技术领域
[0001] 本
发明属于农业
微生物学技术领域，具体涉及金佛手精油对线虫的杀害以及制备杀虫剂的应用。
背景技术
[0002]
植物源线虫作为一种非常常见的寄生线虫，具有多寄主，抗药性强等特点，对于农业生产造成了严重的危害。在我国，防治线虫则是一项很巨大的任务，分布最广、危害最严重的是南方根结线虫，目前国内外线虫防治技术主要有以下几种方法：
[0004] 长期以来，我国对作物病原线虫的防治主要依靠化学
农药，施用杀虫剂等，其在保障
农作物高产稳产中发挥了重要作用。
[0005] (2)农业防治
[0006] 人们通过消毒和无土育苗、种植抗线虫品种等方法，保证种苗的健康，避免早期受到根结线虫的侵染，减轻虫害发生。
[0007] (3)物理防治
[0008] 主要有夏季进行
土壤热处理和
种子汰选，另外还包括
水淹两周以上、射线或
超声波处理等。
[0010] 生物防治是近年来发展较迅速的一种防治方法。根结线虫的天敌主要有
真菌、细菌、病毒、立克氏体、放线菌、捕食性线虫、涡虫和
原生动物等，其中对细菌和真菌的生物防治作用研究较多。
[0011] 秀丽隐杆线虫(C.elegans)是一种生长在土壤中的线虫，以细菌为食，很容易在实验室培养。成虫体长1mm，且通体透明，在
显微镜下易于观察。它从幼虫到成虫只需三天，其一生能产生约300个受精卵，如果在一个培养皿上放上几只虫子，几天之后就可得到大量的后代。其诸多特点使得秀丽隐杆线虫作为极优的生物模型，在很多方面都有应用。
发明内容
[0012] 本发明的目的是提供金佛手精油的新应用。
[0013] 为了达到上述目的，本发明提供了如下技术方案：
[0014] 金佛手精油作为杀虫剂在秀丽隐杆线虫模型中的应用。
[0015] 进一步地，所述的金佛手精油用于影响线虫的行为器官，干扰线虫的正常发育，使线虫产卵能
力下降、并且使幼虫发育历期延长。
[0016] 金佛手精油在制备线虫杀虫剂中的应用。
[0017] 一种线虫杀虫剂，其特征在于，含有金佛手精油。
[0018] 一种农药，其特征在于，含有金佛手精油。
[0019] 进一步地，所述的线虫为秀丽隐杆线虫。
[0020] 本发明还提供了一种金佛手精油杀虫效果的验证方法(急性应激实验)，其特征在于，包括：将秀丽隐杆线虫同步化至L4期后，将不同剂量浓度的金佛手精油溶于0.1％DMSO水溶液中，配制成金佛手精油溶液；将线虫在精油溶液中培养48h后，用M9缓冲液洗涤三次，转移至48孔板，并添加M9缓冲液作为培养液，后加入K2Cr2O7用于重金属急性应激诱导，每四个小时记录一次线虫的存活情况。
[0021] 本发明还提供了一种金佛手精油杀虫效果的验证方法(寿命实验)，其特征在于，包括：将同步化至L4期的秀丽隐杆线虫成虫转移至96孔板中，周围一圈每孔加入蒸馏水
预防杂菌污染，每孔挑入一条线虫，添加配制好的不同剂量浓度的金佛手精油溶液于S.com培养液中培养线虫，提供充足的食物并抑制其繁殖，每隔一天记录一次线虫的死亡数。
[0022] 本发明还提供了一种金佛手精油杀虫效果的验证方法(生存率和生殖率实验)，其特征在于，包括：记录经不同剂量浓度处理金佛手精油溶液处理后从L1期到L4期生长的秀丽隐杆线虫幼虫的死亡数，并得出LD50值和LD90；或记录经不同剂量浓度处理金佛手精油溶液处理后生长至L4期的线虫繁殖两天的总量。
[0023] 本发明还提供了一种金佛手精油杀虫效果的验证方法(行为学实验)，其特征在于，包括：取一只由不同剂量浓度的金佛手精油处理后的L4期的秀丽隐杆线虫，将其转移至空的NGM板上，让线虫自由活动一分钟后，滴一滴蒸馏水让其运动，记录20秒内的身体弯曲次数和1分钟内的头部摆动次数。
[0024] 本发明所提供的验证方法是一种用于急性实验的高通量评价方法，其操作简便，设备要求简单等优点，在微生物实验室就可以操作，选取模型良好，便于验证该精油的有效杀虫实验。
[0025] 与
现有技术相比，本发明的有益效果是：
[0026] 1、本发明的植物源杀虫剂金佛手精油具有良好的
杀虫活性，尤其是对秀丽隐杆线虫这种多细胞生物为新型植物源杀虫剂防治线虫提供了新的选择性。
[0027] 2、本发明对设备要求简单，操作简便，结果客观准确，由于实验的高通量，节省人力物力和时间，
费用低廉，具有很高的经济效益。
[0028] 3、本发明具有制备成本低，周期短，操作简易的巨大优点。
附图说明
[0029] 图1不同浓度的金佛手精油对线虫的重金属应激实验结果；显著性：(*)p<0.05,(**)p<0.01,(***)p<0.001。横轴为时间，单位为：小时(h)；
[0030] 图2不同浓度的金佛手精油对线虫的寿命实验结果；显著性：(*)p<0.05,(**)p<0.01,(***)p<0.001；横轴为时间，单位为：天(d)；
[0031] 图3不同浓度的金佛手精油对线虫的生存率实验结果；显著性：(*)p<0.05,(**)p<0.01,(***)p<0.001。
[0032] 图4不同浓度的金佛手精油对线虫的身体弯曲的实验结果；显著性：(*)p<0.05,(**)p<0.01,(***)p<0.001；
[0033] 图5不同浓度的金佛手精油对线虫的头部摆动的实验结果；显著性：(*)p<0.05,(**)p<0.01,(***)p<0.001；
[0034] 图6不同浓度的金佛手精油对线虫的生殖率的实验结果。显著性：(*)p<0.05,(**)p<0.01,(***)p<0.001。
具体实施方式
[0035] 下面结合具体
实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。此外应理解，在阅读了本发明讲授的内容之后，本领域技术人员可以对本发明作各种改动或
修改，这些等价形式同样落于本
申请所附
权利要求书所限定的范围。
[0036] 本发明各实施例中采用的金佛手精油按照申请号为201610979286.1、公开号为CN106539053A、名称为《一种金佛手精油的制备方法》的中国
专利申请中公开的方法制得，金佛手由浙江金手宝生物科技有限公司提供。
[0037] 野生型秀丽隐杆线虫虫株N2及线虫标准食物大肠杆菌(E.coli)OP50菌株，购自美国Caenorhabditis Genetics Center。
[0038] 实施例1
[0039] 野生型秀丽隐杆线虫虫株N2少量传代培养时，挑选几十条同步化生长3天的线虫于涂有大肠杆菌OP50的NGM的培养基上(这时的线虫处于未产卵时期，繁殖子代数量和能力最强时期)。待其产完卵后再移除该培养基，使培养基上只有同一时期的卵，进而放入20℃
培养箱中，培养3天，得到同步化L4期的成虫，将金佛手精油溶于0.1％DMSO蒸馏水溶液中，配制成不同剂量浓度0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml和2mg/ml金佛手精油溶液。将线虫放入不同浓度的精油溶液中培养48h后，用M9缓冲液洗三次，转移至48孔板，取152μl M9缓冲液作为培养液加入每个孔中，后加入8μl的K2Cr2O7(10mmol/L)用于重金属急性应激诱导，K2Cr2O7被用作
氧化应激发生器，它是一种重金属
氧化剂，能够在秀丽隐杆线虫中产生超氧自由基O2·产生的细胞内氧化还原循环，并且通常用于在线虫内氧化应激实验。每个孔里挑取30条成虫，每个浓度实验三组平行，浓度0为对照组，每4个小时记录一次线虫的存活情况。具体情况如图1所示，低浓度的精油具有杀虫效果，高浓度也具有极好的杀虫效果，且浓度越高，杀虫效果越明显。
[0040] 实施例2
[0041] 按照实施例1中方法制备同步化后的L4期野生型秀丽隐杆线虫虫株N2转移至96孔板中，周围一圈每孔加入80μl蒸馏水预防杂菌污染，每个孔中加入80μlS.com培养液，由S.basal培养液(NaCl(终浓度为5.85g/L)、KH2PO4(终浓度为6g/L)、K2HPO4(终浓度为1g/L))加入灭菌后的
柠檬酸钾(1M)、CaCl2(1M)、MgSO4(1M)和胆固醇(终浓度为5g/L))配制而成(所用的药品均来自国药集团化学
试剂有限公司)，培养液内添加不同剂量浓度的0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml和2mg/ml金佛手精油溶液和2mg/mL的OP50保证足够的食物，每孔挑取线虫一条，共计60条，同时抑制其繁殖，加入5-氟-2-脱氧尿苷，简写FUDR(购于Sigma公司),含量400μl(于6ml S.com)，每隔一天(从成年的第一天起)对死亡线虫计数，直到所有线虫死亡。轻轻刺激时(用铂丝)不动的线虫被评为死亡。具体情况图2，可以看出金佛手精油会影响线虫的寿命，有杀虫的作用，且浓度越高，线虫存活时间越短，说明杀虫效果越好。
[0042] 实施例3
[0043] 使用L1期的N2野生型秀丽隐杆线虫虫株评估精油对线虫的生存率，使线虫在不同剂量浓度0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml和2mg/ml金佛手精油溶液(配制方法同实施例1)中培养至L4期，观察线虫的死亡情况，得到线虫生存率的具体结果，如图3所示，可以看出，精油对线虫具有毒杀作用，经精油处理过的线虫，会降低线虫的生存率，且浓度越大，线虫的生存率越低。在1mg/ml时线虫的生存率为51％，1.5mg/ml时15％和2mg/ml时为9％，则在1mg/ml和1.5mg/ml期间的方程为y＝－0.72x+1.23，得出50％的生存率时，剂量浓度为1.01mg/ml，即LD50为1.01mg/ml，同理，做出1.5mg/ml和2mg/ml的方程为y＝－0.12x+0.33，得出10％的生存率时剂量浓度为1.91mg/ml，即LD90为1.91mg/ml。
[0044] 实施例4
[0045] 由于野生型秀丽隐杆线虫虫株N2的感觉系统可以准确地
感知外界信息，同时，身体的弯曲和头部摆动为交替的肌肉收缩提供反馈。现进行线虫的身体弯曲实验和头部摆动实验。在不同剂量浓度0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml和2mg/ml金佛手精油溶液(配制方法同实施例1)中培养L4期的线虫48h后进行实验，身体的弯曲和头部摆动为交替的肌肉收缩提供反馈。取一只经处理后的线虫，将其转移到空的NGM板，让线虫自由活动一分钟后，滴一滴蒸馏水让线虫进行行为学运动，记录线虫在20秒内的身体屈曲次数和在1分钟内的头部摆动次数，具体结果如图4-5，可以看出，精油可以影响线虫的行为器官，干扰线虫的正常发育，且浓度越大，干扰效果越明显。
[0046] 实施例5
[0047] 由于精油的某种成分具有使线虫产卵能力下降、并且使幼虫发育历期延长等特点，在不同剂量浓度0mg/ml、0.5mg/ml、1mg/ml、1.5mg/ml和2mg/ml金佛手精油溶液(配制方法同实施例1)中使野生型秀丽隐杆线虫虫株N2从L1期生长到L4期，并记录生长到L4期的线虫繁殖两天的总量，每一天将同一条线虫转移至一个新的空板，转移两次，待线虫成虫后，读取并记录该线虫的繁殖数量，如图6所示，可以看出，精油对抑制线虫生殖率是有很大的影响，且浓度越高，抑制效果越明显。
[0048] 对于本领域的技术人员来说，以上述的工艺过程和材料以及思路，作出适当调整和
变形，这些调整和变形都属于本发明的权利要求的保护范围内。本发明的保护范围以所有权利要求为准。
[0049] 综上所述，本发明的植物源杀虫剂-金佛手精油对秀丽隐杆线虫的杀虫效果的探究，高效，环保，满足绿色和可持续发展的要求，金佛手精油可以起到较好的杀虫效果。
