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产胞外果聚糖的解淀粉芽孢杆菌及其应用

阅读:721发布:2020-05-08

专利汇可以提供产胞外果聚糖的解淀粉芽孢杆菌及其应用专利检索,专利查询,专利分析的服务。并且本 发明 涉及 微 生物 学领域,具体而言,涉及一种产胞外果聚糖的解 淀粉 芽孢杆菌及其应用。该解淀粉芽孢杆菌具有多方面的功能,不仅高产胞外聚糖,还能够对多种 真菌 、细菌、癌细胞产生抑制,因而在农业生产、医学等多个方面具有广阔的应用前景。,下面是产胞外果聚糖的解淀粉芽孢杆菌及其应用专利的具体信息内容。

1.解淀粉芽孢杆菌,其16S rDNA基因序列与SEQ ID NO:1所示的DNA序列具有至少99%的同源性,且能够产以果聚糖为主要活性成分的胞外聚糖。
2.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌,其对如下真菌中的至少一种具有抑制作用:
弯孢菌、黄瓜枯萎菌、串珠镰刀菌、茶叶炭疽菌以及禾谷镰刀菌。
3.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌,其对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。
4.如权利要求1所述的解淀粉芽孢杆菌,其对腺癌细胞具有抑制作用。
5.如权利要求1~4任一项所述的解淀粉芽孢杆菌,其为保藏于广东省生物菌种保藏中心的菌株,保藏编号为:GDMCC No:60884。
6.权利要求1~5任一项所述的解淀粉芽孢杆菌的发酵产物。
7.组合物,其含有权利要求1~5任一项所述的解淀粉芽孢杆菌和/或权利要求6所述的发酵产物,其还含有以下a)、b)组分中的至少一种:
a)作为菌剂成分的助剂和/或载体;
b)农业有效量的选自以下的化合物或组合物:营养素、肥料杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂线虫剂以及杀虫剂
其中b)组分中不含有所述解淀粉芽孢杆菌以及所述发酵产物。
8.药用组合物,其含有权利要求6所述的发酵产物,以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种。
9.增强植物的健康、生长或产量的方法,所述方法包括将有效量的权利要求1~5任一项所述的解淀粉芽孢杆菌,或权利要求6所述的发酵产物,或权利要求7所述的组合物施用于所述植物或施用于所述植物的周围环境。
10.权利要求1~5任一项所述的解淀粉芽孢杆菌的培养方法,包括将所述解淀粉芽孢杆菌在适宜其生长的培养基和培养条件下进行培养。

说明书全文

产胞外果聚糖的解淀粉芽孢杆菌及其应用

技术领域

[0001] 本发明涉及生物学领域,具体而言,涉及一种产胞外果聚糖的解淀粉芽孢杆菌及其应用。

背景技术

[0002] 多糖是单糖通过糖苷键结合而成的高分子聚合物,具有广泛的应用价值,已作为乳化剂、增稠剂、稳定剂、成膜剂、悬浮剂、保鲜剂、润滑剂食品添加剂和抗癌药品应用于食品、石油化工、医疗、环保等多个领域。微生物多糖包括胞内多糖、胞壁多糖和胞外多糖,胞外多糖易与菌体分离,可通过深层发酵实现工业化生产而倍受研究者的青睐。目前,黄原胶、结冷胶和普鲁蓝多糖等多种微生物胞外多糖已被研究并开发应用。但是,除了野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)生物合成黄原胶时源转化率能达到70%外,其它高产胞外多糖的微生物还比较少。
[0003] 果聚糖包括菊粉类果聚糖(inulin)和Levan类果聚糖,菊粉类果聚糖主要由β-(2,1)果糖苷键组成,主要来源于植物;Levan果聚糖分子中含有大量β-(2,6)果糖苷键组成的聚糖主链及少量β-(2,1)果糖苷键组成的支链,主要来源于植物或微生物。菊粉类果聚糖具有免疫增强、抗化、提高骨头质量的作用;谷物来源的果聚糖还具有降低脂肪积累、促进矿物质吸收的功能。作为脂肪替代品、糖替代品和功能性食品,菊粉类果聚糖在乳制品、面制品和油脂类食品等中得到了较好的应用。微生物来源的Levan果聚糖具有抗肿瘤、抗糖尿病、降血脂、免疫增强和增加肠道双歧杆菌菌群等作用,它还具有降低重金属的毒害功能。
[0004] 地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)和副凝聚小短杆菌(Brachybacterium paraconglomeratum)等多种微生物都可以产生Levan果聚糖。少量菌株既可以产生菊粉类果聚寡糖又可以产生Levan类果聚寡糖,如百欧博伟杨奇青霉(Penicillium janczewskii)。
[0005] 为了进一步寻找高产胞外多糖的微生物,不断开发微生物多糖的潜能,仍需继续筛选、分离新的微生物多糖产生菌。

发明内容

[0006] 本发明筛选、鉴定多糖产生菌,纯化并分析多糖组成,分析了筛选菌株的抑制真菌和细菌的作用和胞外多糖、蛋白质抑癌作用。丰富了胞外多糖产生菌资源,为该菌株的进一步研究奠定基础
[0007] 本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌,其16S rDNA基因序列与SEQ ID NO:1所示的DNA序列具有至少99%的同源性,且能够产以果聚糖为主要活性成分的胞外聚糖。
[0008] 本发明还通过提供上述解淀粉芽孢杆菌的发酵产物、组合物,以及它们的应用解决前述需求。
[0009] 本发明所提供的解淀粉芽孢杆菌,其具有多方面的功能,不仅高产胞外聚糖,还能够对多种真菌、细菌、癌细胞产生抑制,因而在农业生产、医学等多个方面具有更为广阔的应用前景。附图说明
[0010] 为了更清楚地说明本发明具体实施方式或现有技术中的技术方案,下面将对具体实施方式或现有技术描述中所需要使用的附图作简单地介绍,显而易见地,下面描述中的附图是本发明的一些实施方式,对于本领域普通技术人员来讲,在不付出创造性劳动的前提下,还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0011] 图1为本发明一个实施例中LE-3菌落形态及菌体染色;A,LB平板上的LE-3;B,革兰氏染色;C,芽孢染色;
[0012] 图2为本发明一个实施例中基于NJ法构建的菌株LE-3系统发育树;
[0013] 图3为本发明一个实施例中CM-Sepharose FF柱层析结果;
[0014] 图4为本发明一个实施例中DEAE-Sepharose FF柱层析结果;
[0015] 图5为本发明一个实施例中Sephacryl S-200HR柱层析结果;
[0016] 图6为本发明一个实施例中LE-3胞外多糖的FT-IR图谱结果;
[0017] 图7为本发明一个实施例中LE-3多糖组分的薄层层析分析;1,鼠李糖;2,半乳糖;3,LE-3多糖;4,酸后LE-3多糖;5,葡萄糖;6,果糖;7,酸后葡萄糖;8,酸后果糖;9,甘露糖;
10,木糖;11,阿拉伯糖;
[0018] 图8为本发明一个实施例中五种糖的高效液相色谱图;A,果糖;B,葡萄糖;C,酸后多糖;D,酸后果糖;E,酸后葡萄糖;
[0019] 图9为本发明一个实施例中菌株LE-3胞外多糖螯合Fe2+能的测定;
[0020] 图10为本发明一个实施例中菌株LE-3对植物病原菌的抑制作用;A~E:依次为弯孢菌、串珠镰刀菌、黄瓜枯萎菌、茶叶炭疽菌和禾谷镰刀菌5种植物病原菌;a~e:依次为菌株LE-3对5种(A~E)植物病原菌的抑制作用;
[0021] 图11为本发明一个实施例中菌株LE-3抑制弯孢菌活性的作用;
[0022] 图12为本发明一个实施例中LE-3菌株发酵上清液对弯孢菌孢子萌发的影响;A、弯孢菌分生孢子;B、孢子与上清液混合培养13h;C、孢子培养13h;
[0023] 图13为本发明一个实施例中LE-3菌株发酵上清液对弯孢菌菌丝生长的影响;A、孢子培养8h;B和C、孢子培养57h;D~F、上清液处理49h;
[0024] 图14为本发明一个实施例中菌株LE-3抑制细菌的作用;
[0025] 图15为本发明一个实施例中不同饱和度硫酸铵分级沉淀蛋白的抑菌作用;0、Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液对照;1、0~30%饱和度;2、30%~50%饱和度;3、50%~80%饱和度;4、80%~100%饱和度。
[0026] 本发明提供的解淀粉芽孢杆菌(Bacillus  amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens),菌株名为LE-3,保藏于广东省微生物菌种保藏中心,地址为广州市先烈中路100号大院59号楼5楼,广州微生物研究所。保藏编号为:GDMCC No:60884;于
2019年11月4日于保藏中心登记入册,并经保藏中心于2019年11月8日检测为存活菌株。

具体实施方式

[0027] 现将详细地提供本发明实施方式的参考,其一个或多个实例描述于下文。提供每一实例作为解释而非限制本发明。实际上,对本领域技术人员而言,显而易见的是,可以对本发明进行多种修改和变化而不背离本发明的范围或精神。例如,作为一个实施方式的部分而说明或描述的特征可以用于另一实施方式中,来产生更进一步的实施方式。
[0028] 因此,旨在本发明覆盖落入所附权利要求的范围及其等同范围中的此类修改和变化。本发明的其它对象、特征和方面公开于以下详细描述中或从中是显而易见的。本领域普通技术人员应理解本讨论仅是示例性实施方式的描述,而非意在限制本发明更广阔的方面。
[0029] 本发明涉及一种解淀粉芽孢杆菌,其16S rDNA基因序列与SEQ ID NO:1所示的DNA序列具有至少99%的同源性,且能够产以果聚糖为主要活性成分的胞外聚糖。
[0030] 在一些实施方式中,所述胞外聚糖中基本不含有鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖以及葡萄糖。
[0031] 在一些实施方式中,所述的解淀粉芽孢杆菌对如下真菌中的至少一种具有抑制作用:
[0032] 弯孢菌、黄瓜枯萎菌、串珠镰刀菌、茶叶炭疽菌以及禾谷镰刀菌。
[0033] 在一些实施方式中,所述的解淀粉芽孢杆菌对金黄色葡萄球菌具有抑制作用。
[0034] 在一些实施方式中,所述的解淀粉芽孢杆菌对癌细胞具有抑制作用。
[0035] 所述肿瘤可以选自:骨、骨连接、肌肉、、气管、心脏、脾脏、动脉、静脉、血液、毛细血管、淋巴结、淋巴管、淋巴液、口腔、咽、食管、胃、十二指肠、小肠、结肠、直肠、肛、阑尾、肝、胆、胰腺、腮腺、舌下腺、泌尿肾、输尿管、膀胱、尿道、卵巢、输卵管、子宫、阴道、外阴部、阴囊、睾丸、输精管、阴茎、眼、、鼻、舌、皮肤、脑、脑干、延髓、瘠髓、脑瘠液、神经、甲状腺、甲状旁腺、肾上腺、垂体、松果体、胰岛、胸腺、性腺、舌下腺以及腮腺中任一处病变生成的肿瘤。
[0036] 在一些实施方式中,所述癌细胞为人肺腺癌细胞。
[0037] 在一些实施方式中,所述的解淀粉芽孢杆菌为保藏于广东省微生物菌种保藏中心的菌株,保藏编号为:GDMCC No:60884。
[0038] 其菌株名为LE-3。
[0039] 该菌株LE-3经划线培养后较为典型的菌落特征为:菌落大而圆,乳白色,易挑取,正反面色泽一致;菌体杆状,革兰氏阳性,芽孢中生。该菌株从桂花树、桃树、樟树下以及油菜田采集的混合土壤中筛选得到。
[0040] 本发明请求保护的解淀粉芽孢杆菌,其包括上述保藏编号的解淀粉芽孢杆菌菌株,以及在适度范围内发生突变的突变菌株。
[0041] 所谓“解淀粉芽孢杆菌菌株的突变菌株”,是指基因组高度类似LE-3菌株的基因组的解淀粉芽孢杆菌菌株。在本发明中,表述“本发明的解淀粉芽孢杆菌菌株”涵盖了所述突变株。突变菌株可通过与SEQ ID NO:1所示的LE-3菌株16S rDNA同源性≥99%(例如99.1%、99.2%、99.3%、99.4%、99.5%、99.6%、99.7%、99.8%、99.9%的同源性)的方式进行限定,也可以通过基因组方面高度类似涵盖:
[0042] 突变菌株的基因组同LE-3菌株的基因组相比,包含至多150个突变事件,优选包含至多140个、130个、120个、110个、100个、90个、80个、70个、60个、50个、40个、30个或20个突变事件。突变事件被限定为SNP(单核苷酸多态性)或INDEL(插入、缺失,及两者的组合)。按如下方式确定突变事件的数量:将LE-3菌株的基因组视为对照,鉴定存在于突变株基因组中的突变事件,每种突变事件(SNP或INDEL)代表一个突变事件(即,例如,插入含若干个核苷酸的序列只视作一个突变事件)。在该语境中,本发明的突变株的基因组序列由同LE-3菌株相比所含突变事件的数量限定,除这种限定方式外,还可额外由其与LE-3菌株的基因组序列的同一性百分比限定,其中同一性百分比在本文表示在一种菌株的基因组中发现存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比,具体地讲:a)在LE-3菌株的基因组中发现并存在于突变菌株的基因组中的序列的百分比,或b)在突变菌株的基因组序列中发现并存在于LE-3菌株的基因组中的序列的百分比。因此,与LE-3菌株的不同之处只有插入(一个或多个)或只有缺失(一个或多个)的突变菌株,具有的基因组与LE-3菌株的基因组的同一性百分比为100%,因为在一种菌株的基因组中完全发现了另一种菌株的整个基因组序列。在一个具体实施例中,由突变事件数量限定的本发明的突变株的基因组序列,与LE-3菌株的基因组序列的同一性百分比为至少90%、为至少91%、为至少92%、为至少93%、为至少94%、为至少95%、为至少96%、为至少97%、为至少98%、为至少99%、为至少99.1%、为至少99.2%、为至少99.3%、为至少99.4%、为至少99.5%、为至少99.6%、为至少99.7%、为至少99.8%、为至少99.9%、为至少99.92%、为至少99.94%、为至少99.96%、为至少99.98%或为至少99.99%,其中同一性百分比表示在一种菌株的基因组中发现并存在于另一种菌株的基因组中的序列的百分比;同一性是按照将两种基因组序列在它们的全长范围内相比较(全局比对)的方式作出描述的,并且可使用基于Needleman-Wunsch算法的任一种程序来计算。
[0043] LE-3菌株的基因组可通过本领域惯用的技术手段测得。
[0044] 根据本发明的再一方面,本发明还涉及如上所述的解淀粉芽孢杆菌发酵产物。
[0045] 在一些实施方式中,所述发酵产物经过至少一次纯化(例如过滤、自然沉降后取上清)。
[0046] 在一些实施方式中,所述发酵产物为胞外发酵产物。
[0047] 根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种组合物,其含有如上所述的解淀粉芽孢杆菌和/或如上所述的发酵产物,其还含有以下a)、b)组分中的至少一种:
[0048] a)作为菌剂成分的助剂和/或载体;
[0049] b)农业有效量的选自以下的化合物或组合物:营养素、肥料杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂线虫剂以及杀虫剂
[0050] 其中b)组分中不含有所述解淀粉芽孢杆菌以及所述发酵产物。
[0051] 本发明的组合物(优选地,在用作发酵剂培养物时)可为纯培养物或混合培养物。所以,本发明将纯培养物限定为这样一种培养物,其中全部或基本上全部培养物由本发明的同一种解淀粉芽孢杆菌组成。在替代形式中,将混合培养物限定为这样一种培养物,其包含若干种微生物,具体地讲包含若干种细菌菌株,包括本发明的解淀粉芽孢杆菌。
[0052] 所述组合物用于农业,可制成液体、冷冻或干燥粉末形式;或以本行业常用的制剂形式来表述,如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。
[0053] 在一些具体的实施方式中,当所述组合物为冷冻或干燥粉末形式时,其包括固态载体;
[0054] 固体载体的例子包括矿石粉诸如陶土、滑石、膨润土、沸石、碳酸藻土和白炭(White carbon);植物面粉如玉米面和淀粉;和高分子化合物如聚乙烯醇的聚亚烷基二醇。另一方面,典型的液体载体包括各种有机溶剂如癸烷和十二烷,植物油,矿物油和
[0055] 在一些实施方式中,所述固态载体包括泥炭、草皮、滑石、、叶蜡石、蒙脱土、藻酸盐、压滤泥浆、锯屑、珍珠岩、母、硅石、石英粉、钙基膨润土、蛭石、高岭土、轻质碳酸钙、硅藻土、麦饭石、方解石、沸石、白炭黑、细沙以及粘土中的一种或多种。
[0056] 在一些实施方式中,所述组合物中包含助剂;
[0057] 通常在农业和园艺用化学品中用作助剂的表面活性剂粘合剂、稳定剂等等可以单独使用或需要时组合使用,作为稳定剂可以使用例如抗氧化剂和/或pH调节剂。在某些情况下中也可以使用光稳定剂
[0058] 这些助剂的总含量可以是0wt%至80wt%,载体的含量是从100wt%减去有效成分和助剂含量后的值。
[0059] 在一些具体的实施方式中,所述助剂包括十二烷基苯磺酸钠、丁基磺酸钠、海藻糖、甘油、木质素磺酸钠、烷基萘磺酸钠缩聚物、烟酸、醇、缓冲盐、氯化钠基酸、维生素类、蛋白质、多肽、多糖或单糖、酵母膏、白炭黑、茶皂素、脱脂奶中的一种或多种。
[0060] 在一些具体的实施方式中,所述组合物还包含农业有效量的选自以下的化合物或组合物:营养素、肥料、杀螨剂、杀细菌剂、杀真菌剂、杀昆虫剂、杀微生物剂、杀线虫剂以及杀虫剂。
[0061] 上述成分可与本发明所提供的菌株配合以实现更佳的技术效果。
[0062] 所述组合物用于农业,可制成液体、冷冻或干燥粉末形式;或以本行业常用的制剂形式来表述,如颗粒剂、悬浮剂、可湿性粉剂、乳液或液剂。
[0063] 任何载体都可使用,不论它们是固体或液体,只要它们是农业上和园艺上的农药常用的和生物学上惰性的即可。不限于任何特定的载体。
[0064] 根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种药用组合物,其含有如上所述的发酵产物,以及药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体中的一种或多种。术语“药学上可接受的赋形剂、稀释剂或载体”是指在药理学和/或生理学上与受试者和活性成分相容的赋形剂、稀释剂或载体,其是本领域公知的,包括但不限于:pH调节剂,表面活性剂,佐剂,离子强度增强剂。例如,pH调节剂包括但不限于磷酸盐缓冲液;表面活性剂包括但不限于阳离子,阴离子或者非离子型表面活性剂,例如Tween-80;离子强度增强剂包括但不限于氯化钠。
[0065] 所述的药物组合物也可以包含抗癌剂、细胞毒性剂以及化学治疗剂中的至少一种。
[0066] 根据本发明的再一方面,本发明还涉及一种增强植物的健康、生长或产量的方法,所述方法包括将有效量的如上所述的解淀粉芽孢杆菌,或如上所述的发酵产物,或如上所述的组合物施用于所述植物或施用于所述植物的周围环境。
[0067] 根据本发明的再一方面,本发明还涉及如上所述的解淀粉芽孢杆菌的培养方法,包括将所述解淀粉芽孢杆菌在适宜其生长的培养基和培养条件下进行培养。
[0068] 下面将结合实施例对本发明的实施方案进行详细描述。
[0069] 实施例
[0070] 1材料和方法
[0071] 1.1土壤来源
[0072] 从桂花树、桃树、樟树下以及油菜田采集的混合土壤。
[0073] 1.2培养基
[0074] 1)初筛培养基:肉膏3.0g、胰蛋白胨10.0g、氯化钠5.0g、蔗糖30.0g、琼脂20.0g、自来水1000mL、pH 7.4~7.6,121℃灭菌20min。
[0075] 2)复筛培养基(种子培养基)
[0076] 牛肉膏1.0g,KH2PO4 2.5g,K2HPO4 2.5g,NaCl 1.0g,蔗糖30g,MgSO4·7H2O 0.2g/L,FeSO4·7H2O 0.001g/L,蒸馏水1000mL,pH 7.0,115℃灭菌30min。
[0077] 3)发酵培养基
[0078] 蔗糖60g/L、酵母膏2.5g/L、KH2PO4 2.5g/L、K2HPO4 2.5g/L、NaCl 1.0g/L、MgSO4·7H2O0.2g/L、FeSO4·7H2O 0.001g/L,初始pH 7.0,115℃灭菌30min。
[0079] 1.3供试菌株和细胞株
[0080] 黄瓜枯萎病菌(Fusarium oxysporum)、弯孢病菌(Curvularia lunata)、禾谷镰刀病菌(Fusarium graminearum)、串珠镰刀病菌(Fusarium moniliforme)、茶叶炭疽病菌(Gloeosporium theae sinensis Miyake),大肠杆菌(Escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(Staphylocuccus aureus)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis),由阜阳师范大学微生物实验室保存。
[0081] 人肺腺癌A549细胞,由阜阳师范大学安徽省胚胎与发育重点实验室保存。
[0082] 1.4胞外多糖产生菌的筛选
[0083] 1.4.1初筛
[0084] 在初筛培养基上,以菌落周围有粘稠分泌物为标准进行筛菌。
[0085] 称量土样5g放入内装有适量玻璃珠和45mL无菌水的锥形瓶内,摇床振摇15min,制备成10-1稀释度的土壤稀释液,再吸取1mL土壤稀释液加入盛有9mL无菌水的试管内,制备成10-2稀释度的土壤稀释液,依此类推,共制备成10-3、10-4、10-5、10-6等不同稀释度的土壤溶液。将不同稀释度的土壤溶液涂布初筛培养基平板,37℃培养2d。挑选符合初筛标准的单菌落,在初筛平板上多次划线,37℃培养24h得到纯培养物,4℃保存备用。
[0086] 1.4.2复筛
[0087] 挑取初筛保存的菌种各两环菌种接种种子培养基,160r/min、37℃培养24h。按10%(V/V)的接种量吸取种子培养液接种发酵培养基,160r/min、37℃摇床内培养48h,每菌株重复3次。届时,取发酵液于10000r/min、4℃离心10min,取上清液,加入3倍体积预冷的无水乙醇,4℃静置过夜,离心(4℃、10000r/min、10min)弃上清,沉淀加入少量蒸馏水溶解后定容于100mL容量瓶中,苯酚-硫酸法测胞外多糖产量。以y=95.726x-0.0934(R2=
0.9995)为葡萄糖标准方程,式中x为490nm处吸光值,y为葡萄糖量。
[0088] 1.5菌株LE-3的初步鉴定
[0089] (1)形态学观察将菌株LE-3划线培养,观察菌落形态,并进行革兰氏染色和芽孢染色观察。
[0090] (2)16S  rRNA基因序列分析提取菌株LE-3基因组,以通用引物(27f:5’-AGAGTTTGATC-MTGGCTCAG-3’,1492r:5’-TACCTTGTTACGACTT-3’)进行PCR扩增,PCR反应体系含有:PCR buffer 5μL,200nmol/L dNTPs 1μL,正向引物反向引物各2μL,模板2μL,Taq DNA聚合酶1μL,MgCl2 3μL,超纯水34μL。PCR反应程序:94℃预变性1min;94℃变性30s,55℃退火30s,72℃延伸2min,37个循环。PCR产物送至上海生工生物工程有限公司进行测定,利用BLASTN软件进行序列分析,寻找具有较高同源性的16S rDNA序列,利用MEGA 7.0软件进行系统发育分析,Neighbor-joining方法构建系统发育树,Bootstrap(1 000次重复)进行检验。
[0091] 1.6菌株LE-3胞外多糖的提取
[0092] 将菌株LE-3发酵培养48h,10000r/min、4℃离心10min,取上清液,加入3倍体积预冷的无水乙醇,4℃静置过夜,离心弃上清,沉淀加入少量蒸馏水溶解,真空冷冻干燥得到粗多糖。
[0093] 1.7LE-3胞外多糖的纯化
[0094] 1.7.1Sevage法除蛋白
[0095] 取适量LE-3胞外多糖粗品溶解于蒸馏水,按照三氯甲烷和正丁醇的体积比为4∶1配制Sevage液,将粗多糖溶液与Sevage液以体积比为2∶1混合,剧烈振摇30min,然后去除水层与溶剂交界处的变性蛋白,重复5遍。然后在自来水和蒸馏水中各透析(MWCO为8kD)1d,10000r/min、4℃离心10min,取上清液,苯酚-硫酸法测糖、考斯亮蓝法测蛋白。以y=
130.84x-2.661(R2=0.9956)为蛋白质标准方程,式中x为595nm处吸光值,y为蛋白质含量。
[0096] 1.7.2雾喷显色剂法检测多糖
[0097] 将0.5%3,5-二羟基甲苯溶解于20%H2SO4中即为显色剂,将糖溶液点样于薄层层析(TLC)板上,雾喷显色剂,120℃烘烤30s,糖斑点显棕黄色。
[0098] 1.7.3柱层析法纯化多糖
[0099] 1.7.3.1CM-Sepharose FF柱层析
[0100] 称取0.5g LE-3粗多糖,溶解于10mL蒸馏水中,离心,将上清液加入已经用蒸馏水平衡2个柱体积的CM-Sepharose FF柱(1.6×17cm),用蒸馏水洗脱约2个柱体积,流速为0.6mL/min,部份收集器收集,每管3mL,先雾喷显色剂法检测多糖,再硫酸-苯酚法测糖(以OD490表示),考马斯亮蓝法测蛋白(以OD595表示)。收集多糖峰的主要部分并浓缩至适当体积。
[0101] 1.7.3.2DEAE-Sepharose FF柱层析
[0102] 将CM-Sepharose FF柱层析得到的多糖加入到预先用蒸馏水(pH 7.5)平衡2个柱体积的DEAE-Sepharose FF柱(1.6×16cm),蒸馏水洗脱约2个柱体积,流速为0.6mL/min,部份收集器收集,每管3mL,先雾喷显色剂法检测多糖,再硫酸-苯酚法测糖,考马斯亮蓝法测蛋白。收集多糖峰的主要部分并浓缩至适当体积。
[0103] 1.7.3.3Sephacryl S-200HR柱层析
[0104] 将DEAE-Sepharose FF柱层析得到的浓缩多糖加入预先用0.1mol/L NaCl平衡2个柱体积的Sephacryl S-200HR柱(1.6×18cm),用0.1mol/L NaCl进行洗脱,流速为0.6mL/min,部份收集器收集,每管1.5mL,先雾喷显色剂法检测多糖,再硫酸-苯酚法测糖,考马斯亮蓝法测蛋白。收集多糖峰的主要部分,蒸馏水透析2d,浓缩至适当体积,冷冻干燥。
[0105] 1.8傅里叶红外光谱分析
[0106] 称取冷冻干燥的多糖粉末10mg,加入干燥的KBr粉末100mg,混匀后研磨至样品呈细碎的粉末状,压片,在NICOLET IS50 FT-IR(Thermo Fisher)红外光谱仪上于4000~400cm-1波长范围进行扫描。
[0107] 1.9LE-3胞外多糖的组成分析
[0108] 1.9.1薄层层析分析
[0109] 称取纯化的LE-3胞外多糖、葡萄糖、果糖各40mg,置于20mL的具塞试管中,加入1mol/L的硫酸溶液8mL,100℃水解2h,水解液中加入CaCO3中和至不冒泡。
[0110] 将2%标准单糖(葡萄糖、果糖、甘露糖、木糖、阿拉伯糖、半乳糖、鼠李糖)溶液、纯化的LE-3胞外多糖、酸水解的多糖、酸后果糖和酸后葡萄糖点样于TLC板,然后置于展层剂(正丁醇∶乙醇∶蒸馏水=5∶3∶2,V/V)中展层,约7h后取出,雾喷显色剂后于120℃烘箱中烘5min,糖斑点显色较明显后进行扫描拍照。
[0111] 1.9.2高效液相色谱分析
[0112] 配制1mg/mL的标准单糖溶液和酸水解的LE-3多糖溶液,经0.22um滤器过滤后进行高效液相检测,总进样量为20μL,进3次,其中流动相为78%的乙腈,流速为1.000mL/min,喷射腔温度为30℃,冲洗管温度为60℃,恒温器温度为25℃。
[0113] 1.10胞外多糖螯合Fe2+能力的测定
[0114] 将胞外粗多糖溶液Sevage法除蛋白、超滤(MWCO为3000),真空冷冻干燥得到胞外多糖样品。用蒸馏水配制不同质量浓度(0.1、0.2、0.4、0.8、1.6、3.2mg/mL)胞外多糖溶液,以EDTA为对照进行实验。向3mL胞外多糖溶液中加入0.1mL FeCl2(2mmol/L)溶液混匀,25℃静置5min再加入0.2mL 5mmol/l Ferrozin试剂,混匀,25℃静置20min,于561nm处测吸光度值,以蒸馏水代替胞外多糖溶液作为空白对照。按照下式计算螯合率:
[0115] CR(%)=(1-A1/A0)×100
[0116] 式中:CR为螯合率;A1为样品溶液吸光度;A0为空白对照组吸光度。
[0117] 1.11菌株LE-3抑菌活性的检测
[0118] 1.11.1菌株LE-3抑制真菌活性的检测
[0119] 1.11.1.1平板对峙法
[0120] 将受试菌株LE-3接种到LB平板上活化,37℃培养1d。将弯孢、黄瓜枯萎、串珠镰刀、禾谷镰刀和茶叶炭疽5株病原菌接种到PDA平板上活化,28℃培养直至菌丝长至满皿。将供试病原菌和菌株LE-3菌饼 对称放置于PDA平板上,以仅在中心接种病原菌的平板为对照,28℃培养3~5d,分别测量处理组和对照组病原菌的半径(mm),计算抑菌率。抑菌率=(对照菌落半径-处理菌落半径)/(对照菌落半径-2.5)×100%。
[0121] 1.11.1.2菌株LE-3发酵上清液的抑菌作用
[0122] 打孔检测LE-3菌株发酵浓缩上清液对弯孢菌的抑制作用。取最优条件下发酵培养液600mL,10000r/min离心10min,取上清,超滤1h,浓缩成80mL,过滤除菌。按照以下两种方式处理弯孢菌:(A)无菌水冲洗弯孢菌平板,取孢子悬液涂布PDA平板,打孔加入85uL除菌浓缩液,28℃培养;(B)在培养2d的弯孢菌菌落两侧打孔,加入85uL浓缩发酵上清液,培养4d后观察。
[0123] 1.11.1.3菌株LE-3发酵上清液对孢子萌发的影响
[0124] 取200uL孢子悬浮液与等量浓缩8倍上清液混合,涂布于PDA平板,以加入等量孢子悬浮液的平板为对照,28℃培养过夜,用倒置显微镜观察试验结果,每个实验设置三个重复。
[0125] 1.11.1.4发酵上清液对菌丝生长的影响
[0126] 取LE-3菌株发酵上清液浓缩8倍过滤除菌,无菌水冲洗弯孢菌孢子,取85uL孢子悬浮液涂布于PDA平板,28℃倒置培养8h,倒置显微镜观察,观察到弯孢菌孢子萌发后,加入100uL浓缩发酵上清液,以等量无菌水为对照,28℃倒置培养49h,观察菌丝生长情况。
[0127] 1.11.2菌株LE-3抑制细菌活性的检测
[0128] 1.11.2.1发酵上清液对细菌的抑制作用
[0129] 取活化的大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌至LB液体培养基中,37℃摇床培养24h制成菌悬液,取100uL菌悬液涂布于平板,平板打孔,加入85uL除菌后的LE-3浓缩发酵上清液,37℃培养15h。
[0130] 1.11.2.2脂肽类物质对金黄色葡萄球菌的抑制作用
[0131] 取LE-3发酵培养液50mL,8000r/min、4℃离心15min,取上清,加入6mol/L HCl调pH至2.0,4℃过夜。离心收集沉淀,加入甲醇后用1mol/L NaOH调节pH至7.0,再用甲醇抽提2次,获得脂肽类化合物粗提物。采用打孔法检测抑菌效果,金黄色葡萄球菌悬液涂布于LB平板,每孔加入85uL脂肽类化合物粗提物,以甲醇为对照,37℃培养过夜观察抑菌效果。
[0132] 1.11.2.3蛋白质类物质对金黄色葡萄球菌的抑制作用
[0133] 将菌株LE-3发酵培养液离心,取上清液,加入固体硫酸铵分别至四个饱和度(0~30%、30%~50%、50%~80%和80%~100%)进行分级沉淀,得到四种蛋白质,4℃过夜。
10000r/min、4℃离心20min去上清。每50mL培养液所得沉淀用2mL浓度为20mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)缓冲液悬浮。打孔法比较不同饱和度盐沉淀的蛋白对金黄色葡萄球菌的抑制作用。每孔加入不同饱和度盐沉淀的蛋白溶液85μL,以20mmol/L Tris-HCl(pH 7.5)作为对照,37℃培养过夜,观察抑菌效果。
[0134] 1.12胞外蛋白的提取与初步纯化
[0135] 硫酸铵四个饱和度(0~30%、30%~50%、50%~80%、80%~100%)分级沉淀得到四种蛋白质,4℃静置过夜,再离心(10000r/min、4℃、20min)弃上清,沉淀用蒸馏水溶解、透析(MWCO为8kD),将透析后的溶液进行真空冷冻干燥,得蛋白初步纯化样品。
[0136] 1.13多糖及胞外蛋白对癌细胞A549的抑制作用
[0137] 取对数期A549细胞,用0.25%胰酶溶液消化,离心去上清,重悬后细胞浓度为8×104个/mL,分别于96孔板每孔中加入100μL的细胞悬液,再分别加入不同方法处理(Sevage法除蛋白、透析、水浴加热和柱层析)得到的多糖样品溶液或硫酸铵分级沉淀得到的初步纯化蛋白样品100μL,各样品设置200μg/mL、400μg/mL、800μg/mL三个终浓度,每浓度设置3个重复孔,以不加细胞悬液的孔为背景,以不加样品的孔为空白对照,CO2培养箱培养48h。届时,每孔中加入10μL 5mg/mL MTT,继续培养4h,每孔分别再加入三联溶解液100μL,继续培养4h后,在酶标仪上测定OD570,计算抑制率。抑制率=(空白对照组OD570-实验OD570)/空白对照组OD570。
[0138] 2结果
[0139] 2.1胞外多糖产生菌的筛选与发酵
[0140] 从土壤中筛出26株符合初筛标准的菌株,复筛得到3株产糖量在5g/L以上,其中LE-3产量为5.29g/L。将菌株LE-3种子菌液培养24h后按照10%(v/v)接种发酵培养基,37℃培养36h,胞外多糖产量达到18.36g/L。
[0141] 2.2LE-3菌株的鉴定
[0142] 菌株LE-3菌落大而圆,乳白色,易挑取,正反面色泽一致;菌体杆状,革兰氏阳性,芽孢中生(图1)。
[0143] 将提取的基因组进行琼脂糖凝胶电泳,LE-3基因组片段大小约23kb;以该基因组为模板,采用细菌16S rDNA通用引物进行PCR扩增,获得产物大小约为1.5kb,将PCR产物进行测序,并将测得的序列通过BLASTN软件进行比对,结果显示菌株LE-3是芽孢杆菌(Bacillus sp.),在进化树中与解淀粉芽孢杆菌亚种(Bacillus amyloliquefaciens subsp.amyloliquefaciens)KF689544.1聚在一起(图2)。因此,菌株LE-3是一株解淀粉芽孢杆菌亚种。
[0144] 2.3LE-3胞外多糖的纯化
[0145] 2.3.1Sevage法除蛋白
[0146] 由表1可见,用Sevage法除蛋白后,已处理样品与未处理样品相比,多糖含量变化较小但蛋白质含量明显下降。根据标准曲线可计算出处理后样品中蛋白质浓度为1.08mg/mL,多糖浓度为6.16mg/mL。
[0147] 表1 LE-3多糖Sevage法除蛋白分析
[0148]
[0149] 2.3.2CM-Sepharose FF柱层析
[0150] LE-3胞外多糖溶液经Sevage法除蛋白、透析后,加样于CM-Sepharose FF柱,洗脱,测定各收集管中液体OD490和OD595。在由蒸馏水洗脱得到的1~13管出现一个多糖峰,表明该多糖是不带正电荷的多糖,含少量蛋白质(图3)。
[0151] 2.3.3DEAE-Sepharose FF柱层析
[0152] 收集、浓缩CM-Sepharose FF柱层析得到的多糖峰,加样于DEAE-Sepharose FF柱,洗脱,测定各收集管中液体OD490和OD595。在由蒸馏水洗脱得到的6~14管出现一个多糖峰,表明该多糖是不带负电荷的多糖,且蛋白质含量较低(图4)。
[0153] 2.3.4Sephacryl S-200HR柱层析
[0154] 收集、浓缩DEAE-Sepharose FF柱层析得到的多糖峰,加样于Sephacryl S-200HR柱,洗脱,测定各收集管中液体OD490和OD595。在9~37管出现一个多糖峰,表明LE-3多糖只存在一个多糖组分,且分子量较大,此时多糖中几乎不含有蛋白质(图5)。
[0155] 2.4多糖的红外检测
[0156] 如图6所示,在红外光谱扫描中,样品在3447.05cm-1处的吸收峰,是由O-H伸缩振动引起的,而2939.29cm-1处是C-H的吸收峰,这是多糖的特征吸收峰。1636.19cm-1处是结合水-1的吸收峰,927.73cm 处的吸收峰表明该多糖含有呋喃环,初步判断该多糖为果聚糖。
[0157] 2.5LE-3多糖组分分析
[0158] 2.5.1薄层层析分析
[0159] 如图7所示,LE-3胞外多糖中不含有鼠李糖、半乳糖、木糖、阿拉伯糖、甘露糖。含有大量果糖,但是否含有葡萄糖还不能确定,还需进一步实验确认。
[0160] 2.5.2高效液相色谱分析
[0161] 从图8可以看出:果糖、酸后果糖、葡萄糖和酸后葡萄糖的HPLC保留时间分别为15.7、15.7、21.3和21.3min,酸后多糖的保留时间为16.13min,该保留时间与果糖接近,说明LE-3菌株胞外多糖含有果糖、没有葡萄糖,高效液相色谱法检测和TLC检测结果相同。
[0162] 2.6胞外多糖螯合Fe2+能力的测定
[0163] 在0.1~1.6mg/mL范围内胞外多糖对Fe2+的螯合能力呈先升后降,当胞外多糖浓度为0.4mg/mL时,螯合率达到最高,为62.3%。阳性对照EDTA对Fe2+的螯合能力较强,当浓度为0.8mg/mL时螯合率最高(99.4%),随后螯合能力趋于稳定(图9)。
[0164] 2.7菌株LE-3抑菌活性的检测
[0165] 2.7.1菌株LE-3抑制真菌活性的检测
[0166] 2.7.1.1平板对峙法
[0167] 利用菌丝生长抑制法,对菌株LE-3进行抑菌试验和抑菌谱测定。结果表明:菌株LE-3对5种植物病原菌都有抑制作用,对弯孢病原菌的抑制作用最强,抑菌率为61.5%(图10、表2)。
[0168] 表2菌株LE-3的抑制真菌作用
[0169]
[0170] 2.7.1.2菌株LE-3发酵上清液的抑菌作用
[0171] 打孔法检测LE-3菌株浓缩8倍的发酵液对弯孢菌的抑制作用。LE-3菌株对弯孢菌具有明显的抑制作用(图10-A),而LE-3菌株抑制弯孢菌的物质存在于发酵上清液中,且LE-3菌株发酵上清液对弯孢菌的抑菌圈直径达到1.8cm(图11)。
[0172] 2.7.1.3菌株LE-3发酵上清液对孢子萌发的影响
[0173] 将LE-3菌株发酵上清浓缩液与弯孢菌孢子悬液混合后涂布于PDA平板上,28℃倒置培养13h,于倒置显微镜下观察拍照。弯孢菌的分生孢子与上清液混合后培养13h,未见明显的菌丝生长(图12-B),而未处理的孢子培养13h后菌丝伸长明显(图12-C)。由此可见,LE-3菌株发酵液具有抑制弯孢菌孢子萌发的作用。
[0174] 2.7.1.4发酵上清液对菌丝生长的影响
[0175] 孢子培养8h后,弯孢菌菌丝向四周延伸,再在该平板上涂布上清液后继续培养49h,未处理的孢子菌丝几乎布满平板且颜色较深(图13-B,C),处理后的孢子较少且颜色较浅(图13-D,E,F)。因此,LE-3发酵液上清液对弯孢菌的菌丝生长也存在抑制作用。
[0176] 2.7.2菌株LE-3抑制细菌活性的检测
[0177] 2.7.2.1发酵上清液对细菌的抑制作用
[0178] LE-3菌株浓缩8倍的发酵上清液对大肠杆菌和枯草芽孢杆菌没有明显的抑菌作用,但对金黄色葡萄球菌有明显的抑菌作用,抑菌圈直径为2.0cm(图14)。
[0179] 2.7.2.2脂肽类物质对金黄色葡萄球菌的抑制作用
[0180] 打孔法检测甲醇提取保存的脂肽类物质抑制金黄色葡萄球菌的活性。结果表明:菌株LE-3分泌在发酵液中的脂肽类物质对金黄色葡萄球菌没有抑制作用。
[0181] 2.7.2.3蛋白质类物质对金黄色葡萄球菌的抑制作用
[0182] 利用分级饱和的硫酸铵(0~30%、30%~50%、50%~80%和80%~100%)从LE-3菌发酵上清液中提取得到4种蛋白质,将这4种蛋白分别加入涂有金黄色葡萄球菌的LB平板上的孔内,37℃培养过夜,观察。由图15可见:不同饱和度硫酸铵提取的蛋白对金黄色葡萄球菌都具有明显的抑制作用,抑菌圈直径分别为1.75cm、1.40cm、1.70cm、1.53cm。结果表明:0~30%饱和度硫酸铵提取的蛋白质对金黄色葡萄球菌的抑制作用最强,30%~50%饱和度硫酸铵提取的蛋白质对金黄色葡萄球菌的抑制作用最弱。
[0183] 2.8胞外多糖及胞外蛋白对癌细胞A549的抑制作用
[0184] 从表3可以看出:未进行处理的多糖对人肺腺癌A549细胞增殖的抑制作用随浓度增加而增加,当浓度达到800ug/mL时,抑制率达到最大(28.05%)。不同处理方法得到的多糖对A549细胞增殖的抑制作用不同。Sevage处理后的多糖对A549细胞增殖的抑制作用与未处理的多糖作用相差不大,浓度对抑制率影响不大;70℃水浴处理后的多糖对A549细胞增殖的抑制作用与未处理的多糖作用相比大大降低,抑制率降至10%以下;透析处理的多糖对A549细胞增殖的抑制作用与未处理的多糖作用相比也降低。
[0185] 表3不同处理方式多糖抗A549活性(抑制率%)
[0186]
[0187] 从表4可以看出:硫酸铵沉淀得到的蛋白质溶液对A549细胞的增殖有明显的抑制作用,且饱和度不同抑制率也不同,抑制率在51.6%~70.65%之间。0~30%饱和度的蛋白溶液浓度为800ug/mL时,A549细胞的抑制率最高,达到70.65%。
[0188] 表4不同饱和度硫酸铵沉淀得到的蛋白质抗A549活性(抑制率%)
[0189]
[0190] 以上所述实施例的各技术特征可以进行任意的组合,为使描述简洁,未对上述实施例中的各个技术特征所有可能的组合都进行描述,然而,只要这些技术特征的组合不存在矛盾,都应当认为是本说明书记载的范围。
[0191] 以上所述实施例仅表达了本发明的几种实施方式,其描述较为具体和详细,但并不能因此而理解为对发明专利范围的限制。应当指出的是,对于本领域的普通技术人员来说,在不脱离本发明构思的前提下,还可以做出若干变形和改进,这些都属于本发明的保护范围。因此,本发明专利的保护范围应以所附权利要求为准。
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