具有协同效应的线虫毒性组合物、具有协同效应的线虫毒性
组合物的用途
发明领域
[0001] 本发明落入
绿色化学的范围内，总体上涉及用于控制农业
害虫的组合物，并且在具有的实施方案中，涉及可用于防治线虫的组合物。
[0003] 在持续性的概念中，
环境化学和/或绿色化学已经向引入替代污染技术的工艺和产品的方向发展。已经证实，使用
植物起源的原材料和/或与天然存在的那些相同的物质以及将其引入生态上正确的工艺/产品为世界性的趋势，尤其是具有大的
生物质利用度的国家。
[0004] 在巴西，瘿线虫(爪哇根结线虫(Meloidogyne javanica))在密集农业区中为重要作物例如咖啡豆、
甘蔗、大豆、豆类、
烟草、果树和蔬菜植物的危害最大的害虫之一。这些
植物病原体所导致的损伤包括形成导致
土壤水分和营养吸收失衡的虫瘿、使植物对任何环境改变或对害虫和病原体攻击更为敏感。根结线虫(Meloydogyne spp)属的线虫为强制在多种植物上的固定内寄生虫。宿主包括超过3,000个植物种类。每年与这些生物的作用相关的损失达到US$ 1500亿，其中90%与南方根结线虫(Meloigogyne incognica)、爪哇根结线虫(M. Javanica)、花生根结线虫(M. arenaria)和北方根结线虫(M. hapla)有关(Abad,等，2008；Bakhetia等，2005)。在本文中，南方根结线虫作为对经济损失最具表现
力的物种而格外突出(Huang等，2006)。
[0005] 用于控制此植物寄生物的策略包括
轮作、使用抗性变种、综合处理害虫以及主要施用合成的农业防御物(Chitwood, 2002)。在轮作方案中使用拮抗植物是一个备选方案，但伴随生产力和农民利润降低(Dufour等，2003；Ferraz & Freitas，2000)。使用抗性变种是一个值得推荐的控制害虫和
疾病的方法，但抗性栽培品种的数目以及与此抗性相关的遗传多样性有限(Dofour等，2003；Ferraz & Freitas，2000)。害虫的综合处理为一个期需策略，但其需要严格计划、密集管理作物、较高的时间消耗，并且成本可能高于使用农业防御物(Gentz，2010)。最广泛使用的控制策略在于合成杀线虫药的大量使用，这导致自然环境和公众健康受到损害(Abad等，2008)。在此方面，利用天然线虫毒性植物化合物(Newman等，2003)为控制该植物线虫的一个策略。
[0006] 植物代谢组学领域的显著进步，以及其与基因组学、转录组学、
蛋白质组学和生物信息学的整合提供了用于开拓和扩展生物系统的复杂相互作用的新的可能(Weckwerth，2009；Shulaev，2008；Weckwerth，2008；Huang等，2008；Roessner等，2006；Roessner等，
2001)。对获自拮抗植物
种子的提取物的作用的研究证明了相当有效的杀线虫和抑线虫(nematostatic)作用。这些作用与
次级代谢产物例如生物
碱、萜、
单宁、类黄
酮和糖苷的存在有关(Chitood, 2002; Ferraz & Freitas, 2000)。
[0007] 因此，寻找具有广泛结构和
生物多样性的新颖天然化学物质极其重要(Newman等，2003；Kirkpatrick，2002)，其目的在于获得新型有效和环境安全的线虫毒性产品。在这种情况下，植物成为超过100,000种天然小分子产品(称为植物化合物或代谢产物)的来源(Clardy，2004；Dixon，2001)。在植物中，这些化合物可与细胞分化、生长调节、植物与其它生物之间相互作用的测量以及尤其与
植物保护有关(Dobson, 2004)。
[0008] 在本文中，本发明提供一种对使用损害环境并且可损伤人类健康的线虫毒性化合物的可行替代。此替代通过用于控制线虫并且可用在植物、植物的部分和土壤上的线虫毒性组合物体现。相应的技术来自于使用直生刀豆(Canavalia ensiformis)植物的提取物进行实验所获得的意外结果，其导致一种前所未有的包含提取物中天然存在的物质的特殊组合的线虫毒性组合物。
[0009] 发明概述
[0010] 本发明提供包含天然存在并且协同作用于植物线虫控制的物质的特殊组合的组合物。
[0011] 本发明协同线虫毒性组合物包含：
[0012] 反式乌头酸，
[0015] 作为活性化合物。
[0016] 本发明组合物呈现的形式为溶液、乳液、可湿性粉末、悬液、粉末、粉剂、糊剂、可溶性粉末、颗粒、悬液-乳液浓缩物、浸渍所述活性化合物的天然和合成材料以及在
聚合物质中微胶囊化。此外，本发明组合物可进一步包含制剂成分，其尤其包括液体载体/液体
溶剂和/或固体载体和/或
表面活性剂和/或
增稠剂和/或染料。
[0017] 本发明的第二个实施方案涉及将协同线虫毒性组合物用于控制植物线虫的用途。
[0019] 图1 - 拮抗植物种子的水性粗提物对南方根结线虫的(J2)的作用。条形柱代表暴露48小时之后活线虫的百分比。生物测定中使用每种提取物1 mg/终体积0.3 ml的浓度和100只第二阶段幼虫，每种三个重复，蒸馏水作为阴性对照。
[0020] 图2 - 0.5mg (0.5mg/0.3ml终体积)外部(DECE)和内部(DICE)
透析液对南方根结线虫的J2的作用。条形柱代表死亡线虫的百分比。对照用蒸馏水(dH2O)、
牛血清
白蛋白(BSA)和直生刀豆的水性粗提物(ECACe)进行。进行恢复测定以证明杀线虫作用。
[0021] 图3 - 预热的(50℃)的直生刀豆的DE对南方根结线虫的J2的作用，证明了所分析级分的热
稳定性。该生物测定一式三份进行，条形柱代表死亡线虫的百分比。蒸馏水用作阴性对照。进行恢复测定以证明杀线虫作用。
[0022] 图4 - 500 µg/0.3mL直生刀豆DE对自由生活的腐生线虫(FL/VL)和南方根结线虫的J2的作用。条形柱代表死亡线虫的百分比。该生物测定的对照为分别浸渍在蒸馏水中的线虫(VL)和南方根结线虫的J2。
[0023] 图5 - 使用用溶解在PBS中的不同浓度的直生刀豆外部
透析液孵育的牛血(A)或纯化红细胞(B)的溶血活性试验。溶血活性的测量通过使用567 nm
波长以分光光度法监测。蒸馏水(100%溶血)和PBS用作阳性和阴性对照。
[0024] 图6 - 直生刀豆外部透析液(DE)在
温室模拟田地条件下对南方根结线虫的J2的作用。条形柱表示处理后番茄植物根内存在的卵
块数目。该实验一式五份进行，蒸馏水和市售杀线虫药分别用作阴性和阳性对照。
[0025] 图7 - 光学
显微镜：(A)加入DE前的J2 – 200x。(B)加入DE前的J2的肠内区域– 400x。(C )加入DE后24小时的J2 – 200x。(D)加入DE后的J2的肠内区域– 400x。
[0026] 图8 - (A)直生刀豆外部透析液(DE)的色谱(λ = 216 nm)，显示具有22个峰的概况。(B) –生物测定，显示暴露48小时后抗南方根结线虫的J2的活性级分(1、3、6、17和18)。(C) –恢复测定，证明了级分1、3和18的杀线虫作用以及级分6和17的抑线虫作用。
[0027] 图9 - (A)-生物测定，显示暴露48小时后市售化合物对南方根结线虫的第二阶段幼虫的作用。1- 对照dH2O，2- DECE，3- 10%葡萄糖，4- 20%葡萄糖，5- D-松醇(80 ug)，6- D-松醇(150 ug)，7- L-刀豆氨酸(80 ug)，8- L-刀豆氨酸(150 ug)，9- 棕榈酸(80 ug)，10- 棕榈酸(150 ug)，11-
柠檬酸(80 ug)，12- 柠檬酸(150 ug)，13- 苹果酸(80 ug)，14- 苹果酸(150 ug)，15- 顺式乌头酸(80 ug)，16- 顺式乌头酸(150 ug)，17- 反式乌头酸(80 ug)，18- 反式乌头酸(150 ug)，19- 50 mM Tris/HCl pH 8，20- 50 mM乙酸pH 5，21-L-苯胺(80 ug)，22- L-苯胺(150 ug)，23- L-甲硫氨酸(80 ug)，24- L-甲硫氨酸(150 ug)，25- L-
色氨酸(80 ug)，26- L-色氨酸(150 ug)，27- S-羧甲基半胱氨酸(80 ug)，28- S-羧甲基半胱氨酸(150 ug)，29- Zantotoxine (80 ug)，30- Zantotoxine (150 ug)和31- 20%葡萄糖+L-刀豆氨酸(15 ug)。B- 使用蒸馏水恢复测定后对不同市售化合物的作用的评估。
[0028] 图10 - (A)-生物测定，显示暴露48小时之后市售化合物及其组合物对南方根结线虫的第二阶段幼虫(J2)的作用。C+：阳性对照(提取物)；C-：阴性对照(水)；2：棕榈酸；3：S-羧甲基半胱氨酸；4：反式乌头酸；5：葡萄糖。组合物的浓度：3+4、3+5 = 0.25 g/L (组合物中的每种活性化合物)；3+4+5 =组合物中的每种活性化合物0.17 g/L。(B)-使用蒸馏水恢复测定后对不同市售化合物及其组合物的作用的评估。C+：阳性对照(提取物)；2：棕榈酸；3：S-羧甲基半胱氨酸；4：反式乌头酸；5：葡萄糖。组合物的浓度：3+4、3+5、4+5 = 0.25 g/L (组合物中的每种活性化合物)；3+4+5 =组合物中的每种活性化合物0.17 g/L。
[0029] 发明详述
[0030] 本发明为着眼于检测
植物提取物中存在的可能的天然线虫毒性化合物所进行的研究工作的结果。这样的化合物构成了替代导致对自然和人损伤的线虫毒性合成
试剂的备选方案。本发明所述的线虫毒性组合物由使用
植物提取物中所检测到的一些物质作为活性化合物进行线虫毒性生物测定时所获得的意外结果产生。这些生物测定的结果证明存在出人意料的协同线虫毒性效应。
[0031] 在本文中，本发明描述了一种具有协同效应的线虫毒性组合物，其包含：
[0032] 反式乌头酸，
[0033] 葡萄糖和任选地
[0034] S-羧甲基半胱氨酸
[0035] 作为活性化合物。
[0036] 作为选择，本发明所述的线虫毒性组合物可包含制剂成分。所述(存在或不存在制剂成分的)组合物，可为溶液、乳液、可湿性粉末、悬液、粉末、粉剂、糊剂、可溶性粉末、颗粒、悬液-乳液浓缩物、浸渍所述活性化合物的天然和合成材料以及在聚合物质中微胶囊化的形式。
[0037] 可用作制剂成分的化合物尤其为：液体载体/液体溶剂和/或固体载体和/或表面活性剂和/或增稠剂和/或染料。若使用的制剂成分为水，还可以使用助溶剂例如
有机溶剂。
[0038] 在适合用于本发明的液体载体/液体溶剂中，可特别提及芳族溶剂、氯代芳族溶剂或氯代脂肪
烃、脂肪烃、石油馏分、矿物油、
植物油、醇及其醚和酯、酮、强极性溶剂和水。
[0039] 优选地，本发明所用的芳族溶剂选自二
甲苯、甲苯或烷基
萘。在本发明组合物中使用氯代芳族溶剂或氯代脂肪烃的情况下，其优选选自氯苯、氯乙烯或二氯甲烷。脂肪烃优选选自环己烷或
石蜡。在使用醇的备选情况下，其优选选自
乙醇、丙醇、丁醇或乙二醇。对于使用酮的情况，其优选选自丙酮、甲乙酮、甲基异丁基酮或环己酮。强极性溶剂优选选自二甲基甲酰胺和二甲基亚砜。
[0040] 在适合用于本发明的固体载体中，可提及铵盐、
磨碎的天然矿物和磨碎的合成矿物。
[0041] 优选地，当磨碎的天然矿物用作固体载体时，其选自
高岭土、粘土、滑石、白垩、
石英、绿坡缕石、蒙脱石和
硅藻土。当使用磨碎的合成矿物时，其优选选自
二氧化硅、氧化
铝和
硅酸盐。当本发明的线虫毒性组合物以颗粒形式呈现时，使用合适的固体载体。这些合适的固体载体优选选自磨碎的天然
岩石、合成颗粒和有机材料颗粒。
[0042] 或者，表面活性剂可用作本发明组合物的制剂成分。相应的表面活性剂选自乳化剂和/或分散剂和/或
泡沫生成剂。本发明的线虫毒性组合物中可使用不同的乳化剂/泡沫生成剂，包括阳离子、非离子和阴离子乳化剂。当使用非离子和阴离子乳化剂时，其优选选自聚氧乙烯
脂肪酸酯、聚氧乙烯脂肪醚、
烷基磺酸盐、烷基
硫酸盐、芳基磺酸盐和蛋白
水解物。在本发明中使用分散剂例如表面活性剂的情况下，其优选选自甲基
纤维素和木质素亚
硫酸盐废弃物。
[0043] 或者，本发明组合物中还可使用其它制剂成分。这些成分尤其包括增稠剂例如羧甲
纤维素以及呈粉末、颗粒或乳胶形式的天然和合成聚合物，例如阿拉伯树胶、聚乙烯醇和聚乙酸乙烯酯。也可用作制剂成分的其它成分为矿物和植物油、天然磷脂例如脑磷脂、卵磷脂和合成磷脂。
[0044] 或者，本发明的线虫毒性组合物还可包含染料例如无机颜料如氧化
铁、氧化
钛和普鲁士蓝以及有机染料如茜素染料、偶氮染料和金属酞菁染料作为制剂成分。
[0045] 在本发明一个备选的实施方案中，具有协同效应的线虫毒性组合物可进一步包含其它活性化合物。当使用时，这些其它活性化合物选自
杀虫剂、诱惑剂、消毒剂、
杀菌剂、
杀螨剂、杀
真菌剂、生长调节物质、除莠剂和安全剂。
[0046] 在本发明另一个备选的实施方案中，协同的线虫毒性组合物为包含活性化合物的水性组合物。在本发明一个优选的具体组合物中，线虫毒性组合物为包含棕榈酸和反式乌头酸(每种浓度0.25 g/L)的水性组合物。在本发明第二个优选的具体组合物中，线虫毒性组合物为包含棕榈酸和葡萄糖(每种浓度0.25 g/L)的水性组合物。在本发明第三个优选的具体组合物中，线虫毒性组合物为包含棕榈酸、反式乌头酸和葡萄糖(每种浓度0.17 g/L)的水性组合物。在本发明第四个优选的具体组合物中，线虫毒性组合物为包含棕榈酸、反式乌头酸和S-羧甲基半胱氨酸(每种浓度0.17 g/L)的水性组合物。在本发明第五个优选的具体组合物中，线虫毒性组合物为包含棕榈酸、葡萄糖和S-羧甲基半胱氨酸(每种浓度0.17 g/L)的水性组合物。在本发明第六个优选的实施方案中，线虫毒性组合物为包含棕榈酸、葡萄糖、S-羧甲基半胱氨酸和反式乌头酸(每种浓度0.125 g/L)的水性组合物。
[0047] 本发明的另一目标为将前述具有协同效应的线虫毒性组合物用于控制植物线虫的用途。特别地，所述用途通过将本发明组合物施用到植物和/或其部分和/或土壤产生。
[0048] 将本发明的协同线虫毒性组合物施用到植物和/或其部分和/或土壤可直接进行，或通过普通处理方法例如通过浸没、喷射、
蒸发、喷雾、扩散等让化合物在其附近、环境或储存空间作用进行。
[0049] 在本发明一个特别的实施方案中，本文所述具有协同效应的线虫毒性组合物的用途为控制南方根结线虫。
[0050] 进行的实验和获得的结果：
[0051] 最初，在着眼于检测有效抗南方根结线虫的第二阶段幼虫(J2)的化合物的生物测定中检验了获自拮抗植物种子的水性提取物。
[0052] 在所检验的提取物中，直生刀豆，一种起源于中美洲的豆科植物，显示出最高的杀线虫活性(85%)(图1)。通过透析将此材料分级，导致分离出小于3.5 kDa的分子(外部透析液-DE)和大于3.5 kDa的分子(内部透析液-DI)。在这种情况下，与DI相比，DE显示出最有希望的结果，例如：a) 较高的线虫毒性活性(图2)；b)
热稳定性(图3)；c) 对南方根结线虫的J2的高特异性(表1)；d) 无抗真菌(植物病原性胶孢炭疽菌(phitopathogenic Collectotrichum gloeosporioides，登录号1915)、腐皮镰刀菌(Fusarium solani，登录号1624)、菜豆壳球孢菌(Macrophomina phaseolina，登录号1496)和烟草疫霉(Phytophthora tabacum))、细菌(枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis))和昆虫幼虫(
棉铃象(Antonomus grandis)和草地贪夜蛾(Spodoptera frugiperda))的活性(表1)；e) 不存在抗自由生活线虫的活性(图4)；f) 对
哺乳动物红细胞无有害的细胞毒性作用(图5)和g) 在使用番茄植物温室中进行的生物测定中使南方根结线虫卵块减少80%以上(图6)。
[0053] 此外，通过
光学显微镜观察直生刀豆DE中存在的化合物对南方根结线虫的J2产生的作用，显示正常解剖结构被破坏(图7-A、B、C和D)，并且沿着僵硬的线虫体形成各种不同的
空泡。此改变提示该植物寄生物的肠组织变性。
[0054] 表1 – 通过使用不同浓度的直生刀豆DE体外进行的对真菌、细菌、昆虫幼虫和线虫的特异性测定所获得的结果。该生物测定一式三份进行。A =真菌，B =细菌，C =昆虫幼虫，D =线虫
[0055]
[0056] 使用反相柱(C18)经由HPLC纯化DE使得能够分离三种杀线虫级分和两种抑线虫级分。所有的步骤通过评估线虫毒性活性的生物测定监测(图8 A、B和C)。活性级分通过使用气相色谱偶联质谱(GC-MS)、液相色谱偶联质谱(LC-MS)和
核磁共振(1H RMN)技术通过代谢产物谱法分析。这些技术所产生的数据加上大量的文献研究使得能够鉴定出9种具有线虫毒性作用的化合物。
[0057] 在本文中，在抗南方根结线虫幼虫的生物测定中检验了市售获得的经文献调研后鉴定的并且存在于直生刀豆的线虫毒性级分中的具有生物学功能的化合物(图9A)。在暴露48小时之后10% (W/V)的葡萄糖溶液能够使大部分线虫瘫痪(图9A)。恢复测定之后，87%的J2恢复移动性，证明了所施用浓度的葡萄糖的抑线虫活性(图9A)。然而，20% (W/V)的葡萄糖溶液显示出杀线虫作用，在暴露48小时之后杀死90%以上的J2 (图9B)。分别使用80µg/
300µL和150µg/300µL的浓度，在暴露48小时之后植物
碳水化合物D-松醇对南方根结线虫的J2未显示任何毒性作用(图9A)。相似地，在暴露48小时之后80µg/300µL浓度的非蛋白质氨基酸L-刀豆氨酸也未显示任何线虫毒性活性(图9A)。然而，当将浓度增加至150µg/300µL时，恢复测定之后25%的幼虫保持瘫痪，因此证明了其适度的杀线虫活性(图9B)。在
有机酸苹果酸、柠檬酸、顺式乌头酸、反式乌头酸和棕榈酸中，只有后两种酸在80µg/300µL的浓度下能够在暴露48小时之后使90%和98%的南方根结线虫的J2瘫痪(图9A)。相同浓度和暴露时间的其它有机酸仅使非常低百分比的J2瘫痪(图9A)。对于150µg/300µL的浓度，反式乌头酸显示98%的杀线虫活性，而苹果酸、柠檬酸和顺式乌头酸在恢复测定之后仅显示18%、25%和
40%的杀线虫作用(图9B)。另一方面，所评估的两个浓度的棕榈酸均证实有抑线虫作用，恢复试验之后90%的J2恢复移动性(图9B)。这些结果清楚地显示了所检验的有机酸的剂量-依赖作用。分别使用80µg/300µL和150µg/300µ的浓度，氨基酸L-苯丙氨酸和L-色氨酸不能影响J2 (图9A)。相反，在暴露48小时之后80µg/300µL和150µg/300µL两个浓度的化合物S-羧甲基半胱氨酸均使约90%的幼虫瘫痪(图9A)。恢复测定中大部分J2恢复移动，证明了抑线虫作用(图9B)。在暴露48小时之后80µg/300µL浓度和150µg/300µL浓度的Xantotoxin均使87%的J2瘫痪(图9A)。使用此两个浓度经受恢复测定的J2未恢复移动性，证实了杀线虫作用(图
9B)。
[0058] 为了从前述实验中所检测的具有线虫毒性的化合物获得线虫毒性组合物，通过以不同组合进行体外实验检验了葡萄糖(5)、反式乌头酸(4)和S-羧甲基半胱氨酸(3)。尽管xantotoxine已证实有杀线虫作用，但由于其化学合成耗费高并且困难，故并未选择其用于辅助检验。
[0059] 通过实施抗南方根结线虫幼虫的体外生物测定检验了包含活性化合物的组合的一些组合物。所进行的实验中使用的活性化合物市售获得。
[0060] 所检验的组合物为：
[0061] a) 反式乌头酸+葡萄糖(每种化合物0.25 g/L)；
[0062] b) 葡萄糖+S-羧甲基半胱氨酸(每种化合物0.25 g/L)；
[0063] c) S-羧甲基半胱氨酸+反式乌头酸(每种化合物0.25 g/L)；
[0064] d) 反式乌头酸+葡萄糖+S-羧甲基半胱氨酸(每种化合物0.17 g/L)；
[0065] 用组合物a)、b)和d)进行实验所获得的结果在图10 (A)和(B)中示出并在下文评论。
[0066] 如可在图10A中可看到的，与每种活性化合物各自获得的结果的总和相比，组合物a)和d)对于使线虫瘫痪出乎意料地显示协同的线虫毒性效应。所述比较在下表2和3中示出。
[0067] 表2-用组合物a)试验后获得的协同线虫毒性效应
[0068]
[0069] 对恢复测定中所获的和图10B中所示的结果分析表明，组合物a)获得的协同线虫毒性效应符合抑线虫作用。
[0070] 表3-用组合物d)试验后获得的协同线虫毒性效应
[0071]
[0072] 对恢复测定中所获的和图10B中所示的结果分析表明，组合物d)获得的协同线虫毒性效应符合抑线虫作用。
[0073] 线虫毒性组合物b)和c)的体外测定结果也在图10A和10B中示出，未表现出明显的协同线虫毒性效应。
