一株分离的链霉菌NBF715在制备植物线虫杀虫剂中的应用
阅读：916发布：2020-05-08
专利汇可以提供一株分离的链霉菌NBF715在制备植物线虫杀虫剂中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 公开了一株分离的链霉菌NBF715在制备 植物 线虫 杀虫剂 中的应用， 申请 人 首次发现链霉菌可用于防治各种线虫，与目前使用化学合成 农药 防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、不污染环境和不易产生抗药性等优点，具有广阔的应用前景。，下面是一株分离的链霉菌NBF715在制备植物线虫杀虫剂中的应用专利的具体信息内容。
1.一株分离的链霉菌在制备预防或杀灭线虫的药剂中的应用，所述的链霉菌为淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715；保藏编号为CCTCC NO:M2017414，所述的线虫为大豆孢囊线虫、番茄根结线虫、秀丽隐杆线虫野生型N2。
2.链霉菌发酵液有效成分在制备预防或杀灭线虫的药剂中的应用，所述的链霉菌发酵液有效成分为勃利霉素，所述的链霉菌为淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715；保藏编号为CCTCC NO:M2017414，所述的线虫为大豆孢囊线虫、番茄根结线虫、秀丽隐杆线虫野生型N2。
3.一株分离的链霉菌在制备种子处理剂中的应用，所述的链霉菌为淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715；保藏编号为CCTCC NO:M2017414。
4.根据权利要求3所述的应用，所述的种子处理剂：
所述的链霉菌发酵液为保藏编号为CCTCC NO:M2017414的淡紫褐链霉菌
(Streptomyces enissocaesilis)NBF715的液体发酵液。
5.根据权利要求3所述的应用，所述的种子处理剂：
所述的链霉菌菌剂为保藏编号为CCTCC NO:M2017414的淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715固体发酵菌剂。
一株分离的链霉菌NBF715在制备植物线虫杀虫剂中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 植物寄生线虫在引起植物侵染性病害的四大病原中危害仅次于真菌，超过细菌和病毒。 根结线虫(Meloidogyne spp.)和孢囊线虫是其中的重要类群。
[0003] 根结线虫在世界范围内广泛发生，其寄主范围广，常常造成作物的大面积减产，给农 业生产造成巨大损失，据估测，全世界每年由此造成的农作物损失约500亿美元。大豆胞 囊线虫病是严重危害大豆产量和品质的土传病害。该病害发生的特点是分布广、为害重、传 播途径多，一般减产10％-30％，严重地块可达70％-90％，甚至绝产。
[0004] 化学防治是目前防治根结线虫病最有效的方法，根据其使用方式，杀线虫剂主要分为熏 蒸剂和非熏蒸剂。熏蒸剂需要施入到一定深度的土壤中，以气体的形式向上下扩散，因对土 壤有较强的穿透力，在压低初侵染虫口方面具有显著优势。但该类药剂多为灭生性药剂， 严重影响土壤中的有益生物，若使用不当，易对当茬作物产生药害，且对施药技术要求较高。 非熏蒸剂灌根使用易造成线虫抗药性，同时污染环境并造成农药残留。生产上急需更为安全 有效方法。生物防治作为一种安全有效的手段在作物线虫防治得到了广泛的应用，其可以提 高产品品质，长期使用还可以起到很好的改良土壤作用，为农业的可持续发展提供保障，开 发新型生物杀线虫剂具有重要意义。
发明内容
[0005] 本发明的目的在于提供一株分离的链霉菌NBF715在制备预防或杀灭线虫的药剂中的 应用，所述的链霉菌NBF715的保藏编号为CCTCC NO:M2017414。
[0007] 为了达到上述目的，本发明采取以下技术方案来实现：
[0008] 一株分离的链霉菌NBF715在制备预防或杀灭线虫的药剂中的应用，包括利用本发明的 常规手段将链霉菌NBF715制备成线虫杀虫剂或线虫防治剂，或是与其他辅料或有效成分一 起制备成种子处理剂，所述的链霉菌NBF715的保藏编号为CCTCC NO:M2017414。
[0009] 以上所述的应用中，优选的，用于制备成预防线虫的种子处理剂；
[0010] 以上所述的应用中，优选的，用于制备成种子处理剂时，包括种衣剂：
[0011]
[0013] 以上所述的应用中，优选的，当用于制备成种子处理剂时，包括拌种剂：
[0014]
[0015] 所有组分在砂磨机研磨混合即可。
[0016] 以上所述的应用中，优选的，所述的线虫包括蔬菜根结线虫，大豆孢囊线虫。
[0017] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：
[0018] (1)本发明提供了一种淡紫褐链霉菌，该菌株首次被报道可用于防治作物线虫病， 与现有杀线虫剂无交互抗药性。
[0019] (2)与目前使用化学合成农药防治相比，由于其来自于自然环境，具有高效、低毒、不污 染环境和不易产生抗药性等优点。
具体实施方式
[0020] 为了更好地解释本发明，以下结合具体实施例进一步阐明本发明的主要内容，但本发明 的内容不仅仅局限于以下实施例。本发明所述技术方案，如未特别说明，均为本领域的常规 技术，所述试剂或材料，如未特别说明，均来源于商业渠道。
[0021] 实施例1：
[0022] 淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715的获得及鉴定
[0023] 一株分离的链霉菌，从恩施鹤峰县土壤分离得到，经16s rDNA结合生理生化鉴定后属 于淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)，已于2017年7月7日送至中国典型培养 物保藏中心进行保藏，分类命名：淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715； 保藏编号为CCTCC NO:M2017414；地点：中国，武汉，武汉大学。
[0024] 在本发明中，淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715或被简称为NBF715。
[0025] 形态特征：菌落圆形，边缘光滑，表面致密。气生菌丝银灰色，基内菌丝软木黄色， 菌落圆形，无色素。孢子丝呈直链状分布，孢子卵圆形或椭圆形。
[0026] 菌株生理生化特性：
[0028]
[0029] +：阳性反应；-：阴性反应；W：弱阳性反应
[0030] 菌株NBF715生理生化特性-利用碳源产酸
[0031]
[0032] +：阳性，-：阴性；w：弱阳性
[0033] 实施例2：
[0034] 淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715的发酵：
[0035] 淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715种子液的制备：包括将斜面保存 菌种在ISP-2平板活化，挑取接种至100毫升种子培养基中，在28℃，160转/分的摇床上 培养4天；即得种子液。
[0037] 固体发酵：将淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715种子液按10％接 于固体培养基中，装样量为20％，30℃培养10d即可，按照此方法获得的培养物的浓度是 5*1010个孢子/克，即为NBF715菌剂，用于以下实施例。
[0039] 液体发酵：将淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715种子液按5％量接 种于发酵培养基，温度为28℃，发酵罐的搅拌速度500转/分，发酵培养基的装量为罐体容 积的60％，发酵5天即可，即为NBF715发酵液，用于以下实施例。
[0041] 实施例3：
[0042] 淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715防治番茄根结线虫[0043] 试验于2017年9月于番茄连作温室大棚内进行，处理1为移栽番茄时穴施NBF715菌 剂，用量为3g/穴，随后覆土并浇定根水。处理2为移栽后灌NBF715发酵液，用量为200mL/ 棵，对照不做药剂处理。每处理4个小区，3次重,复，每小区20m2。正常农事管理，施药 后14周在各小区随机取15株番茄，调查植株病级。分级标准：0级，0-5％根有根结；1 级，6％-20根有根结；2级，21％-45％根有根结；3级，46％-70％根有根结；；4级，71％-85％ 根有根结；5级，86％-100％根有根结；：
[0044] 根结指数＝∑(各级植株数×级别)/(调查总株数×最高代表级别)×100。
[0045] 防治效果＝(对照根结指数-处理根结指数)/对照根结指数×100％
[0046] 表1NBF715菌剂和发酵液对番茄根结线虫防治效果
[0047]
[0048]
[0049] 实施例4：
[0050] 淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715种子处理剂防治大豆孢囊线虫
[0051] 试验于2017年5月于连作大豆田进行，处理1为拌种剂和大豆1:30(重量比)拌种， 处理2为悬浮种衣剂1:30(重量比)进行大豆包衣，对照不做处理。每处理4个小区，3次 重复，每小区20m2。试验采取随机区组5次重复的方法。每个处理5行区，5m行长， 行距0.65m，小区面积16.25m2，每行播种100粒种子。大豆播种50d后，每小区选取 25株苗，调查单株大豆根系胞囊着生量，并用体视显微镜观察根内线虫数量，并折成每 克根鲜重线虫的数量。胞囊抑制率(％)＝(对照胞囊数—处理胞囊数)/对照胞囊数×100％； 线虫减少率(％)＝(对照线虫数—处理线虫数)/对照线虫数×100％。
[0052] 所述的悬浮种衣剂的组分及配比：
[0053]
[0054] 所有组分在高剪切乳化机剪切后用砂磨机研磨处理即得。
[0055] 所述的拌种剂的组分及配比：
[0056]
[0057] 所有组分在砂磨机研磨混合即可。
[0058] 表2NBF715悬浮种衣剂和拌种剂对大豆根系孢囊和根内线虫影响
[0059] 处理 胞囊抑制率(％) 线虫减少率(％)悬浮种衣剂包衣 73.78 83.29
拌种剂拌种 52.34 61.33
对照 - -
拌种剂拌种 52.34 61.33
对照 - -
[0060] 实施例4：
[0061] 淡紫褐链霉菌(Streptomyces enissocaesilis)NBF715发酵液活性物质鉴定：
[0062] NBF715发酵液20L，将发酵液转移至不诱钢冻干杯中，置冻干机中冰冻干燥，冻干条 件为：-40℃预冻2h，然后将冷阱预冷至-45℃以下，开启真空泵升华。真空度为10-30Pa， 升温速率为2-3℃/h，极限温升为37℃。取出冻干粉后，转移至三角瓶中，先用少量50％甲 醇-水湿润，再加入100mL乙酸乙酯，于摇床上180rpm振荡萃取1h，分离出酯相，旋蒸， 除去溶剂，再以少量甲醇溶解，辅以超声波助溶，转入1.5mL塑料离心管内，离心2min后， 取上层转入专用小管进行分析。
[0063] 从紫外吸收光谱图可看出，该化合物只有一个紫外吸收峰，λmax＝259nm。根据质谱图的 规律，首先从负离子模式下的质谱图可以初步确定，m/z489为分子离子峰，右边的一处较 高峰为峰，这正好说明分子离子峰的判断。正离子模式下的m/z982为[2M+H]，说明分子离 子峰为m/z491，从而确定该化合物的分子量为490。根据以上紫外吸收波长及分子量的信息， 查阅天然产物数据库词典，最相吻合的化合物为勃利霉素。
[0064] 实施例5：
[0065] 勃利霉素杀线虫活性
[0066] 本实验所用腐生线虫为秀丽隐杆线虫野生型N2，线虫在线虫生长培养基上培养，并以 大肠杆菌OP50作为食物，生长温度20℃，线虫的同步化是通过对怀孕的雌雄同体成虫进行 碱裂解得到的，即在线虫悬液中加入裂解液，放在游祸振荡器上强烈震动5min使么充分裂 解。卵可抵抗裂解，而虫体则溶解在裂解液中。在离心管中加入5mL M 9缓冲液漂洗裂解 液，3000rpm离心3min，去除上清，重复此步骤4次。将漂洗后所得卵转移到含有M9缓 冲液的培养皿中，20℃培养16-20h，卵即孵化为同步的一龄幼虫化，用于毒性测试。
[0067] 将约300条秀丽隐杆线虫一龄幼虫转移至含有1mL的发酵滤液的3.5cm的培养皿中， 从空白PDB培养基为对照。化合兙物活性测试方法为将勃利霉素溶于二甲基亚砜(DMSO)， 取5μL勃利霉素母液溶于M9缓冲液，配置为1mL勃利霉素水溶液，以二甲基亚砜(终浓 度为0.5％)为对照。取约300条秀丽隐杆线虫一龄幼虫的线虫或南方根结线虫二龄幼虫加 入含有0，10μg/mL，20μg/mL，40μg/mL勃利霉素的M9缓冲液中，对照药剂为噻唑磷和 氟吡菌酰胺。放于20℃线虫培养箱，24h后显微镜下对线虫的存活或者死亡数量进行统计。 生测结果表明，勃利霉素对秀丽隐杆线虫具有良好杀虫活性，与商品药剂噻唑磷和氟吡菌酰 胺效果相当。
[0068] 表3勃利霉素对秀丽隐杆线虫杀虫效果
[0069]药剂 浓度 防效(％)
勃利霉素 40μg/mL 91.37
勃利霉素 20μg/mL 73.56
勃利霉素 10μg/mL 33.72
噻唑膦 100μg/mL 95.69
10μg/mL 0
氟吡菌酰胺 100μg/mL 97.34
10μg/mL 36.67
CK - -
勃利霉素 40μg/mL 91.37
勃利霉素 20μg/mL 73.56
勃利霉素 10μg/mL 33.72
噻唑膦 100μg/mL 95.69
10μg/mL 0
氟吡菌酰胺 100μg/mL 97.34
10μg/mL 36.67
CK - -
[0070] 取南方根结线虫(温室人工培养繁殖)严重感染的番茄根，用自来水冲洗干净表面泥沙 后，用尖头镊子从根上取下卵块，0.5％(V/W)次氯酸钠对卵块表面消毒2次，每次5min， 再用无菌水反复冲洗干净。将消毒的卵块置于吸足水的滤纸上，25℃孵化3-5天；孵化出 的线虫即可用作生物测定。生物测定在96孔板上进行生物测定，参照Masler(2007)的方 法。每孔吸入190μl 2龄幼虫线虫悬液包含线虫约40头，加入勃利霉素40μg/ml，用20μg/ml 氯霉素抑制杂菌生长。以噻唑磷作为对照。pH 8.0，25℃条件下作用3天，在奥林巴斯倒置 显微镜下观察计数，统计每孔死亡虫数并计算防效。生测结果表明，勃利霉素对南方根结线 虫具有良好杀虫活性，与商品药剂噻唑磷和氟吡菌酰胺效果相当。
[0071] 表4勃利霉素对南方根结线虫杀虫效果
[0072]药剂 浓度 防效(％)
勃利霉素 40μg/mL 88.18
噻唑膦 40μg/mL 83.26
勃利霉素 40μg/mL 88.18
噻唑膦 40μg/mL 83.26
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