一种红树尖瓣海莲内生真菌及其在制备抗虫活性萜类晶体化合物中的应用
阅读：706发布：2020-06-07
专利汇可以提供一种红树尖瓣海莲内生真菌及其在制备抗虫活性萜类晶体化合物中的应用专利检索，专利查询，专利分析的服务。并且本 发明 涉及一种红树尖瓣海莲内生 真菌 及其在制备抗虫活性萜类晶体化合物中的应用，所述菌种保藏信息为：保藏单位名称：中国 微 生物 菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年11月9日；保藏编号：CGMCC No.16499；分类命名：青霉Penicillium sp.。，下面是一种红树尖瓣海莲内生真菌及其在制备抗虫活性萜类晶体化合物中的应用专利的具体信息内容。
1.一种红树尖瓣海莲内生真菌TGM112，其特征在于其菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期：2018年11月9日；保藏编号：CGMCC No.16499；
分类命名：青霉Penicillium sp.。
2.权利要求1所述的红树尖瓣海莲内生真菌TGM112在制备混元萜类化合物1和2中的应用；所述化合物1、2所示的结构：
3.一种混元萜类化合物1的晶型，其特征在于所述化合物1晶型的晶体数据为：斜方晶系，空间群P212121，晶胞参数为 α＝
90°,β＝90°,γ＝90°, Z＝4,Dx＝1.260mg/mm3,μ(Cu Kα)＝0.816mm-1,F(000)＝1272,5654个可观测点[I>2σ(I)]，可观测点精修最终偏离因子R＝0.0373,wR＝
0.0902,Flack常数为-0.03(6)；化合物1的结构为
4.一种混元萜类化合物2的晶型，其特征在于所述化合物2晶型的晶体数据为：斜方晶系，空间群P212121，晶胞参数为 α＝
3 -1
90°,β＝90°,γ＝90°, Z＝4,Dx＝1.399mg/mm ,μ(Cu Kα)＝0.892mm ,F(000)＝1000,4005个可观测点[I>2σ(I)],可观测点精修最终偏离因子R＝0.0340,wR＝
0.0877，Flack常数为0.10(7)；化合物2的结构为
5.一种制备化合物1或2晶型的方法，其特征在于包括如下步骤：将化合物1或2溶于有机溶剂中，静置自然结晶，2-7天后即得化合物1或2的晶型。
6.权利要求5所述的方法，其特征在于所述有机溶剂优选甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮中的一种或几种。
7.一种药物组合物，其特征在于权利要求3-4所述化合物1、2的晶型或其药学上可接受的盐作为活性成分。
8.权利要求7所述的药物组合物，其特征在于还包含其他杀虫药物。
9.权利要求7-8任一项所述的药物组合物，其特征在于还包含药学上可接受的辅料(优选药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。上述药物组合物的剂型可以是固体制剂、半固体制剂或液体制剂。
10.权利要求3-4所述化合物1、2的晶型或其药学上可接受的盐在制备杀虫剂中的用途。尤其是在制备杀棉铃虫、线虫药物中的应用。
一种红树尖瓣海莲内生真菌及其在制备抗虫活性萜类晶体化
合物中的应用
技术领域
背景技术
[0002] 海洋来源的内生真菌结构新颖活性独特的化合物重要来源之一。近年来，一些新的活性化合物已经从真菌Penicillum中分离得到，例如：抗炎活性化合物 chrysogenester，抑制α-葡萄糖苷酶的化合物chrysines B和C，具有细胞毒活性的化合物penicimenolides B-D and penitalarins A-C，抗真菌化合物brocapyrrozin A。前期研究发现内生真菌Penicillum乙酸乙酯粗提物具有一定的抗虫活性。
发明内容
[0003] 本发明提供一种红树尖瓣海莲内生真菌TGM112，其特征在于其菌种保藏信息：保藏单位名称：中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心；保藏单位地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号，中国科学院微生物研究所；保藏日期： 2018年11月9日；保藏编号：CGMCC No.16499；分类命名：青霉Penicillium sp.。
[0004] 本发明的另一实施方案提供上述红树尖瓣海莲内生真菌TGM112在制备混元萜类化合物1和2中的应用；所述化合物1、2所示的结构：
[0005]
[0006] 本发明的另一实施方案提供一种混元萜类化合物1的晶型，其特征在于所述化合物1晶型的晶体数据为：斜方晶系，空间群P212121，晶胞参数为α＝90°,β＝90°,γ＝90°, Z＝4,
Dx＝1.260mg/mm3,μ(Cu Kα)＝0.816mm-1,F(000)＝1272,5654个可观测点[I>2σ(I)]，可观测点精修最终偏离因子R＝0.0373,wR＝0.0902,Flack常数为-0.03(6)；化合物1的结构为[0007] 本发明的另一实施方案提供一种混元萜类化合物2的晶型，其特征在于所述化合物2晶型的晶体数据为：斜方晶系，空间群P212121，晶胞参数为
α＝90°,β＝90°,γ＝90°,
Z＝4,Dx＝1.399mg/mm3,μ(Cu Kα)＝0.892mm-1,F(000)＝1000, 4005个可观
测点[I>2σ(I)],可观测点精修最终偏离因子R＝0.0340,wR＝0.0877， Flack常数为0.10(7)；化合物2的结构为
Dx＝1.260mg/mm3,μ(Cu Kα)＝0.816mm-1,F(000)＝1272,5654个可观测点[I>2σ(I)]，可观测点精修最终偏离因子R＝0.0373,wR＝0.0902,Flack常数为-0.03(6)；化合物1的结构为[0007] 本发明的另一实施方案提供一种混元萜类化合物2的晶型，其特征在于所述化合物2晶型的晶体数据为：斜方晶系，空间群P212121，晶胞参数为
α＝90°,β＝90°,γ＝90°,
Z＝4,Dx＝1.399mg/mm3,μ(Cu Kα)＝0.892mm-1,F(000)＝1000, 4005个可观
测点[I>2σ(I)],可观测点精修最终偏离因子R＝0.0340,wR＝0.0877， Flack常数为0.10(7)；化合物2的结构为
[0008]
[0009] 本发明的另一实施方案，提供一种利用红树尖瓣海莲内生真菌TGM112同时制备化合物1、2的制备方法，其特征在于包括如下步骤：
[0012] (3)将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取3～5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
[0013] (4)步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按 100:0、90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100 梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，其中30:70梯度洗脱得到的馏分浓缩后经 Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿：甲醇＝1∶1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×
250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝45:55，最终得到化合物1；其中10:90梯度得到的馏分浓缩后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿：甲醇＝1∶1，再经高效液相色谱 HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为MeOH:H2O＝45:55，最终得到化合物2。
250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝45:55，最终得到化合物1；其中10:90梯度得到的馏分浓缩后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿：甲醇＝1∶1，再经高效液相色谱 HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为MeOH:H2O＝45:55，最终得到化合物2。
[0014] 其中所述洗脱剂或流动相的比例均为体积比；所述种子培养基中含有葡萄糖 1.5％–3.0％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％–0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；
所述发酵培养基中含有葡萄糖1.6％–3.5％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％– 0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；上述百分比均为重量百分比；所述种子培养基和发酵培养基均需120℃灭25–30分钟。
所述发酵培养基中含有葡萄糖1.6％–3.5％、酵母膏0.1％–0.5％、蛋白胨0.1％– 0.5％、粗海盐0.11％–0.6％、适量的水；上述百分比均为重量百分比；所述种子培养基和发酵培养基均需120℃灭25–30分钟。
[0015] 本发明的另一实施方案提供一种制备化合物1或2晶型的方法，其特征在于包括如下步骤：将化合物1或2溶于有机溶剂中，静置自然结晶，2-7天后即得化合物1或2的晶型。所述有机溶剂优选甲醇、乙醇、乙酸乙酯、丙酮中的一种或几种。
[0016] 本发明的另一实施方案提供红树尖瓣海莲内生真菌TGM112在制备化合物1 或2晶型中的应用。
[0017] 本发明提供一种药物组合物，其特征在于以本发明化合物1、2的晶型或其药学上可接受的盐作为活性成分。
[0018] 本发明提供的上述药物组合物，还可包含其他杀虫药物；也可以包含药学上可接受的辅料(优选药学上可接受的载体、稀释剂或赋形剂)。上述药物组合物的剂型可以是固体制剂、半固体制剂或液体制剂。
[0020] 本发明中术语“药学上可接受的盐”是指非毒性的无机或有机酸和/或碱的加成盐，可参见“Salt selection for basic drugs”,Int.J.Pharm.(1986),33,201–217。附图说明
[0021] 图1是化合物1的X-Ray图；
[0022] 图2是化合物1的ECD谱图；
[0023] 图3是化合物2的X-Ray图；
[0024] 图4是化合物2的ECD谱图。
具体实施方式
[0025] 为了便于对本发明的进一步理解，下面提供的实施例对其做了更详细的说明。但是这些实施例仅供更好的理解发明而并非用来限定本发明的范围或实施原则，本发明的实施方式不限于以下内容。
[0026] 实施例1
[0027] (1)TGM112的菌种培养
[0028] 配制种子培养基：葡萄糖80g，蛋白胨8g，酵母膏8g，粗海盐10g，水4.0L，平均分装于8个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
[0029] 将TGM112菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养3天得种子培养液；
[0030] (2)TGM112的发酵
[0031] 配制发酵培养基：葡萄糖1.1kg，蛋白胨100g，酵母膏100g，海盐125g，水 50L，平均分装于75个1000mL锥形瓶中，120℃灭25–30分钟。
[0032] 取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养21天得发酵物。
[0033] (3)浸膏的制备
[0034] 将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取3次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
[0035] (4)化合物1-2的提取分离
[0036] 步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、 90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，其中30:70梯度洗脱得到的馏分浓缩后经 Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿：甲醇＝1∶1，再经高效液相色谱 HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝45:55，最终得到化合物1(16.2mg)；其中10:90梯度得到的馏分浓缩后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿：甲醇＝1∶1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为 2mL/min，流动相为MeOH:H2O＝45:55，最终得到化合物2(13.3mg)。
[0037]
[0038] 化合物1和2的1H和13C-NMR(400/100MHz,aCDCl3.bCD3OD)数据如下表1。
[0039] 表1化合物1和2的1H和13C-NMR(400/100MHz,aCDCl3.bCD3OD)数据(ppm)
[0040]
[0041]
[0042] 化合物1结构的确定：根据高分辨质谱数据601.2282[M+H]+，推算出该化合物1的分子式为C31H36O12，不饱和度为14。
[0043] 从1H和13C NMR谱中看到化合物1有6个羰基碳和4个烯碳，推测该化合物存在六环系统，有混元萜的基本骨架。除此之外，在低场区出现1个烯氢信号δH 6.78(q,J＝5.6Hz,H-20)和2个末端双键氢信号δH 5.83(dd,J＝24.0,1.6Hz, H-13)，3个连氧次甲基氢信号δH
5.93(m,H-11),5.47(dd,J＝10.0,5.6Hz,H-7),和 5.19(q,J＝6.8Hz,H-5')，3个亚甲基信号δH 2.61(m,H-2),2.53(m,H-1a)and 2.33 (m,H-1b),1.86(d,J＝5.2Hz,H-6a)和1.83(d,J＝5.2Hz,H-6b)，以上氢谱和碳谱信息，提示该化合物与已知化合物1,2-dehydro-terredehydroaustin非常相似，不同之处仅在于在化合物1中少了两个烯碳信号(δC
116.7and 137.0)，多了一个羰基信号(δC 191.7)，推测已知化合物中的C-1′和C-2′的碳碳双键在化合物1中被氧化成C-2′的羰基，高分辨数据也证实了这点。C-9′甲基的连接位置是通过 HMBC确定的，在HMBC中，9'-Me与C-2′/C-3′/C-11相关，提示甲基连接在 C-3'上，此外
2-甲基巴豆酸酯单元也是通过HMBC连接确定的，在HMBC中， H-22与C-18/C-19/C-20相关。
基于以上推断化合物1的平面结构得以确定，化合物1的相对构型是通过NOESY来定的，在NOESY谱中可以看到H-11与15-Me 和H-7相关，H-7与10'-Me相关，9'-Me与H-5'和12-Me相关，即9'-Me，H-5' 和12-Me在α面，H-7,H-11,15-Me和10′-Me在β面。化合物1的绝对构型是通过X-Ray衍射和ECD计算确定的，即化合物的绝对构型为 5S,7R,8S,9R,11S,3′R,5′R,6′R,7′S。命名为penicianstinoid A。
5.93(m,H-11),5.47(dd,J＝10.0,5.6Hz,H-7),和 5.19(q,J＝6.8Hz,H-5')，3个亚甲基信号δH 2.61(m,H-2),2.53(m,H-1a)and 2.33 (m,H-1b),1.86(d,J＝5.2Hz,H-6a)和1.83(d,J＝5.2Hz,H-6b)，以上氢谱和碳谱信息，提示该化合物与已知化合物1,2-dehydro-terredehydroaustin非常相似，不同之处仅在于在化合物1中少了两个烯碳信号(δC
116.7and 137.0)，多了一个羰基信号(δC 191.7)，推测已知化合物中的C-1′和C-2′的碳碳双键在化合物1中被氧化成C-2′的羰基，高分辨数据也证实了这点。C-9′甲基的连接位置是通过 HMBC确定的，在HMBC中，9'-Me与C-2′/C-3′/C-11相关，提示甲基连接在 C-3'上，此外
2-甲基巴豆酸酯单元也是通过HMBC连接确定的，在HMBC中， H-22与C-18/C-19/C-20相关。
基于以上推断化合物1的平面结构得以确定，化合物1的相对构型是通过NOESY来定的，在NOESY谱中可以看到H-11与15-Me 和H-7相关，H-7与10'-Me相关，9'-Me与H-5'和12-Me相关，即9'-Me，H-5' 和12-Me在α面，H-7,H-11,15-Me和10′-Me在β面。化合物1的绝对构型是通过X-Ray衍射和ECD计算确定的，即化合物的绝对构型为 5S,7R,8S,9R,11S,3′R,5′R,6′R,7′S。命名为penicianstinoid A。
[0044] 化合物2结构的确定：根据高分辨质谱数据473.1811[M+H]+，推算出该化合物2的分子式为C25H28O9，不饱和度为12。
[0045] 1H NMR和13C-NMR谱与已知化合物dehydroaustinol非常相似，不同之处仅在于C-7化学位移的差别，在已知化合物dehydroaustinol中C-7是亚甲基[δH 1.70(m)和δC 27.7(CH2)]，化合物2中C-7是连氧次甲基[δH 4.32(dd,J＝12.0,4.8 Hz)和δC 64.7(CH)]，从HMBC中也能看到H-7与C-5/C-8/C-9相关。化合物2 的绝对构型是通过NOESY、X-Ray和ECD计算确定，即化合物2绝对构型为 5S,7R,8S,9R,11R,3'S,5'R,6'R,7'S，命名为penicianstinoid B。
[0046] 实施例2
[0047] 取2.0mg化合物1溶于2mL丙酮中，静置自然结晶，3天后得到无色晶体，其晶体结构以双子超衍射仪(Xcalibur,Atlas,Gemini ultra diffractometer)采用Cu Kα射线在120.01(10)K下扫描收集衍射数据。
[0048] 化合物1的晶体数据：斜方晶系，空间群P212121，晶胞参数为α＝90°,β＝90°,γ＝90°, Z＝4,
Dx＝1.260mg/mm3,μ(Cu Kα)＝0.816mm-1,F(000)＝1272,5654个可观测点[I>2σ(I)]，可观测点精修最终偏离因子R＝0.0373,wR＝0.0902,Flack常数为 -0.03(6).
Dx＝1.260mg/mm3,μ(Cu Kα)＝0.816mm-1,F(000)＝1272,5654个可观测点[I>2σ(I)]，可观测点精修最终偏离因子R＝0.0373,wR＝0.0902,Flack常数为 -0.03(6).
[0049] 取2.0mg化合物2溶于2mL甲醇中，静置自然结晶，4天后得到无色晶体，其晶体结构以双子超衍射仪(Xcalibur,Atlas,Gemini ultra diffractometer)采用Cu Kα射线在120.01(10)K下扫描收集衍射数据。
[0050] 化合物2的晶体数据：斜方晶系，空间群P212121，晶胞参数为α＝90°,β＝90°,γ＝90°, Z＝4,
Dx＝1.399mg/mm3,μ(Cu Kα)＝0.892mm-1,F(000)＝1000,4005个可观测点[I>2σ(I)],可观测点精修最终偏离因子R＝0.0340,wR＝0.0877，Flack常数为0.10(7).
Dx＝1.399mg/mm3,μ(Cu Kα)＝0.892mm-1,F(000)＝1000,4005个可观测点[I>2σ(I)],可观测点精修最终偏离因子R＝0.0340,wR＝0.0877，Flack常数为0.10(7).
[0051] 实施例3
[0052] (1)TGM112的菌种培养
[0053] 配制种子培养基(10.0L)：葡萄糖1.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于16个1000mL锥形瓶， 120℃灭25–30分钟。
[0054] 将TGM112菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养4天得种子培养液；
[0055] (2)TGM112的发酵
[0056] 配制发酵培养基(100L)：葡萄糖1.6％(重量百分比，下同)、酵母膏0.5％、蛋白胨0.1％、粗海盐0.11％，其余为水；平均分装于150个1000mL锥形瓶， 120℃灭25–30分钟。
[0057] 取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养24天得发酵物。
[0058] (3)浸膏的制备
[0059] 将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
[0060] (4)化合物1-2的提取分离
[0061] 步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、 90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，其中30:70梯度洗脱得到的馏分浓缩后经 Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿：甲醇＝1∶1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝45:55，最终得到化合物1(32.5mg)；其中10:90梯度得到的馏分浓缩后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿：甲醇＝1∶1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为 2mL/min，流动相为MeOH:H2O＝45:55，最终得到化合物2(25.4mg)。
[0062] 实施例4
[0063] (1)TGM112的菌种培养
[0064] 配制种子培养基(1.0L)：葡萄糖3.0％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于3个500mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
[0065] 将TGM112菌株接入配制好的种子培养基中，于26～28℃下，培养4天得种子培养液；
[0066] (2)TGM112的发酵
[0067] 配制发酵培养基(10L)：葡萄糖3.5％(重量百分比，下同)、酵母膏0.1％、蛋白胨0.5％、粗海盐0.6％，其余为水；平均分装于15个1000mL锥形瓶，120℃灭25–30分钟。
[0068] 取适量的步骤(1)中得到的种子培养液接入装有发酵培养基的锥形瓶中，于26～28℃静置培养22天得发酵物。
[0069] (3)浸膏的制备
[0070] 将步骤(2)得到的发酵物中的发酵液和菌体分离，发酵液和菌体分别用等体积的乙酸乙酯萃取5次，合并萃取液后减压浓缩得到浸膏；
[0071] (4)化合物1-2的提取分离
[0072] 步骤(3)得到的浸膏经过减压硅胶柱层析，采用石油醚-乙酸乙酯按100:0、 90:10、80:20、70:30、60:40，50:50、40:60、30:70、20:80、10:90、0:100梯度洗脱，每个梯度收集两个柱体积，其中30:70梯度洗脱得到的馏分浓缩后经 Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿：甲醇＝1∶1，再经高效液相色谱 HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为CH3CN:H2O＝45:55，最终得到化合物1；其中10:90梯度得到的馏分浓缩后经Sephadex LH-20凝胶柱层析，洗脱剂为氯仿：甲醇＝1∶1，再经高效液相色谱HPLC制备，色谱柱为Agilent C18,9.4×250mm，7μm，流速为2mL/min，流动相为MeOH:H2O＝
45:55，最终得到化合物2。
45:55，最终得到化合物2。
[0073] 实施例5本发明化合物1、2的抗虫活性的测定
[0074] 试验方法：取化合物1、2各对棉铃虫幼虫和线虫进行活性测试。
[0075] 棉铃虫活性测试，在6孔板中加入等量混有不同浓度样品(200,100,50,25 and 12.5μL/孔)的人工饲料，平行三组。设置阳性组、空白组和阴性组，阳性对照组中分别加入相应的人工饲料及阳性药(200,100,50,25and 12.5μL/孔)，空白对照为等量人工饲料，阴性对照为不同浓度的DMSO(200,100,50,25and 12.5 μL/孔)。将6孔板放置室温下连续培养一周，观察棉铃虫幼虫的生长情况，每隔 2天观察并记录棉铃虫生长死亡情况。木楝素(azadirachtin)为阳性对照药。
[0076] 线虫活性测试，在48孔板中加入40μL的大肠杆菌OP50，5μL在M9介质中L1的龄线虫(30-40条)，1.2μL的氯霉素，所有的化合物加入量分别为0,1,5, 10,20,40μg/mL，再用介质补满所有孔体积至400μL，设置三组平行。设置阳性组、阴性组和空白组，阳性组中加入介质和阳性药(0,1,5,10,20,40μg/mL)，阴性组中只加入DMSO(0,1,5,10,20,40μg/mL)，空白组中什么都不加入。在 24℃黑暗条件下培养60小时，每隔十二小时观察一次，记录线虫的生长情况和死亡情况，左旋咪唑(levamisole)。
[0077] 试验结果如下：
[0078] 表2：
[0079]
[0080] 上表中：IC50：半抑制浓度(half maximal inhibitory concentration)。
[0081] EC50：半有效浓度(concentration for 50％of maximal effect)。
[0082] Azadirachtin a为棉铃虫组阳性对照。
[0083] Levamisoleb为线虫组阳性对照
[0084] 试验结果表明两个化合物有一定的抗虫活性，化合物1和化合物2对 H.armigera Hubne(棉铃虫)具有抑制活性，IC50值都为200μg/mL。化合物1 和化合物2对C.elegans(线虫)具有较好的致死活性，EC50值都为10μg/mL。
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