SEQ ID NO:9-12)代表从用反义ssDNA寡核苷酸溶液局部治疗的样品处收集的数据点。左边示出来自接种叶片的数据,且右边示出来自系统的、非感染的、非寡核苷酸治疗叶片的数据。
[0040] 图11:示出寡核苷酸治疗对洋葱植物的作用结果的图。图A示出描绘在用局部寡核苷酸治疗之前球茎直径的图。图B示出描绘在大田的4个不同区域中不同球茎直径的图。图C示出描绘在用缓冲液或局部反义ssDNA寡核苷酸治疗之后球茎直径的图。图D示出描绘对于缓冲液和反义ssDNA治疗植物的OD 450nm测量的图。
[0041] 图12:图A示出针对不同治疗的植物高度的图。T25748、T25753、T25755、T25763、T25769、T25770、T25773、T25776以及T25778是dsRNA触发物。图B示出针对健康的(未感染的)、病毒感染但未治疗的、病毒感染缓冲液治疗的(缓冲液)、病毒感染T25748 dsRNA触发物治疗的(T25748)以及病毒感染T25773dsRNA触发物治疗的(T25773)植物的植物高度的图。
[0042] 图13:示出针对不同治疗的植物高度的图表。T25748、T25755、T25763、T25769、T25770、T25772、T25775以及T25776是dsRNA触发物。

具体实施方式

[0043] 提供适用于治疗或预防植物中的病毒感染的组合物和方法。本文所公开的方法和组合物的方面可应用于治疗或预防在农艺学及其它载培环境下的植物中的病毒感染。
[0044] 若干实施方案涉及用于预防或治疗植物中的番茄斑萎病毒属感染的方法和组合物,其包括局部施用包含至少18个与番茄斑萎病毒属基因基本上相同或基本上互补的连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中,番茄斑萎病毒属基因选自由以下组成的组:核衣壳(N)基因、抑制(NSs)基因、移动(NSm)基因以及RNA依赖性RNA聚合酶(RdRp)基因。在一些实施方案中,提供用于预防或治疗植物中的番茄斑萎病毒属感染的方法和组合物,其包括局部施用在如SEQ ID NO:1-12(表1-3)所列举的反义(as)方向上的单链(ss)DNA。还提供用于预防或治疗植物中的番茄斑萎病毒属感染的方法和组合物,其包含局部施用包含与如SEQ ID NO:47-103(表5)或SEQ ID NO:448-483(表12)所列举的核苷酸序列基本上相同或基本上互补的多核苷酸的双链(ds)RNA。在一些实施方案中,dsRNA的反义多核苷酸包含悬突在3’端上的与靶基因互补的二(2)核苷酸。在某些实施方案中,本发明的方法和组合物提供对由番茄斑萎病毒属所引起的症状或疾病的调控、抑制、或延缓和/或调节。
[0045] 若干实施方案涉及用于预防或治疗植物中的双生病毒组感染的方法和组合物,其包括局部施用包含至少18个与双生病毒组基因基本上相同或基本上互补的连续核苷酸的多核苷酸。在一些实施方案中,双生病毒组基因选自由以下组成的组:外壳蛋白(CP)基因、沉默抑制基因以及移动基因。还提供用于预防或治疗植物中的双生病毒组感染的方法和组合物,其包括局部施用包含与如SEQ ID NO:104-268(表6)所列举的核苷酸序列基本上相同或基本上互补的多核苷酸的dsRNA。所述方法和组合物的方面可应用于在农艺学及其它载培环境中管理植物病毒疾病。
[0046] 本发明的组合物可包括ssDNA、dsDNA、ssRNA或dsRNA多核苷酸和/或ssDNA、dsDNA、ssRNA或dsRNA寡核苷酸,它们被设计来靶向单个或多个病毒基因、或一个或多个病毒基因的多个节段,如来自番茄斑萎病毒属或其它植物疾病的基因,包括但不限于在SEQ ID NO:1-46(表1-4)中所列举的病毒基因序列。在另一实施方案中,这类多核苷酸和寡核苷酸可被设计来靶向单个或多个病毒基因、或一个或多个病毒基因的多个节段,如来自双生病毒组的基因,包括但不限于在SEQ ID NO:269-447(表7-11)中所列举的病毒基因序列。在一个实施方案中,来自任何植物病毒的任何病毒基因可由本发明的组合物所靶向。靶基因可包括靶基因的多个连续节段、靶基因的多个非连续节段、靶基因的多个等位基因、或来自一种或多种番茄斑萎病毒属物质的多个靶基因。在一些实施方案中,多核苷酸或寡核苷酸与共有核苷酸序列基本上相同或基本上互补。
[0047] 本发明的多核苷酸可与病毒基因序列的全部或一部分互补,包括启动子、内含子、编码序列、外显子、5’非翻译区、以及3’非翻译区。本发明的组合物进一步包含转移剂,其促进本发明的多核苷酸向植物的递送,并且可包括溶剂、稀释剂、补充多核苷酸作用的农药、除草剂或提供不同于多核苷酸的另外的作用方式的另外的农药、增强组合物效用的各种盐或稳定剂作为组合物的组分的混合物。
[0048] 在某些方面,本发明的方法可包括多核苷酸组合物的一种或多种施用和转移剂的一种或多种施用,所述转移剂是用于调节植物或植物病毒通过多核苷酸的渗透或多核苷酸的活性或稳定性。当用于调节渗透的试剂是有机硅组合物或包含在其中的化合物时,多核苷酸分子可以是ssDNA、dsDNA、ssRNA或dsRNA寡核苷酸;或ssDNA、dsDNA、ssRNA或dsRNA多核苷酸、化学修饰的DNA寡核苷酸或多核苷酸、或其混合物。
[0049] 在一个实施方案中,本发明提供用于控制植物的番茄斑萎病毒属或双生病毒组感染的方法,其包括用至少一种与靶病毒基因的全部或一部分互补的第一反义ssDNA治疗植物,其中所述多核苷酸分子能够调节靶基因并控制番茄斑萎病毒属或双生病毒组感染。在另一实施方案中,本发明提供一种用于控制植物的番茄斑萎病毒属或双生病毒组感染的方法,其包括用至少一种与靶病毒基因的全部或一部分互补的第一反义dsDNA治疗植物,其中所述多核苷酸分子能够调节靶基因并控制番茄斑萎病毒属或双生病毒组感染。在另一实施方案中,本发明提供一种用于控制植物的番茄斑萎病毒属或双生病毒组感染的方法,其包括用至少一种与靶病毒基因的全部或一部分互补的第一dsRNA治疗植物,其中所述多核苷酸分子能够调节靶基因并控制番茄斑萎病毒属或双生病毒组感染。
[0050] 在某些实施方案中,可包括提高植物对多核苷酸的渗透性的调节步骤。可单独地或一步进行调节与多核苷酸施用。当调节与多核苷酸施用在单独的步骤中进行时,调节可先于或可在多核苷酸施用之后几分钟、几小时或几天内。在一些实施方案中,超过一个调节步骤或超过一次多核苷酸分子施用可针对同一植物进行。
[0051] 在所述方法的具体实施方案中,本发明的多核苷酸可从以下来克隆或鉴定:(a)目标病毒基因的编码(蛋白质编码)部分,(b)目标病毒基因的非编码(启动子及其它基因相关分子)部分,或(c)目标病毒基因的编码和非编码部分。非编码部分可包括DNA,如启动子区或由提供RNA调控分子的DNA转录的RNA,包括但不限于:内含子、顺式作用调控RNA元件、5’或3’非翻译区及微RNA(miRNA)、反式作用siRNA、天然反义siRNA、及具有调控功能的其它小RNA或具有结构或酶促功能的RNA,包括但不限于:核酶、核糖体RNA、t-RNA、适体及核糖开关
[0052] 如本文所用的“番茄斑萎病毒属”是指来自番茄斑萎病毒属的病毒,其可包括:豆坏死花叶病毒、辣椒萎黄病病毒、落花生芽坏死病毒、落花生环斑病毒、落花生黄斑病毒、风仙花坏死斑病毒、鸢尾黄斑病毒、甜瓜黄斑病毒、花生芽坏死病毒、花生黄斑病毒、大豆叶脉坏死相关病毒、番茄褪绿斑病毒、番茄坏死环斑病毒、番茄斑萎病毒、番茄带斑病毒、西瓜芽坏死病毒、西瓜银色斑驳病毒或绿皮密生西葫芦致命萎黄病病毒。
[0053] 如本文所用的“双生病毒组”是指来自植物病毒的双生病毒科的病毒。双生病毒组可包括但不限于大麦黄矮病病毒(BYDW)、黄瓜花叶病毒(CMV)、茄瓜花叶病毒(PepMV)、棉花缩叶病毒(CuCLV)、番茄黄色缩叶病毒(TYLCV)、番茄金色花叶病毒、马铃薯黄色花叶病毒、胡椒缩叶病毒(PepLCV)、豆金色花叶病毒(BGMV-PR)、豆金色花叶病毒(BGMV-DR)、番茄斑驳病毒(TMV)等等。
[0054] 本发明的DNA或RNA多核苷酸组合物适用于组合物中,如包含DNA或RNA多核苷酸分子单独或与在相同液体中或在提供转移剂的单独施用的液体中的其它组分组合的液体。如本文所用,转移剂是当在局部施用于靶植物表面的组合物中与多核苷酸组合时促进多核苷酸用于控制番茄斑萎病毒属或双生病毒组的试剂。在一个实施方案中,转移剂增强多核苷酸进入植物细胞中的能力。在某些实施方案中,转移剂因此是调节植物组织例如叶片、茎、根、花或果实的表面以便多核苷酸分子渗入到植物细胞中的试剂。多核苷酸向植物细胞中的转移可通过向植物组织事先或同时施用多核苷酸-转移剂得以促进。在一些实施方案中,转移剂是在施用多核苷酸组合物之后施用。多核苷酸转移剂能够采用便于多核苷酸穿过表皮蜡屏障、气孔和/或细胞壁或膜屏障进入植物细胞中的路径。促进多核苷酸向植物细胞中的转移的适合的转移剂包括提高植物外部的渗透性或提高植物细胞对寡核苷酸或多核苷酸的渗透性的试剂。促进组合物向植物细胞中转移的这类试剂包括化学试剂、或物理试剂或其组合。用于调节或转移的化学试剂包括(a)表面活性剂,(b)有机溶剂或有机溶剂的溶液或含水混合物,(c)化剂,(d)酸,(e),(f)油,(g)酶,或其组合。所述方法的实施方案可任选地包括培养步骤、中和步骤(例如,为了中和酸、碱或氧化剂,或为了使酶失活)、冲洗步骤或其组合。
[0055] 用于调节由多核苷酸所渗透的植物的试剂或处理的实施方案包括乳液、反相乳液、脂质体及其它胶束样组合物。用于调节由多核苷酸所渗透的植物的试剂或处理的实施方案包括抗衡离子或已知与核酸分子缔合的其它分子,例如,无机铵离子、烷基铵离子、锂离子、多胺如精胺、亚精胺或腐胺、及其它阳离子。适用于调节由多核苷酸所渗透的植物的有机溶剂包括DMSO、DMF、吡啶、N-吡咯烷、六甲基磷酰胺、乙腈、二噁烷、聚丙二醇、与水可混溶或将磷核苷酸溶解于非水系统(如用于合成反应)中的其它溶剂。可使用有或没有表面活性剂或乳化剂的天然来源的或合成油,例如植物来源的油,可使用作物油(如在万维网(国际互联网络)上的herbicide.adjuvants.com处可公开获得的9th Compendium of Herbicide Adjuvants中所列举的那些),例如石蜡油、多元醇脂肪酸酯或具有用酰胺或多胺如聚乙烯亚胺或N-吡咯烷修饰的短链分子的油。转移剂包括但不限于有机硅制剂。
[0056] 在某些实施方案中,包含含有三硅氧烷头部基团的有机硅化合物的有机硅制剂在本文所提供的方法和组合物中使用。在某些实施方案中,包含含有七甲基三硅氧烷头部基团的有机硅化合物的有机硅制剂在本文所提供的方法和组合物中使用。在本文所提供的方法和组合物的某些实施方案中,使用或提供包含多核苷酸分子和一种或多种有效的有机硅化合物的组合物,所述有机硅化合物的范围在约0.015至约2重量百分比(wt%)内(例如,约0.01、0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、
0.08、0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、
1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt%)。
[0057] 本文所提供的方法和组合物中使用的有机硅制剂可包含一种或多种有效的有机硅化合物。如本文所用,短语“有效的有机硅化合物”是用于描述在能够使得多核苷酸进入植物细胞中的有机硅制剂中所见的任何有机硅化合物。在某些实施方案中,有效的有机硅化合物可使得多核苷酸以容许多核苷酸介导植物细胞中的靶基因表达抑制的方式进入植物细胞中。一般说来,有效的有机硅化合物包括但不限于可包含以下的化合物:i)三硅氧烷头部基团,其共价连接至,ii)包括但不限于正丙基接头的烷基接头,其共价连接至,iii)聚二醇链,其共价连接至,iv)端基。这类有效的有机硅化合物的三硅氧烷头部基团包括但不限于七甲基三硅氧烷。烷基接头可包括但不限于正丙基接头。聚二醇链包括但不限于聚乙二醇或聚丙二醇。聚二醇链可包含提供约“7.5”的平均链长“n”的混合物。在某些实施方案中,平均链长“n”可在约5至约14之间变化。端基可包括但不限于烷基,如甲基。有效的有机硅化合物被认为包括但不限于三硅氧烷乙氧基化物表面活性剂或聚环氧烷修饰的七甲基三硅氧烷。
[0058] 在某些实施方案中,可作为具有CAS编号27306-78-1和EPA编号:CAL.REG.NO.5905-50073-AA的 L-77表面活性剂商购获得以及当前可从
Momentive Performance Materials,Albany,New York得到的有机硅制剂可用于制备多核苷酸组合物。在某些实施方案中,当Silwet L-77有机硅制剂用作植物叶片或其它植物表面的预喷雾处理时,在约0.015至约2重量百分比(wt%)(例如,约0.01、0.015、0.02、0.025、
0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、0.09、0.095、
0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、1.7、1.8、1.9、
2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt%)范围内的新鲜制备的浓度在准备叶片或其它植物表面以便多核苷酸分子从局部施用于表面上转移到植物细胞中是有效的。在本文所提供的方法和组合物的某些实施方案中,使用或提供包含多核苷酸分子和包含Silwet L-77的有机硅制剂的组合物,所述有机硅制剂的范围在约0.015至约2重量百分比(wt%)内(例如,约0.01、
0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、
0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、
1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt%)。
[0059] 在某些实施方案中,可使用如以下所提供的任何可商购获得的有机硅制剂作为多核苷酸组合物中的转移剂:Breakthru S 321、Breakthru S 200目录号67674-67-3、Breakthru OE 441目录号68937-55-3、Breakthru S 278目录号27306-78-1、Breakthru S 
243、Breakthru S 233目录号134180-76-0,购自制造商Evonik Goldschmidt(Germany)、HS 429、 HS 312、 HS 508、 HS 604(Momentive 
Performance Materials,Albany,New York)。在某些实施方案中,当有机硅制剂用作植物叶片或其它表面的预喷雾处理时,在约0.015至约2重量百分比(wt%)(例如,约0.01、
0.015、0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、
0.085、0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、
1.6、1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt%)范围内的新鲜制备的浓度在准备叶片或其它植物表面以便多核苷酸分子从局部施用于表面上转移到植物细胞中是有效的。在本文所提供的方法和组合物的某些实施方案中,使用或提供包含多核苷酸分子和有机硅制剂的组合物,所述有机硅制剂的范围在约0.015至约2重量百分比(wt%)内(例如,约0.01、0.015、
0.02、0.025、0.03、0.035、0.04、0.045、0.05、0.055、0.06、0.065、0.07、0.075、0.08、0.085、
0.09、0.095、0.1、0.2、0.3、0.4、0.5、0.6、0.7、0.8、0.9、1.0、1.1、1.2、1.3、1.4、1.5、1.6、
1.7、1.8、1.9、2.0、2.1、2.2、2.3、2.5wt%)。
[0060] 本发明的多核苷酸的递送可通过以下多种方法实现,包括但不限于(1)用本文所提供的ssDNA、dsDNA、ssRNA或dsRNA分子加载脂质体及(2)将ssDNA、dsDNA、ssRNA或dsRNA分子与脂质或脂质体复合以形成核酸-脂质或核酸-脂质体复合物。脂质体可由阳离子和常用于体外转染细胞的中性脂质组成。阳离子脂质可与带负电的核酸复合(例如电荷相关的)以形成脂质体。阳离子脂质体的实例包括但不限于脂转染素、脂转染胺、lipofectace和DOTAP。用于形成脂质体的程序在本领域中是熟知的。脂质体组合物可由例如以下形成:磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰胆碱、二棕榈酰磷脂酰胆碱、二肉豆蔻酰磷脂酰甘油、二油酰磷脂酰乙醇胺或包含二氢鞘磷脂(DHSM)的脂质体。许多亲脂性试剂可商购获得,包括TM
(Invitrogen/Life Technologies,Carlsbad,Calif.)和Effectene
(Qiagen,Valencia,Calif.)。另外,系统递送方法可使用可商购获得的阳离子脂质如DDAB或DOTAP来优化,每种阳离子脂质可与中性脂质如DOPE或胆固醇混合。在一些情况下,可使用脂质体,如由Templeton(Nature Biotechnology,15:647-652,1997)等人所述的那些。在其它实施方案中,聚阳离子如聚乙烯亚胺可用于实现体内和离体递送(Boletta等人,J.Am Soc.Nephrol.7:1728,1996)。关于使用脂质体递送核酸的附加的信息可见于美国专利号6,
271,359、PCT公布WO 96/40964和Morrissey等人(Nat Biotechnol.23(8):1002-7,2005)中。
[0061] 提供以下定义和方法来指导本领域技术人员。除非另作说明,术语将由相关领域技术人员根据传统用法来理解。当术语以单数形式提供时,发明者也考虑到该术语的复数方面。
[0062] “非可转录的”多核苷酸意味着多核苷酸不包含完整的聚合酶II转录单元。
[0063] 如本文所用的“溶液”是指均质混合物和非均质混合物,如悬浮液、胶体、胶束和乳液。
[0064] “触发物”或“触发多核苷酸”是与靶基因多核苷酸同源或互补的DNA多核苷酸分子。触发多核苷酸分子当用转移剂局部施用于植物表面时调节靶基因的表达,借此用所述组合物治疗的病毒感染的植物能够维持其生长或发育或生殖能力,或所述植物由于所述含有多核苷酸的组合物的缘故相对于未用含有触发分子的组合物治疗的植物来说对病毒的敏感性较小。用这种组合物治疗的植物可由于所述含有多核苷酸的组合物而相对于未用含有触发分子的组合物治疗的植物来说对病毒表达有抗性。本文所公开的触发多核苷酸可通常关于在如ssDNA、dsDNA、ssRNA或dsRNA分子或核苷酸变体及其修饰的核苷酸的反义(互补的)或有义方向上关于靶基因序列来描述,取决于所靶向的基因的各个区。
[0065] 预期组合物可含有多个DNA或RNA多核苷酸和/或农药,包括但不限于抗病毒化合物、杀虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、杀细菌剂、杀螨剂、生长调节剂、化学绝育剂、化学信息素、驱避剂、引诱剂、信息素、取食刺激剂以及生物杀虫剂。必需的基因是在植物中提供关键酶或其它蛋白质的基因,例如生物合成酶、代谢酶、受体、信号转导蛋白、结构基因产物、转录因子或转运蛋白;或调控RNA,如微RNA,它们对于有机体或细胞的生长或存活是必需的或涉及于植物的正常生长和发育中(Meinke等人,Trends Plant Sci.2008:13(9):483-91)。在病毒中必需的基因可包括负责衣壳制造、病毒组装、传染性、出芽等等的基因。在病毒中必需基因的抑制影响能够在植物中造成病毒感染的基因产物的功能。所述组合物可包含各种触发DNA或RNA多核苷酸,其调节必需基因在番茄斑萎病毒属中的表达。
[0066] 如本文所用,术语“DNA”、“DNA分子”或“DNA多核苷酸分子”是指基因组或合成来源的ssDNA或dsDNA分子,如脱氧核糖核苷酸碱基聚合物或DNA多核苷酸分子。如本文所用,术语“DNA序列”、“DNA核苷酸序列”或“DNA多核苷酸序列”是指DNA分子的核苷酸序列。除非另有说明,本说明书正文中的核苷酸序列当从左到右阅读时是在5'至3'方向上给出。本文所用的命名法是由美国联邦法规第37章§1.822所要求并且阐述在WIPO Standard ST.25(1998),附录2,表1和3的表中。
[0067] 如本文所用,术语“RNA”、“RNA分子”或“RNA多核苷酸分子”是指基因组或合成来源的ssRNA或dsRNA分子,如核糖核苷酸碱基的聚合物或RNA多核苷酸分子。如本文所用,术语“RNA序列”、“RNA核苷酸序列”或“RNA多核苷酸序列”是指RNA分子的核苷酸序列。除非另有说明,本说明书正文中的核苷酸序列当从左到右阅读时是在5’至3’方向上给出。本文所用的命名法是由美国联邦法规第37章§1.822所要求并且阐述在WIPO Standard ST.25(1998),附录2,表1和3的表中。
[0068] 如本文所用,“多核苷酸”是指含有多个核苷酸的DNA或RNA分子并且通常还是指“寡核苷酸”(通常长度为50个或更少核苷酸的多核苷酸分子)。实施方案包括组合物,所述组合物包含具有18-25个核苷酸长度的寡核苷酸(18-聚体、19-聚体、20-聚体、21-聚体、22-聚体、23-聚体、24-聚体或25-聚体),例如,如由SEQ ID NO:1-12、47-268及448-483或其片段所列举的寡核苷酸。靶基因包含在植物细胞中的任何多核苷酸分子或其片段,对靶基因的表达的调节是由所述方法和组合物提供。基因具有为基因功能而提供的非编码遗传元件(组分),这些元件是提供基因表达调控的多核苷酸,如启动子、增强子、5'未翻译区、内含子区以及3'未翻译区。寡核苷酸和多核苷酸可被制成基因的任何遗传元件并且制成跨越遗传元件的接合区的多核苷酸,如内含子和外显子、启动子与转录区的接合区、5'前导区与编码序列的接合区、3'未翻译区与编码序列的接合区。
[0069] 各种实施方案中所用的多核苷酸组合物包括包含DNA或RNA的寡核苷酸或多核苷酸、或两者的混合物、或化学上修饰的寡核苷酸或多核苷酸或其混合物的组合物。在一些实施方案中,多核苷酸包含化学上修饰的核苷酸。化学上修饰的寡核苷酸或多核苷酸的实例在本领域中是熟知的;参见,例如美国专利公布20110171287、美国专利公布20110171176以及美国专利公布20110152353、美国专利公布20110152346、美国专利公布20110160082,在此以引用的方式整体并入本文。例如,包括但不限于,寡核苷酸或多核苷酸的天然存在的磷酸二酯主链可用硫代磷酸酯、二硫代磷酸酯或甲基膦酸酯核苷酸间键修饰部分或完全修饰,修饰的核苷碱基或修饰的糖可用于寡核苷酸或多核苷酸合成,并且寡核苷酸或多核苷酸可用荧光部分(例如荧光素或若丹明)或其它标记物(例如生物素)标记。
[0070] 术语“基因”是指包括以下的组分:染色体DNA、RNA、质粒DNA、cDNA、内含子和外显子DNA、人工DNA多核苷酸或编码肽、多肽、蛋白质或RNA转录分子的其它DNA、以及侧接有涉及表达的调控的编码序列的遗传元件,如启动子区、5'前导区、3'非翻译区,其可作为植物基因组中的天然基因或转基因而存在。基因或其片段被分离并且经受多核苷酸测序方法,所述方法测定包含基因的核苷酸的顺序。基因的任何组分都是触发寡核苷酸和多核苷酸的可能的靶标。
[0071] 触发多核苷酸分子被设计来通过诱发调控或抑制病毒基因来调节表达并且被设计以具有与病毒基因的核苷酸序列或从植物病毒基因转录的RNA序列、通过将基因或所述基因的片段从植物中分离所确定的其序列(其可以是编码序列或非编码序列)基本上相同或基本上互补的核苷酸序列。调节表达的有效分子被称为“触发分子或触发多核苷酸”。“基本上相同”或“基本上互补”意味着触发多核苷酸(或至少一部分多核苷酸)被设计来杂交内源基因非编码序列或从内源基因转录的RNA(被称为信使RNA或RNA转录产物)以实现内源基因的表达的调控或抑制。触发分子是通过将基因靶标与反义多核苷酸的部分重叠的探针或不重叠的探针“拼接(tiling)”来鉴定,所述反义多核苷酸与内源基因的核苷酸序列基本上相同或基本上互补。可对多个靶序列进行比对并且根据所述方法具有共有同源性的序列区被鉴定为用于多个靶标的可能的触发分子。各种长度(例如18-25个核苷酸、26-50个核苷酸、51-100个核苷酸、101-200个核苷酸、201-300个核苷酸或更大)的多个触发分子可被汇集到几个治疗中以便研究覆盖基因序列一部分(例如,编码区的一部分对比非编码区的一部分、或基因的5'部分对比3'部分)的多核苷酸分子或包括靶基因的编码和非编码区的整个基因序列。汇集的触发分子的多核苷酸分子可被分成较小的池或单分子以便鉴定提供所需作用的触发分子。
[0072] 靶基因ssDNA多核苷酸分子(包括SEQ ID NO:1-12)或dsRNA分子(包括SEQ ID NO:47-268和448-483)可通过本领域中已知的许多可用的方法和设备来测序。一些测序技术是商购获得的,如来自Affymetrix Inc.(Sunnyvale,Calif.)的通过杂交测序的平台和来自
454Life Sciences(Bradford,Conn.)的通过合成测序的平台、Illumina/Solexa(Hayward,Calif.)和Helicos Biosciences(Cambridge,Mass.)、以及来自Applied Biosystems
(Foster City,Calif.)的通过连接测序的平台。除使用Helicos Biosciences的通过合成测序进行的单分子测序之外,其它单分子测序技术也涵盖在内并且包括Pacific 
Biosciences的SMRTTM技术、Ion TorrentTM技术、以及例如由Oxford  Nanopore 
Technologies开发的纳米孔测序。包含DNA或RNA的病毒靶基因可使用与靶基因或其片段基本上互补或基本上同源的引物或探针来分离。聚合酶链反应(PCR)基因片段可使用与对从植物基因组分离病毒基因有用的病毒基因或其片段基本上互补或基本上同源的引物来产生。各种序列捕获技术可用于分离另外的靶基因序列,例如,包括但不限于Roche
(Madison,WI)和链霉亲和素偶联的 (Life 
Technologies,Grand Island,NY)和US20110015084,以引用的方式整体并入本文。
[0073] 功能性单链或双链多核苷酸的实施方案具有不必是100%的序列互补性,但至少足以容许从靶基因转录的RNA或靶基因的DNA杂交以形成双链体以便容许基因沉默机制。因此,在实施方案中,多核苷酸片段被设计来与必需的靶标番茄斑萎病毒属或双生病毒基因序列的全部或一部分互补。例如,片段可与靶病毒基因序列或从靶基因转录的信使RNA中的18个或更多个连续核苷酸序列基本上相同或基本上互补。“基本上相同”意味着当与靶基因或从靶基因转录的RNA中的18个或更多个连续核苷酸序列相比时具有100%序列同一性或至少约83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列同一性;“基本上互补”意味着当与在靶基因或从靶基因转录的RNA中的18个或更多个连续核苷酸序列相比时具有100%序列互补性或至少约83、84、85、86、87、88、89、90、91、92、93、94、95、96、97、98或99%序列互补性。在一些实施方案中,多核苷酸分子被设计来与给定的靶基因的一个等位基因或一个家族成员(基因的编码或非编码序列)具有100%序列同一性或互补性;在其它实施方案中,多核苷酸分子被设计来与给定的靶基因的多个等位基因或家族成员具有
100%序列同一性或互补性。
[0074] “同一性”是指两个多核酸或蛋白质序列之间的相似性程度。两个序列的比对是通过适合的计算机程序进行。用于进行序列比对的广泛使用和接受的计算机程序是CLUSTALW v1.6(Thompson等人Nucl.Acids Res.,22:4673-4680,1994)。将匹配碱基或基酸的数目除以碱基或氨基酸的总数并乘以100以获得同一性百分比。例如,如果两个580碱基对序列具有145个匹配碱基,它们将是25%同一的。如果两个比较序列具有不同的长度,那么将匹配数目除以两个长度中较短的那个。例如,如果在200与400个氨基酸蛋白之间存在100个匹配的氨基酸,那么它们对于较短的序列是50%同一。如果较短的序列在长度上小于150个碱基或50个氨基酸,那么匹配的数目除以150(对于核酸碱基)或50(对于氨基酸),并且乘以100以获得同一性百分比。
[0075] 对于特定病毒基因家族成员的触发分子可通过从比对序列中的最小同源区比对和选择200-300个多核苷酸片段而从植物病毒或多个植物病毒基因家族的编码和/或非编码序列来鉴定,并且使用局部施用的多核苷酸(反义ssDNA或dsRNA)进行评价以确定它们在提供抗病毒表型中的相对有效性。在一些实施方案中,病毒基因家族是番茄斑萎病毒属且序列是选自SEQ ID NO:13-46。在一些实施方案中,病毒基因家族是黄瓜花叶病毒且序列是选自SEQ ID NO:269-316。在一些实施方案中,病毒基因家族是茄瓜花叶病毒且序列是选自SEQ ID NO:317-349。在一些实施方案中,病毒基因家族是大麦黄矮病病毒且序列是选自SEQ ID NO:350-385。在一些实施方案中,病毒基因家族是番茄黄色缩叶病毒且序列是选自SEQ ID NO:386-421。在一些实施方案中,病毒基因家族是棉花缩叶病毒且序列是选自SEQ ID NO:422-441。有效的节段被进一步再分成50-60个多核苷酸片段,通过最小同源性划分优先级,并且使用局部施用的多核苷酸来重新评价。有效的50-60个多核苷酸片段被再分成19-30个多核苷酸片段,通过最小同源性划分优先级,并且再次评价抗病毒表型的诱导。一旦确定了相对有效性,便单独地利用片段,或与一个或多个其它片段组合来进行再次评价以便确定用于提供抗病毒表型的触发组合物或触发多核苷酸的混合物。
[0076] 对于宽的抗病毒活性的触发分子可通过从比对序列中的最大同源区比对和选择200-300个多核苷酸片段而从植物病毒或多个植物病毒基因家族的编码和/或非编码序列来鉴定,并且使用局部施用的多核苷酸(反义ssDNA或dsRNA)进行评价以确定它们在诱导抗病毒表型中的相对有效性。在一些实施方案中,病毒基因家族是番茄斑萎病毒属且序列是选自SEQ ID NO:13-46。在一些实施方案中,病毒基因家族是黄瓜花叶病毒且序列是选自SEQ ID NO:269-316。在一些实施方案中,病毒基因家族是茄瓜花叶病毒且序列是选自SEQ ID NO:317-349。在一些实施方案中,病毒基因家族是大麦黄矮病病毒且序列是选自SEQ ID NO:350-385。在一些实施方案中,病毒基因家族是番茄黄色缩叶病毒且序列是选自SEQ ID NO:386-421。在一些实施方案中,病毒基因家族是棉花缩叶病毒且序列是选自SEQ ID NO:
422-441。有效的节段被再分成50-60个多核苷酸片段,通过最大同源性划分优先级,并且使用局部施用的多核苷酸来重新评价。有效的50-60个多核苷酸片段被再分成19-30个多核苷酸片段,通过最大同源性划分优先级,并且再次评价抗病毒表型的诱导。一旦确定了相对有效性,便可单独地或与一个或多个其它片段组合来利用片段,以便确定用于提供抗病毒表型的触发组合物或触发多核苷酸的混合物。
[0077] 制造多核苷酸的方法在本领域中是熟知的。化学合成、体内合成和体外合成方法和组合物在本领域中是已知的并且包括各种病毒元件、微生物细胞、修饰的聚合酶以及修饰的核苷酸。寡核苷酸的商业制剂经常在有义链的3’端上提供两个脱氧核糖核苷酸。长的多核苷酸分子可从商购获得的试剂盒来合成。长的多核苷酸分子还可从多个DNA片段来组装。在一些实施方案中,设计参数如雷诺评分(Reynolds等人Nature Biotechnology 22,326-330(2004))、Tuschl规则(Pei和Tuschl,Nature Methods 3(9):670-676,2006)、i评分(Nucleic Acids Res 35:e123,2007)、i评分设计师工具及相关算法(Nucleic Acids Res 
32:936-948,2004.Biochem Biophys Res Commun 316:1050-1058,2004,Nucleic Acids Res 32:893-901,2004,Cell Cycle 3:790-5,2004,Nat Biotechnol 23:995-1001,2005,Nucleic Acids Res 35:e27,2007,BMC Bioinformatics 7:520,2006,Nucleic Acids Res 
35:e123,2007,Nat Biotechnol 22:326-330,2004)是本领域中已知的并且可用于选择在基因沉默中有效的多核苷酸序列。在一些实施方案中,针对预期植物的基因组DNA筛选多核苷酸序列以使其它基因的无意沉默最小化。
[0078] 配体可连接至ssDNA或dsRNA多核苷酸。配体一般说来可包括修饰剂,例如用于增加摄取;诊断化合物或报道基团,例如用于监测分布;交联剂;核酸酶抗性赋予部分;以及天然或稀有核碱基。一般实例包括亲脂体、脂质(例如胆固醇、胆汁酸或脂肪酸(例如石胆酸-油烯基、月桂酰基、二十二烷基、硬脂酰基、棕榈酰基、肉豆寇酰基、油酰基、亚油酰基)、类固醇(例如熊果醇、龙舌蓝皂苷配基、薯蓣皂苷配基)、萜烯(例如三萜,例如萨洒皂角苷配基、软木三萜、表木栓烷醇衍生的石胆酸)、维生素(例如叶酸、维生素A、生物素、吡哆)、水化合物、蛋白质、蛋白结合剂、整联蛋白靶向分子、聚阳离子、肽、多胺以及肽模拟物)。配体也可以是重组或合成分子,如合成聚合物,例如聚乙二醇(PEG)、PEG-40K、PEG-20K以及PEG-5K。配体的其它实例包括亲脂性分子,例如胆固醇、胆酸、金刚烷乙酸、1-芘丁酸、二氢睾丸酮、甘油(例如其酯和醚,例如C10、C11、C12、C13、C14、C15、C16、C17、C18、C19或C20烷基;例如月桂酰基、二十二烷基、硬脂酰基、油酰基、亚油酰基1,3-双-O(十六基)甘油、1,3-双-O(十八基)甘油)、香叶氧基己基、十六基甘油、片、薄荷醇、1,3-丙二醇、十七基、棕榈酸、肉豆蔻酸、O3-(油酰基)石胆酸、O3-(油酰基)胆烯酸、十二烷酰基、石胆酰基、5β-胆甾烷基、N,N-二硬脂基-石胆酰胺、1,2-二-O-硬脂酰甘油酯、二甲氧基三苯甲基或吩恶嗪)以及PEG(例如,PEG-5K、PEG-20K、PEG-40K)。优选的亲脂性部分包括脂质、胆固醇、油烯基、视黄基或胆甾醇残基。
[0079] 本发明方法可施用于是转基因或不是转基因的植物。转基因植物的非限制性实例包括包含一个或多个赋予选自由以下组成的组的特性的转基因的那些植物:抗虫性、抗农药性、延长的储存期、果实着色、果实成熟、果实甜度、营养价值及其类似特性。
[0080] 在本发明的具体实施方案中,如本文所提供的植物疾病控制组合物可进一步提供于被配制来施用于植物的组合物中,所述组合物包含至少一种其它活性成分。这种活性成分的实例可包括但不限于杀虫蛋白,如马铃薯贮藏蛋白、苏金杆菌杀虫蛋白、致病杆菌杀虫蛋白、光杆状菌杀虫蛋白、杆菌土壤共生菌杀虫蛋白以及杆菌球形芽孢杆菌杀虫蛋白。在另一非限制性实例中,这种活性成分是除草剂,如以下一种或多种:乙草胺、氟草醚、氟锁草醚-钠、苯草醚、丙烯醛、草不绿、禾草灭、烯丙醇、莠灭净、氨唑草酮、酰嘧磺隆、氯氨基吡啶酸、杀草强、氨基磺酸铵、莎稗磷、黄草灵、阿特拉通、莠去津、四唑嘧磺隆、BCPC、氟丁酰草胺、草除灵、氟草胺、呋草黄、苄嘧黄隆、苄嘧黄隆-甲基、地散磷、苯达松除草剂、双苯嘧草酮、双环磺草酮、吡草酮、甲羧除草醚、双丙氨膦、双草醚、双草醚-钠、砂、除草定、溴丁酰草胺、溴苯腈、去草胺、氟丙嘧草酯、草胺灵、地乐胺、丁氧环酮、苏达灭、卡可基酸、氯酸、唑酰草胺、草长灭、唑草酯、唑草酯-乙基、CDEA、CEPC、氯甲丹、氯甲丹-甲基、杀草敏、氯嘧黄隆、氯嘧黄隆-乙基、氯乙酸、绿麦隆、氯苯胺灵、氯磺隆、敌草索、敌草索-二甲基、吲哚酮草酯-乙基、环庚草醚、醚磺隆、咯草隆、烯草酮、炔草酸、炔草酸-炔丙基、广灭灵、稗草胺、二氯吡啶酸、氯酯磺草胺、氯酯磺草胺-甲基、CMA、4-CPB、CPMF、4-CPP、CPPC、甲酚、苄草隆、氨基氰、草净津、草灭特、环丙嘧磺隆、噻草酮、氰氟草酯、氰氟草酯-丁基、2,4-D、3,4-DA、香草隆、茅草枯、棉隆、2,4-DB、3,4-DB、2,4-DEB、甜菜安、麦草畏、敌草腈、邻二氯苯、对二氯苯、2,4-滴丙酸、2,4-滴丙酸-P、禾草灵、禾草灵-甲基、唑嘧磺胺、燕麦枯、燕麦枯甲硫酸盐、吡氟酰草胺、氟吡草腙、恶唑隆、哌草丹、二甲草胺、异戊乙净、噻吩草胺、噻吩草胺-P、噻节因、卡可基酸、敌乐胺、地乐消、草乃敌、杀草快、敌草快、氟硫草定、敌草隆、DNOC、3,4-DP、DSMA、EBEP、草哆嗦、EPTC、禾草畏、烯氯乐灵、胺苯黄隆、胺苯黄隆-甲基、乙氧呋草黄、氟乳醚、乙氧嘧磺隆、乙氧苯草胺、恶唑禾草灵-P、恶唑禾草灵-P-乙基、四唑酰草胺、硫酸亚、氟燕灵-M、啶嘧磺隆、双氟磺草胺、吡氟禾草灵、吡氟禾草灵-丁基、吡氟禾草灵-P、吡氟禾草灵-P-丁基、氟酮磺隆、氟酮磺隆-钠、氟吡磺隆、氟消草、氟噻草胺、氟哒嗪草酯、氟哒嗪草酯-乙基、唑嘧磺草胺、氟烯草酸、氟烯草酸-戊基、丙炔氟草胺、伏草隆、乙羧氟草醚、乙羧氟草醚-乙基、四氟丙酸、氟啶黄隆、氟啶黄隆-甲基-钠、抑草丁、氟草同、氟咯草酮、氯氟吡氧乙酸、呋草酮、达草氟、达草氟-甲基、氟黄胺草醚、甲酰胺磺隆、杀木膦、草铵膦、草铵膦-铵、草甘膦、吡氯黄隆、吡氯黄隆-甲基、吡氟氯禾灵、吡氟氯禾灵-P、HC-252、环嗪酮、咪草酸、咪草酸-甲基、咪草啶酸、甲咪唑烟酸、灭草烟、灭草喹、咪草烟、咪唑磺隆、茚草酮、碘代甲烷、碘黄隆、碘黄隆-甲基-钠、碘苯腈、异丙隆、异隆、异酰草胺、异氯草酮、异氟草、卡草灵、乳氟禾草灵、环草定、利谷隆、MAA、MAMA、MCPA、MCPA-硫乙基、MCPB、2甲4氯丙酸、2甲4氯丙酸-P、苯噻草胺、氟磺酰草胺、甲基二磺隆、甲基二磺隆-甲基、硝草酮、威百亩、恶唑酰草胺、苯嗪草酮、吡草胺、噻唑隆、甲基砷酸、甲基杀草隆、异硫氰酸甲酯、吡喃隆、异丙甲草胺、S-异丙甲草胺、磺草唑胺、甲氧隆、嗪草酮、甲磺隆、甲磺隆-甲基、MK-66、草达灭、绿谷隆、MSMA、丙胺、敌草胺、抑草生、草不隆、烟嘧磺隆、壬酸、达草灭、油酸(脂肪酸)、坪草丹、嘧苯胺磺隆、黄草消、丙炔恶草酮、恶草灵、环氧嘧磺隆、恶嗪草酮、乙氧氟草醚、百草枯、百草枯二氯化物、克草猛、二甲戊乐灵、五氟磺草胺、五氯苯酚、蔬草灭、环戊恶草酮、烯草胺、石油、苯敌草、苯敌草-乙基、毒莠定、氟吡酰草胺、唑啉草酯、哌草磷、亚砷酸、叠氮钾、丙草胺、氟嘧黄隆、氟嘧黄隆-甲基、氨氟乐灵、氟唑草胺、氯苯噻草酮、扑灭通、扑草净、毒草安、敌稗、喔草酯、扑灭津、苯胺灵、异丙草胺、丙苯磺隆、丙苯磺隆-钠、拿草特、苄草丹、氟磺隆、双唑草腈、吡草醚、吡草醚-乙基、吡唑特、吡嘧磺隆、吡嘧磺隆-乙基、苄草唑、嘧啶肟草醚、稗草畏、氯苯哒醇(pyridafol)、哒草特、环酯草醚、嘧草醚、嘧草醚-甲基、吡丙醚(pyrimisulfan)、嘧硫草醚、嘧硫草醚-钠、二氯喹啉酸、氯甲喹啉酸、灭藻醌、喹禾灵、喹禾灵-P、砜嘧磺隆、稀禾定、环草隆、西玛三嗪、西草净、SMA、亚砷酸钠、叠氮化钠、氯酸钠、磺草酮、甲磺草胺、甲嘧磺隆、甲嘧磺隆-甲基、草硫膦、磺酰磺隆、硫酸、焦油、2,3,6-TBA、TCA、TCA-钠、丁噻隆、吡喃草酮、特草定、甲氧去草净、特丁津、去草净、甲氧噻草胺、噻唑烟酸、噻吩磺隆、噻吩磺隆-甲基、禾草丹、仲草丹、苯吡唑草酮、肟草酮、野麦畏、醚苯磺隆、三嗪氟草胺、苯磺隆、苯磺隆-甲基、杀草畏、绿草定、草达津、三氟啶磺隆、三氟啶磺隆-钠、氟乐灵、氟胺磺隆、氟胺磺隆-甲基、三羟基三嗪、三氟甲磺隆、[3-[2-氯-4-氟-5-(-甲基-6-三氟甲基-2,4-二氧代-,2,3,
4-四氢嘧啶-3-基)苯氧基]-2-吡啶氧基]乙酸乙酯(CAS RN 353292-3-6)、4-[(4,5-二氢-
3-甲氧基-4-甲基-5-氧代)-H-,2,4-三唑基羰基-氨磺酰基]-5-甲基-噻吩-3-甲酸
(BAY636)、BAY747(CAS RN 33504-84-2)、氟磺草酮(CAS RN 2063-68-8)、4-羟基-3-[[2-[(2-甲氧基乙氧基)甲基]-6-(三氟-甲基)-3-吡啶基]羰基]-二环[3.2.]辛-3-烯-2-酮
(CAS RN 35200-68-5)以及4-羟基-3-[[2-(3-甲氧基丙基)-6-(三氟甲基)-3-吡啶基]羰基]-二环[3.2.]辛-3-烯-2-酮。
[0081] 触发DNA或RNA多核苷酸和/或寡核苷酸分子组合物适用于组合物中,如包含低浓度多核苷酸分子单独或与其它组分组合的液体,例如一种或多种除草剂分子,在同一溶液中或在还提供转移剂的单独施用的液体中。虽然可适用于所述方法中的多核苷酸分子的浓度和剂量不存在上限,但较低的有效浓度和剂量通常是在寻求效率。浓度可考虑到施用于植物叶片或其它植物部分表面上的喷雾或治疗体积来调节,如花瓣、茎、块茎、果实、花药、花粉或种子。在一个实施方案中,在草本植物中使用25-聚体寡核苷酸分子的有用的治疗为每株植物约1纳摩尔(nmol)寡核苷酸分子,例如每株植物约0.05至1nmol。草本植物的其它实施方案包括每株植物约0.05至约100nmol、或约0.1至约20nmol、或约1nmol至约10nmol多核苷酸的有效范围。极大的植物、树或藤可能需要相对较大数量的多核苷酸。为了说明实施方案,因子1X,当施用于寡核苷酸分子时,任意地用于表示每株植物0.8nmol多核苷酸分子的治疗;10X,每株植物8nmol多核苷酸分子;以及100X,每株植物80nmol多核苷酸分子。
[0082] 需要病毒控制的农艺学大田可通过向生长中的植物表面如通过喷雾直接施用农业化学组合物来处理。例如,所述方法应用于在作物植物的大田中通过用组合物喷雾所述大田来控制病毒感染。组合物可作为与一种或多种杀虫或除草化学品的混合罐来提供以控制需要害虫和疾病控制的作物植物的害虫和疾病,作为组分的连续治疗(通常是含有多核苷酸的组合物,接着是农药)、或来自单独的容器的组合物的一种或多种组分的同时治疗或混合来提供。大田的治疗可每当需要提供病毒控制时而出现,并且组合物的组分可被调节以经由利用能选择性地靶向有待被控制的具体病毒的具体多核苷酸或多核苷酸组合物来靶向具体的番茄斑萎病毒或双生病毒。组合物可根据施用于大田的时间,例如种植前、种植时、种植后或收获后在有效的使用率下施用。组合物的多核苷酸可取决于大田中病毒感染范围所需的触发分子的数目在每英亩1至30克的比率下施用。
[0083] 其中可需要病毒控制的作物植物包括但不限于玉米、大豆、棉花、菜籽、甜菜、苜蓿、甘蔗、水稻、大麦和小麦;蔬菜植物,包括但不限于番茄、甜椒、辣椒、甜瓜、西瓜、黄瓜、绿皮密生西葫芦、茄子、花椰菜、茎椰菜、莴苣、菠菜、洋葱、豆类、胡萝卜、甜玉米、大白菜、韭菜、茴香、番瓜、南瓜或葫芦、萝卜、马铃薯、抱子甘蓝、粘果酸浆、花生、青刀豆、干豆或秋葵;烹饪植物,包括但不限于罗勒、欧芹、咖啡或茶叶;或水果植物,包括但不限于苹果、梨、樱桃、桃、李子、杏、香蕉、车前草、鲜食葡萄、酿酒用葡萄、柑桔、鳄梨、芒果或浆果;为装饰或商业用途而生长的树木,包括但不限于水果或坚果树;观赏植物(例如观赏花卉植物或灌木或草皮草),如鸢尾和风仙花。本文所提供的方法和组合物还可施用于通过切割、克隆或移植过程(即,不是从种子生长而来的植物)而产生的植物,包括果树和植物,包括但不限于鳄梨、番茄、茄子、黄瓜、甜瓜、西瓜和葡萄以及各种观赏植物。
[0084] 触发多核苷酸组合物还可用作与各种农业化学品和/或杀虫剂、杀螨剂和杀真菌剂、杀虫和生物杀虫剂的混合物。实例包括但不限于谷硫磷保棉磷-甲基、乙酰甲胺磷、异恶唑磷、异丙胺磷、乙硫磷、乙嘧硫磷、砜吸磷-甲基、异亚砜磷、喹恶磷、毒死蜱、毒死蜱-甲基、毒虫畏、杀螟腈、蔬果磷、敌敌畏、乙拌磷、甲基毒虫畏、乐果、硫丙磷、二嗪农、二甲硫吸磷、杀虫畏、双硫磷、丁基嘧啶磷、特丁硫磷、二溴磷、蚜灭多、吡唑硫磷、哒嗪硫磷、嘧啶磷-甲基、杀螟松、倍硫磷、稻丰散、flupyrazophos、丙硫磷、丙虫磷、丙溴磷、腈肟磷、伏杀磷、亚胺硫磷、安果、甲拌磷、马拉硫磷、灭蚜磷、倍硫磷亚砜、甲胺磷、杀扑磷、对硫磷、甲基对硫磷、久效磷、敌百虫、EPN、氯唑磷、isamidofos、硫线磷、除线特、除线磷、硫磷嗪、苯线磷、噻唑磷、丁硫环磷、磷虫威、DSP、灭线磷、棉铃威、涕灭威、异丙威、杀虫丹、西维因、丁硫克百威、灭杀威、硫双威、抗蚜威、仲丁威、呋线威、残杀威、苯噁威、丙硫克百威、灭多虫、速灭威、XMC、呋喃丹、涕灭砜威、草氨酰、氟丙菊酯、丙烯除虫菊酯、高氰戊菊酯、右旋烯炔菊酯、乙氰菊酯、氯氟氰菊酯、γ-氯氟氰菊酯、λ-氯氟氰菊酯、氟氯氰菊酯、β-氟氯氰菊酯、氯氰菊酯、α-氯氰菊酯、ξ-氯氰菊酯、氟硅菊酯、胺菊酯、七氟菊酯、溴氰菊酯、四溴菊酯、联苯菊酯、苯醚菊酯、氰戊菊酯、甲氰菊酯、炔呋菊酯、炔丙菊酯、氟氰戊菊酯、氟胺氰菊酯、溴氟菊酯、苄氯菊酯、灭虫菊、醚菊酯、巴丹、杀虫环、杀虫磺、啶虫脒、吡虫啉、噻虫胺、呋虫胺、噻虫啉、噻虫嗪、烯啶虫胺、氟啶脲、除虫脲、氟苯脲、杀铃脲、双苯氟脲、多氟脲、bistrifluoron、氟佐隆、氟螨脲、氟虫脲、氟铃脲、虱螨脲、环虫酰肼、虫酰肼、氯虫酰肼、甲氧虫酰肼、苯虫醚、环丙氨嗪、蚊蝇醚、稻虱净、烯虫酯、烯虫乙酯、烯虫炔酯、唑蚜威、硫丹、杀螨酯、乙酯杀螨醇、三氯杀螨醇、溴螨酯、乙酰虫腈、氟虫腈、扑虱灵、除虫菊酯鱼藤酮、烟碱硫酸盐、BT(苏云金杆菌)剂、多杀菌素、阿维菌素、灭螨醌、磺胺螨酯、阿米曲拉、乙螨唑、灭螨猛、四螨嗪、苯丁、除螨灵、三环锡、螺螨酯、螺甲螨酯、四氯二苯砜、吡螨胺、乐杀螨、联苯肼酯、哒螨灵、嘧螨醚、喹螨醚、苯硫威、霸螨灵、嘧螨酯、氟啶胺、杀螨净、噻螨酮、克螨特、苯螨特、素酯混剂、弥拜菌素、虱螨脲、灭蚜磷、灭虫威、速灭磷、苄螨醚、印楝素、丁醚脲、茚虫威、埃玛菌素安息香酸盐、油酸钾、油酸钠、溴虫腈、唑虫酰胺、吡蚜酮、苯氧威、氟蚁腙、羟基丙基淀粉、啶虫丙醚、嘧虫胺、氟虫酰胺、氟啶虫酰胺、氰氟虫腙、雷皮菌素、TPIC、丙硫咪唑、奥苯达唑、磺唑氨酯、水杨菌胺、丰索磷、达虫净、左旋四咪唑盐酸盐、甲噻吩嘧啶酒石酸盐、棉隆、威百亩、三唑酮、己唑醇、丙环唑、种菌唑、咪鲜胺、氟菌唑、戊唑醇、氟环唑、苯醚甲环唑、氟硅唑、三唑醇、环唑醇、叶菌唑、氟喹唑、联苯三唑醇、氟醚唑、灭菌唑、粉唑醇、戊菌唑、烯唑醇、腈苯唑、糠菌唑、亚胺唑、硅氟唑、腈菌唑、恶霉灵、抑霉唑、呋吡菌胺、噻呋酰胺、土菌灵、恶咪唑、恶咪唑延胡索酸盐、稻瘟酯、丙硫菌唑、啶斑肟、氯苯嘧啶醇、氟苯嘧啶醇、乙嘧酚磺酸酯、嘧菌胺、嘧菌环胺、嘧霉胺、甲霜灵、精甲霜灵、恶霜灵、苯霜灵、托布津、托布津-甲基、苯菌灵、多菌灵、麦穗宁、涕必灵、代森锰、甲基代森锌、代森锌、代森联、代森锰、二甲氨荒酸锌、秋兰姆、百菌清、噻唑菌胺、氧化萎锈灵、萎锈灵、氟酰胺、硫硅菌胺、担菌宁、烯酰吗啉、苯锈啶、丁苯吗啉、螺环菌胺、克啉菌、吗菌灵、氟吗啉、嘧菌酯、亚胺菌-甲基、叉氨苯酰胺、肟醚菌胺、氟嘧菌酯、肟菌酯、醚菌胺、唑菌胺酯、啶氧菌酯、异菌脲、腐霉利、农利灵、乙菌利、磺菌胺、棉隆、异硫氰酸甲酯、三氯硝基甲烷、磺菌威、土菌消、土菌消钾、氯唑灵、D-D、安百亩、碱式氯化、碱式硫酸铜、壬基苯酚磺酸铜、喹啉铜、DBEDC、无水硫酸铜、硫酸铜五水合物、氢氧化铜、无机硫、可湿性硫黄粉、石硫合剂、硫酸锌、薯瘟锡、碳酸氢钠、碳酸氢钾、次氯酸钠、银、克瘟散、立枯磷-甲基、乙膦酸、异稻瘟净、敌螨普、定菌磷、环丙酰菌胺、四氯苯酞、三环唑、咯喹酮、双氯氰菌胺、稻瘟酰胺、春日霉素、有效霉素、多氧菌素、blasticiden S、土霉素、灭粉霉素、链霉素菜籽油、机械油、苯噻菌胺、丙森锌、霜霉威、乙霉威、唑呋草、咯菌腈、拌种咯、喹氧灵、恶喹酸、百菌清、克菌丹、灭菌丹、噻菌灵、阿拉酸式苯-S-甲基、噻酰菌胺、环氟菌胺、环酰菌胺、二氟林、苯菌酮、picobenzamide、丙氧喹啉、恶唑菌酮、氰霜唑、咪唑菌酮、苯酰菌胺、啶酰菌胺、霜脲氰、二噻农、氟啶胺、苯氟磺胺、嗪氨灵、稻瘟灵、嘧菌腙、哒菌酮、叶枯酞、戊菌隆、灭螨猛、双胍辛胺乙酸、烷苯磺酸盐、代森铵、聚氨基甲酸酯、噻二嗪、地茂散、福美镍、双胍盐、十二烷基胍-乙酸、五氯硝基苯、对甲抑菌灵、敌菌灵、酞菌酯、种衣酯、甲菌定、苯噻硫氰、过敏蛋白、氟酰菌胺、双炔酰菌胺以及吡噻菌胺。
[0085] 所有公布、专利和专利申请均引入本文以供参考,其程度就如同每个单独的公布或专利申请被具体和单独地指明引入以供参考。
[0086] 出于例证的目的提供以下实施例并且不应被视为是限制。本领域技术人员根据本公开将了解,可在不背离精神和范围的情况下对本文所公开的具体实施方案做出许多改变并且还获得相似或类似的结果。
[0087] 实施例1
[0088] 反义ssDNA寡核苷酸向莴苣植物的局部施用用于控制风仙花坏死斑病毒(INSV)
[0089] 对在反义(as)方向上的单链DNA(ssDNA)片段进行鉴定并且将其与转移剂及其它组分混合。将此组合物局部地施用于莴苣植物以实现靶INSV核衣壳(N)基因的抑制,从而减少或排除病毒感染在植物中的症状。程序如下。
[0090] 生长中的莴苣植物(莴苣,c.v.SVR3606-L4)用组合物局部地治疗,用于诱发植物中的靶基因抑制。所述组合物包含:(a)能够使多核苷酸渗透到植物中的试剂,以及(b)至少一条多核苷酸链,其包含至少一个在反义方向上的靶基因的17-25个连续核苷酸的节段。莴苣植物用包含反义ssDNA的佐剂溶液局部治疗,所述反义ssDNA与编码INSV N蛋白的序列基本上同源或基本上互补。植物在生长室[22℃,8小时光(ˉ50μmol),16小时暗循环]中生长和治疗。
[0091] 莴苣植物在测定之前大约16-21天发芽。单叶的莴苣植物(总共40株植物)被大约200纳克(100ng/μL在磷酸盐缓冲液中)INSV病毒感染。病毒感染之后大约3小时,使用喷枪在20psi下用寡核苷酸在溶液中(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2,混合在一起)的混合物对20株植物进行喷雾。反义ssDNA寡核苷酸序列列在表1中。剩下的20株植物不用寡核苷酸治疗且用作对照。
[0092] 除非另有说明,每个寡核苷酸或多核苷酸的最终浓度对于ssDNA是20nM(在0.1%Silwet L-77、2%硫酸铵、5mM磷酸钠缓冲液,pH 6.8中)。将喷雾溶液施用于植物以提供总共200-300μL体积。测量气生组织的鲜重(参见图1)。
[0093] 表1.针对INSV核衣壳基因N的反义ssDNA寡核苷酸的序列。
[0094]SEQ ID NO 序列(5'-3') 长度 病毒 靶标
1 GCTATAAACAGCCTTCCAAGTCA 23 INSV 核衣壳基因(N)
2 GTCATTAAGAGTGCTGACTTCAC 23 INSV 核衣壳基因(N)
[0095] 实施例2
[0096] 使用ELISA对病毒的定量
[0097] 将如实施例1中所述从未治疗的或治疗的植物莴苣植物(图2)收获的叶刺(Leaf punctures)使用研钵和杵在抗原缓冲液中粉碎。将匀浆在4℃下在10,000rpm下离心5分钟。将上清液抽出并且经受针对抗INSV N蛋白的间接ELISA。
[0098] 如图3所示,圆形代表在从对照植物(仅病毒,没有多核苷酸)处收集的个别叶片试样中的INSV N蛋白读数。三角形代表在从用反义ssDNA寡核苷酸(SEQ ID NO:1和SEQ ID NO:2)的混合物治疗的植物处收集的个别叶片试样中的INSV N蛋白读数。大约65%寡核苷酸治疗的植物展现0.2或更低的OD405值,并且100%对照植物展现1或更高的OD405值。图4和图5示出在用反义ssDNA寡核苷酸治疗之后莴苣植物的提取物的光密度(OD)和目测评定。
[0099] 实施例3
[0100] 在病毒治疗之后向莴苣植物局部施用反义ssDNA寡核苷酸改善光合体系II功能
[0101] 在此实施例中,将未治疗的(无治疗)或已经感染上INSV病毒并用ss反义寡核苷酸治疗的莴苣植物使用便携式叶绿素荧光计(PAM-2500)来测量。此测量给出光合体系II(PSII)功能的有效产率,总产率的一个度量。一组六个随机选取的非治疗植物和六个随机选取的治疗植物在叶片数目2、4、6和8时测量。叶片数目指示具有在形成莴苣头内的最年轻的叶片(叶片2)和位于形成莴苣头之外的最老叶片(叶片8)的莴苣头的年龄。用ss反义DNA寡核苷酸治疗的植物展现与未治疗的(无治疗)植物相比在外部叶片上的最大保护。
[0102] 实施例4
[0103] 向番茄和胡椒植物局部施用反义ssDNA寡核苷酸用于控制番茄斑萎病毒(TSWV)
[0104] 对在有义或反义方向或两个方向上的单链或双链DNA或RNA片段进行鉴定并且与转移剂及其它组分混合。将此组合物局部地施用于番茄植物以实现靶TSWV核衣壳或衣壳基因的表达,从而减少或排除病毒感染在植物中的症状。程序如下。
[0105] 番茄植物(西红柿HP375)和胡椒植物(c.v.Yolo Wonder B)在户外的笼中生长。将感染上TSWV(一种负义RNA病毒)的胡椒植物从育种家的感染胡椒大田中的含有番茄或胡椒植物的行的中心处移植。任何随后的感染都归因于蓟马将TSWV从感染的中心植物处传播,由此模拟天然的TSWV感染(参见图6)。用至少一条多核苷酸链的混合物进行局部治疗,所述多核苷酸链包含至少一个在反义或有义方向上的靶基因的17-25个连续核苷酸节段。用包含ssDNA寡核苷酸的触发分子的局部施用的佐剂溶液治疗植物,所述ssDNA寡核苷酸与TSWV核衣壳编码序列基本上同源或基本上互补。在每个治疗中使用的触发分子的序列显示于表2中。
[0106] 表2.针对TSWV核衣壳基因N的反义ssDNA寡核苷酸的序列。
[0107]
[0108] 处在2-5片叶完全展开的发育阶段的植物用于这些测定中。7或8株植物当做对照(仅病毒感染)且7或8株植物用多核苷酸治疗。每株植物两片完全展开的叶片用多核苷酸/Silwet L-77溶液治疗。除非另有说明,每个寡核苷酸或多核苷酸的最终浓度对于ssDNA是10nmol(在0.1%Silwet L-77、2%硫酸铵、5mM磷酸钠缓冲液,pH 6.8中)。将二十微升溶液施用于两个叶片各自的上表面上以提供每株植物总共40μL。图7示出未治疗的(圈出的)和局部用针对TSWV的反义ssDNA寡核苷酸治疗的番茄植物,而图8和9示出番茄和胡椒植物分别的局部治疗结果。
[0109] 实施例5
[0110] 反义ssDNA寡核苷酸向胡椒植物的局部施用用于控制黄瓜花叶病毒(CMV)
[0111] 在此实施例中,用黄瓜花叶病毒(CMV)(一条正链RNA病毒)接种生长中的胡椒植物(c.v.Yolo Wonder B)并且将植物分为两组。然后用至少一条多核苷酸链的混合物局部地治疗实验组,所述多核苷酸链包含至少一个在反义或有义方向上的靶基因的17-25个连续核苷酸节段。在局部佐剂溶液中的触发分子包含与CMV衣壳编码序列基本上同源或基本上互补的dsRNA和ssDNA。在每个治疗中使用的触发分子的序列显示于表3中。
[0112] 表3.针对CMV外壳蛋白(CP)的反义ssDNA寡核苷酸的序列。
[0113] SEQ ID NO 序列(5'-3') 长度 病毒 靶标5 AGACGTGGGAATGCGTTGGTG 21 CMV 外壳蛋白(CP)
6 CTCGACGTCAACATGAAGTAC 21 CMV 外壳蛋白(CP)
7 GCTTGGACTCCAGATGCAGCA 21 CMV 外壳蛋白(CP)
8 TACTGATAAACCAGTACCGGT 21 CMV 外壳蛋白(CP)
9 CGAATTTGAATGCGCGAAACA 21 CMV 外壳蛋白(CP)
10 AGTTTCTTGTCATATTCTGTG 21 CMV 外壳蛋白(CP)
11 GACGACCAGCTGCCAACGTCT 21 CMV 外壳蛋白(CP)
12 TATTAAGTCGCGAAAGCTGCT 21 CMV 外壳蛋白(CP)
[0114] 在2-5片叶完全展开的发育阶段的胡椒植物用于所述测定。7或8株植物用作对照(仅病毒感染)且7或8株植物用病毒、接着用多核苷酸触发溶液处理。每株植物两片完全展开的叶片用多核苷酸/Silwet L-77溶液处理。一组植物用包含SEQ ID NO:5-8的多核苷酸混合物处理且另一组植物用包含SEQ ID NO:9-12的多核苷酸混合物处理。除非另有说明,每个寡核苷酸或多核苷酸的最终浓度对于ssDNA是5nmol(在0.1%Silwet L-77、2%硫酸铵、5mM磷酸钠缓冲液,pH 6.8中)。将二十微升溶液施用于两个叶片各自的上表面上以提供每株植物总共40μL。
[0115] 如图10所示,圆形代表从对照植物(仅有病毒,没有寡核苷酸治疗)处收集的数据点。菱形(SEQ ID NO:5-8)和三角形(SEQ ID NO:9-12)代表从用反义ssDNA寡核苷酸溶液局部治疗的样品处收集的数据点。左边部分示出来自接种叶片的数据,且右边部分示出来自系统的、非感染的、非寡核苷酸治疗叶片的数据。
[0116] 实施例6
[0117] 反义ssDNA寡核苷酸向洋葱植物的局部施用用于控制鸢尾黄斑病毒(IYSV)
[0118] 在此实施例中,用鸢尾黄斑病毒(IYSV)接种生长中的洋葱植物并且将植物分为两组(每组31株植物)。然后用至少一条多核苷酸链的混合物局部地治疗实验组,所述多核苷酸链包含至少一个在反义方向上的靶基因的17-25个连续核苷酸节段。在局部佐剂溶液中的触发分子包含与IYSV编码序列基本上同源或基本上互补的ssDNA。用反义ssDNA治疗的洋葱植物的结果显示于图11中。
[0119] 实施例7
[0120] 局部施用多核苷酸触发物用于控制商业上相关的番茄斑萎病毒属分离株
[0121] 在此实施例的表4中,对因为在番茄、胡椒、马铃薯或大豆中的产率损失而考虑是商业上相关的番茄斑萎病毒属分离株的基因序列进行鉴定并且构成SEQ ID NO:13-46。
[0122] 计算机比对用于鉴定核衣壳(N)、沉默抑制子(NSs)、移动(NSm)和RNA依赖性RNA聚合酶基因(表5中的SEQ ID NO:47-103)内高度保守的区域以用作与用于局部施用治疗来控制番茄斑萎病毒属感染的基因序列同源的反义ssDNA或dsRNA多核苷酸的候选物(表5)。在番茄斑萎病毒属感染的番茄植物上对这些多核苷酸进行测试以控制病毒感染。
[0123] 表4.番茄斑萎病毒属的RNA序列。
[0124]
[0125]
[0126]
[0127] 表5.针对番茄斑萎病毒属的dsRNA寡核苷酸的序列。
[0128]
[0129]
[0130]
[0131] 实施例8
[0132] 局部施用多核苷酸触发物用于在农业中控制其它商业相关的植物病毒
[0133] 在此实施例的表6中,将常用的计算机算法用于鉴定在农业中商业相关的植物病毒分离株的外壳蛋白(CP)、移动蛋白(MP)和沉默抑制子蛋白中的高度保守区。这些病毒可以是不同的家族,如双生病毒组(即棉花缩叶病毒、大麦黄矮病病毒)或雀麦花叶病毒(即CMV)或马铃薯X病毒(即PepMV)。在表6中鉴定的触发物构成SEQ ID NO:104-268并且可以用转移剂局部地施用于番茄或胡椒植物以测试针对由各自的病毒引起的感染的功效。
[0134] 表6.针对商业上相关病毒的dsRNA寡核苷酸的序列。
[0135]
[0136]
[0137]
[0138]
[0139]
[0140]
[0141]
[0142] 实施例9
[0143] 局部施用多核苷酸触发物用于控制黄瓜花叶病毒
[0144] 在此实施例中,对不同的黄瓜花叶病毒的外壳蛋白(CM)和移动蛋白(MP)或沉默抑制子(S)的序列进行鉴定并且可见于表7中。将由黄瓜花叶病毒(CMV)感染的胡椒植物中使用转移试剂局部施用来源于所列序列(SEQ ID NO:269-316)的ss反义DNA或dsRNA序列并且将通过ELISA分析对植物进行评分且目测评定症状的减轻。
[0145] 表7.在黄瓜花叶病毒(CMV)中的靶基因的序列。
[0146]
[0147]
[0148]
[0149] 实施例10
[0150] 局部施用多核苷酸触发物用于控制茄瓜花叶病毒感染
[0151] 在此实施例中,对不同的茄瓜花叶病毒分离株的外壳蛋白(CM)和移动蛋白(MP)的序列进行鉴定并且可见于表8中。将由茄瓜花叶病毒(PepMV)感染的番茄植物中使用转移试剂局部施用来源于所列序列(SEQ ID NO:317-349)的ss反义DNA或dsRNA序列并且将通过ELISA分析对植物进行评分且目测评定症状的减轻。
[0152] 表8.在茄瓜花叶病毒(PepMV)中的靶基因的序列。
[0153]
[0154]
[0155]
[0156] 实施例11
[0157] 局部施用多核苷酸触发物用于控制大麦黄矮病病毒(BYDV)的感染
[0158] 在此实施例中,对不同大麦黄矮病病毒分离株的外壳蛋白(CM)、移动蛋白(MP)、及沉默抑制子(SS)蛋白的序列进行鉴定并且列于表9中。可在由BYDV感染的大麦植物中使用转移试剂局部施用来源于所列序列(SEQ ID NO:350-385)的反义ssDNA或dsRNA序列并且可通过ELISA分析对植物进行评分且目测评定症状的减轻。
[0159] 表9.在大麦黄矮病病毒(BYDV)中的靶基因的序列。
[0160]
[0161]
[0162]
[0163] 实施例12
[0164] 局部施用多核苷酸触发物用于控制番茄黄色缩叶病毒(TYLCV)的感染
[0165] 在此实施例中,对不同番茄黄色缩叶病毒分离株的外壳蛋白(CM)、移动蛋白(MP)、及补体(C2)蛋白的序列进行鉴定并且列于表10中。可在凭TYLCV感染的番茄植物中使用转移试剂局部施用来源于所列序列(SEQ ID NO:386-421)的反义ssDNA或dsRNA序列并且通过ELISA分析对植物进行评分且目测评定症状的减轻。
[0166] 表10.在番茄黄色缩叶病毒(TYCLV)中的靶基因的序列。
[0167]
[0168]
[0169]
[0170] 实施例13
[0171] 局部施用多核苷酸触发物用于控制棉花缩叶病毒(CLCuV)的感染
[0172] 在此实施例中,对不同的棉花缩叶毒分离株的外壳蛋白(CM)、移动蛋白(MP)和AC2蛋白的序列进行鉴定并且可见于表11中。在由CLCuV感染的棉花植物中使用转移试剂局部施用来源于所列序列(SEQ ID NO:422-447)的ss反义DNA或dsRNA序列并且将通过ELISA分析对植物进行评分且目测评定症状的减轻。
[0173] 表11.在棉花缩叶病毒(CLCuV)中的靶基因的序列。
[0174]
[0175]
[0176] 实施例14
[0177] dsRNA寡核苷酸向胡椒植物的局部施用用于控制番茄斑萎病毒(TSWV)
[0178] 在此实施例中,用番茄斑萎病毒(TSWV)(负链ssRNA病毒)接种生长中的胡椒植物(c.v.Yolo Wonder B)并且将植物分到不同的组中。将实验组用含有至少一个dsRNA多核苷酸的液体组合物局部地治疗,所述dsRNA多核苷酸包含大约100bp序列,所述序列与TSWV及互补链的核衣壳(N)、抑制子(NSs)或移动(NSm)基因的转录产物同源。在此实施例中所概述的实验中所用的触发分子的有义链序列显示于表12中。
[0179] 表12.针对TSWV核衣壳(N)、抑制子(NSs)或移动(NSm)基因转录物的dsRNA多核苷酸。
[0180]
[0181]
[0182] 将植物种在生长室[22℃,8小时光(~50μmol),16小时暗循环]中并在治疗之前几天转移到温室中。处在2-5片叶完全展开发育阶段的胡椒植物用于此测定中。实验组分由每次治疗20-24株植物组成。治疗由以下组成:(a)健康对照(没有病毒感染),(b)仅病毒对照(没有多核苷酸溶液),(c)仅制剂(没有多核苷酸),或(d)在病毒感染之后实验性施用包含选自SEQ ID NO:448-483清单的触发分子的多核苷酸/Silwet L-77触发溶液。病毒感染是使用标准机械接种技术和使用番茄斑萎病毒(TSWV)或黄瓜花叶病毒(CMV)(一种与TSWV不相关的正链RNA病毒)来进行。每个dsRNA多核苷酸的最终浓度是在14.2-15.15pmol/植物之间(在0.1%Silwet L-77、2%硫酸铵、5mM磷酸钠缓冲液,pH 6.8中)。使用喷枪(Badger 200G)在10psi下向每个植物组施用一千微升多核苷酸/Silwet L-77溶液。在随机化的完全区组设计之后将植物排列在温室中并且在视觉上监测症状发展。植物高度和ELISA分析两者都在感染后32天(32DPI)时进行。使用针对TSWV核衣壳(N)蛋白的抗体对从对照和系统叶片组织穿刺提取的上清液进行ELISA分析。重复两次实验(参见表13-17)。
[0183] 表13.实验1:在用dsRNA多核苷酸治疗之后在32DPI时的植物高度测量。
[0184]
[0185]
[0186] *没有用相同字母连接的水平是显著不同的。
[0187] 表14.实验1:与对照相比进行触发序列的最佳统计分析。
[0188] 处理 平均值 标准偏差 标准误差健康的 39.9 5.4 1.10486
病毒(TSWV) 31.3 8.7 1.77702
缓冲液(制剂) 29.2 7.1 1.44554
T25748 33.4 10.0 2.05127
T25773 32.9 7.9 1.61158
[0189] 用相当于TSWV核衣壳(N)基因中的SEQ ID NO:448的多核苷酸触发序列T25748治疗的植物显著高于用其它多核苷酸治疗的植物。这还显示于图12A和B中,其中示出这些结果的图示。
[0190] 表15.实验1:在用dsRNA多核苷酸处理之后在32DPI时的ELISA分析。
[0191]
[0192]
[0193] 表16.实验2:在用dsRNA多核苷酸处理之后在32DPI时的植物高度测量。
[0194]处理 平均值   组       N 标准偏差
健康的 30.1   A       24 7.2
T25772 25.6     B     24 7.1
T25748 25.1       BC   24 7.0
T25769 24.8       BC   24 5.7
T25755 24.3       BC   24 8.0
T25775 24.2       BC   24 6.3
T25776A 23.9       BC   24 6.6
病毒 23.6       BC   24 6.2
T25763 23.3       BC   24 5.4
CMV 23.2       BC   24 7.1
T25770 23.1       BC   24 6.1
缓冲液 22.6       BC   24 6.6
T25776B 22.0         C 24 6.6
[0195] *没有用相同字母连接的水平是显著不同的。
[0196] 在此实验中,用触发序列T25748(SEQ ID NO:448)进行的治疗是“BC”组的最佳治疗。图13示出此实验结果的图形显示。
[0197] 表17.实验2:在用dsRNA多核苷酸处理之后在32DPI时的ELISA分析。
[0198]
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