用以防治昆虫有害生物的组合物和方法
阅读：517发布：2020-06-10
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1.一种沉默元件，其包含至少一个双链RNA区域，所述双链RNA区域的至少一条链包含与以下互补的多核苷酸：
(a)包含SEQ ID NO：1-49中任一者的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；
(b)与核苷酸SEQ ID NO：1-49中任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或
(c)包含SEQ ID NO：1-49中任一者的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；
其中所述沉默元件对昆虫植物有害生物具有杀昆虫活性。
2.如权利要求1所述的沉默元件，其中所述昆虫植物有害生物是鞘翅目(Coleoptera)植物有害生物。
3.如权利要求2所述的沉默元件，其中所述鞘翅目植物有害生物是叶甲属
(Diabrotica)植物有害生物。
4.如权利要求3所述的沉默元件，其中所述叶甲属植物有害生物包括玉米根萤叶甲(D.virgifera virgifera)、墨西哥玉米根虫(D.virgifera zeae)、南美叶甲
(D.speciosa)、巴氏根叶甲(D.barberi)、墨西哥玉米根虫(D.vtrgifera zeae)、或黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata)。
5.如权利要求1所述的沉默元件，其中所述昆虫植物有害生物是鳞翅目
(Lepidopteran)植物有害生物。
6.如权利要求5所述的沉默元件，其中鳞翅目植物有害生物为斜纹夜蛾(Spodoptera litura)、玉米螟(Ostrinia nubilalis)、谷实夜蛾(Helicoverpa zea)、或草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda)。
7.如权利要求1-6中任一项所述的沉默元件，其中所述沉默元件包含发夹环。
8.如权利要求1或7所述的沉默元件，其中所述沉默元件包含第一区段、第二区段和第三区段，其中
(a)所述第一区段包含至少约19个核苷酸，这些核苷酸与SEQ ID NO：1-49中任一者所示的序列具有至少90％序列互补性；或其变体和片段，及互补序列；或者所述第一区段由与SEQ ID NO：1-49中任一者所示的序列具有至少90％序列互补性的至少19个核苷酸组成；
(b)所述第二区段包含足够长的环，以允许所述沉默元件被转录为发夹RNA；并且，(c)所述第三区段包含至少约19个核苷酸，这些核苷酸与所述第一区段具有至少85％互补性。
9.如权利要求8所述的沉默元件，其中所述第三区段与所述第一区段具有至少90％互补性。
10.如权利要求8所述的沉默元件，其中所述第三区段与所述第一区段具有至少95％互补性。
11.如权利要求8所述的沉默元件，其中所述第三区段与所述第一区段具有至少98％互补性。
12.如权利要求8所述的沉默元件，其中所述第一区段与鞘翅目昆虫物种互补；并且其中所述第三区段与不同的鞘翅目昆虫物种互补。
13.如权利要求8所述的沉默元件，其中所述第一区段与半翅目(Hemiptera)昆虫物种互补；并且其中所述第三区段与不同的半翅目昆虫物种互补。
14.如权利要求8所述的沉默元件，其中所述第一区段与鳞翅目昆虫物种互补；并且其中所述第三区段与不同的鳞翅目昆虫物种互补。
15.一种DNA构建体，其包含编码如权利要求1-14中任一项所述的沉默元件的多核苷酸。
16.一种表达构建体，其包含如权利要求15所述的DNA构建体。
17.如权利要求16所述的表达盒，其中所述多核苷酸可操作地连接至异源启动子。
18.如权利要求16所述的表达盒，其中所述多核苷酸的侧翼是在所述多核苷酸的一个末端处的第一可操作地连接的趋同启动子和在所述多核苷酸的对向末端处的第二可操作地连接的趋同启动子，其中所述第一趋同启动子和所述第二趋同启动子能够驱动所述沉默元件的表达。
19.一种宿主细胞，其包含如权利要求1-14中任一项所述的沉默元件、如权利要求15所述的DNA构建体、或如权利要求16-18中任一项所述的表达构建体。
20.如权利要求19所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞是细菌细胞。
21.如权利要求20所述的宿主细胞，其中所述细菌细胞是灭活的细菌细胞。
22.如权利要求19-21中任一项所述的宿主细胞，其中所述宿主细胞包含如权利要求16所述的表达构建体。
23.如权利要求22所述的宿主细胞，其中所述表达构建体包含与如权利要求15所述的DNA构建体可操作地连接的转录启动子。
24.如权利要求23所述的宿主细胞，其中可通过将所述宿主细胞暴露于外源性分子来诱导所述转录启动子。
25.一种组合物，其包含如权利要求1-14中任一项所述的核糖核酸构建体、如权利要求
15所述的DNA构建体、如权利要求16-18中任一项所述的表达构建体、或如权利要求19-24中任一项所述的宿主细胞。
26.如权利要求25所述的组合物，其进一步包含农业上可接受的载体。
27.如权利要求25所述的组合物，其进一步包含除草剂化合物、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀线虫剂、农业上可接受的载体、和/或细菌，或其组合。
28.如权利要求25或27所述的组合物，其中所述组合物呈液体形式、固体形式或凝胶形式。
29.如权利要求25所述的组合物，其中所述组合物是固体形式。
30.如权利要求29所述的组合物，其中所述固体形式是丸剂、粉末、聚集体或模制物品。
31.一种植物细胞，其基因组中稳定地并入了编码沉默元件的异源多核苷酸，其中所述多核苷酸包含：
(a)包含SEQ ID NO：1-49中任一者的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；
(b)与核苷酸SEQ ID NO：1-49中任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或
(c)包含SEQ ID NO：1-49中任一者的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；
其中所述沉默元件对植物有害生物具有杀昆虫活性。
32.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述昆虫植物有害生物是鞘翅目植物有害生物。
33.如权利要求32所述的植物细胞，其中所述鞘翅目植物有害生物是叶甲属植物有害生物。
34.如权利要求33所述的植物细胞，其中所述叶甲属植物有害生物包括玉米根萤叶甲、墨西哥玉米根虫、南美叶甲、巴氏根叶甲、墨西哥玉米根虫、或黄瓜十一星叶甲。
35.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述鞘翅目植物有害生物是条跳甲属
(Phyllotreta)植物有害生物。
36.如权利要求35所述的植物细胞，其中条跳甲属植物有害生物是黄曲条跳甲
(Phyllotreta striolata)。
37.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述鞘翅目植物有害生物是瘦跗叶甲属
(Leptinotarsa)植物有害生物。
38.如权利要求37所述的植物细胞，其中瘦跗叶甲属植物有害生物是马铃薯甲虫
(Leptinotarsa decemlineata)。
39.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述昆虫植物有害生物是半翅目植物有害生物。
40.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述昆虫植物有害生物是鳞翅目植物有害生物。
41.如权利要求40所述的植物细胞，其中鳞翅目植物有害生物是草地贪夜蛾、玉米螟、或谷实夜蛾。
42.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述植物细胞包含如权利要求16所述的表达盒。
43.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述沉默元件表达双链RNA。
44.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述沉默元件表达发夹RNA。
45.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述沉默元件可操作地连接至异源启动子。
46.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自单子叶植物。
47.如权利要求46所述的植物细胞，其中所述单子叶植物是玉米、大麦、粟、小麦或稻。
48.如权利要求31所述的植物细胞，其中所述植物细胞来自双子叶植物。
49.如权利要求48所述的植物细胞，其中所述双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、卡诺拉油菜(canola)、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥属植物(Arabidopsis)、或棉花。
50.一种植物或植物部分，其包含如权利要求31所述的植物细胞。
51.一种转基因种子，其来自如权利要求50所述的植物。
52.一种用于防治昆虫植物有害生物的方法，其包括向昆虫植物有害生物饲喂包含沉默元件的组合物，其中所述沉默元件防治所述植物有害生物，其中所述沉默元件包含与以下互补的序列：
(a)包含SEQ ID NO：1-49中任一者的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；
(b)与核苷酸SEQ ID NO：1-49中任一者具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或
(c)包含SEQ ID NO：1-49中任一者的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或
其中所述沉默元件对所述植物有害生物具有杀昆虫活性。
53.如权利要求52所述的方法，其中所述组合物包含其基因组中稳定地并入了编码所述沉默元件的多核苷酸的植物或植物部分。
54.如权利要求52所述的方法，其中所述沉默元件包含双链RNA。
55.如权利要求52所述的方法，其中所述沉默元件包含发夹RNA。
56.如权利要求52所述的方法，其中编码沉默元件的所述多核苷酸可操作地连接至异源启动子。
57.如权利要求52所述的方法，其中沉默元件由多核苷酸编码，其中所述多核苷酸的侧翼是在所述多核苷酸的一个末端处的第一可操作地连接的趋同启动子和在所述多核苷酸的对向末端处的第二可操作地连接的趋同启动子，其中所述第一趋同启动子和所述第二趋同启动子能够驱动所述沉默元件的表达。
58.如权利要求52所述的方法，其中所述沉默元件包含第一区段、第二区段和第三区段，其中
(a)所述第一区段包含至少约19个核苷酸，这些核苷酸与SEQ ID NO：1-49中任一者所示的序列具有至少90％序列互补性；或其变体和片段，及互补序列；
(b)所述第二区段包含足够长的环，以允许所述沉默元件被转录为发夹RNA；并且，(c)所述第三区段包含至少约19个核苷酸，这些核苷酸与所述第一区段具有至少85％互补性。
59.如权利要求58所述的方法，其中所述第三区段与所述第一区段具有至少90％互补性。
60.如权利要求58所述的方法，其中所述第三区段与所述第一区段具有至少95％互补性。
61.如权利要求58所述的方法，其中所述第三区段与所述第一区段具有至少98％互补性。
62.如权利要求58所述的方法，其中所述第一区段与鞘翅目昆虫物种互补；并且其中所述第三区段与不同的鞘翅目昆虫物种互补。
63.如权利要求58所述的方法，其中所述第一区段与半翅目昆虫物种互补；并且其中所述第三区段与不同的半翅目昆虫物种互补。
64.如权利要求58所述的方法，其中所述第一区段与鳞翅目昆虫物种互补；并且其中所述第三区段与不同的鳞翅目昆虫物种互补。
65.如权利要求52所述的方法，其中所述植物是单子叶植物。
66.如权利要求65所述的方法，其中所述单子叶植物是玉米、大麦、粟、小麦或稻。
67.如权利要求52所述的方法，其中所述植物是双子叶植物。
68.如权利要求67所述的方法，其中所述双子叶植物是羽衣甘蓝、花椰菜、西兰花、芥菜植物、卷心菜、豌豆、三叶草、苜蓿、蚕豆、番茄、木薯、大豆、卡诺拉油菜、苜蓿、向日葵、红花、烟草、拟南芥属植物、或棉花。
69.一种试剂盒，其包含如权利要求1-14中任一项所述的沉默元件、如权利要求15所述的DNA构建体、或如权利要求16所述的表达构建体，以及所述沉默元件、所述DNA构建体、或使用所述表达构建体作为对抗植物有害生物的杀昆虫剂的说明书。
70.如权利要求69所述的试剂盒，其包含两种或更多种如权利要求1-14中任一项所述的沉默元件。
71.如权利要求69或70所述的试剂盒，其中所述说明书提供了一种或多种沉默元件的顺序施用，以降低所述昆虫有害生物生物体对所述一种或多种沉默元件产生抗性的发生率。
72.如权利要求69或70所述的试剂盒，其中所述说明书提供了一种或多种沉默元件的同时施用，以降低所述昆虫有害生物生物体对所述一种或多种沉默元件产生抗性的发生率。
73.如权利要求69所述的试剂盒，其中所述昆虫植物有害生物是鞘翅目植物有害生物。
74.如权利要求73所述的试剂盒，其中所述鞘翅目植物有害生物是叶甲属植物有害生物。
75.如权利要求74所述的试剂盒，其中所述叶甲属昆虫有害生物生物体包括玉米根萤叶甲、墨西哥玉米根虫、南美叶甲、巴氏根叶甲、墨西哥玉米根虫、或黄瓜十一星叶甲。
76.如权利要求73所述的试剂盒，其中所述鞘翅目植物有害生物是条跳甲属植物有害生物。
77.如权利要求76所述的试剂盒，其中条跳甲属植物有害生物是黄曲条跳甲。
78.如权利要求73所述的试剂盒，其中所述鞘翅目植物有害生物是瘦跗叶甲属植物有害生物。
79.如权利要求78所述的试剂盒，其中瘦跗叶甲属植物有害生物是马铃薯甲虫。
80.如权利要求69所述的试剂盒，其中所述昆虫植物有害生物为半翅目植物有害生物。
81.如权利要求80所述的试剂盒，其中所述半翅目植物有害生物为无网蚜属
(Acyrthosiphon)、小粉虱属(Bemisia)、褐飞虱属(Nilaparvata)或茶翅蝽属
(Halyomorpha)植物有害生物。
82.如权利要求69所述的试剂盒，其中所述昆虫植物有害生物为鳞翅目植物有害生物。
83.如权利要求82所述的试剂盒，其中鳞翅目植物有害生物为斜纹夜蛾、草地贪夜蛾、玉米螟、或谷实夜蛾。
用以防治昆虫有害生物的组合物和方法
[0002] 与本说明书一起以计算机可读形式提交了序列表，其文件名为“7139USPSP_SequenceList.txt”，创建于2016年6月15日，并且大小为85千字节。该序列表是本说明书的一部分并且以其全文通过引用并入本文。
技术领域
背景技术
[0004] 昆虫植物有害生物是农业中的严重问题。昆虫植物有害生物破坏了数百万英亩的主要作物，如玉米、大豆、豌豆和棉花。每年，仅在美国，昆虫植物有害生物就造成了超过1000亿美元的作物损失。在与昆虫有害生物进行的季节性斗争中，农场主们必须施用数十亿加仑的合成杀有害生物剂来对付这些有害生物。过去采用的其他方法通过微生物或在转基因植物中表达来源于微生物的基因来提供杀昆虫活性。例如，已知芽孢杆菌属
(Bacillus)微生物的某些物种对于广泛范围的昆虫有害生物具有杀有害生物活性，这些昆虫有害生物包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等。事实上，微生物杀有害生物剂，特别是从芽孢杆菌菌株获得的那些微生物杀有害生物剂，在农业上作为有害生物化学防治的替代方案起到重要作用。农业科学家通过对作物植物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀昆虫蛋白，开发出了抗昆虫性增强的作物。例如，经遗传工程改造而产生Cry毒素的玉米和棉花植物(参见例如Aronson(2002)Cell Mol.Life Sci.[细胞与分子生命科学]，59(3)：417-425；Schnepf等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学综述]62(3)：775-806)目前在农业中广泛应用，并给农场主提供了传统昆虫防治方法的替代方案。然而，在一些情况下，这些Bt杀昆虫蛋白可能仅保护植物免受相对较窄范围的有害生物的侵害。不断演变的昆虫抗性也是一个问题(Gassmann等人，(2014)PNAS[美国国家科学院院刊]111(14)：5141-6)。因此，新颖的昆虫防治组合物仍然是所希望的。
(Bacillus)微生物的某些物种对于广泛范围的昆虫有害生物具有杀有害生物活性，这些昆虫有害生物包括鳞翅目(Lepidoptera)、双翅目(Diptera)、鞘翅目(Coleoptera)、半翅目(Hemiptera)等。事实上，微生物杀有害生物剂，特别是从芽孢杆菌菌株获得的那些微生物杀有害生物剂，在农业上作为有害生物化学防治的替代方案起到重要作用。农业科学家通过对作物植物进行遗传工程改造以产生来自芽孢杆菌的杀昆虫蛋白，开发出了抗昆虫性增强的作物。例如，经遗传工程改造而产生Cry毒素的玉米和棉花植物(参见例如Aronson(2002)Cell Mol.Life Sci.[细胞与分子生命科学]，59(3)：417-425；Schnepf等人(1998)Microbiol.Mol.Biol.Rev.[微生物学与分子生物学综述]62(3)：775-806)目前在农业中广泛应用，并给农场主提供了传统昆虫防治方法的替代方案。然而，在一些情况下，这些Bt杀昆虫蛋白可能仅保护植物免受相对较窄范围的有害生物的侵害。不断演变的昆虫抗性也是一个问题(Gassmann等人，(2014)PNAS[美国国家科学院院刊]111(14)：5141-6)。因此，新颖的昆虫防治组合物仍然是所希望的。
发明内容
[0005] 提供了采用一种或多种沉默元件的方法和组合物，在被昆虫植物有害生物(例如鞘翅目、半翅目或鳞翅目植物有害生物，包括叶甲属、瘦跗叶甲属、条跳甲属、无网蚜属、小粉虱属、茶翅蝽属、玉米螟属、草盲蝽属、铃夜蛾属、稻绿蝽属或灰翅夜蛾属植物有害生物)摄取时，所述沉默元件能够降低靶标序列在所述有害生物中的表达。在某些实施例中，靶标序列表达的降低能防治一种或多种有害生物，并且因此这些方法和组合物能够限制对植物的损害。本文描述了如SEQ ID NO.：1-49所示的各种靶标多核苷酸，或其变体或片段，或其互补序列，以上各项调节靶标有害生物RNA中参与间壁连接(septate junction)(更具体地是平滑间壁连接(SSJ))形成的一个或多个序列的表达。还提供了沉默元件，所述沉默元件在被有害生物摄取时，降低这些靶标多核苷酸中的一种或多种的表达水平。进一步提供了编码沉默元件的构建体和包含编码沉默元件的构建体的宿主细胞。还提供了包含编码这些沉默元件的构建体或者其活性变体或片段的植物、植物部分、植物细胞、细菌和其他宿主细胞。还提供了用于局部施用到昆虫有害生物或可能存在昆虫有害生物的基质上的可喷雾沉默剂的制剂。
[0006] 在另一个实施例中，提供了用于防治如下昆虫植物有害生物的方法：例如鞘翅目、半翅目或鳞翅目植物有害生物，包括叶甲属、瘦跗叶甲属、条跳甲属、无网蚜属、小粉虱属、茶翅蝽属、玉米螟属、草盲蝽属、铃夜蛾属、稻绿蝽属或灰翅夜蛾属植物有害生物。所述方法包括向昆虫植物有害生物饲喂包含沉默元件的组合物，其中所述沉默元件在被有害生物摄取时，降低所述有害生物中靶标序列的水平，并且因此防治所述有害生物。进一步提供了保护植物免受昆虫植物有害生物侵害的方法。此类方法包括将所披露的沉默元件引入植物或植物部分中。当表达沉默元件的植物被有害生物摄取时，所述靶标序列的水平降低，使有害生物得以防治。附图说明
[0007] 图1.玉米根虫(CRW)SSJ3多肽序列Dv-ssj3(SEQ ID NO：50)、Dv-ssj3b(SEQ ID NO：51)、Db-ssj3(SEQ ID NO：52)、和Du-ssj3(SEQ ID NO：53)，和黑腹果蝇(Drosophila melanogaster)多肽序列Tsp2A-PA(SEQ ID NO：48)与Tsp2A-PB(SEQ ID NO：49)的序列比对。使用具有默认参数的CLUSTAL W(Zuckerkandl E.和Pauling L.，1965)，获得该比对。*(星号)表示CRW SSJ3氨基酸序列之间共有的同一的氨基酸残基，：(冒号)表示强类似性质的两个氨基酸残基之间的保守性，并且.(句点)表示弱类似性质的两个氨基酸残基之间的保守性。
[0008] 图2.SSJ3直向同源物的进化关系。使用邻接法(Saitou N.和Nei M.，1987)推断进化史。示出了具有分支长度之和＝3.67397181的最佳系统树。系统树按比例绘制，分支长度与用于推断系统树的进化距离的分支长度单位相同。使用泊松校正方法(Zuckerkandl E.和Pauling L.，1965)计算进化距离，并且以每个位点的氨基酸取代数为单位。分析涉及24个氨基酸序列。所有包含缺口和缺失数据的位置都被淘汰。最终数据集共有151个位置。进化分析在MEGA7中进行(Kumar S.，Stecher G.，和Tamura K.，2015)。
[0009] 图3.Dv-SSJ3的表达构建体。
具体实施方式
[0010] 如本文所用，单数形式“一个/种(a/an)”以及“该”包括复数个指示物，除非上下文中另外明确指明。因此，例如，提及“细胞”包括多个这样的细胞，并且提及“蛋白质”包括本领域技术人员已知的一种或多种蛋白质及其等同物等。本文使用的所有技术和科学术语具有与本发明所属领域的普通技术人员通常理解的相同的含义，除非另有明确说明。
[0011] I.概述
[0012] 提供了采用一种或多种沉默元件的方法和组合物，在被昆虫植物有害生物(例如鞘翅目、半翅目或鳞翅目植物有害生物，包括叶甲属、瘦跗叶甲属、条跳甲属、无网蚜属、小粉虱属、茶翅蝽属、玉米螟属、草盲蝽属、铃夜蛾属、稻绿蝽属或灰翅夜蛾属植物有害生物)摄取时，所述沉默元件能够降低靶标序列在所述有害生物中的表达。本文披露了如SEQ ID NO.：1-49中所示的靶标多核苷酸、或其变体和片段、及其互补序列。提供了包含这些靶标多核苷酸的序列、互补序列、活性片段或变体的沉默元件，该沉默元件在被有害生物摄取或与有害生物接触时降低该靶标序列中的一者或多者的表达，并且从而防治有害生物。在一些实施例中，提供了包含编码沉默元件的多核苷酸的转基因植物，当所述转基因植物被有害生物摄取或与有害生物接触时降低所述靶标序列中的一者或多者的表达，并且从而防治有害生物。
[0013] 在一个实施例中，提供了采用包含至少一个双链RNA区域的沉默元件的组合物和方法，所述双链RNA区域的至少一条链包含与以下互补的多核苷酸：(a)包含在靶标有害生物中表达的RNA转录物序列的核苷酸序列，其中沉默元件对昆虫植物有害生物具有杀昆虫活性；或其变体和片段，以及所述核苷酸序列的互补序列；(b)包含与所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或者(c)包含所述核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；其中所述多核苷酸编码沉默元件，其中所述沉默元件对昆虫植物有害生物具有杀昆虫活性。
[0014] 在另外的实施例中，提供了采用包含至少一个双链RNA区域的沉默元件的组合物和方法，所述双链RNA区域的至少一条链包含与以下互补的多核苷酸：(a)包含在昆虫植物有害生物中表达的RNA转录物序列的核苷酸序列，其中沉默元件对昆虫植物有害生物具有杀昆虫活性；或其变体和片段，以及所述核苷酸序列的互补序列；(b)包含与所述核苷酸序列具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或者(c)包含所述核苷酸序列的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；其中所述沉默元件对昆虫植物有害生物具有杀昆虫活性。
[0015] 在另一个实施例中，提供了采用包含至少一个双链RNA区域的沉默元件的组合物和方法，所述双链RNA区域的至少一条链包含与以下互补的多核苷酸：(a)包含SEQID NO：1-49中任一项的核苷酸序列或其变体和片段，及其互补序列；(b)与核苷酸SEQ ID NO：1-49中任一项具有至少90％序列同一性的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；或者(c)包含SEQ ID NO：1-49中任一项的至少19个连续核苷酸的核苷酸序列；或其变体和片段，及其互补序列；其中所述沉默元件对昆虫植物有害生物具有杀昆虫活性。
[0016] 在另一个实施例中，提供了采用一种或多种沉默元件的组合物和方法，所述沉默元件靶向编码平滑间壁连接(SSJ)蛋白的多核苷酸。在另外的实施例中，所述一种或多种沉默元件靶向编码SSJ蛋白的多核苷酸，其中编码SSJ蛋白的多核苷酸包含SEQ ID NO：1-49中的任一项。在一个实施例中，SSJ蛋白包含SEQ ID NO.：48-53。在又另一个实施例中，所述一种或多种沉默元件靶向编码SSJ的多核苷酸，其中编码SSJ蛋白包含SEQ ID NO：1-49中的任一项和美国专利申请公开2014/0275208和US 2015/0257389的RyanR和/或HP2靶标序列(SEQ ID NO：561-583、693、和728)。
[0017] 在另一个实施例中，提供了采用编码一种或多种沉默元件的DNA构建体的组合物和方法，所述沉默元件在被有害生物摄取时降低一种或多种靶标多核苷酸的表达水平，并从而防治植物有害生物。在另一个实施例中，还提供了包含编码这些沉默元件的DNA构建体或者其活性变体或片段的植物、植物部分、植物细胞、细菌和其他宿主细胞。
[0018] 如本文所使用的，“对昆虫植物有害生物进行防治”或“防治昆虫植物有害生物”意指使昆虫植物有害生物造成的损害受到限制的、对有害生物的任何影响。防治昆虫植物有害生物包括但不限于杀死该有害生物、抑制该有害生物的发育、改变该有害生物的能育性或生长，以此种方式使该有害生物对植物的损害减小，或以某种方式减少所产生后代的数量、产生适应力较弱的有害生物(包括后代)、产生易受捕食者攻击的有害生物、产生更易受其他杀昆虫蛋白影响的有害生物、或阻止这些有害生物啃食植物。
[0019] 降低有害生物中的靶标多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平使得入侵有害生物被抑制、防治和/或杀死。在一个实施例中，减少有害生物的靶标序列的表达水平将使有害生物损害减少了至少约2％至至少约6％、至少约5％至约50％、至少约10％至约60％、至少约30％至约70％、至少约40％至约80％、或至少约50％至约90％或更高。因此，本文披露的方法可以用于防治有害生物，有害生物包括但不限于鞘翅目昆虫植物有害生物或叶甲属植物有害生物。
[0020] 测量对昆虫植物有害生物的防治的某些测定法通常是本领域已知的，正如用以记录结节损伤评分的方法也是本领域已知的一样。参见，例如，Oleson等人(2005)J.Econ.Entomol.[经济昆虫学杂志]98：1-8。其他测定方法在下面的实例中提供。
[0021] 本文披露的是用于保护植物免受昆虫植物有害生物侵害或诱导植物中的对昆虫植物有害生物(例如鞘翅目植物有害生物或叶甲属植物有害生物或其他昆虫植物有害生物)抗性的组合物和方法。可以靶向的昆虫植物有害生物包括选自如下各目的昆虫：鞘翅目、双翅目、膜翅目、鳞翅目、食毛目、同翅目、半翅目、直翅目、缨翅目、革翅目、等翅目、虱目、蚤目、毛翅目等，特别是鳞翅目和鞘翅目。
[0022] 本领域技术人员将认识到，并非所有组合物对所有有害生物都同样有效。披露的组合物(包括本文披露的沉默元件)显示出抗昆虫植物有害生物活性，该昆虫植物有害生物可以包括经济上重要的农艺、森林、温室、苗圃观赏植物、食物和纤维、公共和动物健康、家庭和商业结构、家用和储存产品有害生物。
[0023] 如本文所使用的，“鞘翅目植物有害生物”用于指鞘翅目的任何成员。可以通过本文披露的方法和组合物进行靶向的其他昆虫植物有害生物包括但不限于墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis)、西方玉米根虫(玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera
virgifera))、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctata))、北方玉米根虫(巴氏根叶甲(Diabrotica Barberi))、和科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯甲虫
(Leptinotarsa decemlineata))。
virgifera))、南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲(Diabrotica undecimpunctata))、北方玉米根虫(巴氏根叶甲(Diabrotica Barberi))、和科罗拉多马铃薯甲虫(马铃薯甲虫
(Leptinotarsa decemlineata))。
[0024] 如本文所使用的，术语“叶甲属植物有害生物”是指叶甲属的任何成员。因此，这些组合物和方法也可用于保护植物免受任何叶甲属植物有害生物的侵害，该叶甲属植物有害生物包括，例如，柠条叶甲(Diabrotica adelpha)；梅卡叶甲(Diabrotica amecameca)；黄瓜条叶甲(Diabrotica balteata)；北方玉米根虫(巴氏根叶甲)；双环叶甲(Diabrotica biannularis)；冠叶甲(Diabrotica cristata)；十星叶甲(Diabrotica dcempunctata)；异色叶甲(Diabrotica dissimilis)；纽带叶甲(Diabrotica lemniscata)；小拟叶甲(Diabrotica limitata)(包括，例如，十五星小拟叶甲(Diabrotica limitata
quindecimpuncata))；长角叶甲(Diabrotica longicornis)；钱币状叶甲(Diabrotica nummularis)；中空叶甲(Diabrotica porracea)；棘角叶甲(Diabrotica scutellata)；六斑叶甲(Diabrotica sexmaculata)；南美叶甲(Diabrotica speciosa)(包括，例加，
Diabrotica speciosa speciosa)；胫叶甲(Diabrotica tibialis)；黄瓜十一星叶甲
(Diabrotica undecimpunctata)(包括，例如南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲)，Diabrotica undecimpunctata duodecimnotata；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica
undecimpunctata howardi)(斑点黄瓜甲虫(spotted cucumber beetle))；西方斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata，western spotted cucumber
beetle)；玉米根虫(Diabrotica virgifera)(包括，例如，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)(西方玉米根虫(western corn rootworm))和墨西哥玉米根虫
(Diabrotica virgifera zeae，Mexican corn rootworm))；绿叶甲(Diabrotica
viridula)；芜菁叶甲(Diabrotica wartensis)；叶甲属物种JJG335；叶甲属物种JJG336；叶甲属物种JJG341；叶甲属物种JJG356；叶甲属物种JJG362；如叶甲属物种JJG365。
quindecimpuncata))；长角叶甲(Diabrotica longicornis)；钱币状叶甲(Diabrotica nummularis)；中空叶甲(Diabrotica porracea)；棘角叶甲(Diabrotica scutellata)；六斑叶甲(Diabrotica sexmaculata)；南美叶甲(Diabrotica speciosa)(包括，例加，
Diabrotica speciosa speciosa)；胫叶甲(Diabrotica tibialis)；黄瓜十一星叶甲
(Diabrotica undecimpunctata)(包括，例如南方玉米根虫(黄瓜十一星叶甲)，Diabrotica undecimpunctata duodecimnotata；黄瓜十一星叶甲食根亚种(Diabrotica
undecimpunctata howardi)(斑点黄瓜甲虫(spotted cucumber beetle))；西方斑点黄瓜甲虫(Diabrotica undecimpunctata undecimpunctata，western spotted cucumber
beetle)；玉米根虫(Diabrotica virgifera)(包括，例如，玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera)(西方玉米根虫(western corn rootworm))和墨西哥玉米根虫
(Diabrotica virgifera zeae，Mexican corn rootworm))；绿叶甲(Diabrotica
viridula)；芜菁叶甲(Diabrotica wartensis)；叶甲属物种JJG335；叶甲属物种JJG336；叶甲属物种JJG341；叶甲属物种JJG356；叶甲属物种JJG362；如叶甲属物种JJG365。
[0025] 在某些实施例中，叶甲属植物有害生物包含玉米根萤叶甲(D.virgifera virgifera)、巴氏根叶甲(D.barberi)、墨西哥玉米根虫(D.virgifera zeae)、南美叶甲(D.speciosa)或黄瓜十一星叶甲(D.undecimpunctata)。
[0026] 鳞翅目幼虫包括但不限于：夜蛾科(Noctuidae)中的粘虫、地老虎、尺蠖，草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda JE Smith)(秋粘虫(fall armyworm))；甜菜夜蛾(S.exigua Hübner，beet armyworm)；斜纹夜蛾(S.litura Fabricius，tobacco cutworm，cluster caterpillar)；蓓带夜蛾(Mamestra configurata Walker)(披肩粘虫(bertha armyworm))；甘蓝夜蛾(M.brassicae Linnaeus，cabbage moth)；小地老虎(Agrotis ipsilon Hufnagel，black cutworm)；地老虎(A.orthogonia Morrison)(西方地老虎
(western cutworm))；A.subterranea Fabricius(颗粒状地老虎(granulate cutworm))；
棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea Hübner)(棉叶虫(cotton leaf worm))；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner，cabbage looper)；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)(大豆夜蛾(soybean looper))；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner，
velvetbean caterpillar)；粗长须夜蛾(Hypena scabra Fabricius)(苜蓿绿夜蛾(green cloverworm))；烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)(烟草夜蛾(tobacco
budworm))；一星粘虫(Pseudaletia unipuncta Haworth)(粘虫(armyworm))；Athetis mindara Barnes&Mcdunnough(粗皮地老虎(rough skinned cutworm))；暗缘地老虎(Euxoa messoria Harris)(暗缘切根虫(darksided cutworm))；棉斑实蛾(Earias insulana
Boisduval)(多刺螟蛉(spiny bollworm))；翠纹钻夜蛾(E.vittella Fabricius)(斑点螟蛉(spotted bollworm))；棉铃虫(Helicoverpa armigera Hüibner)(美洲螟蛉(American bollworm))；玉米穗虫(玉米穗蛾(corn earworm)或棉螟蛉(cotton bollworm))；斑马纹夜蛾(Melanchra picta Harris)(斑马毛虫(zebra caterpillar))；柑橘夜蛾(Egira
(Xylomyges)curialis Grote)(柑橘地老虎(citrus cutworm))；来自螟蛾科玉米螟
(Ostrinia nubilalis Hübner，欧洲玉米螟(European corn borer))的螟虫、鞘蛾、结网虫、锥形虫(coneworms)、和雕叶虫(skeletonizers)；脐橙螟蛾(Amyelois transitella Walker)(脐橙螟(naval orangeworm))；地中海粉螟(Anagasta kuehniella Zeller)(地中海粉斑螟(Mediterranean flour moth))；干果斑螟(Cadra cautella Walker)(粉斑螟(almond moth))；二化螟(Chilo suppressalis Walker)(水稻螟虫(rice stem borer))；
斑禾草螟(C.partellus)，(高粱螟(sorghum borer))；米螟(Corcyra cephalonica
Stainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟(Crambus caliginosellus Clemens)(玉米根结网虫(corn root webworm))；早熟禾草螟(Crambus teterrellus Zincken)(早熟禾结网虫(bluegrass webworm))；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée，rice leaf roller)；葡萄野螟(Desmia funeralis Hüibner)(葡萄甘薯麦蛾(grape leaffolder))；绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)(瓜虫(melon worm))；黄瓜绢野螟(D.llidis
Stoll)(泡菜虫(pickleworm))；巨座玉米螟(Diatraea grandiosella Dyar)(西南玉米秆草螟(southwestern corn borer))、蔗螟(D.saccharalis Fabricius)(甘蔗螟虫
(surgarcane borer))；墨西哥稻螟(Eoreuma loftini Dyar，Mexican rice borer)；烟草粉斑螟(Ephestia elutella Hübner)(烟草飞蛾(tobacco (cacao)moth))；大蜡螟
(Galleria mellonella Linnaeus)(大蜡蛾(greater wax moth))；水稻切叶野螟
(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地螟(sod webworm))；向日葵同斑螟
(Homoeosoma electellum Hulst)(向日葵螟(sunflower moth))；南美玉米苗斑螟
(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)(小蜡蛾(lesser wax moth))；草地螟(Loxostege
sticticalis Linnaeus，beet webworm)；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker)(茶树结网蛾(tea tree web moth))；豆荚野螟(Maruca testulalis Geyer)(豆荚蛀螟(bean pod borer))；印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner，Indian meal moth)；三化螟
(Scirpophaga incertulas Walker，yellow stem borer)；温室螟(Udea rubigalis Guenée)(芹菜卷叶螟(celery leaftier))；和卷蛾科(Tortricidae)中的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana Walsingham)(西部黑头蚜虫(Western blackheaded budworm))；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)(东部黑头蚜虫
(Eastern blackheaded budworm))；果树黄卷蛾(Archips argyrospila Walker)(果树卷叶蛾(fruit tree leafroller))；罗萨娜黄卷蛾(A.rosana Linnaeus)(欧洲卷叶蛾
(European leaf roller))；和其他黄卷蛾属物种，苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana
Fischer von )(苹果小卷蛾(summer fruit tortrix moth))；条纹向日葵
螟(Cochylis hospes Walsingham)(带状向日葵斑蛾(banded sunflower moth))；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham)(filbertworm)；苹果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus)(苹果蚕蛾(codling moth))；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana Clemens)(色稻纵卷叶螟(variegated leafroller))；荷兰石竹小卷蛾(P.stultana Walsingham)(杂食卷叶蛾
(omnivorous leafroller))；鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)(欧洲葡萄蛾(European grape vine moth))；苹白小卷蛾(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller)(苹果芽小卷叶蛾(eyespotted bud moth))；萄果实虫主虫(Endopiza viteana Clemens)(葡萄小卷叶蛾(grape berry moth))；女贞细卷蛾(Eupoecilia
ambiguella Hübner)(葡萄果蠹蛾(vine moth))；巴西苹果卷叶虫(Bonagota salubricola Meyrick)(巴西苹果小卷叶蛾(Brazilian apple leafroller))；东方果实蛾(Grapholita molesta Busck)(梨小食心虫(oriental fruit moth))；向日葵芽蛾(Suleima
helianthana Riley，sunflower bud moth)；带卷蛾属物种(Argyrotaenia spp.)；卷叶蛾属物种(Choristoneura spp.)。
(western cutworm))；A.subterranea Fabricius(颗粒状地老虎(granulate cutworm))；
棉叶波纹夜蛾(Alabama argillacea Hübner)(棉叶虫(cotton leaf worm))；粉纹夜蛾(Trichoplusia ni Hübner，cabbage looper)；大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)(大豆夜蛾(soybean looper))；黎豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hübner，
velvetbean caterpillar)；粗长须夜蛾(Hypena scabra Fabricius)(苜蓿绿夜蛾(green cloverworm))；烟芽夜蛾(Heliothis virescens Fabricius)(烟草夜蛾(tobacco
budworm))；一星粘虫(Pseudaletia unipuncta Haworth)(粘虫(armyworm))；Athetis mindara Barnes&Mcdunnough(粗皮地老虎(rough skinned cutworm))；暗缘地老虎(Euxoa messoria Harris)(暗缘切根虫(darksided cutworm))；棉斑实蛾(Earias insulana
Boisduval)(多刺螟蛉(spiny bollworm))；翠纹钻夜蛾(E.vittella Fabricius)(斑点螟蛉(spotted bollworm))；棉铃虫(Helicoverpa armigera Hüibner)(美洲螟蛉(American bollworm))；玉米穗虫(玉米穗蛾(corn earworm)或棉螟蛉(cotton bollworm))；斑马纹夜蛾(Melanchra picta Harris)(斑马毛虫(zebra caterpillar))；柑橘夜蛾(Egira
(Xylomyges)curialis Grote)(柑橘地老虎(citrus cutworm))；来自螟蛾科玉米螟
(Ostrinia nubilalis Hübner，欧洲玉米螟(European corn borer))的螟虫、鞘蛾、结网虫、锥形虫(coneworms)、和雕叶虫(skeletonizers)；脐橙螟蛾(Amyelois transitella Walker)(脐橙螟(naval orangeworm))；地中海粉螟(Anagasta kuehniella Zeller)(地中海粉斑螟(Mediterranean flour moth))；干果斑螟(Cadra cautella Walker)(粉斑螟(almond moth))；二化螟(Chilo suppressalis Walker)(水稻螟虫(rice stem borer))；
斑禾草螟(C.partellus)，(高粱螟(sorghum borer))；米螟(Corcyra cephalonica
Stainton)(米蛾(rice moth))；玉米根草螟(Crambus caliginosellus Clemens)(玉米根结网虫(corn root webworm))；早熟禾草螟(Crambus teterrellus Zincken)(早熟禾结网虫(bluegrass webworm))；稻纵卷叶螟(Cnaphalocrocis medinalis Guenée，rice leaf roller)；葡萄野螟(Desmia funeralis Hüibner)(葡萄甘薯麦蛾(grape leaffolder))；绢野螟(Diaphania hyalinata Linnaeus)(瓜虫(melon worm))；黄瓜绢野螟(D.llidis
Stoll)(泡菜虫(pickleworm))；巨座玉米螟(Diatraea grandiosella Dyar)(西南玉米秆草螟(southwestern corn borer))、蔗螟(D.saccharalis Fabricius)(甘蔗螟虫
(surgarcane borer))；墨西哥稻螟(Eoreuma loftini Dyar，Mexican rice borer)；烟草粉斑螟(Ephestia elutella Hübner)(烟草飞蛾(tobacco (cacao)moth))；大蜡螟
(Galleria mellonella Linnaeus)(大蜡蛾(greater wax moth))；水稻切叶野螟
(Herpetogramma licarsisalis Walker)(草地螟(sod webworm))；向日葵同斑螟
(Homoeosoma electellum Hulst)(向日葵螟(sunflower moth))；南美玉米苗斑螟
(Elasmopalpus lignosellus Zeller)(小玉米茎蛀虫(lesser cornstalk borer))；小蜡螟(Achroia grisella Fabricius)(小蜡蛾(lesser wax moth))；草地螟(Loxostege
sticticalis Linnaeus，beet webworm)；茶树螟(Orthaga thyrisalis Walker)(茶树结网蛾(tea tree web moth))；豆荚野螟(Maruca testulalis Geyer)(豆荚蛀螟(bean pod borer))；印度谷螟(Plodia interpunctella Hübner，Indian meal moth)；三化螟
(Scirpophaga incertulas Walker，yellow stem borer)；温室螟(Udea rubigalis Guenée)(芹菜卷叶螟(celery leaftier))；和卷蛾科(Tortricidae)中的卷叶虫、蚜虫、种实虫以及果实虫，西部黑头长翅卷蛾(Acleris gloverana Walsingham)(西部黑头蚜虫(Western blackheaded budworm))；东部黑头长翅卷蛾(A.variana Fernald)(东部黑头蚜虫
(Eastern blackheaded budworm))；果树黄卷蛾(Archips argyrospila Walker)(果树卷叶蛾(fruit tree leafroller))；罗萨娜黄卷蛾(A.rosana Linnaeus)(欧洲卷叶蛾
(European leaf roller))；和其他黄卷蛾属物种，苹小卷叶蛾(Adoxophyes orana
Fischer von )(苹果小卷蛾(summer fruit tortrix moth))；条纹向日葵
螟(Cochylis hospes Walsingham)(带状向日葵斑蛾(banded sunflower moth))；榛小卷蛾(Cydia latiferreana Walsingham)(filbertworm)；苹果蠹蛾(C.pomonella Linnaeus)(苹果蚕蛾(codling moth))；杂色卷叶蛾(Platynota flavedana Clemens)(色稻纵卷叶螟(variegated leafroller))；荷兰石竹小卷蛾(P.stultana Walsingham)(杂食卷叶蛾
(omnivorous leafroller))；鲜食葡萄小卷蛾(Lobesia botrana Denis&Schiffermüller)(欧洲葡萄蛾(European grape vine moth))；苹白小卷蛾(Spilonota ocellana Denis&Schiffermüller)(苹果芽小卷叶蛾(eyespotted bud moth))；萄果实虫主虫(Endopiza viteana Clemens)(葡萄小卷叶蛾(grape berry moth))；女贞细卷蛾(Eupoecilia
ambiguella Hübner)(葡萄果蠹蛾(vine moth))；巴西苹果卷叶虫(Bonagota salubricola Meyrick)(巴西苹果小卷叶蛾(Brazilian apple leafroller))；东方果实蛾(Grapholita molesta Busck)(梨小食心虫(oriental fruit moth))；向日葵芽蛾(Suleima
helianthana Riley，sunflower bud moth)；带卷蛾属物种(Argyrotaenia spp.)；卷叶蛾属物种(Choristoneura spp.)。
[0027] 在鳞翅目中选择的其他农艺学有害生物包括但不限于秋星尺蠖(Alsophila pometaria Harris，fall cankerworm)；桃蚜蛾(Anarsia lineatella Zeller)(桃条麦蛾(peach twig borer))；栎橙纹犀额蛾(Anisota senatoria J.E.Smith)(橙色斑纹橡木虫(orange striped oakworm))；柞蚕(Antheraea pernyi Guérin-Méneville)(中国橡树柞蛾(Chinese Oak Tussah Moth))；家蚕(Bombyx mori Linnaeus)(桑蚕(Silkworm))；棉潜蛾(Bucculatrix thurberiella Busck)(棉叶潜蛾(cotton leaf perforator))；纹黄豆粉蝶(Colias eurytheme Boisduval)(苜蓿粉蝶(alfalfa caterpillar))；核桃舟蛾(Datana integerrima Grote&Robinson)(胡桃毛虫(walnut caterpillar))；西伯利亚松毛虫
(Dendrolimus sibirieus Tschetwerikov)(西伯利亚丝蛾(Siberian silk moth))，
Ennomos subsignaria Hübner(榆树尺蠖(elm spanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(椴尺蠖(linden looper))；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guérin-Méneville)(野棉花夜蛾(grapeleaf skeletonizer))；行列半白大蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(山脉毛虫(range caterpillar))；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury，fall webworm)；番茄茎麦蛾(Keiferia lycopersicella Walsingham)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；铁杉尺蠖
(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)(东部铁杉尺蠖(Eastern hemlock
looper))；西部铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)((西方铁杉尺蠖(Western hemlock looper))；毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(柳毒蛾(satin moth))；舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus，gypsy moth)；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata
Haworth)(五点天蛾(five spotted hawk moth)，番茄天蛾(tomato hornworm))；烟草天蛾(M.sexta Haworth)(番茄天蛾(tomato hornworm)，烟草天蛾(tobacco hornworm))；冬尺蠖蛾(Operophtera brumata Linnaeus，winter moth)；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck，spring cankerworm)；美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontes Cramer)(大黄带凤蝶(giant swallowtail)，柑桔凤蝶(orange dog))；加州木角斗蛾(Phryganidia
californica Packard)(加州槲蛾(California oakworm))；柑桔潜蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)(柑桔潜叶蛾(citrus leafminer))；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius)(斑点幕型潜叶虫(spotted tentiform leafminer))；欧洲粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大白粉蝶(large white butterfly))；菜青虫(P.rapae Linnaeus)(小菜粉蝶(small white butterfly))；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(绿色纹理粉蝶(green veined white butterfly))；洋蓟葱羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)(洋蓟羽蛾(artichoke plume moth))；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus，diamondback moth)；红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella Saunders)(棉红铃虫(pink bollworm))；多形云粉蝶(Pontia protodice Boisduval and Leconte)(南方菜青虫
(Southern cabbageworm))；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenée，omnivorous
looper)；红抚天社蛾(Schizura concinna J.E.Smith)(红疣天社蛾(red humped
caterpillar))；麦蛾(Sitotroga cerealella Olivier，Angoumois grain moth)；松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller)(松树列队毛虫(pine processionary caterpillar))；幕谷蛾(Tineola bisselliella Hummel)(织带衣蛾(webbing
clothesmoth))；番茄斑潜蝇(Tuta absoluta Meyrick)(番茄潜叶虫(tomato
leafminer))；苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus)(巢蛾(ermine moth))；实夜蛾(Heliothis subflexa Guenée)；天幕毛虫属(Malacosoma)物种和古毒蛾属(Orgyia)物种。
(Dendrolimus sibirieus Tschetwerikov)(西伯利亚丝蛾(Siberian silk moth))，
Ennomos subsignaria Hübner(榆树尺蠖(elm spanworm))；菩提尺蠖(Erannis tiliaria Harris)(椴尺蠖(linden looper))；黄毒蛾(Euproctis chrysorrhoea Linnaeus)(棕尾毒蛾(browntail moth))；黑拟蛉蛾(Harrisina americana Guérin-Méneville)(野棉花夜蛾(grapeleaf skeletonizer))；行列半白大蚕蛾(Hemileuca oliviae Cockrell)(山脉毛虫(range caterpillar))；美国白蛾(Hyphantria cunea Drury，fall webworm)；番茄茎麦蛾(Keiferia lycopersicella Walsingham)(番茄蛲虫(tomato pinworm))；铁杉尺蠖
(Lambdina fiscellaria fiscellaria Hulst)(东部铁杉尺蠖(Eastern hemlock
looper))；西部铁杉尺蠖(L.fiscellaria lugubrosa Hulst)((西方铁杉尺蠖(Western hemlock looper))；毒蛾(Leucoma salicis Linnaeus)(柳毒蛾(satin moth))；舞毒蛾(Lymantria dispar Linnaeus，gypsy moth)；番茄天蛾(Manduca quinquemaculata
Haworth)(五点天蛾(five spotted hawk moth)，番茄天蛾(tomato hornworm))；烟草天蛾(M.sexta Haworth)(番茄天蛾(tomato hornworm)，烟草天蛾(tobacco hornworm))；冬尺蠖蛾(Operophtera brumata Linnaeus，winter moth)；春尺蠖(Paleacrita vernata Peck，spring cankerworm)；美洲大芷凤蝶(Papilio cresphontes Cramer)(大黄带凤蝶(giant swallowtail)，柑桔凤蝶(orange dog))；加州木角斗蛾(Phryganidia
californica Packard)(加州槲蛾(California oakworm))；柑桔潜蛾(Phyllocnistis citrella Stainton)(柑桔潜叶蛾(citrus leafminer))；斑幕潜叶蛾(Phyllonorycter blancardella Fabricius)(斑点幕型潜叶虫(spotted tentiform leafminer))；欧洲粉蝶(Pieris brassicae Linnaeus)(大白粉蝶(large white butterfly))；菜青虫(P.rapae Linnaeus)(小菜粉蝶(small white butterfly))；暗脉菜粉蝶(P.napi Linnaeus)(绿色纹理粉蝶(green veined white butterfly))；洋蓟葱羽蛾(Platyptilia carduidactyla Riley)(洋蓟羽蛾(artichoke plume moth))；小菜蛾(Plutella xylostella Linnaeus，diamondback moth)；红铃麦蛾(Pectinophora gossypiella Saunders)(棉红铃虫(pink bollworm))；多形云粉蝶(Pontia protodice Boisduval and Leconte)(南方菜青虫
(Southern cabbageworm))；杂食尺蠖(Sabulodes aegrotata Guenée，omnivorous
looper)；红抚天社蛾(Schizura concinna J.E.Smith)(红疣天社蛾(red humped
caterpillar))；麦蛾(Sitotroga cerealella Olivier，Angoumois grain moth)；松异带蛾(Thaumetopoea pityocampa Schiffermuller)(松树列队毛虫(pine processionary caterpillar))；幕谷蛾(Tineola bisselliella Hummel)(织带衣蛾(webbing
clothesmoth))；番茄斑潜蝇(Tuta absoluta Meyrick)(番茄潜叶虫(tomato
leafminer))；苹果巢蛾(Yponomeuta padella Linnaeus)(巢蛾(ermine moth))；实夜蛾(Heliothis subflexa Guenée)；天幕毛虫属(Malacosoma)物种和古毒蛾属(Orgyia)物种。
[0028] 引人关注的是鞘翅目的幼虫和成虫，包括来自长角象虫科、豆象科和象甲科的象鼻虫，包括但不限于：墨西哥棉铃象(Anthonomus grandis Boheman)(棉铃象甲(boll weevil))；稻水象甲(Lissorhoptrus oryzophilus Kuschel，rice water weevil)；谷象鼻虫(Sitophilus granarius Linnaeus)(谷象(granary weevil))；稻象虫(S.oryzae Linnaeus，rice weevil)；三叶草叶象(Hypera punctata Fabricius)(车轴草叶象虫
(clover leaf weevil))；密点细枝象(Cronrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stem weevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红色葵花籽象鼻虫(red sunflower seed weevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seed weevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis Chittenden)(玉米象虫(maize billbug))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(科罗拉多马铃薯甲虫)；玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫(western corn rootworm))；巴氏根叶甲(D.barberi Smith and Lawrence，北方玉米根虫)；斑点黄瓜甲虫(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern corn rootworm))；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer，corn flea beetle)；十字花科条跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze或Crueifer flea beetle)；黄曲条跳甲
(Phyllotreta striolata或stripped flea beetle)；肖叶甲褐斑(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲(grape colaspis))；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷物叶甲(cereal leafbeetle))；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius，sunflower beetle)；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis Mulsant或Mexican bean beetle)；金龟子和来自金龟子科
(Scarabaeidae)的其他甲虫，包括但不限于：日本丽金龟(Popillia japonica Newman)(日本甲虫)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow)(北方独角仙(northern
masked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculata Olivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(European chafer))；具毛鳃角金龟(Phyllophaga crinita Burmeister)(蛴螬(white grub))；胡萝卜甲虫(Ligyrus gibbosus De Geer，carrot beetle)；来自皮蠹科的红缘皮蠹(carpet beetle)；来自叩甲科(Elateridae)、伪金针虫属物种(Eleodes spp.)、梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)的金针虫；宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)；叩甲属物种(Limonius spp.)；缺隆叩甲属(Agriotes spp.)；
特尼塞拉属(Ctenicera spp.)；埃俄罗斯属(Aeolus spp.)；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫和来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。
(clover leaf weevil))；密点细枝象(Cronrocopturus adspersus LeConte)(向日葵茎象鼻虫(sunflower stem weevil))；黄褐小爪象(Smicronyx fulvus LeConte)(红色葵花籽象鼻虫(red sunflower seed weevil))；灰色小爪象(S.sordidus LeConte)(灰葵花籽象甲(gray sunflower seed weevil))；玉米隐啄象(Sphenophorus maidis Chittenden)(玉米象虫(maize billbug))；叶甲科(Chrysomelidae)的跳甲、黄瓜叶甲、根虫、叶甲、马铃薯叶甲以及潜叶虫，包括但不限于：马铃薯叶甲(Leptinotarsa decemlineata Say)(科罗拉多马铃薯甲虫)；玉米根萤叶甲(Diabrotica virgifera virgifera LeConte)(西方玉米根虫(western corn rootworm))；巴氏根叶甲(D.barberi Smith and Lawrence，北方玉米根虫)；斑点黄瓜甲虫(D.undecimpunctata howardi Barber)(南方玉米根虫(southern corn rootworm))；玉米跳甲(Chaetocnema pulicaria Melsheimer，corn flea beetle)；十字花科条跳甲(Phyllotreta cruciferae Goeze或Crueifer flea beetle)；黄曲条跳甲
(Phyllotreta striolata或stripped flea beetle)；肖叶甲褐斑(Colaspis brunnea Fabricius)(葡萄肖叶甲(grape colaspis))；橙足负泥虫(Oulema melanopus Linnaeus)(谷物叶甲(cereal leafbeetle))；向日葵叶甲(Zygogramma exclamationis Fabricius，sunflower beetle)；来自瓢虫科(Coccinellidae)的甲虫(包括但不限于：墨西哥豆瓢虫(Epilachna varivestis Mulsant或Mexican bean beetle)；金龟子和来自金龟子科
(Scarabaeidae)的其他甲虫，包括但不限于：日本丽金龟(Popillia japonica Newman)(日本甲虫)；北方圆头犀金龟(Cyclocephala borealis Arrow)(北方独角仙(northern
masked chafer)，白蛴螬(white grub))；南方圆头犀金龟(C.immaculata Olivier)(南方独角仙(southern masked chafer)，白蛴螬(white grub))；欧洲切根鳃金龟(Rhizotrogus majalis Razoumowsky)(欧洲金龟子(European chafer))；具毛鳃角金龟(Phyllophaga crinita Burmeister)(蛴螬(white grub))；胡萝卜甲虫(Ligyrus gibbosus De Geer，carrot beetle)；来自皮蠹科的红缘皮蠹(carpet beetle)；来自叩甲科(Elateridae)、伪金针虫属物种(Eleodes spp.)、梳爪叩头虫属物种(Melanotus spp.)的金针虫；宽胸金针虫属物种(Conoderus spp.)；叩甲属物种(Limonius spp.)；缺隆叩甲属(Agriotes spp.)；
特尼塞拉属(Ctenicera spp.)；埃俄罗斯属(Aeolus spp.)；来自小蠹科(Scolytidae)的树皮甲虫和来自拟步甲科(Tenebrionidae)的甲虫。
[0029] 目的是双翅目的成虫和未成熟的虫，包括潜叶虫玉米斑潜蝇(Agromyza parvicornis Loew)(玉米斑潜蝇(corn blotch leafminer))；摇蚊科(包括但不限于：高粱瘿蚊(Contarinia sorghicola Coquillett)(高梁瘿蚊(sorghum midge))；黑森瘿蚊
(Mayetiola destructor Say)(黑森蝇(Hessian fly))；麦红吸浆虫(Sitodiplosis
mosellana Géhin)(小麦吸浆虫(wheat midge))；葵花籽蚊(Neolasioptera
murtfeldtiana Felt)，(向日葵籽瘿蚊(sunflower seed midge)))；果蝇(实蝇科
(Tephritidae))、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)(果蝇(frit fllies))；蛆虫(包括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen)(种蝇(seedcorn maggot))；麦地种蝇(D.coarctata Fallen)(麦种蝇(wheat bulb fly))和其他地种蝇属(Delia spp.)，美洲麦秆蝇(Meromyza americana Fitch)(美洲麦秆蝇(wheat stem maggot))；家蝇(Musca
domestica Linnaeus，house flies)；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)、小舍蝇(F.femoralis Stein)(小家蝇(lesser houseflies))；厩螫蝇(Stomoxys calcitrans Linnaeus)(螫蝇(stable flies))；秋家蝇(face flies)、角蝇(horn flies)、丽蝇(blow flies)、金蝇属物种(Chrysomya spp.)；伏蝇属物种(Phormia spp.)和其他蝇状的蝇类有害生物，虻属物种(Tabanus spp.)；肤蝇(bot flies)胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)；狂蝇属物种(Oestrus spp.)；纹皮蝇(cattle grubs)皮蝇属物种(Hypoderma spp.)；鹿虻(deer flies)斑虻属物种(Chrysops spp.)；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)(羊蜱蝇(keds))和其他短角亚目(Brachycera)，蚊子伊蚊属物种(Aedes spp.)；疟蚊属物种(Anopheles spp.)；家蚊属物种(Culex spp.)；黑蝇(black flies)原蚋属物种
(Prosimulium spp.)；蚋属(Simulium spp.)；蠓、沙蝇、眼菌蚊和长角亚目。
(Mayetiola destructor Say)(黑森蝇(Hessian fly))；麦红吸浆虫(Sitodiplosis
mosellana Géhin)(小麦吸浆虫(wheat midge))；葵花籽蚊(Neolasioptera
murtfeldtiana Felt)，(向日葵籽瘿蚊(sunflower seed midge)))；果蝇(实蝇科
(Tephritidae))、瑞典麦秆蝇(Oscinella frit Linnaeus)(果蝇(frit fllies))；蛆虫(包括但不限于：灰地种蝇(Delia platura Meigen)(种蝇(seedcorn maggot))；麦地种蝇(D.coarctata Fallen)(麦种蝇(wheat bulb fly))和其他地种蝇属(Delia spp.)，美洲麦秆蝇(Meromyza americana Fitch)(美洲麦秆蝇(wheat stem maggot))；家蝇(Musca
domestica Linnaeus，house flies)；夏厕蝇(Fannia canicularis Linnaeus)、小舍蝇(F.femoralis Stein)(小家蝇(lesser houseflies))；厩螫蝇(Stomoxys calcitrans Linnaeus)(螫蝇(stable flies))；秋家蝇(face flies)、角蝇(horn flies)、丽蝇(blow flies)、金蝇属物种(Chrysomya spp.)；伏蝇属物种(Phormia spp.)和其他蝇状的蝇类有害生物，虻属物种(Tabanus spp.)；肤蝇(bot flies)胃蝇属物种(Gastrophilus spp.)；狂蝇属物种(Oestrus spp.)；纹皮蝇(cattle grubs)皮蝇属物种(Hypoderma spp.)；鹿虻(deer flies)斑虻属物种(Chrysops spp.)；绵羊虱蝇(Melophagus ovinus Linnaeus)(羊蜱蝇(keds))和其他短角亚目(Brachycera)，蚊子伊蚊属物种(Aedes spp.)；疟蚊属物种(Anopheles spp.)；家蚊属物种(Culex spp.)；黑蝇(black flies)原蚋属物种
(Prosimulium spp.)；蚋属(Simulium spp.)；蠓、沙蝇、眼菌蚊和长角亚目。
[0030] 作为目的昆虫包括了半翅目和同翅目的成体和若虫，例如但不限于：来自球蚜科(Adelgidae)的球蚜、来自盲蝽科(Miridae)的盲蝽、来自蝉科(Cicadidae)的蝉、叶蝉、小绿叶蝉属物种(Empoasca spp.)；来自叶蝉科的，来自菱蜡蝉科(Cixiidae)、青翅飞虱科(Flatidae)、蜡蝉总科(Fulgoroidea)、瓢蜡蝉科(Issidae)和(Delphacidae)的飞虱，来自角蝉科(Membracidae)的角蝉，来自木虱科(Psyllidae)的木虱，来自粉虱科(Aleyrodidae)的粉虱，来自蚜科(Aphididae)的蚜虫，来自根瘤蚜科(Phylloxeridae)的葡萄根瘤蚜，来自粉蚧科(Pseudococcidae)的粉蚧，来自链介壳虫科(Asterolecanidae)、蚧科(Coccidae)、粉蚧科(Dactylopiidae)、盾蚧科(Diaspididae)、绒蚧科(Eriococcidae)、旌介壳虫科(Ortheziidae)、刺葵介壳虫科(Phoenicococcidae)和绵蚧科(Margarodidae)的介壳虫，来自网蝽科的网蝽，来自蝽科(Pentatomidae)的椿象，长蝽(cinch bug)，土长蝽属物种；和来自长蝽科(Lygaeidae)的其他籽长蝽、来自沫蝉科(Cercopidae)的沫蝉、来自缘蝽科(Coreidae)的南瓜缘蝽和来自红蝽科(Pyrrhocotidae)的秋恙螨和棉蝽。
[0031] 来自同翅目的农艺重要成员进一步包括但不限于：豌豆蚜(Acyrthisiphon pisum Harris)(豌豆蚜虫(pea aphid))；黑豆蚜(Aphis craccivora Koch)(豇豆蚜(cowpea aphid))；甜菜蚜(A.fabae Scopoli)(黑豆蚜(black bean aphid))；棉蚜(A.gossypii Glover)(棉蚜虫(cotton aphid，melon aphid))；槐蚜(A.maidiradicis Forbes)(玉米根蚜(corn root aphid))；苹果蚜(A.pomi De Geer，apple aphid)；绣线菊蚜(A.spiraecola Parch，spirea aphid)；茄沟无网蚜(Aulacorthum solani Kaltenbach)(毛地黄蚜虫
(foxglove aphid))；草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii Cockerell)(草莓蚜
(strawberry aphid))；麦双尾蚜(Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko)(俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid))；车前圆尾蚜(Dysaphis plantaginea Paaserini)(红苹果蚜(rosy apple aphid))；苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum Hausmann，woolly apple
aphid)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(菜蚜(cabbage aphid))；大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy)(桃大尾蚜(mealy plum aphid))；萝卜蚜(Lipaphis
erysimi Kaltenbach，turnip aphid)；麦无网蚜(Metopolophium dirrhoduim Walker)(谷物蚜虫(cereal aphid))；马铃薯蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas，potato aphid)；桃蚜(Myzus persicae Sulzer)(桃-马铃薯蚜虫，绿桃蚜虫)；莴苣蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley，lettuce aphid)；瘿绵蚜属物种(Pemphigus spp.)(根蚜(root aphid)和倍蚜(gall aphids))；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch，corn leafaphid)；稻麦蚜
(R.padi Linnaeus)(禾谷缢管蚜(bird cherry-oataphid))；麦二叉蚜(Schizaphis
graminum Rondani，greenbug)；牛鞭草蚜(Sipha flava Forbes)(甘蔗黄蚜(yellow
sugarcane aphid))；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius，English grain aphid)；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton，spotted alfalfa aphid)；茶二叉蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)(黑色柑橘蚜(black citrus aphid)和褐色橘蚜
(T.citricida Kirkaldy)(桔二叉蚜(brown citrus aphid))；球蚜属物种(Adelges spp.)(球蚜(adelgids))；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande)(山胡桃根瘤蚜(pecan phylloxera))；烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)(烟草粉虱(tobacco
whitefly)，甘薯粉虱(sweetpotato whitefly))；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&Perring，silverleaf whitefly)；柑桔粉虱(Dialeurodes citri Ashmead，citrus
whitefly)；结翅白粉虱(Trialeurodes abutiloneus)(带状翅白粉虱(bandedwinged
whitefly)和温室粉虱(T.vaporariorum Westwood)(温室粉虱(greenhouse whitefly))；
马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris)(马铃薯叶蝉(potato leafhopper))；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)(小褐飞虱(smaller brown planthopper))；二点叶蝉(Macrolestes quadrilineatus Forbes)(紫菀叶蝉(aster leafhopper))；黑尾叶蝉
(Nephotettix cinticeps Uhler)(青大叶蝉(green leafhopper))；二条斑黑尾叶蝉
(N.nigropictus )(稻叶蝉(rice leafhopper))；稻褐飞虱(Nilaparvata lugens )
(褐飞虱(brown planthopper))；玉米蜡蝉(Peregrinus maidis Ashmead)(玉米飞虱(com planthopper))；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath，white-backed planthopper)；
稻条背飞虱(Sogatodes orizicola Muir)(稻飞虱(rice delphacid))；苹果白叶蝉
(Typhlocyba pomaria McAtee)(苹白小叶蝉(white apple leafhopper))；葡萄斑叶蝉属物种(Erythroneoura spp.)(葡萄叶蝉(grape leafhopper))；十七年蝉(Magicicada
septendecimLinnaeus)(晚秀蝉(periodical cicada))；吹绵蚧(Icerya purchaseasi Maskell，cottony cushion seale)；梨圆蚧(Quadraspidiotus perniciosus Comstock，San Jose seale)；臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)(桔粉蚧(citrus mealybug))；粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)(其他粉蚧系群)；梨木虱(Cacopsylla pyricola
Foerster，pear psylla)；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead，persimmon psylla)。
(foxglove aphid))；草莓钉蚜(Chaetosiphon fragaefolii Cockerell)(草莓蚜
(strawberry aphid))；麦双尾蚜(Diuraphis noxia Kurdjumov/Mordvilko)(俄罗斯小麦蚜虫(Russian wheat aphid))；车前圆尾蚜(Dysaphis plantaginea Paaserini)(红苹果蚜(rosy apple aphid))；苹果绵蚜(Eriosoma lanigerum Hausmann，woolly apple
aphid)；甘蓝蚜(Brevicoryne brassicae Linnaeus)(菜蚜(cabbage aphid))；大尾蚜(Hyalopterus pruni Geoffroy)(桃大尾蚜(mealy plum aphid))；萝卜蚜(Lipaphis
erysimi Kaltenbach，turnip aphid)；麦无网蚜(Metopolophium dirrhoduim Walker)(谷物蚜虫(cereal aphid))；马铃薯蚜(Macrosiphum euphorbiae Thomas，potato aphid)；桃蚜(Myzus persicae Sulzer)(桃-马铃薯蚜虫，绿桃蚜虫)；莴苣蚜(Nasonovia ribisnigri Mosley，lettuce aphid)；瘿绵蚜属物种(Pemphigus spp.)(根蚜(root aphid)和倍蚜(gall aphids))；玉米蚜(Rhopalosiphum maidis Fitch，corn leafaphid)；稻麦蚜
(R.padi Linnaeus)(禾谷缢管蚜(bird cherry-oataphid))；麦二叉蚜(Schizaphis
graminum Rondani，greenbug)；牛鞭草蚜(Sipha flava Forbes)(甘蔗黄蚜(yellow
sugarcane aphid))；麦长管蚜(Sitobion avenae Fabricius，English grain aphid)；苜蓿斑蚜(Therioaphis maculata Buckton，spotted alfalfa aphid)；茶二叉蚜(Toxoptera aurantii Boyer de Fonscolombe)(黑色柑橘蚜(black citrus aphid)和褐色橘蚜
(T.citricida Kirkaldy)(桔二叉蚜(brown citrus aphid))；球蚜属物种(Adelges spp.)(球蚜(adelgids))；长山核桃根瘤蚜(Phylloxera devastatrix Pergande)(山胡桃根瘤蚜(pecan phylloxera))；烟粉虱(Bemisia tabaci Gennadius)(烟草粉虱(tobacco
whitefly)，甘薯粉虱(sweetpotato whitefly))；银叶粉虱(B.argentifolii Bellows&Perring，silverleaf whitefly)；柑桔粉虱(Dialeurodes citri Ashmead，citrus
whitefly)；结翅白粉虱(Trialeurodes abutiloneus)(带状翅白粉虱(bandedwinged
whitefly)和温室粉虱(T.vaporariorum Westwood)(温室粉虱(greenhouse whitefly))；
马铃薯小绿叶蝉(Empoasca fabae Harris)(马铃薯叶蝉(potato leafhopper))；灰飞虱(Laodelphax striatellus Fallen)(小褐飞虱(smaller brown planthopper))；二点叶蝉(Macrolestes quadrilineatus Forbes)(紫菀叶蝉(aster leafhopper))；黑尾叶蝉
(Nephotettix cinticeps Uhler)(青大叶蝉(green leafhopper))；二条斑黑尾叶蝉
(N.nigropictus )(稻叶蝉(rice leafhopper))；稻褐飞虱(Nilaparvata lugens )
(褐飞虱(brown planthopper))；玉米蜡蝉(Peregrinus maidis Ashmead)(玉米飞虱(com planthopper))；白背飞虱(Sogatella furcifera Horvath，white-backed planthopper)；
稻条背飞虱(Sogatodes orizicola Muir)(稻飞虱(rice delphacid))；苹果白叶蝉
(Typhlocyba pomaria McAtee)(苹白小叶蝉(white apple leafhopper))；葡萄斑叶蝉属物种(Erythroneoura spp.)(葡萄叶蝉(grape leafhopper))；十七年蝉(Magicicada
septendecimLinnaeus)(晚秀蝉(periodical cicada))；吹绵蚧(Icerya purchaseasi Maskell，cottony cushion seale)；梨圆蚧(Quadraspidiotus perniciosus Comstock，San Jose seale)；臀纹粉蚧(Planococcus citri Risso)(桔粉蚧(citrus mealybug))；粉蚧属物种(Pseudococcus spp.)(其他粉蚧系群)；梨木虱(Cacopsylla pyricola
Foerster，pear psylla)；柿木虱(Trioza diospyri Ashmead，persimmon psylla)。
[0032] 来自半翅目的目的农艺重要物种包括但不限于：拟绿蝽(Acrosternum hilare Say)(稻绿蝽(green stink bug))；南瓜缘蝽(Anasa tristis De Geer)(南瓜虫(squash bug))；美洲谷长蝽(Blissus leucopterus leucopterus Say)(麦长蝽(chinch bug))；方翅网蝽(Corythuca gossypii Fabricius)(棉网蝽(cotton lace bug))；番茄蝽(Cyrtopeltis modesta Distant)(番茄虫(tomato bug))；棉蝽(Dysdercus suturellus )(棉红蝽(cotton stainer))；褐臭蝽(Euschistus servus Say，brown
stink bug)；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois)(单斑椿象(one-spotted stink bug))；长蝽属(Graptostethus)物种(果实蝽系群(complex of seed bugs))；叶足松树长蝽(Leptoglossus corculus Say，leaf-footed pine seed bug)；美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois)(牧草盲蝽(tarnished plant bug))；豆荚盲蝽(L.Hesperus Knight)(西方牧草盲蝽(Western tarnished plant bug))；牧草盲蝽
(L.pratensis Linnaeus)(寻常草地虫(common meadow bug))；长毛草盲蝽
(L.rugulipennis Poppius)(欧洲牧草盲蝽(European tarnished plant bug))；长绿盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(苹绿盲蝽(common green capsid))；南方绿椿象
(Nezara viridula Linnaeus)(南方喜绿蝽(southern green stink bug))；美洲稻蝽
(Oebalus pugnax Fabricius)(稻褐蝽(rice stink bug))；马利筋长蝽(Oncopeltus
fasciatus Dallas)(大马利筋长蝽(large milkweed bug))；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)。
stink bug)；一斑臭蝽(E.variolarius Palisot de Beauvois)(单斑椿象(one-spotted stink bug))；长蝽属(Graptostethus)物种(果实蝽系群(complex of seed bugs))；叶足松树长蝽(Leptoglossus corculus Say，leaf-footed pine seed bug)；美洲牧草盲蝽(Lygus lineolaris Palisot de Beauvois)(牧草盲蝽(tarnished plant bug))；豆荚盲蝽(L.Hesperus Knight)(西方牧草盲蝽(Western tarnished plant bug))；牧草盲蝽
(L.pratensis Linnaeus)(寻常草地虫(common meadow bug))；长毛草盲蝽
(L.rugulipennis Poppius)(欧洲牧草盲蝽(European tarnished plant bug))；长绿盲蝽(Lygocoris pabulinus Linnaeus)(苹绿盲蝽(common green capsid))；南方绿椿象
(Nezara viridula Linnaeus)(南方喜绿蝽(southern green stink bug))；美洲稻蝽
(Oebalus pugnax Fabricius)(稻褐蝽(rice stink bug))；马利筋长蝽(Oncopeltus
fasciatus Dallas)(大马利筋长蝽(large milkweed bug))；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)。
[0033] 此外，实施例可以对半翅目有效，如草莓蝽(Calocoris norvegicus Gmelin)(草莓长蝽(strawberry bug))；荒野奥盲蝽(Orthops campestris Linnaeus)；苹果盲蝽(Plesiocoris rugicollis Fallen)(苹盲蝽(apple capsid))；番茄蝽(Cyrtopeltis
modesta Distant)(番茄虫(tomato bug))；黑斑烟盲鋳(Cyrtopeltis notatus Distant)(吸蝇(suckfly))；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter)(水印跳盲蝽
(whitemarked fleahopper))；皂荚蝽(Diaphnocoris chlorionis Say)(皂角蝽
(honeylocust plant bug))；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight)(葱盲蝽(onion plant bug))；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus Say)(快速植食蝽(rapid plant bug))；四线盲蝽
(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(四线叶虫(four-lined plant bug))；小长蝽
(Nysius ericae Schilling)(谷长蝽(false chinch bug))；假麦长蝽(Nysius raphanus Howard)(谷长蝽(false chinch bug))；南方绿椿象(Nezara viridula Linnaeus)(南方喜绿蝽(southern green stink bug))；扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)；缘蝽科
(Coreidae)物种；红蝽科物种(Pyrrhocoridae)；谷蛾科物种(Tinidae)；负子蝽科物种(Blostomatidae)；猎蝽属物种(Reduviidae spp.)和臭虫属物种(Cimicidae spp.)。
modesta Distant)(番茄虫(tomato bug))；黑斑烟盲鋳(Cyrtopeltis notatus Distant)(吸蝇(suckfly))；白斑盲蝽(Spanagonicus albofasciatus Reuter)(水印跳盲蝽
(whitemarked fleahopper))；皂荚蝽(Diaphnocoris chlorionis Say)(皂角蝽
(honeylocust plant bug))；洋葱蝽(Labopidicola allii Knight)(葱盲蝽(onion plant bug))；棉跳盲蝽(Pseudatomoscelis seriatus Reuter，cotton fleahopper)；苜蓿褐盲蝽(Adelphocoris rapidus Say)(快速植食蝽(rapid plant bug))；四线盲蝽
(Poecilocapsus lineatus Fabricius)(四线叶虫(four-lined plant bug))；小长蝽
(Nysius ericae Schilling)(谷长蝽(false chinch bug))；假麦长蝽(Nysius raphanus Howard)(谷长蝽(false chinch bug))；南方绿椿象(Nezara viridula Linnaeus)(南方喜绿蝽(southern green stink bug))；扁盾蝽属物种(Eurygaster spp.)；缘蝽科
(Coreidae)物种；红蝽科物种(Pyrrhocoridae)；谷蛾科物种(Tinidae)；负子蝽科物种(Blostomatidae)；猎蝽属物种(Reduviidae spp.)和臭虫属物种(Cimicidae spp.)。
[0034] 还包括蜱螨目(螨)的成虫和幼虫，如小麦瘤瘿螨(Aceria tosichella Keifer)(小麦卷叶螨(wheat curl mite))；麦岩螨(Petrobia latens Müller)(棕色小麦螨(brown wheat mite))；叶螨科中的蜘蛛螨(spider mite)和红螨(red mite)，苹果全爪螨(Panonychus ulmi Koch)(欧洲红螨(European red mite))；二斑叶螨(Tetranychus
urticae Koch)(二点叶螨(two spotted spider mite))；迈叶螨(T.medanieli McGregor，McDaniel mite)；朱砂虫螨(T.cinnabarinus Boisduval)(胭脂红蜘蛛螨(carmine spider mite))；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski)(草莓蜘蛛螨(strawberry spider mite))；细须螨科中的平螨，短须螨(Brevipalpus lewisi McGregor)(柑橘平螨(citrus flat mite))；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱。肩突硬蜱(Ixodes scapularis Say)(鹿蜱(deer tick))；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)(澳大利亚麻痹蜱(Australian paralysis tick))；变异革蜱(Dermacentor variabilis Say)(美洲犬蜱(American dog tick))；美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)(孤星蜱(lone star tick))和痒螨科、蒲螨科和疥螨科中的疥螨和痒螨。
urticae Koch)(二点叶螨(two spotted spider mite))；迈叶螨(T.medanieli McGregor，McDaniel mite)；朱砂虫螨(T.cinnabarinus Boisduval)(胭脂红蜘蛛螨(carmine spider mite))；土耳其斯坦叶螨(T.turkestani Ugarov&Nikolski)(草莓蜘蛛螨(strawberry spider mite))；细须螨科中的平螨，短须螨(Brevipalpus lewisi McGregor)(柑橘平螨(citrus flat mite))；瘿螨科(Eriophyidae)中的锈螨和芽瘿螨以及其他食叶螨和对人类和动物健康重要的螨，即表皮螨科(Epidermoptidae)的尘螨、蠕形螨科(Demodicidae)的毛囊螨、食甜螨科(Glycyphagidae)的谷螨，硬蜱科(Ixodidae)的蜱。肩突硬蜱(Ixodes scapularis Say)(鹿蜱(deer tick))；全环硬蜱(I.holocyclus Neumann)(澳大利亚麻痹蜱(Australian paralysis tick))；变异革蜱(Dermacentor variabilis Say)(美洲犬蜱(American dog tick))；美洲钝眼蜱(Amblyomma americanum Linnaeus)(孤星蜱(lone star tick))和痒螨科、蒲螨科和疥螨科中的疥螨和痒螨。
[0035] 缨尾目(Thysanura)的昆虫有害生物是目的有害生物，例如衣鱼(Lepisma saccharina Linnaeus)(蠹虫(silverfish))；家衣鱼(Thermobia domestica Packard，firebrat)。
[0036] 目的昆虫有害生物包括椿象和其他相关昆虫的总科，包括但不限于属于以下各科的物种：蝽科(稻绿蝽、茶翅蝽(Halyomorpha halys)、Piezodorus guildini、褐臭蝽、拟绿蝽、英雄美洲蝽(Euschistus heros)、美洲蝽(Euschistus tristigmus)、拟绿蝽、褐蝽(Dichelops melacanthus)、和蓓蝽(Bagrada hilaris或Bagrada Bug))，龟蝽科(Plataspidae)(筛豆龟蝽(Megacopta cribraria)-豆平腹蝽蟓(Bean plataspid))和土蝽科(Scaptocoris castanea-Root stink bug)，以及鳞翅目物种，包括但不限于：小菜蛾，例如，玉米穗虫；大豆尺蠖，例如，大豆尺夜蛾(Pseudoplusia includens Walker)，以及绒毛豆毛虫，例如，大豆夜蛾(Anticarsia gemmatalis Hüübner)。
[0037] II.靶标序列
[0038] 如本文所使用的，“靶标序列”或“靶标多核苷酸”包括有害生物中的希望降低其表达水平的任何序列。在某些实施例中，降低所述靶标序列在有害生物中的表达水平防治该有害生物。例如，该靶标序列可以是生长和发育所必需的。靶标序列的非限制性实例包括SEQ ID NO.：1-49中所示的多核苷酸，或其变体和片段、及其互补序列。如本文别处所示例的，降低这些靶标序列中的一者或多者在鞘翅目植物有害生物或叶甲属植物有害生物中的表达水平防治有害生物。在一个实施例中，靶标序列编码间壁连接或平滑间壁连接(SSJ)蛋白。
[0039] III.沉默元件
[0040] “沉默元件”意指当被昆虫植物有害生物接触或摄取时能够降低或消除靶标多核苷酸或其编码的多肽的水平或表达的多核苷酸。因此，应当理解的是，本文所用的“沉默元件”包含如下多核苷酸：例如RNA构建体、双链RNA(dsRNA)、发夹RNA、siRNA、miRNA、amiRNA、以及正义和/或反义RNA。在一个实施例中，所用的沉默元件可通过影响靶标RNA转录物的水平，或者可替代地，通过影响翻译并由此影响所编码的多肽的水平来降低或消除靶标序列的表达水平。本文别处披露了测定功能性沉默元件的方法，该沉默元件能够降低或消除目的序列的水平。披露的方法中所采用的单个多核苷酸可包含针对相同或不同靶标多核苷酸的一个或多个沉默元件。该沉默元件可在体内(即，在宿主细胞诸如植物或微生物中)或体外生成。
[0041] 在某些实施例中，沉默元件可以包含如下嵌合构建分子，该嵌合构建分子包含两个或更多个本披露的序列或其部分。例如，该嵌合构建体可为如本文所披露的发夹或dsRNA。嵌合体可包含两个或更多个所披露的序列或其部分。在一个实施例中，设想出嵌合体具有本文所示的两个互补序列或其部分，这两个互补序列之间具有一定程度的错配，使得这两个序列彼此并非完全互补。在单一沉默元件中提供至少两个不同序列可以允许使用一个沉默元件和/或例如一个表达盒靶向多个基因。靶向多个基因可以允许减缓或降低有害生物抗性的可能性。此外，在一个表达的分子中提供多重靶向能力可减轻经转化的植物或植物产物的表达负担，或提供能够用一次施用靶向多个宿主的局部处理。
[0042] 在某些实施例中，虽然沉默元件防治有害生物，但优选地沉默元件对正常植物或植物部分无作用。
[0043] 如下文进一步详细讨论的，沉默元件可以包括但不限于，有义抑制元件、反义抑制元件、双链RNA、siRNA、amiRNA、miRNA或发夹抑制元件。在实施例中，沉默元件可以包含如下嵌合体，其中在沉默元件中发现两个或更多个本披露的序列、或者活性片段或变体、或者其互补序列。在各种实施例中，本披露的序列、或者活性片段或变体、或者其互补序列可以作为多于一个拷贝存在于DNA构建体、沉默元件、DNA分子或RNA分子中。在发夹或dsRNA分子中，有义或反义序列在分子中的位置(例如，其中序列首先进行转录或位于该RNA分子的具体末端上)对所公开的序列来说并不是限制性的，并且dsRNA不受本文公开内容中这种序列的具体位置的限制。可用于降低这些靶标序列表达的沉默元件的非限制性实例，包括该有义或反义序列的片段或变体，或者可替代地，由该有义或反义序列和SEQ ID NO.：1-49中所示序列、或者其变体和片段、及其互补序列组成。该沉默元件可以进一步包含有利地影响转录和/或所得转录物的稳定性的另外的序列。例如，该沉默元件可以在3′端包含至少一个胸腺嘧啶残基。这有助于稳定。因此，该沉默元件在3′端可具有至少1、2、3、4、5、6、7、8、9、10或更多个胸腺嘧啶残基。如下文进一步详细讨论的，增强子抑制元件也可以与本文所披露的沉默元件结合使用。
[0044] “减少”或“降低”多核苷酸或由其编码的多肽的表达水平旨在表示，该靶标序列的多核苷酸或多肽水平在统计学上低于适当的对照有害生物中相同靶标序列的多核苷酸水平或多肽水平，该对照有害生物没有暴露于(即没有摄取或接触)沉默元件。在具体实施例中，本文披露的方法和/或组合物降低昆虫植物有害生物中靶标序列的多核苷酸水平和/或多肽水平，得到多核苷酸水平和/或多肽水平是适当的对照有害生物中相同靶标序列的多核苷酸水平或由其编码的多肽的水平的小于95％、小于90％、小于80％、小于70％、小于60％、小于50％、小于40％、小于30％、小于20％、小于10％或小于5％。在一些实施例中，沉默元件与靶标多核苷酸具有大量的序列同一性，通常大于约65％序列同一性，大于约85％序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。此外，沉默元件可以与靶标多核苷酸的一部分互补。通常，可以使用SEQ ID NO.：1-49中任一项所示的序列、或者其变体和片段、及其互补序列的至少15、16、17、18、19、20、22、25、50、
100、200、300、400、450个或更多个连续核苷酸的靶标序列。本文别处讨论了测定RNA转录物水平、经编码的多肽水平、或者该多核苷酸或多肽活性的方法。
100、200、300、400、450个或更多个连续核苷酸的靶标序列。本文别处讨论了测定RNA转录物水平、经编码的多肽水平、或者该多核苷酸或多肽活性的方法。
[0045] i.有义抑制元件
[0046] 如本文所使用的，“有义抑制元件”包括如下多核苷酸，该多核苷酸被设计用于表达对应于“有义”方向的靶标信使RNA的至少一部分的RNA分子。包含有义抑制元件的RNA分子的表达能降低或消除靶标多核苷酸或由其编码的多肽的水平。包含有义抑制元件的多核苷酸可以对应于靶标多核苷酸序列的全部或一部分、靶标多核苷酸的5′和/或3′非翻译区的全部或一部分、靶标多核苷酸的编码序列的全部或一部分、或靶标多核苷酸的编码序列和非翻译区二者的全部或一部分。
[0047] 通常，有义抑制元件与靶标多核苷酸具有大量的序列同一性，通常大于约65％序列同一性，大于约85％序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。参见美国专利号5,283,184和5,034,323。有义抑制元件可以是任何长度的，只要其允许抑制靶标序列即可。该有义抑制元件可以是例如，SEQ ID NO.：1-49中任一项所示的靶标多核苷酸、或其变体和片段、以及其补体的15、16、17、18、19、20、22、25、30、50、100、150、200、250、300、350、400、450、500、600、700、900、1000、1100、1200、1300个核苷酸或更长。在其他实施例中，该有义抑制元件可以是例如，SEQ ID NO.：1-49中任一项所示的靶标多核苷酸、或其变体和片段、以及其互补序列的约15-25、19-35、19-50、25-100、100-
150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、450-500、500-550、550-600、600-650、
650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、
1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800个核苷酸或更长。
150、150-200、200-250、250-300、300-350、350-400、450-500、500-550、550-600、600-650、
650-700、700-750、750-800、800-850、850-900、900-950、950-1000、1000-1050、1050-1100、
1100-1200、1200-1300、1300-1400、1400-1500、1500-1600、1600-1700、1700-1800个核苷酸或更长。
[0048] ii.反义抑制元件
[0049] 如本文所使用的，“反义抑制元件”包括被设计用于表达与靶标信使RNA的全部或部分互补的RNA分子的多核苷酸。反义RNA抑制元件的表达降低或消除靶标多核苷酸的水平。用于反义抑制中的多核苷酸可以对应于编码靶标多核苷酸的序列的互补序列的全部或部分、靶标多核苷酸的5′和/或3′非翻译区的互补序列的全部或部分、靶标多核苷酸的编码序列的互补序列的全部或部分、或靶标多核苷酸的编码序列和非翻译区两者的互补序列的全部或部分。此外，该反义抑制元件可以与靶标多核苷酸完全互补(即，与靶标序列的互补序列100％同一)或部分互补(即，与靶标序列的互补序列低于100％同一)。在某些实施例中，该反义抑制元件包含与靶标多核苷酸具有至少85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列互补性。反义抑制可用于抑制同一植物中多种蛋白质的表达。参见例如美国专利号5，942，657。此外，该反义抑制元件可以与靶标多核苷酸的一部分互补。通常，可以使用SEQ ID NO.：1-49中任一项所示的序列、或者其变体和片段、及其互补序列的至少15、16、17、18、19、20、22、25、50、100、200、300、400、450个或更多个核苷酸的序列。用于使用反义抑制来抑制植物中内源基因表达的方法描述于以下文献中：例如，Liu等人(2002)Plant Physiol.[植物生理学]129：1732-1743和美国专利号5,942,657。
[0050] iii.双链RNA抑制元件
[0051] “双链RNA沉默元件”或“dsRNA”包含至少一种能够在被昆虫植物有害生物摄取之前或之后形成dsRNA的转录物。因此，“dsRNA沉默元件”包括dsRNA、能够形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸或超过一种能够形成dsRNA的转录物或多核糖核苷酸。“双链RNA”或“dsRNA”是指由单个自互补的RNA分子形成的多核糖核苷酸结构或由至少两个不同的RNA链的表达形成的多核糖核苷酸结构。所披露的方法和组合物中使用的一种或多种dsRNA分子介导靶标序列表达的降低，例如通过以序列特异性方式介导RNA干扰“RNAi”或基因沉默。在各种实施例中，dsRNA能够降低或消除昆虫植物有害生物中靶标多核苷酸或由其编码的多肽的水平或表达。
[0052] dsRNA可以通过影响靶标RNA转录物的水平、通过影响翻译并从而影响经编码的多肽的水平、或通过影响转录前水平上的表达(即，经由染色质结构的调节、甲基化模式等来改变基因表达)来降低或消除靶标序列的表达水平。例如，参见Verdel等人(2004)Science[科学]303：672-676；Pal-Bhadra等人(2004)Science[科学]303：669-672；Allshire(2002)Science[科学]297：1818-1819；Volpe等人(2002)Science[科学]297：1833-1837；Jenuwein(2002)Science[科学]297：2215-2218；以及Hall等人(2002)Science[科学]297：2232-2237。本文别处披露了测定功能性dsRNA的方法，该dsRNA能够降低或消除目的序列的水平。
因此，如本文所使用的，术语“dsRNA”意在包括用于描述能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子的其他术语，包括例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、发夹RNA、短发夹RNA(shRNA)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。
因此，如本文所使用的，术语“dsRNA”意在包括用于描述能够介导RNA干扰或基因沉默的核酸分子的其他术语，包括例如短干扰RNA(siRNA)、双链RNA(dsRNA)、微RNA(miRNA)、发夹RNA、短发夹RNA(shRNA)、转录后基因沉默RNA(ptgsRNA)等。
[0053] 在某些实施例中，dsRNA的双链体或双链区域的至少一条链与靶标多核苷酸共享足够的序列同一性或序列互补性，以允许dsRNA降低靶标序列的表达水平。在一些实施例中，dsRNA与靶标多核苷酸具有大量的序列同一性，通常大于约65％序列同一性，大于约85％序列同一性，约90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％或99％序列同一性。此外，dsRNA元件可以与靶标多核苷酸的一部分互补。通常，可以使用SEQID NO.：1-49中任一项所示的序列、或者其变体和片段、及其互补序列的至少15、16、17、18、19、20、21、22、
23、24、25、50、100、200、300、400、450个或更多个核苷酸的序列。如本文所使用的，与靶标多核苷酸互补的链是“反义链”，并且与靶标多核苷酸同源的链是“有义链”。
23、24、25、50、100、200、300、400、450个或更多个核苷酸的序列。如本文所使用的，与靶标多核苷酸互补的链是“反义链”，并且与靶标多核苷酸同源的链是“有义链”。
[0054] 在另一个实施例中，dsRNA包含发夹RNA。发夹RNA包含能够折回到自身上以形成双链结构的RNA分子。多种结构都可以用作发夹元件。在某些实施例中，该dsRNA抑制元件包含如下发夹元件，该发夹元件依次包含第一区段、第二区段和第三区段，其中该第一和第三区段共享足够的互补性，以允许经转录的RNA形成双链茎环结构。
[0055] 该发夹的“第二区段”包含“环”或“环区”。这些术语在本文中作为同义词使用，并且广义地被解释为包含任何如下核苷酸序列，该核苷酸序列赋予足够灵活性以允许多核苷酸的互补区域(即，形成发夹茎的区段1和3)之间发生自配对。例如，在一些实施例中，该环区可以基本上是单链的并且作为发夹茎环的自互补区域之间的间隔区。在一些实施例中，该环区可以包含随机或无义核苷酸序列，并且因此不与靶标多核苷酸共享序列同一性。在其他实施例中，该环区包含与靶标多核苷酸共享同一性的有义或反义RNA序列或者其片段。参见，例如，国际专利公开号WO 02/00904。在某些实施例中，该环序列可以包括内含子序列、源自内含子序列的序列、与内含子序列同源的序列、或经修饰的内含子序列。该内含子序列可以是与衍生出区段1和3相同或不同物种中发现的序列。在某些实施例中，可以将环区优化为尽可能短，同时仍然提供足够的分子内灵活性以允许形成碱基配对的茎区。因此，该环序列通常小于1000、900、800、700、600、500、400、300、200、100、50、25、20、19、18、17、
16、15、10个核苷酸或更少。
16、15、10个核苷酸或更少。
[0056] 发夹RNA分子的“第一”和“第三”区段包含发夹结构的碱基配对的茎。第一和第三区段是彼此的反向重复序列，并且共享足够的互补性以允许形成碱基配对的茎区。在某些实施例中，第一和第三区段彼此完全互补。可替代地，第一和第三区段可以彼此部分互补，只要它们能够彼此杂交形成碱基配对的茎区就可以。第一和第三区段之间的互补性的量可以计算为整个区段的百分比。因此，发夹RNA的第一和第三区段通常共享至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％、高至且包括
100％的互补性。
100％的互补性。
[0057] 第一和第三区段至少约为1000、500、475、450、425、400、375、350、325、300、250、225、200、175、150、125、100、75、60、50、40、30、25、22、21、20、19、18、17、16、15或10个核苷酸的长度。在某些实施例中，该第一和/或第三区段的长度为约10-100个核苷酸、约10至约75个核苷酸、约10至约50个核苷酸、约10至约40个核苷酸、约10至约35个核苷酸、约10至约30个核苷酸、约10至约25个核苷酸、约10至约19个核苷酸、约10至约20个核苷酸、约19至约50个核苷酸、约50个核苷酸至约100个核苷酸、约100个核苷酸至约150个核苷酸、约100个核苷酸至约300个核苷酸、约150个核苷酸至约200个核苷酸、约200个核苷酸至约250个核苷酸、约250个核苷酸至约300个核苷酸、约300个核苷酸至约350个核苷酸、约350个核苷酸至约
400个核苷酸、约400个核苷酸至约500个核苷酸、约600nt、约700nt、约800nt、约900nt、约
1000nt、约1100nt、约1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、1600nt、1700nt、1800nt、1900nt、
2000nt或更长。在其他实施例中，第一和/或第三区段的长度包含至少10-19个核苷酸、10-
20个核苷酸；19-35个核苷酸、20-35个核苷酸；30-45个核苷酸；40-50个核苷酸；50-100个核苷酸；100-300个核苷酸；约500-700个核苷酸；约700-900个核苷酸；约900-1100个核苷酸；
约1300-1500个核苷酸；约1500-1700个核苷酸；约1700-1900个核苷酸；约1900-2100个核苷酸；约2100-2300个核苷酸；或约2300-2500个核苷酸。参见，例如国际公开号WO 02/00904。
400个核苷酸、约400个核苷酸至约500个核苷酸、约600nt、约700nt、约800nt、约900nt、约
1000nt、约1100nt、约1200nt、1300nt、1400nt、1500nt、1600nt、1700nt、1800nt、1900nt、
2000nt或更长。在其他实施例中，第一和/或第三区段的长度包含至少10-19个核苷酸、10-
20个核苷酸；19-35个核苷酸、20-35个核苷酸；30-45个核苷酸；40-50个核苷酸；50-100个核苷酸；100-300个核苷酸；约500-700个核苷酸；约700-900个核苷酸；约900-1100个核苷酸；
约1300-1500个核苷酸；约1500-1700个核苷酸；约1700-1900个核苷酸；约1900-2100个核苷酸；约2100-2300个核苷酸；或约2300-2500个核苷酸。参见，例如国际公开号WO 02/00904。
[0058] 本披露的发夹分子或双链RNA分子可以具有在该RNA分子的相同部分中发现的多于一个本披露的序列或活性片段或变体或者其互补序列。例如，在嵌合发夹结构中，发夹分子的第一区段包含两个多核苷酸部分，每个具有不同的本披露的序列。例如，从发夹的一个末端开始读，第一区段由来自两个单独基因(A之后是B)的序列构成。该第一区段后面是第二区段，即发夹的环部分。该环区段之后是第三区段，其中发现第一区段中的序列的互补链(B*之后是A*)形成了发夹结构的茎环，该茎包含茎远端的SeqA-A*以及邻近环区的SeqB-B*。
[0059] 在某些实施例中，该第一和第三区段包含与该第一区段具有至少85％互补性的至少20个核苷酸。在其他实施例中，形成发夹的茎-环结构的第一和第三区段包含具有不成对的核苷酸残基的3′或5′悬垂区域。
[0060] 在某些实施例中，第一、第二和/或第三区段中使用的序列包含设计为与目的靶标多核苷酸具有足够的序列同一性并且从而具有降低靶标多核苷酸的表达水平的能力的结构域。因此抑制性RNA转录物的特异性通常由沉默元件的这些结构域赋予。因此，在一些实施例中，沉默元件的第一、第二和/或第三区段包含具有至少10、至少15、至少19、至少20、至少21、至少22、至少23、至少24、至少25、至少30、至少40、至少50、至少100、至少200、至少300、至少500、至少1000或1000个以上的核苷酸的结构域，这些核苷酸与靶标多核苷酸共享足够的序列同一性，以允许在合适的细胞中表达时降低靶标多核苷酸的表达水平。在其他实施例中，该结构域介于约15至50个核苷酸之间、约19-35个核苷酸之间、约20-35个核苷酸之间、约25-50个核苷酸之间、约19至75个核苷酸之间、约20至75个核苷酸之间、约40-90个核苷酸之间、约15-100个核苷酸之间、10-100个核苷酸之间、约10至约75个核苷酸之间、约
10至约50个核苷酸之间、约10至约40个核苷酸之间、约10至约35个核苷酸之间、约10至约30个核苷酸之间、约10至约25个核苷酸之间、约10至约20个核苷酸之间、约10至约19个核苷酸之间、约50个核苷酸至约100个核苷酸之间、约100个核苷酸至约150个核苷酸之间、约150个核苷酸至约200个核苷酸之间、约200个核苷酸至约250个核苷酸之间、约250个核苷酸至约
300个核苷酸之间、约300个核苷酸至约350个核苷酸之间、约350个核苷酸至约400个核苷酸之间、约400个核苷酸至约500个核苷酸之间或更长。在其他实施例中，第一和/或第三区段的长度包含至少10-20个核苷酸、至少10-19个核苷酸、20-35个核苷酸、30-45个核苷酸、40-
50个核苷酸、50-100个核苷酸、或约100-300个核苷酸。
10至约50个核苷酸之间、约10至约40个核苷酸之间、约10至约35个核苷酸之间、约10至约30个核苷酸之间、约10至约25个核苷酸之间、约10至约20个核苷酸之间、约10至约19个核苷酸之间、约50个核苷酸至约100个核苷酸之间、约100个核苷酸至约150个核苷酸之间、约150个核苷酸至约200个核苷酸之间、约200个核苷酸至约250个核苷酸之间、约250个核苷酸至约
300个核苷酸之间、约300个核苷酸至约350个核苷酸之间、约350个核苷酸至约400个核苷酸之间、约400个核苷酸至约500个核苷酸之间或更长。在其他实施例中，第一和/或第三区段的长度包含至少10-20个核苷酸、至少10-19个核苷酸、20-35个核苷酸、30-45个核苷酸、40-
50个核苷酸、50-100个核苷酸、或约100-300个核苷酸。
[0061] 在某些实施例中，第一、第二和/或第三区段的结构域与靶标多核苷酸具有100％序列同一性。在其他实施例中，与靶标多核苷酸具有同源性的第一、第二和/或第三区段的结构域与该靶标多核苷酸的区域具有至少50％、60％、70％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。与靶标多核苷酸互补的第一、第二和/或第三区段的结构域的序列同一性只需足以降低目的靶标多核苷酸的表达即可。参见，例如Chuang和Meyerowitz(2000)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]97：
4985-4990；Stoutjesdijk等人(2002)Plant Physiol.[植物生理学]129：1723-1731；
Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.[遗传学自然评论]4：29-38；Pandolfini等人BMC Biotechnology[BMC生物技术学]3：7，以及美国专利公开号20030175965。用于测定hpRNA构建体沉默基因体内表达的效率的瞬时测定法已在以下文献中进行描述：Panstruga等人(2003)Mol.Biol.Rep.[分子生物学导报]30：135-140。
4985-4990；Stoutjesdijk等人(2002)Plant Physiol.[植物生理学]129：1723-1731；
Waterhouse和Helliwell(2003)Nat.Rev.Genet.[遗传学自然评论]4：29-38；Pandolfini等人BMC Biotechnology[BMC生物技术学]3：7，以及美国专利公开号20030175965。用于测定hpRNA构建体沉默基因体内表达的效率的瞬时测定法已在以下文献中进行描述：Panstruga等人(2003)Mol.Biol.Rep.[分子生物学导报]30：135-140。
[0062] 第一、第二和/或第三区段与靶标多核苷酸之间共享的互补性的量或第一区段与第三区段(即，发夹结构的茎)之间共有的互补性的量可以根据其基因表达需要被防治的生物体而有所不同。一些生物体或细胞类型可能需要精确配对或100％同一性，而其他生物体或细胞类型可以容忍一些错配。在一些细胞中，例如，靶向序列中的单一核苷酸错配消除了抑制基因表达的能力。在这些细胞中，所披露的抑制盒可以用于靶向突变基因的抑制，例如其转录物包含点突变的癌基因，并因此可使用本发明的方法和组合物特异性地靶向这些癌基因而不改变其余野生型等位基因的表达。在其他生物体中，可以容忍整体序列变异性，只要该序列的某个22nt区域表现出靶标多核苷酸与抑制盒之间的100％同源性即可。
[0063] 可以使用靶标多核苷酸的任何区域来设计共享足够序列同一性的沉默元件的结构域，以允许发夹转录物的表达来降低靶标多核苷酸的水平。例如，可以将结构域设计为与一种或多种靶标多核苷酸的5′非翻译区、一种或多种靶标多核苷酸的3′非翻译区、一种或多种靶标多核苷酸的外显子区、一种或多种靶标多核苷酸的内含子区以及其任何组合共享序列同一性。在某些实施例中，该沉默元件的结构域与来自靶标序列的约核苷酸1-50、25-75、75-125、50-100、125-175、175-225、100-150、150-200、200-250、225-275、275-325、250-
300、325-375、375-425、300-350、350-400、425-475、400-450、475-525、450-500、525-575、
575-625、550-600、625-675、675-725、600-650、625-675、675-725、650-700、725-825、825-
875、750-800、875-925、925-975、850-900、925-975、975-1025、950-1000、1000-1050、1025-
1075、1075-1125、1050-1100、1125-1175、1100-1200、1175-1225、1225-1275、1200-1300、
1325-1375、1375-1425、1300-1400、1425-1475、1475-1525、1400-1500、1525-1575、1575-
1625、1625-1675、1675-1725、1725-1775、1775-1825、1825-1875、1875-1925、1925-1975、
1975-2025、2025-2075、2075-2125、2125-2175、2175-2225、1500-1600、1600-1700、1700-
1800、1800-1900、1900-2000的至少约15、16、17、18、19、20、22、25或30个连续核苷酸共享足够的同一性、同源性、或与其互补。在某些情况下，为了优化发夹中使用的siRNA序列，可以使用合成的寡脱氧核糖核苷酸/核糖核酸酶H法确定靶标mRNA上易经受RNA沉默的构象中的位点。参见，例如，Vickers等人(2003)J.Biol.Chem[生物化学杂志]278：7108-7118和Yang等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]99：9442-9447。这些研究表明，核糖核酸酶-H-敏感位点与促进有效的siRNA导向的mRNA降解的位点之间具有显著的相关性。
300、325-375、375-425、300-350、350-400、425-475、400-450、475-525、450-500、525-575、
575-625、550-600、625-675、675-725、600-650、625-675、675-725、650-700、725-825、825-
875、750-800、875-925、925-975、850-900、925-975、975-1025、950-1000、1000-1050、1025-
1075、1075-1125、1050-1100、1125-1175、1100-1200、1175-1225、1225-1275、1200-1300、
1325-1375、1375-1425、1300-1400、1425-1475、1475-1525、1400-1500、1525-1575、1575-
1625、1625-1675、1675-1725、1725-1775、1775-1825、1825-1875、1875-1925、1925-1975、
1975-2025、2025-2075、2075-2125、2125-2175、2175-2225、1500-1600、1600-1700、1700-
1800、1800-1900、1900-2000的至少约15、16、17、18、19、20、22、25或30个连续核苷酸共享足够的同一性、同源性、或与其互补。在某些情况下，为了优化发夹中使用的siRNA序列，可以使用合成的寡脱氧核糖核苷酸/核糖核酸酶H法确定靶标mRNA上易经受RNA沉默的构象中的位点。参见，例如，Vickers等人(2003)J.Biol.Chem[生物化学杂志]278：7108-7118和Yang等人(2002)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]99：9442-9447。这些研究表明，核糖核酸酶-H-敏感位点与促进有效的siRNA导向的mRNA降解的位点之间具有显著的相关性。
[0064] 还可对发夹沉默元件进行设计，使得有义序列或反义序列不对应于靶标多核苷酸。在这个实施例中，该反义和有义序列侧翼于如下环序列，该环序列包含对应于靶标多核苷酸的全部或部分的核苷酸序列。因此，是环区决定了RNA干扰的特异性。参见，例如WO 02/00904。
[0065] 另外，可以通过使用发夹抑制元件实现转录基因沉默(TGS)，其中该发夹的反向重复序列与待沉默的靶标多核苷酸的启动子区域共享序列同一性。参见，例如，Aufsatz等人(2002)PNAS[美国科学院院报]99(增刊4)：16499-16506和Metre等人(2000)EMBO J[欧洲分子生物学杂志]19(19)：5194-5201。
[0066] 在其他实施例中，该沉默元件可包含小RNA(sRNA)。sRNA可以包含微RNA(miRNA)和短干扰RNA(siRNA)两者(Meister和Tuschl(2004)Nature[自然]431：343-349和Bonetta等人(2004)Nature Methods[自然方法]1：79-86)。miRNA是长度为约19至约24个核糖核苷酸的调控剂，其能高效抑制靶标多核苷酸的表达。参见例如Javier等人(2003)Nature[自然]425：257-263。对于miRNA干扰，可以将该沉默元件设计用来表达形成发夹结构或部分碱基配对的结构的dsRNA分子，该发夹结构或部分碱基配对的结构包含与目的靶标多核苷酸互补的19、20、21、22、23、24或25个核苷酸序列。该miRNA可以经合成产生，或被转录为更长的RNA，该更长的RNA随后裂解，以产生活性miRNA。具体地讲，miRNA可以包含有义方向上与靶标多核苷酸具有同源性的序列的19个核苷酸，以及与有义序列互补的相应反义序列的19个核苷酸。miRNA可以是包含miRNA序列的“人工miRNA”或“amiRNA”，其以合成的方式被设计用来使靶标序列沉默。
[0067] 当表达miRNA时，最终的(成熟的)miRNA以双链体存在于前体骨架结构中，这两条链被称为miRNA(最终与靶标碱基配对的链)和miRNA*(星号序列)。已经证明miRNA能以转基因的方式被表达并且目的靶基因可以被有效地沉默(Highly specific gene silencing by artificial microRNAs in Arabidopsis[在拟南芥中通过人工微RNA进行高度特异性基因沉默]Schwab R，Ossowski S，Riester M，Warthmann N，Weigel D.Plant Cell.[植物细胞]2006年5月；18(5)：1121-33.2006年3月10日电子公布；以及Expression of artificial microRNAs in transgenic Arabidopsis thaliana confers virus
resistance[人工微RNA在转基因拟南芥中的表达赋予病毒抗性]Niu QW，Lin SS，Reyes几，Chen KC，Wu HW，Yeh SD，Chua NH.Nat Biotechnol.[自然生物技术]2006年11月；24(11)：
1420-8.2006年10月22日电子公布勘误表在：Nat Biotechnol.[自然生物技术]2007年2月；
25(2)：254中)。
resistance[人工微RNA在转基因拟南芥中的表达赋予病毒抗性]Niu QW，Lin SS，Reyes几，Chen KC，Wu HW，Yeh SD，Chua NH.Nat Biotechnol.[自然生物技术]2006年11月；24(11)：
1420-8.2006年10月22日电子公布勘误表在：Nat Biotechnol.[自然生物技术]2007年2月；
25(2)：254中)。
[0068] 用于miRNA干扰的沉默元件包含miRNA一级序列。该miRNA一级序列包含如下DNA序列，该DNA序列具有被环间隔开的miRNA和星号序列，以及侧翼于该区域的对于加工重要的另外的序列。当表达为RNA时，该一级miRNA的这种结构使得允许形成如下发夹RNA结构，该发夹RNA结构可被加工成成熟的miRNA。在一些实施例中，miRNA骨架包含基因组或cDNA miRNA前体序列，其中所述序列包含在其中插入有异源(人工)成熟miRNA和星号序列的天然一级结构。
[0069] 如本文所使用的，“星号序列”是miRNA前体骨架内的与miRNA互补，并与miRNA形成双链体进而形成发夹RNA的茎结构的序列。在一些实施例中，该星号序列可以与miRNA序列具有小于100％的互补性。可替代地，该星号序列可以与miRNA序列具有至少99％、98％、97％、96％、95％、90％、85％、80％或更低的序列互补性，只要该星号序列与miRNA序列具有足以形成双链结构的互补性即可。在仍另外的实施例中，该星号序列包含与miRNA序列具有
1、2、3、4、5或更多个错配的序列并且仍然具有足够的互补性以与miRNA序列形成双链结构，从而生成miRNA并抑制靶标序列。
1、2、3、4、5或更多个错配的序列并且仍然具有足够的互补性以与miRNA序列形成双链结构，从而生成miRNA并抑制靶标序列。
[0070] miRNA前体骨架可来自任何植物。在一些实施例中，miRNA前体骨架来自单子叶植物。在其他实施例中，miRNA前体骨架来自双子叶植物。在另外的实施例中，骨架来自玉米或大豆。之前已对微RNA前体骨架进行了描述。例如，US 20090155910 A1(WO 2009/079532)披露了下列大豆miRNA前体骨架：156c、159、166b、168c、396b和398b，并且US 20090155909 A1(WO 2009/079548)披露了下列玉米miRNA前体骨架：159c、164h、168a、169r和396h。
[0071] 因此，可以改变一级miRNA以允许异源miRNA和星号序列有效插入到miRNA前体骨架内。在此类情况下，使用PCR技术将miRNA前体骨架的miRNA区段和星号区段替换为设计用来靶向任何目的序列的异源miRNA和异源星号序列，并克隆到表达构建体中。已经认识到，可以改变人工miRNA和星号序列插入骨架中的位置。用于将miRNA和星号序列插入miRNA前体骨架中的详细方法描述于例如美国专利申请20090155909 A1和US 20090155910 A1中。
[0072] 当设计miRNA序列和星号序列时，可作出各种设计选择。参见，例如，Schwab R等人(2005)Dev Cell[发育细胞]8：517-27。在非限制性实施例中，本文所披露的miRNA序列可具有5′端的“U”、第19个核苷酸位置处的“C”或“G”、以及第10个核苷酸位置处的“A”或“U”。在其他实施例中，miRNA的这种设计使得miRNA具有如用ZipFold算法计算得到的高自由Δ-G(Markham，N.R.和Zuker，M.(2005)Nucleic Acids Res.[核酸研究]33：W577-W581)。任选地，在miRNA的5′部分内可添加一个碱基对改变，以使该序列与靶标序列相差一个核苷酸。
[0073] 本文披露的方法和组合物使用DNA构建体，所述DNA构建体在转录时“形成”沉默元件(例如dsRNA分子)。所述方法和组合物还可以包含含有编码沉默元件的DNA构建体的宿主细胞。在另一个实施例中，所述方法和组合物还可以包含含有编码沉默元件的DNA构建体的转基因植物。因此，正在被表达的异源多核苷酸不需要自己形成dsRNA，而可以与植物细胞中或摄食后的有害生物肠中的其他序列相互作用，以允许形成dsRNA。例如，可以通过将包含miRNA或siRNA靶标序列的嵌合构建体表达到与待沉默的一个或多个基因的全部或一部分相对应的序列中，来生成能够选择性沉默靶标多核苷酸的嵌合多核苷酸。在这个实施例中，当miRNA或siRNA的靶标与细胞中存在的miRNA相互作用时，“形成”dsRNA。然后所得的dsRNA可以降低待沉默的一个或多个基因的表达水平。参见例如美国申请公开2007-0130653，题目为“Methods and Compositionsfor Gene Silencing[用于基因沉默的方法和组合物]”。可以将该构建体设计为具有内源性miRNA的靶标，或者可替代地，可以在该构建体中使用的异源的和/或合成的miRNA的靶标。如果使用异源的和/或合成的miRNA，可以将其引入与嵌合多核苷酸相同的核苷酸构建体上或单独的构建体上的细胞中。如本文别处所述的，可以用任何方法来引入包含该异源miRNA的构建体。
[0074] IV.变体和片段
[0075] “片段”意在是多核苷酸的一部分或者氨基酸序列和因此由其编码的蛋白质的一部分。多核苷酸的片段可以编码保留天然蛋白的生物活性的蛋白质片段。可替代地，可用作沉默元件的多核苷酸片段不必编码保留生物活性的片段蛋白质。因此，核苷酸序列的片段的范围为至少约10个核苷酸、约15个核苷酸、约16个核苷酸、约17个核苷酸、约18个核苷酸、约19个核苷酸、约20个核苷酸、约21个核苷酸、约22个核苷酸、约50个核苷酸、约75个核苷酸、约100个核苷酸、200个核苷酸、300个核苷酸、400个核苷酸、500个核苷酸、600个核苷酸、700个核苷酸并且高至且包括比所采用的全长多核苷酸少一个核苷酸。可替代地，核苷酸序列的片段的范围可以为SEQ ID NO.：1-49中任一项、或者其变体和片段、及其互补序列的1-
50、25-75、75-125、50-100、125-175、175-225、100-150、100-300、150-200、200-250、225-
275、275-325、250-300、325-375、375-425、300-350、350-400、425-475、400-450、475-525、
450-500、525-575、575-625、550-600、625-675、675-725、600-650、625-675、675-725、650-
700、725-825、825-875、750-800、875-925、925-975、850-900、925-975、975-1025、950-
1000、1000-1050、1025-1075、1075-1125、1050-1100、1125-1175、1100-1200、1175-1225、
1225-1275、1200-1300、1325-1375、1375-1425、1300-1400、1425-1475、1475-1525、1400-
1500、1525-1575、1575-1625、1625-1675、1675-1725、1725-1775、1775-1825、1825-1875、
1875-1925、1925-1975、1975-2025、2025-2075、2075-2125、2125-2175、2175-2225、1500-
1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000。测定希望的沉默元件的活性的方法在本文其他地方进行了描述。
50、25-75、75-125、50-100、125-175、175-225、100-150、100-300、150-200、200-250、225-
275、275-325、250-300、325-375、375-425、300-350、350-400、425-475、400-450、475-525、
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700、725-825、825-875、750-800、875-925、925-975、850-900、925-975、975-1025、950-
1000、1000-1050、1025-1075、1075-1125、1050-1100、1125-1175、1100-1200、1175-1225、
1225-1275、1200-1300、1325-1375、1375-1425、1300-1400、1425-1475、1475-1525、1400-
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1875-1925、1925-1975、1975-2025、2025-2075、2075-2125、2125-2175、2175-2225、1500-
1600、1600-1700、1700-1800、1800-1900、1900-2000。测定希望的沉默元件的活性的方法在本文其他地方进行了描述。
[0076] “变体”意指基本上相似的序列。对于多核苷酸，变体包含在天然多核苷酸中的一个或多个内部位点处的一个或多个核苷酸的缺失和/或添加，和/或在天然多核苷酸中的一个或多个位点处的一个或多个核苷酸的取代。可用作沉默元件的多核苷酸的变体将保留降低靶标多核苷酸表达的能力，并且在一些实施例中，因此能防治目的昆虫植物有害生物。如本文所用，“天然”多核苷酸或多肽分别包含天然存在的核苷酸序列或氨基酸序列。对于多核苷酸，保守变体包括如下那些序列，由于遗传密码的简并性而编码所披露的多肽之一的氨基酸序列。变体多核苷酸还包括通过合成衍生的多核苷酸，诸如那些例如通过使用定点诱变产生但继续保留所需活性的多核苷酸。通常，如通过本文别处所描述的序列比对程序和参数确定的，具体披露的多核苷酸(即，沉默元件)的变体将与该具体多核苷酸具有至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、98％、99％或更高的序列同一性。
[0077] 具体披露的多核苷酸(即参考多核苷酸)的变体还可通过比较由变体多核苷酸所编码的多肽与由该参考多核苷酸所编码的多肽之间的序列同一性百分数来进行评价。可以使用本文别处描述的序列比对程序和参数计算任何两个多肽之间的百分比序列同一性。当通过比较由它们编码的两个多肽共有的序列同一性百分数来评估所使用的给定的所披露的多核苷酸对时，两个编码的多肽之间的序列同一性百分数为至少约40％、45％、50％、55％、60％、65％、70％、75％、80％、85％、90％、91％、92％、93％、94％、95％、96％、97％、
98％、99％或更高的序列同一性。
98％、99％或更高的序列同一性。
[0078] 相对于参考序列(受试者)，“百分比(％)序列同一性”被确定为在比对序列并引入空位(如果需要)以实现最大百分比序列同一性后，并且不考虑作为序列同一性的一部分的任何氨基酸保守取代，候选序列(查询)中与参考序列中的相应氨基酸残基或核苷酸同一的氨基酸残基或核苷酸的百分比。用于确定序列同一性百分比目的的比对可以以本领域技术范围内的各种方式实现，例如，使用公共可用的计算机软件，例如BLAST，BLAST-2。本领域的技术人员可以确定用于比对序列的适当参数，包括在进行比较的序列的全长度上实现最大比对所需的任何算法。两个序列之间的同一性百分比是序列共有的同一位置的数目的函数(例如，查询序列的同一性百分比＝查询序列和主题序列之间的同一位置的数目/查询序列的位置总数×100)。
[0079] 进一步提供了用于从SEQ ID NO.：1-49中所示的靶标多核苷酸、或者其变体和片段、及其互补序列中识别沉默元件的方法。这样的方法包括获得SEQ ID NO.：1-49中任一项、或者其变体和片段、及其互补序列的候选片段，该候选片段具有足够的长度以至于能充当沉默元件，并且从而降低靶标多核苷酸的表达和/或防治希望的有害生物；在合适的表达盒中表达所述候选多核苷酸片段以产生候选沉默元件，并确定所述候选多核苷酸片段具有沉默元件的活性，并且从而降低靶标多核苷酸的表达和/或防治期望的有害生物。鉴于本文提供的教导，基于抑制所期望的通路来识别此类候选片段的方法是已知的。例如，可以采用各种生物信息学程序来识别可以被用来产生沉默元件的靶标多核苷酸的区域。参见，例如，Elbahir等人(2001)Genes and Development[基因与发育]15：188-200，Schwartz等人(2003)Cell[细胞]115：199-208，Khvorova等人(2003)Cell[细胞]115：209-216。还参见，在Whitehead网站(jura.wi.mit.edu/bioc/siRNAext/)的siRNA，其计算正义和反义siRNA的结合能。还参见网址genscript.com/ssl-bin/app/rnai？op＝known；来自英杰公司(Invitrogen)的Block-iTTM RNAi设计器(Block-iTTM RNAi designer)和金斯瑞公司
(GenScript)的siRNA构建体生成器(siRNA Construct Builder)。在各个方面，应当理解，术语“......SEQ ID NO.：1-49，或者其变体或片段，或者其互补序列......”意指本披露的序列包含SEQ ID NO.：1-49，和/或SEQ ID NO.：1-49的片段，和/或SEQ ID NO.：1-49的变体，和/或SEQ ID NO.：1-49、SEQ ID NO.：1-49的变体、和/或SEQ ID NO.：1-49的片段的互补序列，单独地(或)或包含一些或所有列出的序列。
(GenScript)的siRNA构建体生成器(siRNA Construct Builder)。在各个方面，应当理解，术语“......SEQ ID NO.：1-49，或者其变体或片段，或者其互补序列......”意指本披露的序列包含SEQ ID NO.：1-49，和/或SEQ ID NO.：1-49的片段，和/或SEQ ID NO.：1-49的变体，和/或SEQ ID NO.：1-49、SEQ ID NO.：1-49的变体、和/或SEQ ID NO.：1-49的片段的互补序列，单独地(或)或包含一些或所有列出的序列。
[0080] V.DNA构建体
[0081] 术语“多核苷酸”的使用并不旨在局限于包含DNA的多核苷酸。本领域普通技术人员将认识到，多核苷酸可以包含核糖核苷酸和核糖核苷酸与脱氧核糖核苷酸的组合。这种脱氧核糖核苷酸和核糖核苷酸既包括天然存在的分子也包括合成的类似物。所披露的多核苷酸还涵盖所有形式的序列，包括但不限于单链形式、双链形式、发夹结构、茎-环结构等。
[0082] 编码沉默元件或在某些实施例中的、在披露的方法和组合物中使用的多核苷酸可以在表达盒中提供以便在目的植物或生物体中表达。已经认识到，可以使用多个沉默元件，包括多个相同沉默元件、多个靶向靶标序列不同区域的沉默元件、或多个来自不同靶标序列的沉默元件。在这个实施例中，已经认识到每个沉默元件可以由单个或单独的盒、DNA构建体或载体编码。如所讨论的，设想了提供该沉默元件的任何方式。可使用包含编码一个或多个沉默元件的DNA的单个的盒来转化植物或植物细胞，或者可使用编码沉默元件的分离的盒来转化植物或者植物细胞或宿主细胞。同样地，经一种组分转化的植物可以随后用第二组分进行转化。还可以通过有性杂交将编码沉默元件的一个或多个DNA构建体聚在一起。也就是说，包含一种组分的第一植物与包含第二种组分的第二植物杂交。杂交所产生的子代植物将包含这两种组分。
[0083] 该表达盒可以包括可操作地连接至本发明的多核苷酸的5′和3′调控序列。“可操作地连接”旨在表示两个或更多个元件之间的功能性连接。例如，本发明的多核苷酸与调节序列(即，启动子)之间的有效连接是可使本文披露的多核苷酸得以表达的功能性连接。可操作地连接的元件可以是连续的或非连续的。当用于指两个蛋白质编码区域的连接时，可操作地连接意在是这些编码区域处于相同的阅读框中。该盒可以另外地含有至少一个待共转化到生物体中的另外的多核苷酸。可替代地，可以在多个表达盒上提供另外的一种或多种多肽。提供的表达盒可以具有多个限制性位点和/或重组位点，用于将多核苷酸插入到调控区的转录调控之下。该表达盒可另外包含选择性标记基因。
[0084] 该表达盒在5′-3′转录方向可以包括转录和翻译起始区(即启动子)、编码本发明的方法和组合物中使用的沉默元件的多核苷酸、以及在植物中起作用的转录和翻译终止区(即，终止区)。在其他实施例中，从抑制盒表达双链RNA。这样的盒可以包含驱动可操作地连接的沉默元件的转录的两个趋同启动子。“趋同启动子”是指在编码该沉默元件的、可操作地连接的多核苷酸任一末端上取向，使得每个启动子以相反方向驱动该沉默元件的转录，产生两个转录物的启动子。在此类实施例中，趋同启动子允许正义和反义链的转录，并且从而允许dsRNA的形成。这种盒还可以包含驱动编码该沉默元件的一个或多个可操作地连接的多核苷酸的转录的两个趋异启动子。“趋异启动子”是指彼此以相反方向取向，驱动编码该沉默元件的一个或多个多核苷酸以相反的方向转录的启动子。在此类实施例中，趋异启动子允许正义和反义链的转录并允许dsRNA的形成。在此类实施例中，趋异启动子还允许至少两个单独发夹RNA的转录。在另一个实施例中，构建体中存在一个盒，该盒包含受到两个单独启动子控制的、处于相同取向的、编码该沉默元件的两个或更多个多核苷酸。在另一个实施例中，构建体中存在处于相同取向的两个或更多个单独的盒，每个盒包含受到启动子控制的、编码该沉默元件的至少一个多核苷酸。
[0085] 本文披露的调控区(即，启动子、转录调控区和翻译终止区)和/或多核苷酸对于宿主细胞而言或彼此之间可以是天然的/同功的。可替代地，本文披露的调控区和/或多核苷酸对于宿主细胞或彼此之间可以是异源的。如本文所用，关于序列的“异源性”是指该序列源于外来物种，或者，如果源于相同物种的话，则是通过蓄意人为干预从其在组合物和/或基因组基因座中的天然形式进行实质性修饰得到的序列。例如，可操作地连接至异源多核苷酸的启动子来自与从其衍生该多核苷酸的物种不同的物种，或者，如果来自相同/类似的物种，那么一方或双方基本上由它们的原来形式和/或基因组基因座修饰得到，或者该启动子不是被可操作地连接的多核苷酸的天然启动子。如本文使用的，嵌合基因包含与转录起始区可操作地连接的编码序列，该转录起始区对于该编码序列是异源的。
[0086] 终止区可以对于转录起始区而言是天然的，可以对于编码沉默元件的可操作地连接的多核苷酸而言是天然的，可以对于植物宿主而言是天然的，或者可以衍生自对于启动子、编码该沉默元件的多核苷酸、植物宿主或其任何组合而言别的来源(即外来的或异源的)。方便的终止区可获自根癌农杆菌(A.tumefaciens)的Ti质粒，诸如章鱼碱合酶和胭脂碱合酶终止区。还参见Guerineau等人(1991)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和普通遗传学]262：141-144；Proudfoot(1991)Cell[细胞]64：671-674；Sanfacon等人(1991)Genes Dev.[基因与发育]5：141-149；Mogen等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2：1261-1272；Munroe等人(1990)Gene[基因]91：151-158；Ballas等人(1989)Nucleic Acids Res.[核酸研究]17：
7891-7903；以及Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.[核酸研究]15：9627-9639。
7891-7903；以及Joshi等人(1987)Nucleic Acids Res.[核酸研究]15：9627-9639。
[0087] 已知有另外的序列修饰能增强细胞宿主中的基因表达。这些包括消除以下序列：编码假聚腺苷酸化信号、外显子-内含子剪接位点信号、转座子样重复的序列、及可能不利于基因表达的其他经充分表征的序列。可将序列的G-C含量调整至通过参照宿主细胞中表达的已知基因而计算出的给定细胞宿主的平均水平。当可能时，修饰序列以避免出现可预见的发夹二级mRNA结构。
[0088] 在制备表达盒时，可以操作各种DNA片段，以提供处于适当取向以及合适时，处于适当阅读框中的DNA序列。为此，可采用衔接子(adapter)或接头以连接DNA片段，或可以涉及其他操作以提供方便的限制位点、移除多余的DNA、移除限制位点等。出于这个目的，可以涉及体外诱变、引物修复、限制性酶切(restriction)、退火、再取代(例如转换和颠换)。
[0089] 多种启动子可用于本发明的实践中。可基于所需结果，选择启动子。核酸可以与组成型启动子、组织偏好性启动子、诱导型启动子或其他启动子组合用于在宿主生物体中的表达。
[0090] 此类组成型启动子包括，例如Rsyn7启动子的核心启动子和其他在WO 99/43838和美国专利号6,072,050中披露的组成型启动子；核心CaMV 35S启动子(Odell等人，(1985)Nature[自然]313：810-812)；稻肌动蛋白(McElroy等人，(1990)Plant Cell[植物细胞]2：163-171)；泛素(Christensen等人(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]12：619-632和Christensen等人(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]18：675-689；pEMU(Last等人(1991)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]81：581-588)；MAS(Velten等人(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2723-2730)；ALS启动子(美国专利号5,659,026)等。
其他组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,
466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。
其他组成型启动子包括例如美国专利号5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,
466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。
[0091] 根据期望的结果，从诱导型启动子表达基因可能是有益的。还可以采用诱导型启动子，例如病原体诱导型启动子。这些启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)的那些启动子，其在被病原体感染后被诱导；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.[荷兰植物病理学杂志]89：245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：645-656；以及Van Loon(1985)Plant
Mol.Virol.[植物分子病毒学]4：111-116。还参见WO 99/43819。
Mol.Virol.[植物分子病毒学]4：111-116。还参见WO 99/43819。
[0092] 此外，由于病原体通过伤口或昆虫损伤找到进入植物的入口，伤口诱导型启动子可以用于本发明的构建中。这种伤口诱导型启动子包括马铃薯蛋白酶抑制剂(pin II)基因(Ryan(1990)Ann.Rev.Phytopath.[植物病理学年鉴]28：425-449；Duan等人(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：494-498)；wun1和wun2，美国专利号5,428,148；win1和win2(Stanford等人(1989)Mol.Gen.Genet.[分子和普通遗传学]215：200-208)；系统素(McGurl等人(1992)Science[科学]225：1570-1573)；WIP1(Rohmeier等人(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]22：783-792；Eckelkamp等人(1993)FEBS Letters[欧洲生化学会联盟通讯]323：73-76)；MPI基因(Corderok等人(1994)Plant J.[植物杂志]6(2)：141-150)；等等。
[0093] 此外，可以在实施例的方法和核苷酸构建体中使用病原体诱导型启动子。这种病原体诱导型启动子包括来自病程相关蛋白(PR蛋白)的那些，其在病原体感染后被诱导；例如，PR蛋白、SAR蛋白、β-1，3-葡聚糖酶、几丁质酶等。参见，例如Redolfi等人(1983)Neth.J.Plant Pathol.[荷兰植物病理学杂志]89：245-254；Uknes等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：645-656；以及Van Loon(1985)Plant Mol.Virol.[植物分子病毒学]4：111-116。还参见WO 99/43819。
[0094] 引人关注的是在病原体侵染部位处或附近局部表达的启动子。参见，例如，Marineau等人(1987)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]9：335-342；Matton等人(1989)Molecular Plant-Microbe Interactions[分子植物-微生物相互作用]2：325-331；
Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]83：2427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.[分子遗传和基因组学]2：93-98和Yang(1996)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]93：14972-14977。还参见，Chen等人(1996)Plant J.[植物杂志]10：955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]91：2507-2511；Warner等人(1993)Plant J.[植物杂志]3：191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell[植物细胞]1：961-968；美国专利号5，750，386(线虫诱导型)。特别引人关注的是玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达是由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)病原体诱导的(参见例如Cordero等人(1992)Physiol.Mol.Plant Path.[生理学与分子植物病理学]41：189-200)。
Somsisch等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]83：2427-2430；Somsisch等人(1988)Mol.Gen.Genet.[分子遗传和基因组学]2：93-98和Yang(1996)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]93：14972-14977。还参见，Chen等人(1996)Plant J.[植物杂志]10：955-966；Zhang等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]91：2507-2511；Warner等人(1993)Plant J.[植物杂志]3：191-201；Siebertz等人(1989)Plant Cell[植物细胞]1：961-968；美国专利号5，750，386(线虫诱导型)。特别引人关注的是玉米PRms基因的诱导型启动子，其表达是由串珠镰刀菌(Fusarium moniliforme)病原体诱导的(参见例如Cordero等人(1992)Physiol.Mol.Plant Path.[生理学与分子植物病理学]41：189-200)。
[0095] 可以使用化学调节型启动子以通过应用外源化学调节剂来调节植物中的基因表达。取决于目标，在应用化学品诱导基因表达的情况下启动子可以是化学诱导型启动子，或者在应用化学品阻抑基因表达的情况下启动子可以是化学阻抑型启动子。化学诱导型启动子是本领域已知的，并且包括但不限于由苯磺酰胺除草剂安全剂激活的玉米In2-2启动子、由用作萌前除草剂的疏水亲电子化合物激活的玉米GST启动子、以及由水杨酸激活的烟草PR-1a启动子。其他目的化学调节的启动子包括类固醇应答性启动子(参见，例如，糖皮质激素诱导型启动子(Schena等人(1991)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]88：10421-10425和McNellis等人(1998)Plant J[植物杂志]14(2)：247-257)以及四环素诱导型和四环素阻抑型启动子(参见例如Gatz等人(1991)Mol Gen Genet[分子遗传和基因组学]227：229-237以及美国专利号5,814,618和5,789,156)。
[0096] 组织偏好性启动子可以用于靶向特定植物组织内的增强的表达。组织偏好性启动子包括Yamamoto等人(1997)Plant J.[植物杂志]12(2)：255-265；Kawamata等人(1997)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]38(7)：792-803；Hansen等人(1997)Mol.GenGenet.[分子遗传学和普通遗传学]254(3)：337-343；Russell等人(1997)
Transgenic Res.[转基因研究]6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(3)：1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2)：
525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2)：513-524；
Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.[细胞分化的结果和问题]20：181-196；Orozco等人(1993)PlantMol Biol.[植物分子生物学]23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc
Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.[植物杂志]4(3)：495-505。必要的话，此类启动子可经修饰用于弱表达。
Transgenic Res.[转基因研究]6(2)：157-168；Rinehart等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(3)：1331-1341；Van Camp等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2)：
525-535；Canevascini等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112(2)：513-524；
Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]35(5)：773-778；Lam(1994)Results Probl.Cell Differ.[细胞分化的结果和问题]20：181-196；Orozco等人(1993)PlantMol Biol.[植物分子生物学]23(6)：1129-1138；Matsuoka等人(1993)Proc
Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]90(20)：9586-9590；和Guevara-Garcia等人(1993)Plant J.[植物杂志]4(3)：495-505。必要的话，此类启动子可经修饰用于弱表达。
[0097] 叶偏好性启动子是本领域已知的。参见，例如，Yamamoto等人(1997)Plant J.[植物杂志]12(2)：255-265；Kwon等人(1994)Plant Physiol.[植物生理学]105：357-67；Yamamoto等人(1994)Plant Cell Physiol.[植物细胞生理学]35(5)：773-778；Gotor等人(1993)Plant J.[植物学]3：509-18；Orozco等人(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]23(6)：1129-1138；以及Matsuoka等人(1993)Proc Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]90(20)：9586-9590。
[0098] 根偏好性启动子是已知的，并且可以选自来自文献的许多可获得的启动子，或从各种相容物种中重新分离。参见，例如，Hire等人(1992)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]20(2)：207-218(大豆根特异性谷氨酰胺合成酶基因)；Keller和Baumgartner(1991)Plant Cell[植物细胞]3(10)：1051-1061(法国菜豆的GRP 1.8基因中的根特异性控制元件)；Sanger等人(1990)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]14(3)：433-443(根癌农杆菌的甘露碱合酶(MAS)的根特异性启动子)；以及Miao等人(1991)Plant Cell[植物细胞]3(1)：11-22(编码细胞溶质谷氨酰胺合成酶(GS)的全长cDNA克隆，其在大豆根和根结节中表达)。
还参见，Bogusz等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2(7)：633-641，其中描述了从来自固氮的非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)以及相关的非固氮的非豆科植物山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶报告基因连接，并且被引入非豆科作物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科作物百脉根(Lotus corniculatus)两者中，并且在两种情况下都保留了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对发根土壤杆菌的高表达的rolC和rolD根诱导性基因的启动子的分析(参见Plant Science[植物科学](Limerick)79(1)：69-76)。他们得出结论，增强子和组织偏好性DNA决定簇在这些启动子中是解离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合以显示编码章鱼碱合酶的土壤杆菌属T-DNA基因尤其是在根尖的表皮中有活性，并且TR2′基因在完整植物中具有根特异性并且被叶组织中的创伤刺激，这是杀昆虫的或杀幼虫的基因一起使用的特别希望的特征组合(参见，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示类似的特征。另外的根偏好性启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29(4)：759-772)；和ro1B启动子(Capana等人(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]25(4)：681-691。还参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；
5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。
还参见，Bogusz等人(1990)Plant Cell[植物细胞]2(7)：633-641，其中描述了从来自固氮的非豆科植物榆科山黄麻(Parasponia andersonii)以及相关的非固氮的非豆科植物山黄麻(Trema tomentosa)的血红蛋白基因分离的两个根特异性启动子。这些基因的启动子与β-葡糖醛酸糖苷酶报告基因连接，并且被引入非豆科作物烟草(Nicotiana tabacum)和豆科作物百脉根(Lotus corniculatus)两者中，并且在两种情况下都保留了根特异性启动子活性。Leach和Aoyagi(1991)描述了他们对发根土壤杆菌的高表达的rolC和rolD根诱导性基因的启动子的分析(参见Plant Science[植物科学](Limerick)79(1)：69-76)。他们得出结论，增强子和组织偏好性DNA决定簇在这些启动子中是解离的。Teeri等人(1989)使用与lacZ的基因融合以显示编码章鱼碱合酶的土壤杆菌属T-DNA基因尤其是在根尖的表皮中有活性，并且TR2′基因在完整植物中具有根特异性并且被叶组织中的创伤刺激，这是杀昆虫的或杀幼虫的基因一起使用的特别希望的特征组合(参见，EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]8(2)：343-350)。与nptII(新霉素磷酸转移酶II)融合的TR1′基因显示类似的特征。另外的根偏好性启动子包括VfENOD-GRP3基因启动子(Kuster等人(1995)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]29(4)：759-772)；和ro1B启动子(Capana等人(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]25(4)：681-691。还参见美国专利号5,837,876；5,750,386；5,633,363；
5,459,252；5,401,836；5,110,732；和5,023,179。
[0099] “种子偏好性”启动子包括“种子特异性”启动子(在种子发育期间有活性的那些启动子如种子贮藏蛋白的启动子)以及“种子发芽性”启动子(在种子发茅期间有活性的那些启动子)。参见Thompson等人，(1989)BioEssays[生物学分析]10：108。这样的种子偏好性启动子包括但不限于Cim1(细胞分裂素诱导的信息)；cZ19B1(玉米19kDa玉米醇溶蛋白)；和milps(肌醇-1-磷酸盐合酶)(参见美国专利号6,225,529，通过引用并入本文)。γ-玉米蛋白和Glob-1是胚乳特异性启动子。对于双子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于：菜豆β-菜豆素、油菜籽蛋白、β-伴大豆球蛋白、大豆凝集素、十字花科蛋白等。对于单子叶植物，种子特异性启动子包括但不限于玉米15kDa玉米蛋白、22kDa玉米蛋白、27kDa玉米蛋白、g-玉米蛋白、waxy蛋白、收缩素(shrunken)1、收缩素2、球蛋白1等。还参见WO 00/12733，其中公开了来自end1和end2基因的种子偏好性启动子。在特定组织中具有“偏好性”表达的启动子在该组织中比在至少一种其他植物组织中以更高程度表达。一些组织偏好性启动子几乎专门在特定组织中表达。
[0100] 在实施例中，植物表达性启动子是维管特异性启动子，例如韧皮部特异性启动子。如本文所使用的，“维管特异性”启动子是至少在维管细胞中表达的启动子或优先在维管细胞中表达的启动子。维管特异性启动子的表达不必仅在维管细胞中，其他细胞类型或组织中的表达也是可能的。如本文所使用的，“韧皮部特异性启动子”是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达性启动子，或优先在韧皮部细胞中表达的启动子。
[0101] 韧皮部特异性启动子的表达不必仅在韧皮部细胞中，在其他细胞类型或组织(例如木质部组织)中的表达也是可能的。在本发明的一个实施例中，韧皮部特异性启动子是至少在韧皮部细胞中表达的植物可表达性启动子，其中与韧皮部细胞中的表达相比，非韧皮部细胞中的表达更有限(或不存在)。根据本发明，合适的维管特异性或韧皮部特异性启动子的实例包括但不限于选自由以下各项组成的组的启动子：SCSV3、SCSV4、SCSV5和SCSV7启动子(Schunmann等人(2003)Plant Functional Biology[植物生物学功能]30：453-60)；发根土壤杆菌的rolC基因启动子(Kiyokawa等人(1994)Plant Physiology[植物生理学]104：801-02；Pandolfini等人(2003)BioMedCentral(BMC)Biotechnology[生物医学中心(BMC)生物技术]3：7，(www.biomedcentral.com/1472-6750/3/7)；Graham等人(1997)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]33：729-35；Guivarc′h等人(1996)；Almon等人(1997)Plant Physiol.[植物生理学]115：1599-607；the rolA gene promoter of Agrobacterium rhizogenes[发根土壤杆菌的rolA基因启动子](Dehio等人(1993)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]23：1199-210)；根癌农杆菌T-DNA基因5的启动子(Korber等人(1991)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]10：3983-91)；稻蔗糖合酶RSs1基因启动子(Shi等人(1994)J.Exp.Bot.[实验植物学杂志]45：623-31)；CoYMV或鸭跖草黄斑驳杆状病毒(Commelina yellow mottle badnavirus)启动子(Medberry等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：185-
92；Zhou等人(1998)Chin.J.Biotechnol.[中国生物技术杂志]14：9-16)；CFDV或椰子叶面腐败病毒启动子(Rohde等人(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]27：623-28；Hehn和Rhode(1998)J.Gen.Virol.[普通病毒学杂志]79：1495-99)；RTBV或水稻东格鲁杆状病毒(rice tungro bacilliform virus)启动子(Yin和Beachy(1995)Plant J.[植物杂志]7：
969-80；Yin等人(1997)Plant J.[植物杂志]12：1179-80)；豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因(Edwards等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]87：3459-63；Brears等人(1991)Plant J.[植物杂志]1：235-44)；马铃薯转化酶基因的iny CD111和inv CD141启动子(Hedley等人(2000)J.Exp.Botany[实验植物学杂志]51：817-21)；从拟南芥中分离的启动子显示在烟草中具有韧皮部特异性表达(Keribundit等人(1991)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]88：5212-16)；VAHOX1启动子区(Tornero等人(1996)Plant J.[植物杂志]9：639-48)；豌豆细胞壁转化酶基因启动子(Zhang等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112：1111-17)；与美国公开专利申请20030106097的几丁质酶相关的内源性棉花蛋白的启动子，这是来自胡萝卜的酸性转化酶基因启动子(Ramloch-Lorenz等人(1993)The Plant J.[植物学杂志]4：545-54)；硫酸盐转运蛋白基因Sultr1的启动子；3(Yoshimoto等人(2003)Plant Physiol.[植物生理学]131：1511-17)；蔗糖合酶基因的启动子(Nolte和Koch(1993)PlantPhysiol.[植物生理学]101：899-905)；以及烟草蔗糖转运蛋白基因的启动子(Kuhn等人(1997)Science[科学]275-1298-1300)。
92；Zhou等人(1998)Chin.J.Biotechnol.[中国生物技术杂志]14：9-16)；CFDV或椰子叶面腐败病毒启动子(Rohde等人(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]27：623-28；Hehn和Rhode(1998)J.Gen.Virol.[普通病毒学杂志]79：1495-99)；RTBV或水稻东格鲁杆状病毒(rice tungro bacilliform virus)启动子(Yin和Beachy(1995)Plant J.[植物杂志]7：
969-80；Yin等人(1997)Plant J.[植物杂志]12：1179-80)；豌豆谷氨酰胺合酶GS3A基因(Edwards等人(1990)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]87：3459-63；Brears等人(1991)Plant J.[植物杂志]1：235-44)；马铃薯转化酶基因的iny CD111和inv CD141启动子(Hedley等人(2000)J.Exp.Botany[实验植物学杂志]51：817-21)；从拟南芥中分离的启动子显示在烟草中具有韧皮部特异性表达(Keribundit等人(1991)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]88：5212-16)；VAHOX1启动子区(Tornero等人(1996)Plant J.[植物杂志]9：639-48)；豌豆细胞壁转化酶基因启动子(Zhang等人(1996)Plant Physiol.[植物生理学]112：1111-17)；与美国公开专利申请20030106097的几丁质酶相关的内源性棉花蛋白的启动子，这是来自胡萝卜的酸性转化酶基因启动子(Ramloch-Lorenz等人(1993)The Plant J.[植物学杂志]4：545-54)；硫酸盐转运蛋白基因Sultr1的启动子；3(Yoshimoto等人(2003)Plant Physiol.[植物生理学]131：1511-17)；蔗糖合酶基因的启动子(Nolte和Koch(1993)PlantPhysiol.[植物生理学]101：899-905)；以及烟草蔗糖转运蛋白基因的启动子(Kuhn等人(1997)Science[科学]275-1298-1300)。
[0102] 可能的启动子还包括洋李甙水解酶(PH DL1.4PRO)的黑樱桃启动子(美国专利号6,797,859)，来自黄瓜和稻的硫氧还蛋白H启动子(Fukuda A等人(2005)Plant Cell
Physiol.[植物细胞生理学]46(11)：1779-86)，稻(RSs1)(Shi，T.Wang等人(1994)
J.Exp.Bot.[实验植物学杂志]45(274)：623-631)和玉米蔗糖合酶-1启动子(Yang.，N-S.等人(1990)PNAS[美国科学院院报]87：4144-4148)，来自南瓜的PP2启动子(Guo，H.等人(2004)Transgenic Research[转基因研究]13：559-566)，At SUC2启动子(Truernit，E.等人(1995)Planta[植物]196(3)：564-70)，At SAM-1(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(Mijnsbrugge KV.等人(1996)Plant Cell.Physiol.[植物细胞生物学]37(8)：1108-1115)，以及水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子(Bhattacharyya-Pakrasi等人(1993)Plant J.[植物杂志]4(1)：
71-79)。
Physiol.[植物细胞生理学]46(11)：1779-86)，稻(RSs1)(Shi，T.Wang等人(1994)
J.Exp.Bot.[实验植物学杂志]45(274)：623-631)和玉米蔗糖合酶-1启动子(Yang.，N-S.等人(1990)PNAS[美国科学院院报]87：4144-4148)，来自南瓜的PP2启动子(Guo，H.等人(2004)Transgenic Research[转基因研究]13：559-566)，At SUC2启动子(Truernit，E.等人(1995)Planta[植物]196(3)：564-70)，At SAM-1(S-腺苷甲硫氨酸合成酶)(Mijnsbrugge KV.等人(1996)Plant Cell.Physiol.[植物细胞生物学]37(8)：1108-1115)，以及水稻东格鲁杆状病毒(RTBV)启动子(Bhattacharyya-Pakrasi等人(1993)Plant J.[植物杂志]4(1)：
71-79)。
[0103] 当希望低水平表达时，可使用弱启动子。通常，如在此使用的术语“弱启动子”是指以低水平驱动编码序列的表达的启动子。低水平表达是指约1/1000转录物至约1/100,000转录物至约1/500,000转录物的水平。可替代地，应当认识到，术语“弱启动子”还涵盖仅在少数细胞中驱动表达但不在其他细胞中表达，从而具有低水平总表达的启动子。当启动子以不可接受的高水平驱动表达时，可以对启动子序列的部分进行缺失或修饰，以降低表达水平。
[0104] 此类弱组成型启动子包括，例如：Rsyn7启动子的核心启动子(WO 99/43838和美国专利号6,072,050)、核心35S CaMV启动子等。其他组成型启动子包括，例如以下美国专利号中所公开的那些；5,608,149；5,608,144；5,604,121；5,569,597；5,466,785；5,399,680；5,268,463；5,608,142；和6,177,611。
[0105] 该表达盒还可以包含选择性标记基因，用于筛选转化的细胞。利用选择性标记基因来筛选转化的细胞或组织。标记基因包括编码抗生素抗性的基因，例如编码新霉素磷酸转移酶II(NEO)和潮霉素磷酸转移酶(HPT)的基因，以及赋予除草剂化合物抗性的基因，例如草胺磷、溴草腈、咪唑啉酮和2，4-二氯苯氧乙酸(2，4-D)。另外的选择性标记包括表型标记，例如β-半乳糖苷酶和荧光蛋白，例如绿色荧光蛋白(GFP)(Su等人(2004)Biotechnol Bioeng[生物技术与生物工程]85：610-9和Fetter等人(2004)Plant Cell[植物细胞]16：215-28)、青色荧光蛋白(CYP)(Bolte等人(2004)J.Cell Science[细胞科学杂志]117：943-
54和Kato等人(2002)Plant Physiol[植物生理学]129：913-42)和黄色荧光蛋白(来自
Evrogen的PhiYFPTM，参见Bolte等人(2004)J.Cell Science[细胞科学杂志]117：943-54)。
对于另外的选择性标记，通常参见，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.[当前对生物技术的意见]3：506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell[细胞]71：63-72；Reznikoff(1992)
Mol.Microbiol.[分子微生物学]6：2419-2422；Barkley等人(1980)于The Operon[操纵子]，第177-220页中；Hu等人(1987)Cell[细胞]48：555-566；Brown等人(1987)Cell[细胞]
49：603-612；Figge等人(1988)Cell[细胞]52：713-722；Deuschle等人(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]86：5400-5404；Fuerst等人(1989)
Proc.Natl.Acad..Sci.USA[美国科学院院刊]86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science[科学]248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University ofHeidelberg[博士论文，海德堡大学]；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]90：1917-1921；
Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.[分子与细胞生物学]10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]89：3952-3956；Baim等人(1991)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.[核酸研究]19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics
Mol.Struc.Biol.[热点分子结构生物学]10：143-162；Degenkolb等人(1991)
Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry[生物化学]27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg[博士论文，海德堡大学]；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]，第78卷(施普林格出版社，柏林)和Gill等人(1988)Nature[自然]334：721-
724。以上选择性标记基因的列表并不意味着是限制性的。任何选择性标记基因都可以与本文所述的组合物和方法一起使用。
54和Kato等人(2002)Plant Physiol[植物生理学]129：913-42)和黄色荧光蛋白(来自
Evrogen的PhiYFPTM，参见Bolte等人(2004)J.Cell Science[细胞科学杂志]117：943-54)。
对于另外的选择性标记，通常参见，Yarranton(1992)Curr.Opin.Biotech.[当前对生物技术的意见]3：506-511；Christopherson等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]89：6314-6318；Yao等人(1992)Cell[细胞]71：63-72；Reznikoff(1992)
Mol.Microbiol.[分子微生物学]6：2419-2422；Barkley等人(1980)于The Operon[操纵子]，第177-220页中；Hu等人(1987)Cell[细胞]48：555-566；Brown等人(1987)Cell[细胞]
49：603-612；Figge等人(1988)Cell[细胞]52：713-722；Deuschle等人(1989)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]86：5400-5404；Fuerst等人(1989)
Proc.Natl.Acad..Sci.USA[美国科学院院刊]86：2549-2553；Deuschle等人(1990)Science[科学]248：480-483；Gossen(1993)Ph.D.Thesis，University ofHeidelberg[博士论文，海德堡大学]；Reines等人(1993)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]90：1917-1921；
Labow等人(1990)Mol.Cell.Biol.[分子与细胞生物学]10：3343-3356；Zambretti等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]89：3952-3956；Baim等人(1991)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]88：5072-5076；Wyborski等人(1991)Nucleic Acids Res.[核酸研究]19：4647-4653；Hillenand-Wissman(1989)Topics
Mol.Struc.Biol.[热点分子结构生物学]10：143-162；Degenkolb等人(1991)
Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]35：1591-1595；Kleinschnidt等人(1988)Biochemistry[生物化学]27：1094-1104；Bonin(1993)Ph.D.Thesis，University of Heidelberg[博士论文，海德堡大学]；Gossen等人(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]89：5547-5551；Oliva等人(1992)Antimicrob.Agents Chemother.[抗微生物剂化学疗法]36：913-919；Hlavka等人(1985)Handbook of Experimental Pharmacology[实验药理学手册]，第78卷(施普林格出版社，柏林)和Gill等人(1988)Nature[自然]334：721-
724。以上选择性标记基因的列表并不意味着是限制性的。任何选择性标记基因都可以与本文所述的组合物和方法一起使用。
[0106] VI.包含沉默元件的组合物
[0107] 包含沉默元件的多核苷酸中的一种或多种可以作为植物、植物部分、种子、昆虫植物有害生物或耕作区的外用组合物，诸如喷雾剂或粉剂提供。在另一个实例中，用DNA构建体或表达盒转化植物，用于至少一个沉默元件的表达。在任一组合物中，在被有害生物摄取时，沉默元件可降低靶标有害生物序列的水平并从而防治该有害生物(即，鞘翅目植物有害生物，包括叶甲属植物有害生物，例如玉米根萤叶甲、巴氏根叶甲、墨西哥玉米根虫、南美叶甲或黄瓜十一星叶甲)。已经认识到，该组合物可以包含如下细胞(诸如植物细胞或细菌细胞)，在该细胞中，编码沉默元件的多核苷酸稳定地被并入到基因组中并可操作地连接到在细胞中有活性的启动子上。还涵盖包含细胞混合物(表达至少一个沉默元件的一些细胞)的组合物。在其他实施例中，包含沉默元件的组合物不包含于细胞中。在此类实施例中，可将该组合物施用到昆虫植物有害生物所栖息的区域。在一个实施例中，将该组合物外用地施用于植物(即，通过喷洒田间或种植区域)来保护植物免受有害生物侵害。以这种方式施用核苷酸的方法是本领域技术人员已知的。
[0108] 还可以将本文披露的组合物配制成诱饵。在此实施例中，这些组合物包含增加该组合物对有害生物的吸引力的食品或引诱剂。
[0109] 包含沉默元件的组合物可在农业上合适的和/或环境上可接受的载体中进行配制。此类载体可以为待处理的动物、植物或环境可耐受的任何材料。此外，此类载体必须使得该组合物在防治昆虫植物有害生物时仍然有效。此类载体的实例包括水、盐水、林格氏溶液、右旋糖或其他糖溶液、汉克氏溶液和其他生理上平衡的水性盐溶液、磷酸盐缓冲液、碳酸氢盐缓冲液以及Tris缓冲液。另外，该组合物可以包括延长组合物半衰期的化合物。各种杀昆虫制剂也可见于例如美国公开2008/0275115、2008/0242174、2008/0027143、2005/
0042245和2004/0127520中。
0042245和2004/0127520中。
[0110] 已经认识到，可使用包含编码沉默元件的序列的多核苷酸来转化生物体，以便宿主生物体产生这些组分，并随后将该宿主生物体施用到一种或多种靶标有害生物的环境中。此类宿主生物体包括杆状病毒、细菌等等。以这种方式，可通过合适的载体将编码沉默元件的多核苷酸的组合引入微生物宿主中，并将所述宿主施用到环境中或者施用到植物或动物上。
[0111] 在将核酸插入细胞的背景下，术语“引入”是指“转染”或“转化”或“转导”，并且包括将核酸并入真核或原核细胞中，在该真核或原核细胞中核酸可以稳定地被并入细胞的基因组(例如，染色体、质粒、质体或线粒体DNA)中，转化为自主复制子，或被瞬时表达(例如转染的mRNA)。
[0112] 可选择如下微生物宿主，已知该微生物宿主可占领一种或多种目的作物的“植物圈”(叶面、叶围、根围和/或根面)。选择这些微生物以便能够在具体环境中成功地与野生型微生物竞争，为编码沉默元件的序列供给稳定的维持和表达，并且理想的是，增加对这些组分的保护使其不受环境降解和失活的影响。
[0113] 此类微生物包括细菌、藻类和真菌。特别引人关注的是微生物，例如细菌，例如假单胞菌属(Pseudomonas)、欧文氏菌属(Erwinia)、沙雷氏菌属(Serratia)、克雷伯氏杆菌属(Klebsiella)、黄单胞菌属(Xanthomonas)、链霉菌属(Streptomyces)、根瘤菌属(Rhizobium)、红假单胞菌属(Rhodopseudomonas)、甲基菌属(Methylius)、土壤杆菌属(Agrobacterium)、醋酸杆菌属(Acetobacter)、乳酸杆菌属(Lactobacillus)、节细菌属(Arthrobacter)、固氮菌属(Azotobacter)、明串珠菌属(Leuconostoc)和产碱杆菌属
(Alcaligenes)；真菌，尤其是酵母，如酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属
(Cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别引人关注的是例如以下的植物圈细菌物种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syrmgae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、富营养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandir)；以及例如以下的植物圈酵母物种：深红酵母(Rhodotorula rubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白色隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomycesrosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(Scerevisiae)、粉红掷孢酵母
(Sporobolomycesrosues)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母
(Kluyveromycesveronae)和出芽短梗霉(Aureobasidiumpollulans)。特别引人关注的是有颜色的微生物。
(Alcaligenes)；真菌，尤其是酵母，如酵母菌属(Saccharomyces)、隐球菌属
(Cryptococcus)、克鲁维酵母菌属(Kluyveromyces)、掷孢酵母属(Sporobolomyces)、红酵母(Rhodotorula)和短梗霉属(Aureobasidium)。特别引人关注的是例如以下的植物圈细菌物种：丁香假单胞菌(Pseudomonas syrmgae)、荧光假单胞菌(Pseudomonas fluorescens)、粘质沙雷氏菌(Serratia marcescens)、木醋杆菌(Acetobacter xylinum)、农杆菌、球形红假单胞菌(Rhodopseudomonas spheroides)、野油菜黄单胞菌(Xanthomonas campestris)、苜蓿根瘤菌(Rhizobium melioti)、富营养产碱菌(Alcaligenes entrophus)、木质棍状杆菌(Clavibacter xyli)和维涅兰德固氮菌(Azotobacter vinlandir)；以及例如以下的植物圈酵母物种：深红酵母(Rhodotorula rubra)、粘红酵母(R.glutinis)、海滨红酵母(R.marina)、橙黄红酵母(R.aurantiaca)、浅白色隐球酵母(Cryptococcusalbidus)、流散隐球酵母(C.diffluens)、罗伦隐球酵母(C.laurentii)、罗斯酵母(Saccharomycesrosei)、普地酵母(S.pretoriensis)、酿酒酵母(Scerevisiae)、粉红掷孢酵母
(Sporobolomycesrosues)、香气掷孢酵母(S.odorus)、佛地克鲁维酵母
(Kluyveromycesveronae)和出芽短梗霉(Aureobasidiumpollulans)。特别引人关注的是有颜色的微生物。
[0114] 有多种方式可用来将包含沉默元件的多核苷酸引入处于如下条件下的微生物宿主中，该条件容许这种核苷酸编码序列的稳定维持和表达。例如，可以构建出如下表达盒，该表达盒包括所感兴趣的为了该核苷酸构建体的表达与转录和翻译调节信号可操作地连接的核苷酸构建体，以及与宿主生物体(在此将发生合并)中的序列同源的核苷酸序列和/或在该宿主(在此将发生合并或稳定维持)中具有功能的复制系统。
[0115] 转录和翻译调节信号包括但不限于启动子、转录起始位点、操纵子、活化子、增强子、其他调节元件、核糖体结合位点、起始密码子、终止信号等。参见，例如美国专利号5,039,523和4,853,331；EP 0480762A2；Sambrook等人(2000)；Molecular Cloning：A rd
Laboratory Manual(3 edition；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)[分子克隆：实验室手册(第3版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)]；Davis等人(1980)Advanced Bacterial Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)[高级细菌遗传学(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)]；以及其中引用的参考文献。
Laboratory Manual(3 edition；Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，NY)[分子克隆：实验室手册(第3版；冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)]；Davis等人(1980)Advanced Bacterial Genetics(Cold Spring Harbor Laboratory，Cold Spring Harbor，NY)[高级细菌遗传学(冷泉港实验室出版社，冷泉港，纽约州)]；以及其中引用的参考文献。
[0116] 合适的宿主细胞包括原核生物和低等真核生物，例如真菌。说明性的原核生物(革兰氏阴性和革兰氏阳性)包括肠杆菌科，如埃希氏杆菌属、欧文氏菌属、志贺氏杆菌、沙门氏菌和变形杆菌；芽孢杆菌科；根瘤科，如根瘤菌；螺菌科，如发光杆菌属、单胞发酵菌属、沙雷菌属、气单孢菌属、弧菌属、脱硫弧菌属、螺旋菌属；乳酸细菌科；假单胞菌科，如假单胞菌属和醋菌属；固氮菌科和硝化杆菌科。真核生物中的真菌，如藻菌和子囊菌纲(包括酵母，如酵母菌属和裂殖酵母属；以及担子菌纲酵母，如红酵母、短梗霉、掷孢酵母等)。
[0117] 在选择宿主细胞方面特别引人关注的特征可以包括易于将编码序列引入该宿主中、表达系统的可用性、表达效率、宿主中的稳定性以及辅助遗传能力的存在。用作杀有害生物剂微胶囊的目的特征包括保护性性质，如细胞壁厚、色素沉着、以及细胞内包装或包涵体的形成；叶亲和力；无哺乳动物毒性；吸引有害生物摄取；等等。其他考虑因素包括易于配制和处理、经济性、储存稳定性等。
[0118] 特别引人关注的宿主生物体包括酵母，例如红酵母属物种(Rhodotorula spp.)、短梗霉属物种(Aureobasidium spp.)、酵母属物种(Saccharomyces spp.)和掷孢酵母属物种(Sporobolomyces spp.)，叶面生物体，例如假单胞菌属物种(Pseudomonas spp.)、欧文氏菌属物种(Erwinia spp.)和黄杆菌属物种(Flavobacterium spp.)，以及其他此类生物体，包括铜绿假单胞菌(Pseudomonas aerugmosa)、荧光假单胞菌、酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)、苏云金芽孢杆菌(Bacillus thuringiensis)、大肠杆菌(Escherichia coli)、枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)等。
[0119] 本发明所包含的编码沉默元件的序列可以被引入到植物上繁殖的微生物(体表寄生菌)中，以将这些组分传递给潜在的靶标有害生物。体表寄生菌，例如可以是革兰氏阳性或革兰氏阴性细菌。
[0120] 可以将沉默元件在细菌宿主中发酵，并且将所得到的细菌以与苏云金芽孢杆菌菌株用作杀昆虫喷雾剂相同的方式进行加工并用作微生物喷雾剂。任何合适的微生物都可以用于此目的。举例来说，假单胞菌已被用来将苏云金芽孢杆菌内毒素表达为包封的蛋白质，并且将所得细胞进行加工并将其作为杀昆虫剂进行喷雾(Gaertner等人(1993)，于Advanced Engineered Pesticides[高级工程杀有害生物剂]，编辑L.Kim(马塞尔·德克尔公司(Marcel Decker，Inc.)))。
[0121] 可替代地，通过将异源基因引入细胞宿主中来产生本文披露的组合物的组分。异源序列的表达直接或间接地导致沉默元件在细胞内产生。然后可以根据常规技术配制这些组合物，以施用于靶标有害生物所寄宿的环境(例如，土壤、水和植物的叶子)中。参见例如EPA0192319，以及其中引用的参考文献。
[0122] 可以用可接受的载体将经转化的微生物配制成单独的或组合的组合物，该组合物为例如悬浮液、溶液、乳剂、扑粉、可分散颗粒、可湿性粉末、以及乳油、气雾剂、浸渍颗粒、辅剂、可涂覆型糊剂，以及还有如聚合物物质中的包封物。
[0123] 上文公开的组合物可以通过添加表面活性剂、惰性载体、防腐剂、湿润剂、摄食刺激剂、引诱剂、包封剂、粘合剂、乳化剂、染料、UV保护剂、缓冲剂、流动剂或肥料、微量营养素供体或其他影响植物生长的制剂来获得。包括但不限于除草剂、杀昆虫剂、杀真菌剂、杀细菌剂、杀线虫剂、杀软体动物剂、杀螨剂、植物生长调节剂、收获助剂(harvest aid)和肥料的一种或多种农用化学品可以与制剂或其他组分的本领域通常使用的载体、表面活性剂或佐剂组合，以促进特定靶标有害生物的产品处理和应用。合适的载体和佐剂可以是固体或液体并且对应于制剂技术中通常使用的物质，例如，天然或再生矿物质、溶剂、分散剂、润湿剂、增粘剂、粘合剂或肥料。这些活性成分(即至少一种沉默元件)通常以组合物的形式被施用，并且可以施用于待处理的作物区域、植物或种子上。例如，可以在准备贮藏于粮仓或筒仓等中或者在贮藏于粮仓或筒仓等中的过程中将这些组合物施用于谷物上。可以将这些组合物与其他化合物同时或相继施用。施用含有至少一种沉默元件的活性成分或组合物的方法包括但不限于叶面施用、种子包衣和土壤施用。施用次数和施用速度取决于相应有害生物侵染的强度。
[0124] 合适的表面活性剂包括但不限于阴离子化合物，例如羧酸盐，如金属的羧酸盐；长链脂肪酸的羧酸盐；N-酰基肌氨酸盐；磷酸与脂肪醇乙氧基化物的单酯或二酯或这些酯的盐；脂肪醇硫酸盐，如十二烷基硫酸钠、十八烷基硫酸钠或十六烷基硫酸钠；乙氧基化脂肪醇硫酸盐；乙氧基化烷基酚硫酸盐；木质素磺酸盐；石油磺酸盐；烷基芳基磺酸盐，例如烷基苯磺酸盐或低级烷基木素磺化盐，如丁基木素磺化盐；磺化萘-甲醛缩合物的盐；磺化苯酚-甲醛缩合物的盐；更复杂的磺酸盐，例如酰胺磺酸盐，如油酸和N-甲基牛磺酸的磺化缩合产物；或二烷基磺基琥珀酸盐，例如，磺酸钠或二辛基琥珀酸盐。非离子剂包括脂肪酸酯、脂肪醇、脂肪酸酰胺或者经脂肪烷基或烯基取代的酚与环氧乙烷的缩合产物，多元醇醚的脂肪酯(例如脱水山梨糖醇脂肪酸酯)，这种酯类与环氧乙烷的缩合产物(例如聚氧乙烯脱水山梨糖醇脂肪酸酯)，环氧乙烷和环氧丙烷的嵌段共聚物，炔二醇(例如2，4，7，9-四乙基-5-癸炔-4，7-二醇，或者乙氧基化的炔二醇)。阳离子表面活性剂的实例包括例如脂肪族单胺、二胺或多胺诸如乙酸盐、环烷酸盐或者油酸盐；或含氧胺，如聚氧乙烯烷基胺的氧化胺；通过羧酸与二胺或多胺的缩合制备的酰胺连接的胺；或季铵盐。
[0126] 包含沉默元件的这些组合物可以处于用于直接施用的合适形式或作为主要组合物的浓缩物，该浓缩物在施用前需要用适量的水或其他稀释剂进行稀释。
[0127] 这些组合物(包括经转化的微生物)可以通过例如以如下方式施用于昆虫有害生物(例如鞘翅目植物有害生物或叶甲属植物有害生物)的环境中：喷雾、雾化、撒粉、散射、涂覆或浇注、引入到土壤中或土壤上、引入到灌溉水中、在有害生物已开始出现时或者在有害生物出现前进行种子处理或普通施用或撒粉作为保护措施。例如，可以将该一种或多种组合物和/或一种或多种经转化的微生物与谷物混合以在储存期间保护谷物。总体而言重要的是在植物生长的早期阶段获得对有害生物的良好防治，因为这是植物可能受到最严重损害的时候。如果认为必要，这些组合物可方便地含有另一种杀昆虫剂。在本发明的实施例中，在种植时将该一种或多种组合物直接施用于土壤，施用的形式为载体与芽孢杆菌菌株的或者本发明经转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。另一个实施例是包含惰性载体中的农业化学品(例如除草剂、杀昆虫剂、肥料)与芽孢杆菌菌株的或本发明经转化微生物的死细胞的组合物的颗粒形式。
[0128] VII.植物、植物部分及将序列引入植物中的方法
[0129] 在一个实施例中，本发明的方法涉及将多核苷酸引入植物中。“引入”旨在表示以使得该序列进入该植物细胞的内部的方式，将该多核苷酸呈送给该植物。本发明的方法不取决于用于将序列引入植物中的具体方法，只要多核苷酸或多肽进入该植物的至少一个细胞的内部即可。将多核苷酸引入植物的方法是本领域已知的，该方法包括但不限于稳定转化法、瞬时转化法和病毒介导法。
[0130] “稳定转化”旨在表示经引入植物中的核苷酸构建体合并到该植物的基因组中，并且能够被其子代遗传。“瞬时转化”旨在表示将多核苷酸引入该植物中并且不整合到该植物的基因组中，或者将多肽引入植物中。
[0131] 转化方案连同用于将多肽或多核苷酸序列引入植物中的方案可以取决于被靶向转化的植物或植物细胞的类型(即，单子叶植物或双子叶植物)而变化。用于将多肽和多核苷酸引入植物细胞的适合的方法包括显微注射(Crossway等人(1986)Biotechniques[生物技术]4：320-334)、电穿孔(Riggs等人(1986)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]83：5602-5606)、土壤杆菌介导的转化(美国专利号5,563,055和美国专利号5,981,840)、直接基因转移(Paszkowski等人(1984)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]3：2717-2722)、和弹道粒子加速法(参见例如美国专利号4,945,050；美国专利号5,879,918；美国专利号5,
886,244；和5,932,782；Tomes等人(1995)在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：
Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]中，Gamborg和Phillips编辑(施普林格出版公司(Springer-Verlag)，柏林)；McCabe等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：923-926)；和Lec1转化法(WO 00/28058)。也参见Weissinger等人(1988)
Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology[生物学/技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞与发育生物学]27P：
175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(稻)；Klein等人(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)
Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855、5,322,783、和5,324,
646；Klein等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)在The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues[卵巢组织的实验操作]中，Chapman等人编辑(纽约朗文出版社(Longman，New York))第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler等人(1992)
Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报告]12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany[植物学年鉴]
75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌获得的玉米)。
886,244；和5,932,782；Tomes等人(1995)在Plant Cell，Tissue，and Organ Culture：
Fundamental Methods[植物细胞、组织和器官培养：基础方法]中，Gamborg和Phillips编辑(施普林格出版公司(Springer-Verlag)，柏林)；McCabe等人(1988)Biotechnology[生物技术]6：923-926)；和Lec1转化法(WO 00/28058)。也参见Weissinger等人(1988)
Ann.Rev.Genet.[遗传学年鉴]22：421-477；Sanford等人(1987)Particulate Science and Technology[微粒科学与技术]5：27-37(洋葱)；Christou等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]87：671-674(大豆)；McCabe等人(1988)Bio/Technology[生物学/技术]6：923-926(大豆)；Finer和McMullen(1991)In Vitro Cell Dev.Biol.[体外细胞与发育生物学]27P：
175-182(大豆)；Singh等人(1998)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]96：319-324(大豆)；Datta等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：736-740(稻)；Klein等人(1988)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]85：4305-4309(玉米)；Klein等人(1988)
Biotechnology[生物技术]6：559-563(玉米)；美国专利号5,240,855、5,322,783、和5,324,
646；Klein等人(1988)Plant Physiol.[植物生理学]91：440-444(玉米)；Fromm等人(1990)Biotechnology[生物技术]8：833-839(玉米)；Hooykaas-Van Slogteren等人(1984)Nature[自然](伦敦)311：763-764；美国专利号5,736,369(谷类)；Bytebier等人(1987)
Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]84：5345-5349(百合科)；De Wet等人(1985)在The ExperimentalManipulation of Ovule Tissues[卵巢组织的实验操作]中，Chapman等人编辑(纽约朗文出版社(Longman，New York))第197-209页(花粉)；Kaeppler等人(1990)Plant Cell Reports[植物细胞报告]9：415-418和Kaeppler等人(1992)
Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]84：560-566(须介导的转化)；D′Halluin等人(1992)Plant Cell[植物细胞]4：1495-1505(电穿孔)；Li等人(1993)Plant Cell Reports[植物细胞报告]12：250-255以及Christou和Ford(1995)Annals of Botany[植物学年鉴]
75：407-413(稻)；Osjoda等人(1996)Nature Biotechnology[自然生物技术]14：745-750(经由根癌农杆菌获得的玉米)。
[0132] 在某些实施例中，可以使用各种瞬时转化法向植物提供本文披露的沉默元件。这种瞬时转化法包括但不限于将蛋白质或者其变体或片段直接引入植物中或将转录物引入植物中。此类方法包括例如显微注射或粒子轰击。参见例如Crossway等人(1986)Mol Gen.Genet.[分子遗传学和基因组学]202：179-185；Nomura等人(1986)Plant Sci.[植物科学]44：53-58；Hepler等人(1994)Proc.Natl.Acad.Sci.[美国国家科学院院刊]91：2176-
2180和Hush等人(1994)The Journal of Cell Science[细胞科学杂志]107：775-784。可替代地，可以使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化到植物中。此类技术包括病毒载体系统，和以阻止DNA后续释放的方式使多核苷酸沉淀。这种方法包括使用包被有聚乙烯亚胺(PEI；西格玛(Sigma)#P3143)的粒子。
2180和Hush等人(1994)The Journal of Cell Science[细胞科学杂志]107：775-784。可替代地，可以使用本领域已知的技术将多核苷酸瞬时转化到植物中。此类技术包括病毒载体系统，和以阻止DNA后续释放的方式使多核苷酸沉淀。这种方法包括使用包被有聚乙烯亚胺(PEI；西格玛(Sigma)#P3143)的粒子。
[0133] 在其他实施例中，可以通过使植物与病毒或病毒核酸接触将本文披露的多核苷酸引入植物中。通常，此类方法涉及将本发明的核苷酸构建体并入病毒DNA或RNA分子内。此外，已经认识到，启动子还可以涵盖用于通过病毒RNA聚合酶转录的启动子。涉及病毒DNA或RNA分子、用于将多核苷酸引入植物中并于其中表达所编码的蛋白质的方法是本领域已知的。参见例如，美国专利号5,889,191、5,889,190、5,866,785、5,589,367、5,316,931和Porta等人(1996)Molecular Biotechnology[分子生物技术]5：209-221。
[0134] 用于在植物基因组的特定位置靶向插入多核苷酸的方法是本领域已知的。在一个实施例中，利用位点特异性重组系统实现多核苷酸在所希望的基因组位置处的插入。参见例如WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855和WO 99/25853。简言之，本文披露的多核苷酸可以包含在侧翼为两个非引起重组的重组位点的转移盒中。将转移盒引入使如下靶位点稳定地并入其基因组中的植物中，该靶位点的侧翼为与该转移盒的这些位点相对应的两个非引起重组的重组位点。提供适当的重组酶，并将该转移盒整合到靶位点。由此，目的多核苷酸被整合在植物基因组中的特定染色体位置处。
[0135] 可依据常规方式将已转化的细胞培育成植株。参见例如，McCormick等人(1986)Plant Cell Reports[植物细胞报告]5：81-84。然后可以培育这些植株，并用相同的经转化的株系或者不同的株系进行授粉，并鉴定出具有所希望的表型特征的组成型表达的所得后代。可以培育两代或更多代植株，确保所希望的表型特征的表达得到稳定保持和遗传，并且然后收获种子以确保已实现所希望的表型特征的表达。以这种方式，本文所述的组合物和方法提供了如下经转化的种子(也称为“转基因种子”)，该种子将本文披露的多核苷酸(例如表达盒)稳定地并入其基因组中。
[0136] 如本文所用，术语植物包括植物细胞、植物原生质体、可再生植物的植物细胞组织培养物、植物愈伤组织、植物块和在植物或植物部分(例如胚、花粉、胚珠、种子、叶、花、枝、果、核、穗、穗轴、壳、茎、根、根尖、花药等)中的完整植物细胞。谷物意指由商业种植者出于栽培或繁殖物种之外的目的所生产的成熟种子。这些再生植物的后代、变体和突变体也包括在本发明的范围内，条件是这些部分包含经引入的多核苷酸。
[0137] 本文描述的组合物和方法可用于转化任何植物物种，包括但不限于单子叶植物和双子叶植物。目的植物物种的实例包括但不限于玉米(玉蜀黍)，芸苔属物种(例如，甘蓝型油菜、芜菁、芥菜)(特别是可用作种子油来源的那些芸苔属物种)，苜蓿(紫花苜蓿(Medicago sativa))，稻(rice，Oryza sativa)，黑麦(rye，Secale cereale)，高粱(甜高粱(Sorghum bicolor)，高粱(Sorghum vulgare))，粟(例如，珍珠粟(御谷(Pennisetum glaucum))，黍(粟米(Panicum miliaceum))，粟(谷子(Setaria italica))，穇子(龙爪稷(Eleusine coracana)))，向日葵(sunflower，Helianthus annuus)，红花(safflower，Carthamus tinctorius)，小麦(wheat，Triticum aestivum)，大豆(soybean，Glycine max)，烟草(tobacco，Nicotiana tabacum)，马铃薯(potato，Solanum tuberosum)，花生(peanut，Arachis hypogaea)，棉花(海岛棉(Gossypium barbadense)、陆地棉(Gossypium hirsutum))，甘薯(番薯(Ipomoea batatas))，木薯(cassava，Manihot esculenta)，咖啡(咖啡属物种(Coffea spp.))，椰子(coconut，Cocos nucifera)，菠萝(pineapple，Ananas comosus)，柑橘树(柑橘属物种(Citrus spp.))，可可(cocoa，Theobroma cacao)，茶树(tea，Camellia sinensis)，香蕉(芭蕉属物种(Musa spp.))，鳄梨(avocado，Persea americana)，无花果(fig或(Ficus casica))，番石榴(guava，Psidium guajava)，芒果(mango，Mangifera indica)，橄榄(olive，Olea europaea)，木瓜(番木瓜(Carica
papaya))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta
vulgaris)，甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。
papaya))，腰果(cashew，Anacardium occidentale)，澳洲坚果(macadamia，Macadamia integrifolia)，巴旦杏(almond，Prunus amygdalus)，甜菜(sugar beets，Beta
vulgaris)，甘蔗(甘蔗属物种(Saccharum spp.))，燕麦，大麦，蔬菜，观赏植物和针叶树。
[0138] 蔬菜包括番茄(tomatoes，Lycopersicon esculentum)、莴苣(例如，莴苣(Lactuca sativa))、青豆(菜豆(Phaseolus vulgaris))、利马豆(lima bean，Phaseolus limensis)、豌豆(香豌豆属(Lathyrus spp.))和黄瓜属的成员诸如黄瓜(cucumber，C.sativus)、香瓜(cantaloupe，C.cantalupensis)和甜瓜(musk melon，C.melo)。观赏植物包括杜鹃(杜鹃花属(Rhododendron spp.))、绣球花(hydrangea，Macrophylla hydrangea)、木槿(hibiscus，Hibiscus rosasanensis)、玫瑰(蔷薇属(Rosa spp.))、郁金香(郁金香属(Tulipa spp.))、水仙(水仙属(Narcissus spp.))、矮牵牛(petunias，Petunia hybrida)、康乃馨(carnation，Dianthus caryophyllus)、一品红(poinsettia，Euphorbia pulcherrima)和菊花。
[0139] 可以用于实践本文所述组合物和方法的针叶树包括(例如)松树诸如火炬松(loblolly pine，Pinus taeda)、湿地松(slash pine，Pinus elliotii)、西黄松
(ponderosa pine，Pinus ponderosa)、黑松(lodgepole pine，Pinus contorta)和辐射松(Monterey pine，Pinus radiata)；花旗松(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；西方铁杉(Western hemlock，Tsuga canadensis)；北美云杉(白云杉(Piceaglauca))；红杉(北美红杉(Sequoia sempervirens))；枞树(true firs)诸如银杉(胶冷杉(Abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉(Abues balsamea))；以及雪松，诸如西方红雪松(北美乔柏(Thuja
plicata))和阿拉斯加黄-雪松(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。在某些实施例中，本文所述组合物和方法可以与植物一起使用，例如作物植物(如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物以及甘蔗植物是最佳的，并且在仍然其他的实施例中，玉米植物是最佳的。
(ponderosa pine，Pinus ponderosa)、黑松(lodgepole pine，Pinus contorta)和辐射松(Monterey pine，Pinus radiata)；花旗松(Douglas-fir，Pseudotsuga menziesii)；西方铁杉(Western hemlock，Tsuga canadensis)；北美云杉(白云杉(Piceaglauca))；红杉(北美红杉(Sequoia sempervirens))；枞树(true firs)诸如银杉(胶冷杉(Abies amabilis))和胶枞(香脂冷杉(Abues balsamea))；以及雪松，诸如西方红雪松(北美乔柏(Thuja
plicata))和阿拉斯加黄-雪松(黄扁柏(Chamaecyparis nootkatensis))。在某些实施例中，本文所述组合物和方法可以与植物一起使用，例如作物植物(如玉米、苜蓿、向日葵、芸苔、大豆、棉花、红花、花生、高粱、小麦、粟、烟草等)。在其他实施例中，玉米和大豆植物以及甘蔗植物是最佳的，并且在仍然其他的实施例中，玉米植物是最佳的。
[0140] 其他目的植物包括提供目的种子的谷物类植物、油料种子植物和豆科植物。目的种子包括谷物种子，例如玉米、小麦、大麦、稻、高粱、黑麦等。油料种子植物包括棉花、大豆、红花、向日葵、芸苔属、玉蜀黍、苜蓿、棕榈、椰子等。豆科植物包括豆类和豌豆。豆类包括瓜尔豆、槐豆、胡芦巴、大豆、四季豆、豇豆、绿豆、利马豆、蚕豆、小扁豆、鹰嘴豆等。
[0141] VIII.转基因植物中性状的堆叠
[0142] 如本文所披露的，转基因植物可以包含大量的如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个靶标多核苷酸、或其变体或片段、或其互补序列，以及一种或多种另外的多核苷酸，该多核苷酸导致多个多肽序列的产生或抑制。包含多核苷酸序列堆叠的转基因植物可以通过传统育种方法或通过遗传工程方法中的一种或两种获得。这些方法包括但不限于，育种各自包含目的多核苷酸的单个品系、如本文所披露的用随后的基因转化包含如下表达构建体的转基因植物，该表达构建体包含如SEQ ID NO.：l-49中所示的各种靶标多核苷酸，或者编码涉及这种靶标序列变体或其片段、或其互补序列的沉默元件，和将基因共转化入单个植物细胞中。如本文所使用的，术语“堆叠”包括使多个性状存在于相同植物中(即，两个性状都并入核基因组中、一个性状并入核基因组中并且另一个性状并入质体的基因组中、或者两种性状都并入质体的基因组中)。在一个非限制性实例中，“堆叠性状”包括如下分子堆叠物，在该分子堆叠物中，这些序列在物理上彼此相邻。如本文使用的性状是指源自特定序列或序列组群的表型。可以使用包含多个多核苷酸或分别携带于多个载体上的多核苷酸的单一转化载体进行多核苷酸的共转化。如果通过遗传转化植物来堆叠序列，则目的多核苷酸序列可以在任意时间并以任意顺序组合。可以用共转化方案将这些性状与转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸一起引入。例如，若引入两个序列，则这两个序列可包含在分开的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)中。这些序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。应当进一步认识到，可以使用位点特异重组系统，在希望的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见，例如WO 1999/25821、WO 1999/25854、WO 1999/25840、WO 1999/25855和WO 1999/25853。
[0143] 在一些实施例中，如本文所披露的，单独的或与一种或多种另外的昆虫抗性性状相堆叠的如SEQ ID NO.：1-49中所示的各种靶标多核苷酸、涉及这类靶标序列的沉默元件、以及其变体或片段、或其互补序列，可以与一种或多种另外的输入性状(例如，除草剂抗性、真菌抗性、病毒抗性、胁迫耐受性、抗病性、雄性不育性、茎秆强度等)或产出性状(例如，增加的产量、经修饰的淀粉、改进的油特性、平衡的氨基酸、高赖氨酸或甲硫氨酸、增加的消化性、改善的纤维品质、抗旱性等)相堆叠。因此，多核苷酸实施例可用于提供具有灵活地且成本有效地控制任何数量的农艺有害生物的能力的经改善的作物品质的完整农艺学方案。
[0144] 可用于堆叠的转基因包括但不限于下文所述的那些转基因。
[0145] i.赋予昆虫抗性或抗病性的转基因
[0146] (A)植物抗病性基因。通常通过植物中抗病性基因(R)的产物与病原体中相应的无毒性(Avr)基因的产物之间的特异性相互作用来激活植物防御。可以用经克隆的抗性基因来转化植物变种，以工程化对特定病原体菌株具有抗性的植物。参见，例如Jones等人(1994)Science[科学]266：789(cloning of the tomato Cf-9 gene for resistance to Cladosporium fulvum[克隆番茄Cf-9基因以抵抗番茄叶霉病菌])；Martin等人(1993)Science[科学]262：1432(tomato Pto gene for resistance to Pseudomonas syringae pv.tomato encodes a protein kinase[用于抵抗丁香假单胞菌番茄致病变种的番茄Pto基因编码蛋白激酶])；Mindrinos等人，(1994)Cell[细胞]78：1089(Arabidopsis RSP2 gene for resistance to Pseudomonas syringae[拟南芥RSP2基因用于对抗丁香假单胞菌])，McDowell和Woffenden，(2003)Trends Biotechnol.[生物科技趋势]21(4)：178-83以及Toyoda等人，(2002)Transgenic Res.[转基因研究]11(6)：567-82。与野生型植物相比，对疾病具有抗性的植物对病原体更具抗性。
[0147] (B)编码苏云金芽孢杆菌蛋白质的基因，其衍生物或其上建模的合成多肽。参见，例如，Geiser等人，(1986)Gene[基因]48：109，其公开了Bt δ-内毒素基因的克隆和核苷酸序列。此外，编码δ-内毒素基因的DNA分子可购自美国典型培养物保藏中心(American Type Culture Collection)(美国马里兰州罗克韦尔市(Rockville，Md.))，例如 登录号40098、67136、31995和31998下。经遗传工程化的苏云金芽孢杆菌转基因的其他非限制性实例在以下专利和专利申请中给出，并且特此通过引用并入本文中：美国专利号5,188,960；
5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,620,
988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7,105,332；7,179,965、7,208,474；7,227,056、7,
288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,544,
862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849和WO
1991/14778；WO 1999/31248；WO 2001/12731；WO 1999/24581和WO 1997/40162。
5,689,052；5,880,275；5,986,177；6,023,013、6,060,594、6,063,597、6,077,824、6,620,
988、6,642,030、6,713,259、6,893,826、7,105,332；7,179,965、7,208,474；7,227,056、7,
288,643、7,323,556、7,329,736、7,449,552、7,468,278、7,510,878、7,521,235、7,544,
862、7,605,304、7,696,412、7,629,504、7,705,216、7,772,465、7,790,846、7,858,849和WO
1991/14778；WO 1999/31248；WO 2001/12731；WO 1999/24581和WO 1997/40162。
[0148] 也可以堆叠编码杀有害生物蛋白的基因，该基因包括但不限于：来自假单胞菌属的杀昆虫蛋白，例如PSEEN3174(Monalysin，(2011)PLoS Pathogens[PLoS病原体]，7：1-13)，来自假单胞菌蛋白菌菌株CHA0和Pf-5(之前为荧光假单胞菌(fluorescens))(Pechy-Tarr，(2008)Environmental Microbiology[环境微生物学]10：2368-2386：基因库登录号EU400157)；来自台湾假单胞菌(Pseudomonas taiwanensis)(Liu等人，(2010)
J.Agric.Food Chem.[农业食品化学学报]58：12343-12349)和来自假产碱假单胞菌
(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(Zhang等人，(2009)Annals of Microbiology[微生物学年报]59：45-50和Li等人，(2007)Plant CellTiss.Organ Cult.[植物细胞组织和器官培养]89：159-168)；来自发光杆菌属和致病杆菌属的杀昆虫蛋白(Hinchliffe等人，(2010)The Open Toxinology Journal[开放性毒理学杂志]3：101-118和Morgan等人，(2001)Applied and Envir.Micro.[应用与环境微生物学]67：2062-2069)，美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946；美国专利公开US 20140007292的PIP-1多肽；美国专利公开US
20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国专利公开号US 20140274885和US
20160040184的PHI-4多肽；PCT公开号WO 201 5/023846的PIP-47多肽、PCT公开号WO 2015/
038734的PIP-72多肽；PCT公开号WO 2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽；PCT公开号WO 2015/120276的PtIP-83多肽；PCT序列号PCT/US 15/55502的PtIP-96多肽；以及δ-内毒素，包括但不限于Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry51和Cry55类的δ-内毒素基因和苏云金芽孢杆菌溶细胞Cyt1和Cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的这些类别的成员包括但不限于Cry1Aa1(登录号AAA22353)；Cry1Aa2(登录号AAA22552)；Cry1Aa3(登录号BAA00257)；Cry1Aa4(登录号CAA31886)；Cry1Aa5(登录号BAA04468)；Cry1Aa6(登录号AAA86265)；Cry1Aa7(登录号AAD46139)；Cry1Aa8(登录号I26149)；Cry1Aa9(登录号BAA77213)；Cry1Aa10(登录号AAD55382)；Cry1Aa11(登录号CAA70856)；Cry1Aa12(登录号AAP80146)；Cry1Aa13(登录号AAM44305)；Cry1Aa14(登录号AAP40639)；Cry1Aa15(登录号AAY66993)；Cry1Aa16(登录号HQ439776)；Cry1Aa17(登录号HQ439788)；Cry1Aa18(登录号HQ439790)；Cry1Aa19(登录号HQ685121)；Cry1Aa20(登录号JF340156)；Cry1Aa21(登录号JN651496)；Cry1Aa22(登录号KC158223)；Cry1Ab1(登录号AAA22330)；Cry1Ab2(登录号AAA22613)；Cry1Ab3(登录号AAA22561)；Cry1Ab4(登录号BAA00071)；Cry1Ab5(登录号CAA28405)；Cry1Ab6(登录号AAA22420)；Cry1Ab7(登录号CAA31620)；Cry1Ab8(登录号AAA22551)；Cry1Ab9(登录号CAA38701)；Cry1Ab10(登录号A29125)；Cry1Ab11(登录号I12419)；Cry1Ab12(登录号AAC64003)；Cry1Ab13(登录号
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J.Agric.Food Chem.[农业食品化学学报]58：12343-12349)和来自假产碱假单胞菌
(Pseudomonas pseudoalcaligenes)(Zhang等人，(2009)Annals of Microbiology[微生物学年报]59：45-50和Li等人，(2007)Plant CellTiss.Organ Cult.[植物细胞组织和器官培养]89：159-168)；来自发光杆菌属和致病杆菌属的杀昆虫蛋白(Hinchliffe等人，(2010)The Open Toxinology Journal[开放性毒理学杂志]3：101-118和Morgan等人，(2001)Applied and Envir.Micro.[应用与环境微生物学]67：2062-2069)，美国专利号6,048,838和美国专利号6,379,946；美国专利公开US 20140007292的PIP-1多肽；美国专利公开US
20140033361的AfIP-1A和/或AfIP-1B多肽；美国专利公开号US 20140274885和US
20160040184的PHI-4多肽；PCT公开号WO 201 5/023846的PIP-47多肽、PCT公开号WO 2015/
038734的PIP-72多肽；PCT公开号WO 2015/120270的PtIP-50多肽和PtIP-65多肽；PCT公开号WO 2015/120276的PtIP-83多肽；PCT序列号PCT/US 15/55502的PtIP-96多肽；以及δ-内毒素，包括但不限于Cry1、Cry2、Cry3、Cry4、Cry5、Cry6、Cry7、Cry8、Cry9、Cry10、Cry11、Cry12、Cry13、Cry14、Cry15、Cry16、Cry17、Cry18、Cry19、Cry20、Cry21、Cry22、Cry23、Cry24、Cry25、Cry26、Cry27、Cry28、Cry29、Cry30、Cry31、Cry32、Cry33、Cry34、Cry35、Cry36、Cry37、Cry38、Cry39、Cry40、Cry41、Cry42、Cry43、Cry44、Cry45、Cry46、Cry47、Cry49、Cry51和Cry55类的δ-内毒素基因和苏云金芽孢杆菌溶细胞Cyt1和Cyt2基因。苏云金芽孢杆菌杀昆虫蛋白的这些类别的成员包括但不限于Cry1Aa1(登录号AAA22353)；Cry1Aa2(登录号AAA22552)；Cry1Aa3(登录号BAA00257)；Cry1Aa4(登录号CAA31886)；Cry1Aa5(登录号BAA04468)；Cry1Aa6(登录号AAA86265)；Cry1Aa7(登录号AAD46139)；Cry1Aa8(登录号I26149)；Cry1Aa9(登录号BAA77213)；Cry1Aa10(登录号AAD55382)；Cry1Aa11(登录号CAA70856)；Cry1Aa12(登录号AAP80146)；Cry1Aa13(登录号AAM44305)；Cry1Aa14(登录号AAP40639)；Cry1Aa15(登录号AAY66993)；Cry1Aa16(登录号HQ439776)；Cry1Aa17(登录号HQ439788)；Cry1Aa18(登录号HQ439790)；Cry1Aa19(登录号HQ685121)；Cry1Aa20(登录号JF340156)；Cry1Aa21(登录号JN651496)；Cry1Aa22(登录号KC158223)；Cry1Ab1(登录号AAA22330)；Cry1Ab2(登录号AAA22613)；Cry1Ab3(登录号AAA22561)；Cry1Ab4(登录号BAA00071)；Cry1Ab5(登录号CAA28405)；Cry1Ab6(登录号AAA22420)；Cry1Ab7(登录号CAA31620)；Cry1Ab8(登录号AAA22551)；Cry1Ab9(登录号CAA38701)；Cry1Ab10(登录号A29125)；Cry1Ab11(登录号I12419)；Cry1Ab12(登录号AAC64003)；Cry1Ab13(登录号
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[0149] δ-内毒素的实例还包括但不限于：美国专利号5,880,275和7,858,849的Cry1A蛋白；美国专利号8,304,604和8.304,605的DIG-3或DIG-11毒素(cry蛋白(如Cry1A)的α螺旋1和/或α螺旋2变体的N末端缺失)，美国专利申请序列号10/525,318的Cry1B；美国专利号6,033,874的Cry1C；美国专利号5,188,960、6,218,188的Cry1F；美国专利号7,070,982、6,
962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体)；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白如Cry2Ab蛋白；
Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的工程化杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,
378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白，如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E、和Cry9F家族的成员；Cry15蛋白，描述于以下文献中：Naimov等人(2008)Applied and
EnvironMental Microbiology[应用与环境微生物学]74：7145-7151；美国专利号6,127,
180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,
399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和CryET34蛋白；美国专利公开号
2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；
美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；US 2008/0295207的TIC807；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利公开号2016/0108428的TIC1100、TIC 860、TIC867、TIC868、TIC869和TIC836。美国专利号8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；US 7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/
083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；US 2004/0250311的AXMI-008；US 2004/0216186的AXMI-006；US 2004/0210965的AXMI-007；US 2004/0210964的AXMI-009；US 2004/0197917的AXMI-014；US 2004/
0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-
007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；US 20110023184的AXMI-205；US 2011/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-
013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063、和AXMI-064；US 2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO
2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO11/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230、和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；US 2010/
0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、和AXMI-045；US 20090144852的AXMI-
066和AXMI-076；美国专利号8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；US 2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；和美国专利号8,319,019的具有修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；
美国专利申请公开号2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、
Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白，和PCT公开号WO 2016/061197的IP1B。其他Cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见Crickmore等人，“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_
Crickmore/Bt/，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员所熟知的(回顾参见van Frannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101：1-16)。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员所熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得监管部门的批准(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9：283-300和CERA(2010)转基因作物数据库环境风险评估中心(CERA)(GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment)，ILSI研究基金会，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。本领域技术人员熟知的多种杀有害生物蛋白也可以在植物中表达：如Vip3Ab&Cry1Fa(US 2012/0317682)、Cry1BE&Cry1F(US 2012/0311746)、Cry1CA&Cry1AB(US 2012/0311745)、Cry1F&CryCa(US 2012/0317681)、Cry1DA&Cry1BE(US
2012/0331590)、Crv1DA&Crv1Fa(US 2012/0331589)、Cry1AB&Cry1BE(US 2012/0324606)以及Cry1Fa&Cry2Aa、Cry1I或Cry1E(US 2012/0324605))；Cry34Ab/35Ab以及Cry6Aa(US
20130167269)；Cry34Ab/VCry35Ab和Cry3Aa(US 20130167268)；Cry3A和Cry1Ab或Vip3Aa(US 20130116170)；以及Cry1F、Cry34Ab1和Cry35Ab1(PCT/US 2010/060818)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，这些杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7，491，869的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Purcell等人，(1993)Biochem Biophys Res Commun[生物化学与生物物理学研究通讯]15：1406-1413)。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,
877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020中的VIP(营养性杀昆虫蛋白)毒素等。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括可从如下生物体获得的毒素复合物(TC)蛋白质：致病杆菌、发光杆菌和类芽孢杆菌(参见美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素(stand-alone toxin)的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)增强了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的实例包括但不限于莱科毒素-1肽及其突变体(美国专利号8,334,
366)。
962,705和6,713,063的Cry1A/F嵌合体)；美国专利号7,064,249的Cry2蛋白如Cry2Ab蛋白；
Cry3A蛋白，包括但不限于通过融合至少两种不同Cry蛋白的可变区和保守区的独特组合产生的工程化杂合杀昆虫蛋白(eHIP)(美国专利申请公开号2010/0017914)；Cry4蛋白；Cry5蛋白；Cry6蛋白；美国专利号7,329,736、7,449,552、7,803,943、7,476,781、7,105,332、7,
378,499和7,462,760的Cry8蛋白；Cry9蛋白，如Cry9A、Cry9B、Cry9C、Cry9D、Cry9E、和Cry9F家族的成员；Cry15蛋白，描述于以下文献中：Naimov等人(2008)Applied and
EnvironMental Microbiology[应用与环境微生物学]74：7145-7151；美国专利号6,127,
180、6,624,145和6,340,593的Cry22、Cry34Ab1蛋白；美国专利号6,248,535、6,326,351、6,
399,330、6,949,626、7,385,107和7,504,229的CryET33和CryET34蛋白；美国专利公开号
2006/0191034、2012/0278954，和PCT公开号WO 2012/139004的CryET33和CryET34同源物；
美国专利号6,083,499、6,548,291和6,340,593的Cry35Ab1蛋白；Cry46蛋白、Cry 51蛋白、Cry二元毒素；TIC901或相关毒素；US 2008/0295207的TIC807；PCT US 2006/033867的ET29、ET37、TIC809、TIC810、TIC812、TIC127、TIC128；美国专利公开号2016/0108428的TIC1100、TIC 860、TIC867、TIC868、TIC869和TIC836。美国专利号8,236,757的AXMI-027、AXMI-036和AXMI-038；US 7,923,602的AXMI-031、AXMI-039、AXMI-040、AXMI-049；WO 2006/
083891的AXMI-018、AXMI-020和AXMI-021；WO 2005/038032的AXMI-010；WO 2005/021585的AXMI-003；US 2004/0250311的AXMI-008；US 2004/0216186的AXMI-006；US 2004/0210965的AXMI-007；US 2004/0210964的AXMI-009；US 2004/0197917的AXMI-014；US 2004/
0197916的AXMI-004；WO 2006/119457的AXMI-028和AXMI-029；WO 2004/074462的AXMI-
007、AXMI-008、AXMI-0080rf2、AXMI-009、AXMI-014和AXMI-004；美国专利号8,084,416的AXMI-150；US 20110023184的AXMI-205；US 2011/0263488的AXMI-011、AXMI-012、AXMI-
013、AXMI-015、AXMI-019、AXMI-044、AXMI-037、AXMI-043、AXMI-033、AXMI-034、AXMI-022、AXMI-023、AXMI-041、AXMI-063、和AXMI-064；US 2010/0197592的AXMI-R1和相关蛋白；WO
2011/103248的AXMI221Z、AXMI222z、AXMI223z、AXMI224z和AXMI225z；WO11/103247的AXMI218、AXMI219、AXMI220、AXMI226、AXMI227、AXMI228、AXMI229、AXMI230、和AXMI231；美国专利号8,334,431的AXMI-115、AXMI-113、AXMI-005、AXMI-163和AXMI-184；US 2010/
0298211的AXMI-001、AXMI-002、AXMI-030、AXMI-035、和AXMI-045；US 20090144852的AXMI-
066和AXMI-076；美国专利号8,318,900的AXMI128、AXMI130、AXMI131、AXMI133、AXMI140、AXMI141、AXMI142、AXMI143、AXMI144、AXMI146、AXMI148、AXMI149、AXMI152、AXMI153、AXMI154、AXMI155、AXMI156、AXMI157、AXMI158、AXMI162、AXMI165、AXMI166、AXMI167、AXMI168、AXMI169、AXMI170、AXMI171、AXMI172、AXMI173、AXMI174、AXMI175、AXMI176、AXMI177、AXMI178、AXMI179、AXMI180、AXMI181、AXMI182、AXMI185、AXMI186、AXMI187、AXMI188、AXMI189；US 2010/0005543的AXMI079、AXMI080、AXMI081、AXMI082、AXMI091、AXMI092、AXMI096、AXMI097、AXMI098、AXMI099、AXMI100、AXMI101、AXMI102、AXMI103、AXMI104、AXMI107、AXMI108、AXMI109、AXMI110、AXMI111、AXMI112、AXMI114、AXMI116、AXMI117、AXMI118、AXMI119、AXMI120、AXMI121、AXMI122、AXMI123、AXMI124、AXMI1257、AXMI1268、AXMI127、AXMI129、AXMI164、AXMI151、AXMI161、AXMI183、AXMI132、AXMI138、AXMI137；和美国专利号8,319,019的具有修饰的蛋白水解位点的Cry蛋白如Cry1A和Cry3A；
美国专利申请公开号2011/0064710的来自苏云金芽孢杆菌菌株VBTS 2528的Cry1Ac、
Cry2Aa和Cry1Ca毒素蛋白，和PCT公开号WO 2016/061197的IP1B。其他Cry蛋白是本领域技术人员熟知的(参见Crickmore等人，“Bacillus thuringiensis toxin nomenclature[苏云金芽孢杆菌毒素命名法]”(2011)，网址为lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_
Crickmore/Bt/，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。Cry蛋白的杀昆虫活性是本领域技术人员所熟知的(回顾参见van Frannkenhuyzen，(2009)J.Invert.Path.[无脊椎动物病理学杂志]101：1-16)。使用Cry蛋白作为转基因植物性状是本领域技术人员所熟知的，并且Cry转基因植物(包括但不限于Cry1Ac、Cry1Ac+Cry2Ab、Cry1Ab、Cry1A.105、Cry1F、Cry1Fa2、Cry1F+Cry1Ac、Cry2Ab、Cry3A、mCry3A、Cry3Bb1、Cry34Ab1、Cry35Ab1、Vip3A、mCry3A、Cry9c和CBI-Bt)已获得监管部门的批准(参见，Sanahuja，(2011)Plant Biotech Journal[植物生物技术杂志]9：283-300和CERA(2010)转基因作物数据库环境风险评估中心(CERA)(GM Crop Database Center for Environmental Risk Assessment)，ILSI研究基金会，华盛顿特区，网址为cera-gmc.org/index.php？action＝gm_crop_database，可以使用“www”前缀在万维网上访问)。本领域技术人员熟知的多种杀有害生物蛋白也可以在植物中表达：如Vip3Ab&Cry1Fa(US 2012/0317682)、Cry1BE&Cry1F(US 2012/0311746)、Cry1CA&Cry1AB(US 2012/0311745)、Cry1F&CryCa(US 2012/0317681)、Cry1DA&Cry1BE(US
2012/0331590)、Crv1DA&Crv1Fa(US 2012/0331589)、Cry1AB&Cry1BE(US 2012/0324606)以及Cry1Fa&Cry2Aa、Cry1I或Cry1E(US 2012/0324605))；Cry34Ab/35Ab以及Cry6Aa(US
20130167269)；Cry34Ab/VCry35Ab和Cry3Aa(US 20130167268)；Cry3A和Cry1Ab或Vip3Aa(US 20130116170)；以及Cry1F、Cry34Ab1和Cry35Ab1(PCT/US 2010/060818)。杀有害生物蛋白还包括杀昆虫脂肪酶，这些杀昆虫脂肪酶包括美国专利号7，491，869的脂质酰基水解酶，和胆固醇氧化酶，如来自链霉菌属(Purcell等人，(1993)Biochem Biophys Res Commun[生物化学与生物物理学研究通讯]15：1406-1413)。杀有害生物蛋白还包括美国专利号5,
877,012、6,107,279、6,137,033、7,244,820、7,615,686和8,237,020中的VIP(营养性杀昆虫蛋白)毒素等。其他VIP蛋白质是本领域技术人员熟知的(参见，lifesci.sussex.ac.uk/home/Neil_Crickmore/Bt/vip.html，其可以使用“www”前缀在万维网上访问)。杀有害生物蛋白还包括可从如下生物体获得的毒素复合物(TC)蛋白质：致病杆菌、发光杆菌和类芽孢杆菌(参见美国专利号7,491,698和8,084,418)。一些TC蛋白具有“独立”杀昆虫活性并且其他TC蛋白增强由相同给定生物体产生的独立毒素(stand-alone toxin)的活性。可以通过源自不同属的来源生物体的一种或多种TC蛋白“增效剂”来增强“独立”TC蛋白(例如来自发光杆菌属、致病杆菌属或类芽孢杆菌属)的毒性。有三种主要类型的TC蛋白。如本文所提及的，A类蛋白(“蛋白A”)是独立毒素。B类蛋白(“蛋白B”)和C类蛋白(“蛋白C”)增强了A类蛋白的毒性。A类蛋白的实例是TcbA、TcdA、XptA1和XptA2。B类蛋白的实例是TcaC、TcdB、XptB1Xb和XptC1Wi。C类蛋白的实例是TccC、XptC1Xb和XptB1Wi。杀有害生物蛋白还包括蜘蛛、蛇和蝎毒蛋白。蜘蛛毒肽的实例包括但不限于莱科毒素-1肽及其突变体(美国专利号8,334,
366)。
[0150] (C)编码昆虫特异性激素或信息素(如蜕化类固醇和保幼激素)的多核苷酸，其变体，基于其的模拟物，或者其拮抗剂或激动剂。参见，例如Hammock等人，(1990)Nature[自然]344：458，该文献公开了经克隆的保幼激素酯酶的杆状病毒表达是保幼激素的灭活剂。
[0151] (D)编码昆虫特异性肽的多核苷酸，其在表达时破坏受影响有害生物的生理机能。例如，参见以下公开内容：Regan，(1994)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]269：9(expression cloning yields DNA coding for insect diuretic hormone receptor[表达克隆产生编码昆虫利尿激素受体的DNA])；Pratt，等人，(1989)Biochem.Biophys.Res.Comm.[生物化学与生物物理学研究通讯]163：1243(an allostatin is identified in Diploptera
puntata[在紫斑折翅类中鉴定一种同分异构他汀])；Chattopadhyay，等人，(2004)
Critical Reviews in Microbiology[微生物学重要评论]30(1)：33-54；Zjawiony，(2004)J Nat Prod[天然产物杂志]67(2)：300-310；Carlini和Grossi-de-Sa，(2002)Toxicon[毒素]40(11)：1515-1539；Ussuf，等人，(2001)Curr Sci.[当代科学]80(7)：847-853以及Vasconcelos和Oliveira，(2004)Toxicon[毒素]44(4)：385-403。还参见，美国专利号5,
266,317，作者Tomalski等人，他们披露了编码昆虫特异性毒素的基因。
puntata[在紫斑折翅类中鉴定一种同分异构他汀])；Chattopadhyay，等人，(2004)
Critical Reviews in Microbiology[微生物学重要评论]30(1)：33-54；Zjawiony，(2004)J Nat Prod[天然产物杂志]67(2)：300-310；Carlini和Grossi-de-Sa，(2002)Toxicon[毒素]40(11)：1515-1539；Ussuf，等人，(2001)Curr Sci.[当代科学]80(7)：847-853以及Vasconcelos和Oliveira，(2004)Toxicon[毒素]44(4)：385-403。还参见，美国专利号5,
266,317，作者Tomalski等人，他们披露了编码昆虫特异性毒素的基因。
[0152] (E)编码如下酶的多核苷酸，该多核苷酸负责单萜、倍半萜烯、类固醇、异羟肟酸、苯丙素衍生物或具有杀昆虫活性的其他非蛋白质分子的超累积。
[0153] (F)编码参与生物活性分子的修饰(包括翻译后修饰)的酶的多核苷酸；例如糖酵解酶、蛋白水解酶、脂肪分解酶、核酸酶、环化酶、转氨酶、酯酶、水解酶、磷酸酶、激酶、磷酸化酶、聚合酶、弹性蛋白酶、几丁质酶和葡聚糖酶，无论是天然还是合成的。参见，Scott等人的PCT申请WO 1993/02197，该文献公开了愈创葡聚糖酶(callase)基因的核苷酸序列。含有几丁质酶编码序列的DNA分子可以例如从ATCC登录号39637和67152下获得。还参见，Kramer等人，(1993)Insect Biochem.Molec.Biol.[昆虫生物化学与分子生物学]，23：691，其教导了编码烟草钩虫几丁质酶的cDNA的核苷酸序列，和Kawalleck等人，(1993)Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]21：673，其提供了欧芹ubi4-2多泛素基因的核苷酸序列，和美国专利号6,563,020、7,145,060和7,087,810。
[0154] (G)编码刺激信号转导的分子的多核苷酸。例如，参见Botella等人，(1994)Plant Molec.Biol.[分子细胞生物学]24：757，该文献公开了绿豆钙调素cDNA克隆的核苷酸序列，以及Griess等人，(1994)Plant Physiol.[植物生理学]104：1467，他们提供了玉米钙调素cDNA克隆的核苷酸序列。
[0155] (H)编码疏水力矩肽(hydrophobic moment peptide)的多核苷酸。参见，PCT申请WO 1995/16776和美国专利号5,580,852(公开了抑制真菌植物病原体的鲎素(Tachyplesin)的肽衍生物)以及PCT申请WO 1995/18855和美国专利号5,607,914(教导了赋予抗病性的合成抗微生物肽)。
[0156] (I)编码膜通透酶、通道形成剂(channel former)或通道阻断剂的多核苷酸。例如，参见Jaynes等人，(1993)Plant Sci.[植物科学]89：43，该文献公开了天蚕素-β裂解肽类似物的异源表达，以提供对烟草假单胞菌具有抗性的转基因烟草植物。
[0157] (J)编码病毒侵入性蛋白质或由其衍生的复合毒素的基因。例如，病毒外壳蛋白在转化的植物细胞中的积累赋予针对由外源蛋白基因来源的病毒以及由相关病毒导致的病毒侵染和/或疾病发展的抗性。参见，Beachy等人，(1990)Ann.Rev.Phytopathol.[植物病理学年评]28：451。外壳蛋白介导的抗性已赋予至转化植物抵抗：苜蓿花叶病毒、黄瓜花叶病毒、烟草线条病毒、马铃薯X病毒、马铃薯Y病毒、烟草蚀纹病毒、烟草脆裂病毒和烟草花叶病毒。同上。
[0158] (K)编码昆虫特异性抗体或由其衍生的免疫毒素的基因。因此，靶向昆虫肠道中关键代谢功能的抗体将使受影响的酶失活，杀灭昆虫。参看Taylor等人，摘要#497，SEVENTH INT′L SYMPOSIUM ON MOLECULAR PLANT-MICROBE INTERACTIONS[关于分子植物-微生物相互作用的第七届国际研讨会](苏格兰爱丁堡，1994)(通过生产单链抗体片段进行转基因烟草中的酶失活)。
[0159] (L)编码病毒特异性抗体的基因。参见，例如Tavladoraki等人，(1993)Nature[自然]366：469，其提出表达重组抗体基因的转基因植物不受病毒侵袭。
[0160] (M)编码由病原体或寄生虫在自然中产生的发育阻滞蛋白的多核苷酸。因此，真菌内α-1，4-D-多聚半乳糖醛酸酶通过溶解植物细胞壁均-α-1，4-D-半乳糖醛酸酶来促进真菌定植和植物营养释放。参见Lamb等人，(1992)Bio/Technology[生物技术]10：1436。以下文献描述了编码豆内聚半乳糖醛酸酶抑制蛋白的基因的克隆和表征：Toubart等人，(1992)Plant J.[植物杂志]2：367。
[0161] (N)编码由植物在自然中产生的发育抑制蛋白的多核苷酸。例如，已在以下文献中表明表达大麦核糖体失活基因的转基因植物具有增加的对真菌疾病的抗性：Logemann等人，(1992)Bio/Technology[生物技术]10：305。
[0162] (O)参与系统获得抗性(SAR)应答的基因和/或发病相关基因。Briggs，(1995)Current Biology[当代生物学]5(2)，Pieterse和Van Loon，(2004)Curr.Opin.Plant Bio.[植物生物学新观点]7(4)：456-64，以及Somssich，(2003)Cell[细胞]113(7)：815-6。
[0163] (P)抗真菌基因(Cornelissen和Melchers，(1993)Pl.Physiol.[植物生理学]101：709-712，和Parijs等人，(1991)Planta[植物]183：258-264，以及Bushnell等人，(1998)Can.J.of Plant Path.[加拿大植物病理学杂志]20(2)：137-149)。还参见，美国专利申请序列号09/950,933；11/619,645；11/657,710；11/748,994；11/774,121以及美国专利号6,
891,085和7,306,946。用于感知几丁质片段的LysM受体样激酶作为对真菌病原体的植物防御应答中的第一步(US 2012/0110696)。
891,085和7,306,946。用于感知几丁质片段的LysM受体样激酶作为对真菌病原体的植物防御应答中的第一步(US 2012/0110696)。
[0164] (Q)解毒基因，如伏马菌素、白僵菌素、念珠菌素和玉米赤霉烯酮及其结构相关的衍生物的基因。例如，参见美国专利号5,716,820；5,792,931；5,798,255；5,846,812；6,083,736；6,538,177；6,388,171和6,812,380。
[0165] (R)编码胱抑素和半胱氨酸蛋白酶抑制剂的多核苷酸。参见美国专利号7,205,453。
[0166] (S)防御素基因。参见WO 2003/000863和美国专利号6,911,577；6,855,865；6,777,592和7,238,781中找到。
[0167] (T)赋予对线虫抗性的基因。参见，例如PCT申请WO 1996/30517；PCT申请WO 1993/19181、WO 2003/033651，以及Urwin等人，(1998)Planta[植物]204：472-479，Williamson，(1999)Curr Opin Plant Bio.[植物生物学新观点]2(4)：327-31；美国专利号6,284,948和
7,301,069，和miR164基因(WO 2012/058266)。
7,301,069，和miR164基因(WO 2012/058266)。
[0168] (U)赋予对疫霉根腐病抗性的基因，如Rps 1、Rps 1-a、Rps 1-b、Rps 1-c、Rps 1-d、Rps 1-e、Rps 1-k、Rps 2、Rps 3-a、Rps3-b、Rps 3-c、Rps 4、Rps 5、Rps 6、Rps 7和其他Rps基因。参见，例如Shoemaker等人，Phytophthora Root Rot Resistance Gene Mapping in Soybean[大豆中疫霉根腐病抗性基因图谱]，植物基因组第四次会议，加利福尼亚州圣迭戈(San Diego，Calif.)(1995)。
[0169] (V)赋予对褐茎腐病抗性的基因，如美国专利号5,689,035所述，并为此通过引入并入本文。
[0170] (W)赋予对炭疽菌抗性的基因，如美国专利申请公开US 2009/0035765中所述，并为此通过引用并入本文。这包括可以用作单一基因座转化的Rcg基因座。
[0171] (X)一些实施例涉及通过干扰核糖核酸(RNA)分子来下调昆虫有害生物物种中靶基因的表达。PCT公开WO 2007/074405描述了抑制无脊椎动物有害生物(包括科罗拉多马铃薯甲虫)中靶基因表达的方法。PCT公开WO2005/110068描述了抑制无脊椎动物有害生物(特别是包括西方玉米根虫)中靶基因表达的方法，该方法作为防治昆虫侵染的手段。此外，PCT公开WO2009/091864描述了用于抑制来自昆虫有害生物物种(包括来自草盲蝽属的有害生物)的靶基因的组合物和方法。
[0172] 核酸分子包括用于靶向液泡ATP酶H亚基的沉默元件，该沉默元件可用于防治如美国专利申请公开号2012/0198586中所述的鞘翅目有害生物群体和侵袭。PCT公开WO 2012/055982描述了抑制或下调如下靶基因的表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)，所述靶基因编码：昆虫核糖体蛋白，例如核糖体蛋白L19、核糖体蛋白L40或核糖体蛋白S27A；昆虫蛋白酶体亚基，如Rpn6蛋白、Pros 25、Rpn2蛋白、蛋白酶体β1亚基蛋白或Prosβ2蛋白；COPI囊泡的昆虫β-外被体，COPI囊泡的γ-外被体，COPI囊泡的β′-外被体蛋白或ζ-外被体；昆虫四跨膜蛋白(Tetraspanin)2A蛋白(推定的跨膜结构域蛋白)；属于肌动蛋白家族的昆虫蛋白，例如肌动蛋白5C；昆虫泛素-5E蛋白；昆虫Sec23蛋白，其是参与细胞内蛋白质转运的GTP酶活化剂；涉及运动活性的作为非常规肌球蛋白的昆虫皱蛋白(crinkled protein)；涉及核替代性mRNA剪接的调节的昆虫曲颈蛋白(crooked neck protein)；昆虫囊泡H+-ATP酶G亚基蛋白和昆虫Tbp-1如Tat结合蛋白。PCT公开WO 2007/035650描述了抑制或下调编码Snf7的靶基因表达的核糖核酸(RNA或双链RNA)。美国专利申请公开2011/0054007描述了靶向RPS10的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2014/0275208和US 2015/0257389描述了靶向RyanR和PAT3的多核苷酸沉默元件。PCT公开WO 2016/060911、WO 2016/060912、WO 2016/
060913、和WO 2016/060914描述了靶向赋予对鞘翅目和半翅目有害生物的抗性的COPI外被体亚单位核酸分子的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2012/029750、US 20120297501和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，所述干扰核糖核酸在被昆虫有害生物物种摄取时起作用以下调所述昆虫有害生物中靶基因的表达，其中所述RNA包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含经退火的互补链的双链RNA区域，所述双链RNA区域的一条链包含或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列至少部分地与靶基因中的靶标核苷酸序列互补。美国专利申请公开2012/0164205描述了用于干扰双链核糖核酸(用于抑制无脊椎动物有害生物)的潜在靶标，包括：Chd3同源序列、β-微管蛋白同源序列、40kDa V-ATP酶同源序列、EF1α同源序列、26S蛋白质体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物酶水解酶同源序列、溶胀依赖氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列、Act42A蛋白同源序列、ADP-核糖因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源序列、保幼激素酯酶同源物、和α微管蛋白同源序列。
060913、和WO 2016/060914描述了靶向赋予对鞘翅目和半翅目有害生物的抗性的COPI外被体亚单位核酸分子的多核苷酸沉默元件。美国专利申请公开2012/029750、US 20120297501和2012/0322660描述了干扰核糖核酸(RNA或双链RNA)，所述干扰核糖核酸在被昆虫有害生物物种摄取时起作用以下调所述昆虫有害生物中靶基因的表达，其中所述RNA包含至少一个沉默元件，其中所述沉默元件是包含经退火的互补链的双链RNA区域，所述双链RNA区域的一条链包含或由如下核苷酸序列组成，所述核苷酸序列至少部分地与靶基因中的靶标核苷酸序列互补。美国专利申请公开2012/0164205描述了用于干扰双链核糖核酸(用于抑制无脊椎动物有害生物)的潜在靶标，包括：Chd3同源序列、β-微管蛋白同源序列、40kDa V-ATP酶同源序列、EF1α同源序列、26S蛋白质体亚基p28同源序列、保幼激素环氧化物酶水解酶同源序列、溶胀依赖氯通道蛋白同源序列、葡萄糖-6-磷酸1-脱氢酶蛋白同源序列、Act42A蛋白同源序列、ADP-核糖因子1同源序列、转录因子IIB蛋白同源序列、几丁质酶同源序列、泛素缀合酶同源序列、甘油醛-3-磷酸脱氢酶同源序列、泛素B同源序列、保幼激素酯酶同源物、和α微管蛋白同源序列。
[0173] ii.赋予除草剂抗性的转基因。
[0174] (A)编码对如下除草剂的抗性的多核苷酸，该除草剂抑制生长点或分生组织，如咪唑啉酮或磺酰脲。这个类别的示例性基因编码突变体ALS和AHAS酶，例如分别如以下文献中所述：Lee等人，(1988)EMBO J.[欧洲分子生物学学会杂志]7：1241和Miki等人，(1990)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]80：449。还参见美国专利号5,605,011；5,013,659；5,141,870；5,767,361；5,731,180；5,304,732；4,761,373；5,331,107；5,928,937和5,
378,824；美国专利申请序号11/683,737和国际公开WO 1996/33270。
378,824；美国专利申请序号11/683,737和国际公开WO 1996/33270。
[0175] (B)编码对草甘膦(分别由突变体5-烯醇丙酮酰-3-磷酸合酶(EPSP)和aroA基因赋予的抗性)和其他膦酰基化合物如草铵膦(草丁膦乙酰转移酶(PAT)和吸水链霉菌草丁膦乙酰转移酶(bar)基因)和吡啶氧基或苯氧基丙酸和环己酮(ACC酶抑制剂编码基因)有抗性的蛋白质的多核苷酸。参见，例如Shah等人的美国专利号4,940,835，其披露了EPSPS形式的能赋予草甘磷抗性的核苷酸序列。Barry等人的美国专利号5,627,061也描述了编码EPSPS酶的基因。还参见美国专利号6,566,587；6,338,961；6,248,876 B1；6,040,497；5,804,425；5,633,435；5,145,783；4,971,908；5,312,910；5,188,642；5,094,945、4,940,835；5,866,
775；6,225,114 B1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；
Re.36,449；RE 37,287E和5,491,288以及国际公开EP 1173580；WO 2001/66704；EP
1173581和EP 1173582中。
775；6,225,114 B1；6,130,366；5,310,667；4,535,060；4,769,061；5,633,448；5,510,471；
Re.36,449；RE 37,287E和5,491,288以及国际公开EP 1173580；WO 2001/66704；EP
1173581和EP 1173582中。
[0176] 还给予植物草甘磷抗性，使该植物表达编码草甘磷氧化还原酶的基因，这在美国专利号5,776,760和5,463,175中进行了更全面地描述。另外，可通过过量表达编码草甘磷N-乙酰转移酶的基因，来赋予植物草甘磷抗性。参见，例如美国专利号7,462,481；7,405,074以及美国专利申请公开号2008/0234130。编码突变aroA基因的DNA分子可以在ATCC登录号39256下获得，并且该突变基因的核苷酸序列披露于授予Comai的美国专利号4,769,061中。欧洲申请号0 333033(Kumada等人)和美国专利号4,975,374(Goodman等人)披露了赋予除草剂(如L-草丁膦)抗性的谷氨酰胺合成酶基因的核苷酸序列。Leemans等人的EP申请号
0242246和0242236中提供了草丁膦乙酰基转移酶基因的核苷酸序列；De Greef等人，
(1989)Bio/Techmology[生物/技术]7：61，描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。还参见美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,
874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616B1和5,879,903。赋予苯氧基丙酸和环己酮(例如稀禾啶和吡氟氯禾灵)抗性的示例性基因是Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因，其描述于以下文献中：Marshall等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]83：435。
0242246和0242236中提供了草丁膦乙酰基转移酶基因的核苷酸序列；De Greef等人，
(1989)Bio/Techmology[生物/技术]7：61，描述了表达编码草丁膦乙酰转移酶活性的嵌合bar基因的转基因植物的产生。还参见美国专利号5,969,213；5,489,520；5,550,318；5,
874,265；5,919,675；5,561,236；5,648,477；5,646,024；6,177,616B1和5,879,903。赋予苯氧基丙酸和环己酮(例如稀禾啶和吡氟氯禾灵)抗性的示例性基因是Acc1-S1、Acc1-S2和Acc1-S3基因，其描述于以下文献中：Marshall等人，(1992)Theor.Appl.Genet.[理论与应用遗传学]83：435。
[0177] (C)编码对抑制光合作用的除草剂具有抗性的蛋白质的多核苷酸，例如三嗪(psbA和gs+基因)和苄腈(腈水解酶基因)。Przibilla等人(1991)Plant Cell[植物细胞]3：169，描述了用编码突变体psbA基因的质粒对衣藻进行转化。针对腈水解酶基因的核苷酸序列披露在Stalker的美国专利号4,810,648中，并且含有这些基因的DNA分子可以在ATCC登录号53435,67441和53435,67442下获得。编码谷胱甘肽S-转移酶的DNA的克隆和表达描述于以下文献中：Hayes等人，(1992)Biochem.J.[生物化学杂志]285：173。
[0178] (D)编码已经被引入到各种植物中对乙酰羟酸合酶具有抗性的蛋白的多核苷酸，已经发现该蛋白使表达该酶的植物对多种类型的除草剂具有抗性(参见，例如，Hattori等人，(1995)Mol Gen Genet.246：419[分子和普通遗传学])。赋予除草剂抗性的其他基因包括：编码大鼠细胞色素P4507A1和酵母NADPH-细胞色素P450氧化还原酶的嵌合蛋白的基因(Shiota等人，(1994)Plant Physiol[植物生理学]106：17)，针对谷胱甘肽还原酶和超氧化物歧化酶的基因(Aono等人，(1995)Plant Cell Physiol[植物细胞生理学]36：1687)和各种磷酸转移酶的基因(Datta等人，(1992)Plant Mol Biol[植物分子生理学]20：619)。
[0179] (E)编码对靶向原卟啉原氧化酶(protox)的除草剂的抗性的多核苷酸，该原卟啉原氧化酶是生产叶绿素所必需的。原卟啉原氧化酶(protox)作为针对各种除草剂化合物的靶标。这些除草剂还抑制存在的所有不同种类的植物的生长，导致其整体毁灭。含有对这些除草剂具有抗性的经改变的原卟啉原氧化酶(protox)活性的植物的发育描述于以下文献中：美国专利号6,288,306 B1；6,282,837 B1和5,767,373，以及国际公开WO 2001/12825。
[0180] (F)aad-1基因(最初来自鞘脂单胞菌(Sphingobium herbicidovorans))编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-1)蛋白。该性状赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和芳氧基苯氧基丙酸酯(通常称为“fop”除草剂，例如喹禾灵)除草剂的耐受性。用于植物中除草剂耐受性的aad-1基因本身首先在WO 2005/107437中公开(还参见US 2009/0093366)。来自食酸丛毛单胞菌的aad-12基因，其编码芳氧基链烷酸酯双加氧酶(AAD-12)蛋白，该蛋白通过用芳氧基链烷酸酯部分(包括苯氧基生长素(例如2，4-D，MCPA)以及吡啶氧基生长素(例如氯氟吡氧乙酸，三氯吡氧乙酸))使几种除草剂失活来赋予对2，4-二氯苯氧基乙酸和吡啶氧基乙酸酯除草剂的耐受性。
[0181] (G)编码美国专利申请公开2003/0135879中披露的用于赋予麦草畏耐受性的除草剂抗性麦草畏单加氧酶的多核苷酸。
[0182] (H)美国专利号4,810,648中所披露的用于给予溴苯腈耐受性的编码溴苯腈腈水解酶(Bxn)的多核苷酸分子。
[0183] (I)用于达草灭耐受性的编码八氢番茄红素(crtl)的多核苷酸分子描述于以下文献中：Misawa等人，(1993)Plant J.[植物杂志]4：833-840和Misawa等人，(1994)Plant J.[植物杂志]6：481-489。
[0184] iii.赋予或贡献于改变的谷物特征的转基因
[0185] (A)经改变的脂肪酸，例如通过(1)硬脂酰-ACP的下调以增加植物的硬脂酸含量。参见，Knultzon等人，(1992)Proc.Natl.Acad.Sci.USA[美国科学院院刊]89：2624和WO
1999/64579(Genes to Alter Lipid Profiles in Corn[改变玉米脂质谱的基因])；(2)通过FAD-2基因修饰提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰降低亚麻酸(参见美国专利号6,063,
947；6,323,392；6,372,965以及WO 1993/11245)；(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，例如在WO 2001/12800中；(4)改变LEC1、AGP、Dek1、Superall、mil ps、各种Ipa基因(如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt)。例如，参见WO 2002/42424，WO 1998/22604，WO 2003/011015，WO 2002/
057439，WO 2003/011015，美国专利号6,423,886、6,197,561、6,825,397，和美国专利申请公开号US 2003/0079247、US 2003/0204870，以及Rivera-Madrid等人，(1995)
Proc.Natl.Acad.Sci.[国家科学院院刊]92：5620-5624；(5)编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的δ-8去饱和酶的基因(美国专利号8,058,571和8,338,152)，用于降低饱和脂肪的δ-9去饱和酶(美国专利号8,063,269)，用于改善ω-3脂肪酸谱的报春花δ6-去饱和酶；(6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和蛋白质，特别是用于生产转基因植物和调节种子储存化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子储存蛋白)的水平的方法中以及用于调节植物种子大小、种子数、种子重量、根长和叶子大小的方法中的脂质代谢蛋白(LMP)(EP 2404499)；
(7)改变植物中糖诱导型2(HSI2)蛋白的高水平表达以增加或减少植物中HSI2的表达。增加HSI2的表达增加油含量，然而降低HSI2的表达降低脱落酸敏感性和/或增加抗旱性(美国专利申请公开号2012/0066794)；(8)细胞色素b5(Cb5)单独或与FAD2一起表达调节植物种子中的油含量，特别是增加ω-3脂肪酸的水平，并改进ω-6与ω-3脂肪酸的比例(美国专利申请公开号2011/0191904)；以及(9)编码用于调节糖代谢的皱纹1样多肽的核酸分子(美国专利号8,217,223)。
1999/64579(Genes to Alter Lipid Profiles in Corn[改变玉米脂质谱的基因])；(2)通过FAD-2基因修饰提高油酸和/或通过FAD-3基因修饰降低亚麻酸(参见美国专利号6,063,
947；6,323,392；6,372,965以及WO 1993/11245)；(3)改变共轭亚麻酸或亚油酸含量，例如在WO 2001/12800中；(4)改变LEC1、AGP、Dek1、Superall、mil ps、各种Ipa基因(如Ipa1、Ipa3、hpt或hggt)。例如，参见WO 2002/42424，WO 1998/22604，WO 2003/011015，WO 2002/
057439，WO 2003/011015，美国专利号6,423,886、6,197,561、6,825,397，和美国专利申请公开号US 2003/0079247、US 2003/0204870，以及Rivera-Madrid等人，(1995)
Proc.Natl.Acad.Sci.[国家科学院院刊]92：5620-5624；(5)编码用于制备长链多不饱和脂肪酸的δ-8去饱和酶的基因(美国专利号8,058,571和8,338,152)，用于降低饱和脂肪的δ-9去饱和酶(美国专利号8,063,269)，用于改善ω-3脂肪酸谱的报春花δ6-去饱和酶；(6)与脂质和糖代谢调节相关的分离的核酸和蛋白质，特别是用于生产转基因植物和调节种子储存化合物(包括脂质、脂肪酸、淀粉或种子储存蛋白)的水平的方法中以及用于调节植物种子大小、种子数、种子重量、根长和叶子大小的方法中的脂质代谢蛋白(LMP)(EP 2404499)；
(7)改变植物中糖诱导型2(HSI2)蛋白的高水平表达以增加或减少植物中HSI2的表达。增加HSI2的表达增加油含量，然而降低HSI2的表达降低脱落酸敏感性和/或增加抗旱性(美国专利申请公开号2012/0066794)；(8)细胞色素b5(Cb5)单独或与FAD2一起表达调节植物种子中的油含量，特别是增加ω-3脂肪酸的水平，并改进ω-6与ω-3脂肪酸的比例(美国专利申请公开号2011/0191904)；以及(9)编码用于调节糖代谢的皱纹1样多肽的核酸分子(美国专利号8,217,223)。
[0186] (B)经改变的磷含量，例如，通过(1)引入植酸酶编码基因将增强植酸盐的分解，向经转化的植物中添加更多的游离磷酸盐。例如，参见Van Hartingsveldt等人，(1993)Gene[基因]127：87，该文献公开了黑曲霉植酸酶基因的核苷酸序列；和(2)调节降低植酸盐含量的基因。例如，可以在玉米中通过以下方法来完成：克隆然后重新引入与一个或多个等位基因相关联的DNA，例如在以低水平的植酸为特征的玉米突变体中经识别的LPA等位基因，例如WO 2005/113778中；和/或改变肌醇激酶活性，如WO 2002/059324、美国专利申请公开号2003/0009011、WO 2003/027243、美国专利申请公开号2003/0079247、WO 1999/05298、美国专利号6,197,561、美国专利号6,291,224、美国专利号6,391,348、WO 2002/059324、美国专利申请公开号2003/0079247、WO 1998/45448、WO 1999/55882、WO 200I/04147中。
[0187] (C)经改变的受到影响的碳水化合物，例如通过改变如下基因：影响淀粉分支模式的酶的基因，或改变硫氧还蛋白(例如NTR和/或TRX)(参见美国专利号6,531,648，为此目的将其通过引用并入本文)和/或γ玉米蛋白敲除或突变体(例如cs27或TUSC27或者en27)(参见美国专利号6,858,778和美国专利申请公开号2005/0160488、美国专利申请公开号2005/0204418，其通过引用并入本文)的基因。参见，Shiroza等人，(1988)J.Bacteriol.[细菌学杂志]170：810(链球菌突变果糖基转移酶基因的核苷酸序列)，Steinmetz等人，(1985)Mol.Gen.Genet.[分子遗传学和基因组学]200：220(枯草芽孢杆菌果聚糖蔗糖酶基因的核苷酸序列)，Pen等人，(1992)Bio/Technology[生物/技术]，10：292(生产表达地衣芽孢杆菌α-淀粉酶的转基因植物)，Elliot等人，(1993)Plant Molec.Biol.[植物分子生物学]21：
515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，Sogaard等人，(1993)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]
268：22480(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)和Fisher等人，(1993)Plant Physiol.[植物生理学]102：1045(玉米胚乳淀粉分支酶II)，WO 1999/10498(通过修饰UDP-D-木糖4-差向异构酶、脆性1和2、Ref1、HCHL、C4H改进的可消化性和/或淀粉提取)，美国专利号6,232,529(通过改变淀粉水平(AGP)生产高油种子的方法)。在此提及的脂肪酸修饰基因也可用于通过淀粉和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成。
515(番茄转化酶基因的核苷酸序列)，Sogaard等人，(1993)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]
268：22480(大麦α-淀粉酶基因的定点诱变)和Fisher等人，(1993)Plant Physiol.[植物生理学]102：1045(玉米胚乳淀粉分支酶II)，WO 1999/10498(通过修饰UDP-D-木糖4-差向异构酶、脆性1和2、Ref1、HCHL、C4H改进的可消化性和/或淀粉提取)，美国专利号6,232,529(通过改变淀粉水平(AGP)生产高油种子的方法)。在此提及的脂肪酸修饰基因也可用于通过淀粉和油途径的相互关系影响淀粉含量和/或组成。
[0188] (D)经改变的抗氧化剂含量或组成，如改变生育酚或生育三烯酚。例如，参见美国专利号6,787,683、美国专利申请公开号2004/0034886和WO2000/68393(涉及抗氧化剂水平操作)，以及WO 2003/082899(通过改变尿黑酸香叶基香叶基转移酶(hggt))。
[0189] (E)经改变的必需种子氨基酸。例如，参见美国专利号6,127,600(增加种子中必需氨基酸积累的方法)、美国专利号6,080,913(增加种子中必需氨基酸积累的二元方法)、美国专利号5,990,389(高赖氨酸)、WO 1999/40209(种子中氨基酸组成的改变)、WO 1999/29882(用于改变蛋白质的氨基酸含量的方法)、美国专利号5,850,016(种子中氨基酸组成的改变)、WO 1998/20133(具有升高水平的必需氨基酸的蛋白质)、美国专利号5,885,802(高甲硫氨酸)、美国专利号5,885,801(高苏氨酸)、美国专利号6,664,445(植物氨基酸生物合成酶)、美国专利号6,459,019(赖氨酸和苏氨酸增加)、美国专利号6,441,274(植物色氨酸合酶B亚基)、美国专利号6,346,403(甲硫氨酸代谢酶)、美国专利号5,939,599(高硫)、美国专利号5,912,414(甲硫氨酸增加)、WO 1998/56935(植物氨基酸生物合成酶)、WO 1998/
45458(具有较高百分比的必需氨基酸的工程化种子蛋白)、WO 1998/42831(赖氨酸增加)、美国专利号5,633,436(增加含硫氨基酸含量)、美国专利号5,559,223(具有限定结构的、含可编程水平的必需氨基酸的合成储存蛋白，用于改善植物的营养价值)、WO 1996/01905(苏氨酸增加)、WO 1995/15392(赖氨酸增加)、美国专利申请公开号2003/0163838、美国专利申请公开号2003/0150014、美国专利申请公开号2004/0068767、美国专利号6,803,498、WO
2001/79516。
45458(具有较高百分比的必需氨基酸的工程化种子蛋白)、WO 1998/42831(赖氨酸增加)、美国专利号5,633,436(增加含硫氨基酸含量)、美国专利号5,559,223(具有限定结构的、含可编程水平的必需氨基酸的合成储存蛋白，用于改善植物的营养价值)、WO 1996/01905(苏氨酸增加)、WO 1995/15392(赖氨酸增加)、美国专利申请公开号2003/0163838、美国专利申请公开号2003/0150014、美国专利申请公开号2004/0068767、美国专利号6,803,498、WO
2001/79516。
[0190] iv.控制雄性不育的基因
[0191] 有几种赋予遗传雄性不育的方法，例如基因组内分离位置处的赋予雄性不育的多个突变基因，如Brar等人在美国专利号4,654,465和4,727,219中所披露的；以及染色体易位，如Patterson在美国专利号3,861,709和3,710,511中所述。除了这些方法之外，Albertsen等人在美国专利号5,432,068中描述了细胞核雄性不育的系统，该系统包括：鉴定对雄性能育性至关重要的基因；沉默这种对雄性能育性至关重要的天然基因；从基本的雄性能育性基因中除去天然启动子并用诱导型启动子替换；将该遗传工程化基因插回入植物；并因此产生雄性不育的植物，因为诱导型启动子不是“开”的，导致雄性能育性基因不被转录。通过诱导或将启动子打“开”来恢复能育性，该启动子反过来叉允许赋予雄性能育性的基因被转录。非限制性实例包括：(A)在绒毡层特异性启动子的控制下并使用化学N-Ac-PPT来引入脱乙酰酶基因(WO 2001/29237)；(B)引入各种雄蕊特异性启动子(WO 1992/
13956、WO 1992/13957)；和(C)引入bamase和barstar基因(Paul等人，(1992)Plant
Mol.Biol.[植物分子生物学]19：611-622)。关于细胞核雄性和雌性不育系统和基因的另外的实例，也可参见美国专利号5,859,341；6,297,426；5,478,369；5,824,524；5,850,014和
6,265,640。
13956、WO 1992/13957)；和(C)引入bamase和barstar基因(Paul等人，(1992)Plant
Mol.Biol.[植物分子生物学]19：611-622)。关于细胞核雄性和雌性不育系统和基因的另外的实例，也可参见美国专利号5,859,341；6,297,426；5,478,369；5,824,524；5,850,014和
6,265,640。
[0192] v.创建用于位点特异性DNA整合的位点的基因。
[0193] 这包括引入可以在FLP/FRT系统中使用的FRT位点和/或可以在Cre/Loxp系统中使用的Lox位点。例如，参见Lyznik等人(2003)Plant Cell Rep[植物细胞报告]21：925-932和WO 1999/25821。可以使用的其他系统包括噬菌体Mu的Gln重组酶(Maeser等人，(1991)Vicki Chandler，The Maize Handbook eh.118[玉米手册，第118章](施普林格出版公司(Springer-Verlag)1994)、大肠杆菌的Pin重组酶(Enomoto等人，1983)和pSRi质粒的R/RS系统(Araki等人，1992)。
[0195] 包括但不限于开花，穗和种子发育，提高氮利用效率，改变氮反应性，抗旱性或耐旱性，抗寒性或耐寒性和抗盐性或耐盐性以及在胁迫下产量的增加。非限制性实例包括：(A)例如，参见：WO 2000/73475，其中通过改变苹果酸来改变水分的使用效率；美国专利号
5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、6,717,
034、6,801,104、WO 2000/060089、WO 2001/026459、WO 2001/035725、WO 2001/034726、WO
2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 200I/036598、WO 2002/015675、WO
2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO
2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 199809521；(B)WO 199938977描述了基因，这些基因包括有效减轻冷冻、高盐和干旱对植物的负面影响以及赋予植物表型其他积极作用的CBF基因和转录因子；(C)美国专利申请公开号2004/0148654和WO 2001/36596，其中脱落酸在植物中被改变，导致改进的植物表型，例如增加的产量和/或增加的对非生物胁迫的耐受性；(D)WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利号7,531,723和6,992,237，其中修饰细胞分裂素表达，产生具有增加的胁迫耐受性(例如耐旱性和/或增加的产量)的植物。还参见，WO 2002/02776、WO 2003/052063、JP 2002/281975、美国专利号6,084,153、WO 2001/64898、美国专利号6,177,275和美国专利号6,107,547(提高氮利用率和改变氮反应性)；(E)对于乙烯改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美国专利申请公开号
2003/0166197和WO 2000/32761；(F)对于非生物胁迫的植物转录因子或转录调节子，参见，例如，美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852；(G)增加囊泡焦磷酸酶(如AVP1)表达的基因(美国专利号8,058,515)，用于提高产量；编码HSFA4或HSFA5(A4或A5类热休克因子)多肽(寡肽转运蛋白(OPT4样)多肽)的核酸；间隔期2样(PLA2样)多肽或Wuschel相关同源框1样(WOX1样)多肽(美国专利申请公开号US 2011/0283420)；
(H)下调编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白的多核苷酸来调节程序性细胞死亡(美国专利号8,058,510)，用于增加活力；(I)编码用于赋予抗旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利申请公开号US 2011/0277181)；(J)编码用于调节发育，调节对胁迫的应答和调节胁迫耐受性的ACC合酶3(ACS3)蛋白的核苷酸序列(美国专利申请公开号US 2010/0287669)；(K)编码赋予耐旱性表型(DTP)的蛋白质的多核苷酸，以赋予抗旱性(WO 2012/058528)；(L)用于赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)基因(美国专利申请公开号2012/0272352)；(M)CAAX氨基末端家族蛋白质，用于胁迫耐受性(美国专利号8,338,661)；(N)SAL1编码基因的突变具有增加的胁迫耐受性，包括耐旱性增加(美国专利申请公开号2010/0257633)；(O)编码选自下组的多肽的核酸序列的表达，该组由以下组成：GRF多肽、RAA1样多肽、SYR多肽、ARKL多肽、和YTP多肽，这些多肽增加产量相关性状(美国专利申请公开号2011/0061133)；
以及(P)调节植物中编码III类海藻糖磷酸酯酶(TPP)多肽的核酸的表达，用于增强植物中产量相关性状，特别是增加种子产量(美国专利申请公开号2010/0024067)。
5,892,009、5,965,705、5,929,305、5,891,859、6,417,428、6,664,446、6,706,866、6,717,
034、6,801,104、WO 2000/060089、WO 2001/026459、WO 2001/035725、WO 2001/034726、WO
2001/035727、WO 2001/036444、WO 2001/036597、WO 200I/036598、WO 2002/015675、WO
2002/017430、WO 2002/077185、WO 2002/079403、WO 2003/013227、WO 2003/013228、WO
2003/014327、WO 2004/031349、WO 2004/076638、WO 199809521；(B)WO 199938977描述了基因，这些基因包括有效减轻冷冻、高盐和干旱对植物的负面影响以及赋予植物表型其他积极作用的CBF基因和转录因子；(C)美国专利申请公开号2004/0148654和WO 2001/36596，其中脱落酸在植物中被改变，导致改进的植物表型，例如增加的产量和/或增加的对非生物胁迫的耐受性；(D)WO 2000/006341、WO 2004/090143、美国专利号7,531,723和6,992,237，其中修饰细胞分裂素表达，产生具有增加的胁迫耐受性(例如耐旱性和/或增加的产量)的植物。还参见，WO 2002/02776、WO 2003/052063、JP 2002/281975、美国专利号6,084,153、WO 2001/64898、美国专利号6,177,275和美国专利号6,107,547(提高氮利用率和改变氮反应性)；(E)对于乙烯改变，参见美国专利申请公开号2004/0128719、美国专利申请公开号
2003/0166197和WO 2000/32761；(F)对于非生物胁迫的植物转录因子或转录调节子，参见，例如，美国专利申请公开号2004/0098764或美国专利申请公开号2004/0078852；(G)增加囊泡焦磷酸酶(如AVP1)表达的基因(美国专利号8,058,515)，用于提高产量；编码HSFA4或HSFA5(A4或A5类热休克因子)多肽(寡肽转运蛋白(OPT4样)多肽)的核酸；间隔期2样(PLA2样)多肽或Wuschel相关同源框1样(WOX1样)多肽(美国专利申请公开号US 2011/0283420)；
(H)下调编码聚(ADP-核糖)聚合酶(PARP)蛋白的多核苷酸来调节程序性细胞死亡(美国专利号8,058,510)，用于增加活力；(I)编码用于赋予抗旱性的DTP21多肽的多核苷酸(美国专利申请公开号US 2011/0277181)；(J)编码用于调节发育，调节对胁迫的应答和调节胁迫耐受性的ACC合酶3(ACS3)蛋白的核苷酸序列(美国专利申请公开号US 2010/0287669)；(K)编码赋予耐旱性表型(DTP)的蛋白质的多核苷酸，以赋予抗旱性(WO 2012/058528)；(L)用于赋予耐旱性和耐盐性的生育酚环化酶(TC)基因(美国专利申请公开号2012/0272352)；(M)CAAX氨基末端家族蛋白质，用于胁迫耐受性(美国专利号8,338,661)；(N)SAL1编码基因的突变具有增加的胁迫耐受性，包括耐旱性增加(美国专利申请公开号2010/0257633)；(O)编码选自下组的多肽的核酸序列的表达，该组由以下组成：GRF多肽、RAA1样多肽、SYR多肽、ARKL多肽、和YTP多肽，这些多肽增加产量相关性状(美国专利申请公开号2011/0061133)；
以及(P)调节植物中编码III类海藻糖磷酸酯酶(TPP)多肽的核酸的表达，用于增强植物中产量相关性状，特别是增加种子产量(美国专利申请公开号2010/0024067)。
[0196] 影响植物生长和农艺性状(如产量、开花、植物生长和/或植物结构)的其他基因和转录因子可被引入或种质渗入到植物中，参见例如WO 1997/49811(LHY)、WO 1998/56918(ESD4)、WO 1997/10339和美国专利号6,573,430(TFL)、美国专利号6,713,663(FT)、WO 1996/14414(CON)、WO 1996/38560、WO 2001/21822(VRN1)、WO 2000/44918(VRN2)、WO
1999/49064(GI)、WO 2000/46358(FR1)、WO 1997/29123、美国专利号6,794,560、美国专利号6,307,126(GAI)、WO 1999/09174(D8和Rht)以及WO 2004/076638和WO 2004/031349(转录因子)。
1999/49064(GI)、WO 2000/46358(FR1)、WO 1997/29123、美国专利号6,794,560、美国专利号6,307,126(GAI)、WO 1999/09174(D8和Rht)以及WO 2004/076638和WO 2004/031349(转录因子)。
[0197] vii.赋予增加的产量的基因
[0198] 赋予增加的产量的基因的非限制性实例是：(A)由1-氨基环丙烷-1-羧酸酯脱氨酶样多肽(ACCDP)编码核酸转化的转基因作物植物，其中，与该植物的野生型品种相比，在该作物植物中的核酸序列的表达使该植物具有增加的根生长、和/或增加的产量、和/或增加的对环境胁迫的耐受性(美国专利号8,097,769)；(B)已显示，使用种子偏好性启动子的玉米锌指蛋白基因(Zm-ZFP1)的过表达能促进植物生长、增加每株植物的籽粒数和总籽粒重量(美国专利申请公开号2012/0079623)；(C)已显示，玉米侧生器官界限(LOB)结构域蛋白(Zm-LOBDP1)的组成型过表达能增加每株植物的籽粒数和总籽粒重量(美国专利申请公开号2012/0079622)；(D)通过调节植物中编码VIM1(甲基化1中的变体)样多肽或VTC2样(GDP-L-半乳糖磷酸化酶)多肽或DUF1685多肽或ARF6样(生长素应答因子)多肽(WO 2012/038893)的核酸的表达来增强植物中产量相关性状；(E)调节植物中编码Ste20样多肽或其同源物的核酸的表达，得到相对于对照植物具有增加的产量的植物(EP 2431472)；以及(F)编码核苷二磷酸酶激酶(NDK)多肽及其同源物的基因，用于修饰该植物根系结构(美国专利申请公开号2009/0064373)。
[0199] IX.使用方法
[0200] 本文中披露的方法包括用于防治如下昆虫植物有害生物的方法：例如鞘翅目、半翅目或鳞翅目植物有害生物，包括叶甲属、瘦跗叶甲属、条跳甲属、无网蚜属、小粉虱属、茶翅蝽属、稻绿蝽属或灰翅夜蛾属植物有害生物。在一个实施例中，该方法包括向昆虫植物有害生物饲喂或施用包含本文披露的沉默元件的组合物，其中在被昆虫植物有害生物(即，并不限于，鞘翅目植物有害生物，包括叶甲属植物有害生物，例如玉米根萤叶甲、巴氏根叶甲、墨西哥玉米根虫、南美叶甲或黄瓜十一星叶甲)摄取或接触时，所述沉默元件降低该有害生物的靶标多核苷酸的水平，并且因此防治该有害生物。可以以各种方式向该有害生物饲喂沉默元件。可以将该沉默元件饲喂给雄性、雌性或两种性别的有害生物。例如，在一个实施例中，将编码沉默元件，即靶向如SEQ ID NO.：1-49中所示一个或多个多核苷酸的沉默元件的多核苷酸引入植物中。由于植物有害生物以表达这些序列的植物或其部分为食，所以在幼虫、成虫、或者在任何或所有的发育阶段，将所述沉默元件递送到该有害生物中。在一个实施例中，本文所述的方法和组合物进一步包含含有本文披露的沉默元件的转基因植物，其中所述沉默元件在幼虫、成虫、或者在任何或所有的发育阶段均具有杀昆虫活性。当以这种方式将沉默元件递送到植物中时，已经认识到，该沉默元件可以以被组成型表达，或可替代的，其能以阶段特异性方式、通过使用各种本文别处所讨论的诱导型或组织偏好性、或发育调节的启动子来产生。在某些实施例中，该沉默元件在根、杆或茎、叶(包括花梗、木质部和韧皮部)、果实或生殖组织、须、花、及其中的所有部分、或其任何组合中表达。
[0201] 在另一种方法中，将包含本文所披露的至少一种沉默元件的组合物施用于植物。在这样的实施例中，可以将沉默元件配制在农艺学上合适的和/或环境可接受的载体(优选适于在田间喷散)中。在一些实施例中，可以将靶向不同昆虫阶段、途径和性别的沉默元件以获得不育活性和杀昆虫活性。在一个实施例中，本文披露的沉默元件可以通过桶混与杀昆虫化学物质混合。此外，载体还可以包括增加该组合物半衰期的化合物。在某些实施例中，包含该沉默元件的组合物以这样的方式配制，使得其在环境中持续一段足以允许其被递送至植物有害生物中的时间。在此类实施例中，可将该组合物施用到昆虫植物有害生物所栖息的区域。在一个实施例中，将该组合物外部施用于植物(即，通过喷洒田地)以保护植物免受有害生物的侵害。
[0202] 在某些实施例中，所披露的多核苷酸或构建体可以与感兴趣的多核苷酸序列的任何组合堆叠，以产生具有所需性状的植物。如本文使用的性状是指源自特定序列或序列组群的表型。例如，本文所述的多核苷酸可以与编码具有杀有害生物和/或杀昆虫活性的多肽的任何其他多核苷酸堆叠，例如其他苏云金芽孢杆菌毒性蛋白(描述于美国专利号5,366,892；5,747,450；5,737,514；5,723,756；5,593,881；和Geiser等人(1986)Gene[基因]48：
109中)、凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]24：825)、果胶(pentin)(描述于美国专利号5,981,722中)等。产生的组合也可以包括目的多核苷酸中的任一种的多个拷贝。本文描述的多核苷酸还可以与任何其他基因或基因的组合堆叠以产生具有各种希望的性状组合的植物，这些性状组合包括但不限于对于动物饲料希望的性状例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡的氨基酸(例如羟丁硫素(hordothionin)(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]165：99-106和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]261：6279；Kirihara等人(1988)Gene[基因]71：359；以及Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]
12：123))；增加的消化率(例如，改良的储存蛋白(2001年11月7日提交的美国申请序列号
10/053,410)；和硫氧还蛋白(2001年12月3日提交的美国申请序列号10/005,429))。
109中)、凝集素(Van Damme等人(1994)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]24：825)、果胶(pentin)(描述于美国专利号5,981,722中)等。产生的组合也可以包括目的多核苷酸中的任一种的多个拷贝。本文描述的多核苷酸还可以与任何其他基因或基因的组合堆叠以产生具有各种希望的性状组合的植物，这些性状组合包括但不限于对于动物饲料希望的性状例如高油基因(例如，美国专利号6,232,529)；平衡的氨基酸(例如羟丁硫素(hordothionin)(美国专利号5,990,389；5,885,801；5,885,802；和5,703,409)；大麦高赖氨酸(Williamson等人(1987)Eur.J.Biochem.[欧洲生物化学杂志]165：99-106和WO 98/20122)和高甲硫氨酸蛋白质(Pedersen等人(1986)J.Biol.Chem.[生物化学杂志]261：6279；Kirihara等人(1988)Gene[基因]71：359；以及Musumura等人(1989)Plant Mol.Biol.[植物分子生物学]
12：123))；增加的消化率(例如，改良的储存蛋白(2001年11月7日提交的美国申请序列号
10/053,410)；和硫氧还蛋白(2001年12月3日提交的美国申请序列号10/005,429))。
[0203] 披露的多核苷酸也可以与以下性状堆叠；疾病或除草剂抗性所期望的性状(例如，伏马菌素解毒基因(美国专利号5,792,931)；无毒性和病害抗性基因(Jones等人(1994)Science[科学]266：789；Martin等人(1993)Science[科学]262：1432；Mindrinos等人(1994)Cell[细胞]78：1089)；导致除草剂抗性的乙酰乳酸合酶(ALS)突变体，例如S4和/或Hra突变；谷氨酰胺合酶抑制剂例如草丁膦或巴斯塔(basta)(例如bar基因)；和草甘膦抗性(EPSPS基因))；以及加工或加工产品希望的性状，例如高油(例如，美国专利号6,232,529)；改性油(例如，脂肪酸去饱和酶基因(美国专利号5,952,544；WO 94/11516))；改性淀粉(例如，ADPG焦磷酸化酶(AGPase)、淀粉合成酶(SS))、淀粉分支酶(SBE))和淀粉脱支酶
(SDBE))；以及聚合物或助发育物(bioplastic)(例如美国专利号5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合成酶和乙酰乙酰基辅酶A还原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.[细菌学杂志]170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(PHA)表达)，其公开内容通过引用并入本文。
还可以将多核苷酸与提供农艺性状(例如，雄性不育(例如，参见美国专利号5.583,210)、茎秆强度、抗旱性(例如美国专利号7,786,353)、开花时间)或转化技术性状(如细胞周期调节或基因靶向(例如，WO 99/61619、WO 00/17364和WO 99/25821))的多核苷酸组合。
(SDBE))；以及聚合物或助发育物(bioplastic)(例如美国专利号5.602,321；β-酮硫解酶、聚羟基丁酸酯合成酶和乙酰乙酰基辅酶A还原酶(Schubert等人(1988)J.Bacteriol.[细菌学杂志]170：5837-5847)促进聚羟基链烷酸酯(PHA)表达)，其公开内容通过引用并入本文。
还可以将多核苷酸与提供农艺性状(例如，雄性不育(例如，参见美国专利号5.583,210)、茎秆强度、抗旱性(例如美国专利号7,786,353)、开花时间)或转化技术性状(如细胞周期调节或基因靶向(例如，WO 99/61619、WO 00/17364和WO 99/25821))的多核苷酸组合。
[0204] 这些堆叠的组合可以通过如下任何方法产生，该方法包括但不限于，通过任何常规的或TopCross方法学进行杂交育种或遗传转化。如果通过对植物进行遗传转化来堆叠这些序列(即分子堆叠物)，则可以在任何时间和以任何顺序组合这些目的多核苷酸序列。例如，可以使用包含一种或多种所需性状的转基因植物作为靶标，以通过随后的转化来引入另外的性状。可以用共转化方案将这些性状与转化盒的任何组合所提供的目的多核苷酸一起引入。例如，若引入两个序列，则这两个序列可包含在分开的转化盒(反式)或包含在同一个转化盒(顺式)中。这些序列的表达可以通过相同的启动子或通过不同的启动子驱动。在某些情况下，可能所希望的是引入将抑制目的聚核苷酸的表达的转化盒。这可以与其他抑制盒或过度表达盒的任何组合进行组合以在该植物中产生所需性状组合。应当进一步认识到，可以使用位点特异重组系统，在希望的基因组位置堆叠多核苷酸序列。参见例如WO 99/25821、WO 99/25854、WO 99/25840、WO 99/25855和WO 99/25853。
[0205] X.昆虫抗性管理方法
[0206] 本文中披露的方法包括用于防治如下昆虫植物有害生物(例如昆虫抗性管理)的方法：例如鞘翅目、半翅目或鳞翅目植物有害生物，包括叶甲属、瘦跗叶甲属、条跳甲属、无网蚜属、小粉虱属、茶翅蝽属、稻绿蝽属或灰翅夜蛾属植物有害生物。昆虫抗性管理(IRM)是用来描述旨在减少昆虫有害生物变得对杀有害生物剂具有抗性的潜力的实践的术语。Bt(或其他杀有害生物蛋白，化学的或生物学的)IRM的维护是非常重要的，因为昆虫抗性对未来使用Bt植物掺入保护剂和Bt技术整体而言构成威胁。特定的IRM策略(例如高剂量/结构化庇护所策略)延迟对玉米、棉花和马铃薯中产生的特异性Bt蛋白的昆虫抗性。然而，为了确保非抗性昆虫发育并可与在受保护作物中产生的任何抗性有害生物交配，这样的策略导致作物的一部分容易受到一种或多种有害生物的侵害。因此，从农民/生产者的角度来看，非常希望拥有尽可能小的庇护所，但仍然能够管理昆虫抗性，从而获得最大的产量，同时仍然保持所用的有害生物防治方法(无论是Bt、化学、一些其他方法、或其组合)的功效。
[0207] 通常使用的IRM策略是种植庇护所(总面积的一部分使用非Bt/杀有害生物性状种子)，因为通常认为这将通过保持昆虫易感性来延迟昆虫对杀有害生物性状的抗性的发展。用于延迟抗性的庇护所策略的理论基础取决于如下假设：昆虫抗性的频率和隐性与有害生物易感性成反比；只有当有害生物对毒素非常敏感时，抗性才是罕见且隐性的，并且反之，当有害生物不是非常敏感时，抗性会更加频繁且隐性也更少。此外，该策略假定对Bt的抗性是隐性的并且由具有两个等位基因的单一基因座赋予，所述两个等位基因产生三种基因型：易感纯合体(SS)、杂合体(RS)和抗性纯合体(RR)。还假定初始抗性等位基因频率较低，并且抗性成虫和易感成虫之间会有大量的随机交配。在理想的情况下，只有罕见的RR个体将幸免于作物产生的杀有害生物毒素。SS个体和RS个体均易受到杀有害生物毒素的影响。
结构化庇护所是种植者的田地或一组田地的非Bt/杀有害生物性状部分，其提供可能与幸免于所述杀有害生物性状作物(可能是Bt性状作物)的罕见抗性(RR)昆虫随机交配的易感(SS)昆虫的产生，以产生将被所述Bt/杀有害生物性状作物杀死的易感RS杂合子。整合的庇护所是种植者的田地或一组田地的随机种植的非Bt/杀有害生物性状部分的某些部分，其提供可能与幸免于所述杀有害生物性状作物的罕见抗性(RR)昆虫随机交配的易感(SS)昆虫的产生，以产生将被所述杀有害生物性状作物杀死的易感RS杂合子每个庇护所策略将从昆虫群体中移除抗性(R)等位基因并延迟抗性的演变。
结构化庇护所是种植者的田地或一组田地的非Bt/杀有害生物性状部分，其提供可能与幸免于所述杀有害生物性状作物(可能是Bt性状作物)的罕见抗性(RR)昆虫随机交配的易感(SS)昆虫的产生，以产生将被所述Bt/杀有害生物性状作物杀死的易感RS杂合子。整合的庇护所是种植者的田地或一组田地的随机种植的非Bt/杀有害生物性状部分的某些部分，其提供可能与幸免于所述杀有害生物性状作物的罕见抗性(RR)昆虫随机交配的易感(SS)昆虫的产生，以产生将被所述杀有害生物性状作物杀死的易感RS杂合子每个庇护所策略将从昆虫群体中移除抗性(R)等位基因并延迟抗性的演变。
[0208] 减少对庇护所的需求的另一个策略是对具有针对靶标昆虫有害生物的不同作用模式的性状进行聚合。例如，具有堆叠在一个转基因植物中的不同作用模式的Bt毒素对庇护所的需求降低。堆叠组合中不同的作用模式也保持了每种性状的持久性，因为抗性发展到每种性状的速度较慢。
[0209] 目前，庇护所的规模、布置和管理通常被认为是减轻昆虫对玉米、棉花、大豆和其他作物中产生的Bt/杀有害生物性状的抗性的庇护所策略成功的关键。由于庇护所种植区的产量下降，一些农民选择避开庇护所需求，而其他农民则不遵循规模和/或布置要求。这些问题导致没有庇护所或庇护所效果不佳，而且抗性有害生物发展的风险也相应增加。
[0210] 因此，仍然需要用于管理一片有害生物抗性作物植物中的有害生物抗性的方法。提供用于保护植物，特别是玉米或其他作物植物免受有害生物的摄食损伤的改良方法是有用的。如果这种方法会降低对传统化学杀有害生物剂所需的施用率，并且还将限制作物种植和栽培所需的单独田间作业的数量，这将是特别有用的。另外，具有部署转基因庇护所的方法将是有用的，该方法消除了上述关于依从性的、淡化或消除许多抗性治理策略的功效的问题。
[0211] 一个实施例涉及减少抗性有害生物发展的方法，该方法包括向植物提供植物保护组合物(Bt毒素、转基因杀昆虫蛋白、其他杀昆虫蛋白、化学杀昆虫剂、杀昆虫生物学昆虫病原体等)，以及使该植物有害生物与沉默元件(即，靶向如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸的沉默元件)接触，其中所述沉默元件(即，靶向如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸的沉默元件)使靶标有害生物中的序列中的一个或多个的表达减少并防治所述有害生物。
[0212] 另外的实施例涉及增加植物有害生物组合物的持久性的方法，该方法包括向植物提供植物保护组合物(Bt毒素、转基因杀昆虫蛋白、其他杀昆虫蛋白、化学杀昆虫剂、杀昆虫生物学昆虫病原体等)，以及使该植物有害生物与沉默元件(即，如SEQ ID NO.：1-49中所示一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸的沉默元件)接触，使靶标有害生物中的序列中的一个或多个的表达减少并防治所述有害生物。在另一个实施例中，作为条、块种植或与所述性状种子整合的庇护所包含进一步包含沉默元件(例如，靶向如SEQ ID NO.：1-49中所示一个或多个多核苷酸的沉默元件)的植物。
[0213] 在仍另外的实施例中，可以通过施加到非庇护所植物的沉默元件的存在(作为与非庇护所植物中的任何杀昆虫性状不同的作用模式)而减少或消除所需的庇护所。在另一个实施例中，所述庇护所或非庇护所可以包括作为喷雾剂、诱饵、引诱物，或者作为不同的转基因植物的沉默元件，即，如SEQ ID NO.：1-49中所示一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸的沉默元件。
[0214] 在另外的实施例中，向昆虫有害生物饲喂如下饲料，该饲料包含如SEQ ID NO.：1-49中所示一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸的沉默元件，并且所述昆虫在饲喂后第1、2、
3、4、5、6、7、8、9或10天被释放到植物上。在叉另外的实施例中，所述有害生物是昆虫有害生物，并且在幼虫或成虫阶段对所述昆虫有害生物进行饲喂。
3、4、5、6、7、8、9或10天被释放到植物上。在叉另外的实施例中，所述有害生物是昆虫有害生物，并且在幼虫或成虫阶段对所述昆虫有害生物进行饲喂。
[0215] 目前的IRM策略需要高剂量的Bt毒素以便使昆虫抗性发展最小化。由于植物毒性，可能难以达到所需的高剂量。借助不同的昆虫防治手段进行有害生物综合治理(IPM)可用于延迟暴露于次最优剂量的蛋白毒素(例如Bt毒素)的昆虫抗性。可以将RNAi和沉默元件作为IPM策略的一部分进行部署。
[0216] 如本文所使用的，术语“杀有害生物的”用于指针对有害生物(例如鞘翅目植物有害生物)的毒性作用，并且包括外部供应的杀有害生物剂和/或由作物植物产生的试剂中的任一者或两者的活性。如本文所使用的，术语“不同的杀有害生物作用模式”包括一种或多种抗性性状的杀有害生物效果，其中无论是通过转化或传统育种方法，例如将由所述作物植物产生的杀有害生物毒素与玉米根虫的肠膜中不同的结合位点(即不同的毒素受体和/或同一毒素受体上的不同位点)结合，或通过RNA干扰，将所述抗性性状引入所述作物植物中。
[0217] XI.施用方法
[0218] 在一个实施例中，可以将如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物直接施用于种子。例如，在本文披露的组合物和方法中使用的如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件可以在没有附加组分和不进行稀释的情况下施用。
[0219] 在一个实施例中，喷雾剂、诱饵、引诱物、引诱剂和种子处理可以包含如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物。
[0220] 在另一个实施例中，将如SEQID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物以合适的制剂形式施用于种子。用于处理种子的合适的制剂和方法是本领域技术人员已知的并且例如描述于以下文献中：US 4,272,417 A、US 4,245,432 A、US 4,808,430 A、US 5,876,739 A、US 2003/0176428 A1、WO
2002/080675 A1、WO 2002/028186 A2。
2002/080675 A1、WO 2002/028186 A2。
[0221] 可以将如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物转化为常规的拌种制剂(例如溶液、乳剂、悬浮剂、粉剂、泡沫剂、浆剂或其他种子包衣材料)和ULV制剂。以已知的方式，通过将如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物与常规添加剂(例如，常规增充剂以及溶剂或稀释剂、着色剂、润湿剂、分散剂、乳化剂、消泡剂、防腐剂、二次增稠剂、粘合剂、赤霉素和水)混合来制备这些制剂。
[0222] 在另一个实施例中，可能存在于拌种制剂中的合适的着色剂包括常用于此类目的的所有着色剂。可以使用在水中溶解性很低的颜料和可溶于水的染料二者。可以提及的实例包括名称为罗丹明B(Rhodamine B)、C.I.颜料红112(C.I.Pigment Red 112)、和C.I.溶剂红1(C.I.Solvent Red 1)的已知着色剂。
[0223] 在另一个实施例中，可存在于所述拌种制剂中的合适的润湿剂包括促进润湿且常用于活性农用化学物质的制剂中的所有物质。优选地，有可能使用烷基萘磺酸盐，如二异丙基萘磺酸盐或二异丁基萘磺酸盐。
[0224] 在仍另一个实施例中，可存在于所述拌种制剂中的合适的分散剂和/或乳化剂包括常用于活性农用化学物质的制剂中的所有非离子、阴离子和阳离子分散剂。在一个实施例中，可以使用非离子或阴离子分散剂或者非离子或阴离子分散剂的混合物。在一个实施例中，非离子分散剂包括但不限于环氧乙烷-环氧丙烷嵌段聚合物、烷基酚聚乙二醇醚和三苯乙烯苯酚聚乙二醇醚，以及它们的磷酸化或硫酸化衍生物。
[0225] 在仍另一个实施例中，可以存在于根据本发明使用的拌种制剂中的消泡剂包括常用于农用化学活性化合物的制剂中的所有泡沫抑制性化合物，但不限于硅酮消泡剂、硬脂酸镁、硅酮乳剂、长链醇、脂肪酸及其盐，以及有机氟化合物及其混合物。
[0226] 在仍另一个实施例中，可存在于拌种制剂中的二次增稠剂包括可用于农业化学组合物中的此类目的的所有化合物，包括但不限于纤维素衍生物、丙烯酸衍生物、多糖类(例如黄原胶或硅酸铝镁(Veegum))、改性粘土、层状硅酸盐(如绿坡缕石和膨润土)、以及精细分散的硅酸。
[0227] 可存在于待根据本发明使用的拌种制剂中的合适的粘合剂包括可用于拌种的所有常规粘合剂。聚乙烯吡咯烷酮、聚乙酸乙烯酯、聚乙烯醇和Tylose可以作为优选的被提及。
[0228] 在另一个实施例中，如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、或者包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物在第一次施用步骤中施用于土壤、在第二次施用中施用于种子、并且在第三次施用中施用于植物的叶面区域。
[0229] 如本文所使用的，将如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物施用于种子、植物、或植物部分包括将所述种子、植物、或植物部分直接和/或间接与所述如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物接触。在一个实施例中，如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物可以作为喷雾剂、冲洗剂(rinse)或粉剂，或其任何组合来直接施用。
[0230] 在另一个方面，如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物可以作为粉剂直接施用于植物或植物部分。如本文所使用的，粉剂是由大量非常细的颗粒组成的干燥或接近干燥的散装固体，其在振动或倾斜时可自由流动。本文公开的干燥或接近干燥的粉末组合物优选地含有低百分比的水，例如在各个方面，小于按重量计的5％、小于2.5％、或小于1％。
[0231] 在另外的实施例中，可以通过本领域技术人员已知的转化技术将如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件引入细菌、酵母或真菌中，并将所述经转化的细菌、酵母或真菌施用于植物、该植物正在生长的土壤、水培介质、种子或按照如上文所述的前述施用方法中的任一种进行任意施用。
[0232] 在一个实施例中，可通过封装技术来配制如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物，以提高稳定性。在一个实施例中，所述封装技术可以包含随时间推移定时释放的珠状聚合物。在一个实施例中，可以将所述封装的如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物以沿犁沟单独施用珠的方式施用于种子。在另一个实施例中，可以将所述封装的如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物与种子同时共同施用。
[0233] 可用于包封实施例的缓释微粒的包衣剂可以是用于用其上待负载的物质对该微粒形式进行包衣的物质。一般可以使用能够形成所述负载物质难以透过的包衣的任何包衣剂，而没有任何特别的限制。例如，可以使用饱和度更高的脂肪酸、蜡、热塑性树脂、热固性树脂等。
[0234] 有用的饱和度更高的脂肪酸的实例包括硬脂酸、硬脂酸锌、硬脂酸酰胺和亚乙基双硬脂酸酰胺；蜡的实例包括合成蜡，如聚乙烯蜡、碳蜡、赫斯特(Hoechst)蜡和脂肪酸酯；天然蜡，如巴西棕榈蜡、蜂蜡和日本蜡；以及石油蜡，如固体石蜡和凡士林。热塑性树脂的实例包括聚烯烃，例如聚乙烯、聚丙烯、聚丁烯和聚苯乙烯；乙烯基聚合物，例如聚乙酸乙烯酯、聚氯乙烯、聚偏二氯乙烯、聚丙烯酸、聚甲基丙烯酸、聚丙烯酸酯和聚甲基丙烯酸酯；二烯聚合物，例如丁二烯聚合物、异戊二烯聚合物、氯丁二烯聚合物、丁二烯-苯乙烯共聚物、乙烯-丙烯-二烯共聚物、苯乙烯-异戊二烯共聚物、MMA-丁二烯共聚物和丙烯腈-丁二烯共聚物；聚烯烃共聚物，例如乙烯-丙烯共聚物、丁烯-乙烯共聚物、丁烯-丙烯共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯共聚物、乙烯-丙烯酸共聚物、苯乙烯-丙烯酸共聚物、乙烯-甲基丙烯酸共聚物、乙烯-甲基丙烯酸酯共聚物、乙烯-一氧化碳共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯-一氧化碳共聚物、乙烯-乙酸乙烯酯-氯乙烯共聚物和乙烯-乙酸乙烯酯-丙烯酸共聚物；以及氯乙烯共聚物，例如氯乙烯-乙酸乙烯酯共聚物和偏二氯乙烯-氯乙烯共聚物。热固性树脂的实例包括聚氨酯树脂、环氧树脂、醇酸树脂、不饱和聚酯树脂、酚醛树脂、脲-三聚氰胺树脂、尿素树脂和硅酮树脂。在以上所述中，优选的是热塑性丙烯酸酯树脂、丁二烯苯乙烯共聚物树脂、热固性聚氨酯树脂和环氧树脂，并且在所述优选的树脂中，特别优选的是热固性聚氨酯树脂。这些包衣剂可以单独使用或者两种或更多种组合使用。
[0235] 在一个实施例中，可以将如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物配制成进一步包含昆虫病原体。在一个实施例中，本公开的方法和组合物涉及如下组合物，该组合物包含如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸序列的沉默元件、以及包含所述序列的组合物和一种或多种生物防治剂。如本文所使用的，术语“生物防治剂”(“BCA”)包括一种或多种细菌、真菌或酵母，原生动物，病毒，昆虫病原线虫和植物提取物，或由微生物产生的产物(包括蛋白质或次级代谢产物)，以及具有以下特征中的一种或两种的接种剂(innoculant)：(1)抑制或减少病原体、有害生物或昆虫(包括但不限于致病性真菌、细菌和线虫)以及节肢动物有害生物(如昆虫、蜘蛛纲动物、蜈蚣、双足动物)的植物侵染和/或生长，或者抑制植物病原体、有害生物或昆虫的组合的植物侵染和/或生长；(2)改进植物性能；(3)改进植物产量；(4)改进植物活力；和(5)改进植物健康。
[0236] XII.使用Cas/CRISPR进行基因编辑
[0237] 在一个实施例中，可以使用基因组编辑技术将如SEQ ID NO.：1-49中所示的一个或多个多核苷酸或其互补序列、包含如SEQ ID NO.：1-49中所示序列或其互补序列的表达构建体、或者靶向所述多核苷酸的沉默元件、以及包含所述序列的组合物引入到植物的基因组中，或者可以使用基因组编辑技术对先前导入的编码植物基因组中本文披露的沉默元件的多核苷酸进行编辑。例如，可以通过使用双链断裂技术(如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等)将公开的多核苷酸引入植物基因组中期望的位置中。例如，为了位点特异性插入的目的，可以使用CRISPR-Cas系统将所公开的多核苷酸引入基因组中期望的位置中。植物基因组中期望的位置可以是任何对于插入来说期望的靶标位点，例如适于育种的基因组区域，或者可以是位于具有现有的目的性状的基因组窗口中的靶标位点。现有的目的性状可能是内生性状或先前引入的性状。
[0238] 在另一个方面，在所披露的编码沉默元件的多核苷酸先前已经被引入到基因组中的情况下，可以使用基因组编辑技术来改变或修饰引入的多核苷酸序列。可以引入披露的编码沉默元件的多核苷酸组合物中的位点特异性修饰包括使用用于引入位点特异性修饰的任何方法产生的修饰，该方法包括但不限于通过使用基因修复寡核苷酸(例如美国公开2013/0019349)，或通过使用双链断裂技术，如TALEN、大范围核酸酶、锌指核酸酶、CRISPR-Cas等。此类技术可用于通过在引入的多核苷酸内的核苷酸的插入、缺失或取代来修饰先前引入的多核苷酸。可替代地，可以使用双链断裂技术向引入的多核苷酸中添加另外的核苷酸序列。可以添加的另外的序列包括另外的表达元件(例如增强子序列和启动子序列)。在另一个实施例中，可以使用基因组编辑技术在植物基因组内定位紧邻本文披露的多核苷酸组合物的另外的杀昆虫活性蛋白，以产生杀昆虫活性蛋白的分子堆叠物。“改变的靶标位点”、“改变的靶标序列”、“修饰的靶标位点”和“修饰的靶标序列”在本文中可互换地使用，并且意指如本文公开的靶标序列，当与非改变的靶标序列相比时，该靶标序列包含至少一种改变。此类“改变”包括，例如：(i)至少一个核苷酸的替代、(ii)至少一个核苷酸的缺失、(iii)至少一个核苷酸的插入、或(iv)(i)-(iii)的任何组合。
[0239] 本说明书中提到的所有出版物和专利申请都指示了本发明所属领域的技术人员的水平。将所有出版物和专利申请通过引用并入本文，其程度就像明确且单独指出通过引用将每个单独出版物或专利申请并入本文一样。
[0241] 通过说明的方式但不是通过限制的方式提供了以下实例。
[0242] 实验
[0243] 实例1：核酸序列。
[0244] 本文披露的核酸序列包含以下核酸序列。某些序列是示例性的，并且使用如下所示的实例2、3和6中所述的测定方法显示出其对玉米根虫具有杀昆虫活性。此类序列或其互补序列可以用于本文上下文所述的方法中。本文所述的DNA构建体、载体、转基因细胞、植物、种子或产物可以包含一种或多种以下核酸序列，或者一种或多种本披露的序列中的一部分。靶标多核苷酸、或者其变体和片段、及其互补序列的非限制性实例列于下表1中，包括例如SEQ ID NO.：1-49、及其变体和片段、及其互补序列。
[0245] 表1.通过同源序列搜索鉴定的SSJ3直向同源物的列表
[0246]
[0247]
[0248]
[0249] *N/A指示是不可获得的。
[0250] 实例2：体外转录(IVT)和dsRNA昆虫生物测定。
[0251] 在基于玉米根虫饮食的测定中使用不同的靶标选择策略用于识别具有杀昆虫活性的RNAi活性靶标。采用标准方法从3日龄西方玉米根虫幼虫的中肠或新生虫产生cDNA文库。使用靶标特异性引物在PCR中扩增含有表达序列标签(EST)的所选择的cDNA克隆，以产生DNA模板。靶标特异性引物还含有T7RNA聚合酶位点(在每个引物5′端的T7序列)。之前的随机cDNA筛选鉴定了若干SSJ cDNA作为RNAi活性靶标(参见美国专利申请公开2014/0275208和US2015/0257389)。为了识别具有RNAi活性的玉米根虫的其他基因，使用来自以下各项的3日龄幼虫来完成转录组实验；西方玉米根虫(“WCRW”；玉米根萤叶甲)、北方玉米根虫(“NCRW”；北方玉米根虫(巴氏根叶甲))、南方玉米根虫(“SCRW”；黄瓜十一星叶甲)。鉴定了同源转录物，并列于表1中(SEQ ID NO.5至44)。
[0252] 通过PCR产生WCRW基因的一个或多个区域，然后通过体外转录(IVT)产生长双链RNA(DvSSJ3FRAG1，SEQ ID NO：45)。将IVT反应产物在凝胶中进行定量，并并入如下所述的用于第一轮IVT筛选(FIS)的人工昆虫饮食中。简言之，将dsRNA以96孔微量滴定板形式并入标准WCRW人工饮食中，终浓度为300ppm。将5μl的IVT反应(300ng/μl)添加到96孔微量滴定板的给定孔中。将25μl的熔融的低熔点西方玉米根虫饮食添加到样品中并在定轨摇床上摇动以混合该样品和饮食。一旦饮食凝固，针对每个RNA样品使用8个孔。将预先准备好的1日龄WCRW(在转移至试验材料中之前将新生昆虫置于中性饮食中持续24小时)以3-5只昆虫/孔的比率添加到96孔微量滴定板中。为了防止饮食变干，首先将板放在具有轻微潮湿的布的塑料袋内，并将这些袋放置在设定在28℃和70％RH的培养箱中。7天后对该测定法的死亡率和发育迟缓影响进行评分，并且基于据对每一类影响的数值赋值确定平均值(3＝死亡，2＝严重发育迟缓，1＝发育迟缓，0＝无影响)。这个和所有饮食测定表中报告的数字反映了所有观察结果的平均分。3分表示所有观察结果全部死亡。例如，得分2.5表明一半的孔显示死亡，而另一半的孔评分为严重发育迟缓。代表性的初步测定(FIS)结果在下表2中提供。
[0253] 表2：西方玉米根虫初步(FIS)测定结果。
[0254]SEQ ID NO. 靶标片段名称 得分
45 DV-SSJ3-FRAG1 2.75
45 DV-SSJ3-FRAG1 2.75
[0255] 实例3.针对改进的杀昆虫活性的靶标片段搜索。
[0256] 设计有效dsRNA的靶子区域来评估饮食和植物体内dsRNA表达方面的杀昆虫活性。如初次筛选所述，将dsRNA掺入饮食中。对于每个样品，评估10个剂量(100、31.6、10、3.16、
1、0.316、0.10、0.032、0.010和0.0032ng μl-1)，对每剂量或水对照总共32次观察。采用四个板，每个板上对每个浓度有8个孔。将两只一日龄幼虫转移到每个孔中。将板在27℃和65％RH孵育。暴露后8天，对幼虫进行生长抑制(严重发育迟缓的幼虫，大小减少＞60％)和死亡率评分。使用SAS中的PROC Probit分析来分析数据以确定50％致死浓度(LC50)。使用死亡和严重发育迟缓的幼虫的总数来分析50％抑制浓度(IC50)，如表3所示。
1、0.316、0.10、0.032、0.010和0.0032ng μl-1)，对每剂量或水对照总共32次观察。采用四个板，每个板上对每个浓度有8个孔。将两只一日龄幼虫转移到每个孔中。将板在27℃和65％RH孵育。暴露后8天，对幼虫进行生长抑制(严重发育迟缓的幼虫，大小减少＞60％)和死亡率评分。使用SAS中的PROC Probit分析来分析数据以确定50％致死浓度(LC50)。使用死亡和严重发育迟缓的幼虫的总数来分析50％抑制浓度(IC50)，如表3所示。
[0257] 表3：靶标片段西方玉米根虫测定结果。
[0258]
[0259] 实例4：土壤杆菌属介导的玉米转化。
[0260] 对于用本发明的沉默元件对玉米进行的土壤杆菌属介导的转化，采用了Zhao的方法(美国专利号5,981,840，和PCT专利公开WO 98/32326；其内容通过引用结合在此)。例如，这样的构建体可以表达表1中所示的靶标序列的长双链RNA。这样的构建体可以与启动子连接。简言之，从玉米中分离未成熟胚，并将胚与土壤杆菌属的悬浮液接触，其中该细菌能够将包含沉默元件的多核苷酸转移至这些未成熟胚中的至少一个的至少一个细胞中(步骤1：侵染步骤)。在该步骤中，将未成熟胚浸泡在土壤杆菌属的悬浮液中，引发接种。使这些胚与土壤杆菌属共培养一段时间(步骤2：共培养步骤)。在该侵染步骤之后，将这些未成熟胚在固体培养基上进行培养。在此共同培养期之后，设想任选的“静息”步骤。在该静置步骤中，将这些胚在至少一种抗生素的存在下(不添加植物转化子的选择剂)孵育，已知该抗生素抑制土壤杆菌属生长(步骤3：静息步骤)。将这些未成熟胚在有抗生素但没有选择剂的固体培养基上培养，以消除土壤杆菌属并用于经侵染的细胞的静息期。接着，在含有选择剂的培养基上培养经接种的胚，并且回收生长的经转化的愈伤组织(步骤4：选择步骤)。在含选择剂的固体培养基上培养这些未成熟胚，使经转化的细胞选择性生长。然后将愈伤组织再生成植物(步骤5：再生步骤)，并将生长在选择培养基上的愈伤组织在固体培养基上培养以再生植物。
[0261] 实例5：沉默元件在玉米中的表达。
[0262] 使用上述测定方法，将确定其IC50值低于2ppm的片段进一步用于植物转化载体构建和植物体内的疗效评价。沉默元件在玉米植物中表达为发夹。在温室环境中测试了RNAi构建体的TO植物对玉米根虫的杀昆虫活性。
[0263] 简言之，用含有本文披露的至少一种多核苷酸的质粒转化玉米植物，并将表达沉默元件的植物从272V板移植到含有盆栽混合土的温室板中。在移植后约10至14天，将植物(现在处于生长阶段V2-V3)移植到含有盆栽混合土的较大盆中。在送入温室后14天，用200个西方玉米根虫(WCRW)的卵/植物侵染植物。对于后来的设置，第一次侵染后14天用200个WCRW的卵/植物进行第二次侵染，并且在第二次侵染后14天进行评分。侵染后21天，使用CRWNIS对植物进行评分。将那些得分≤1.0的植物移植到用于T1种子的大盆中。
[0264] 与转基因阴性品系HC69相比，预期含有DV-SSJ3的片段的TO转基因植物在昆虫损伤评分(CRWNIS)方面显示显著降低。因此，预期在温室里植物体内获得的数据能证实上述饮食测定杀昆虫活性数据(表2)。
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