技术领域
[0001] 本
发明涉及三维打印技术领域，具体来说，涉及一种液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的方法。
背景技术
[0002] 腰椎间盘由髓核、
纤维环和软骨板三部分构成，它位于上下两椎体之间，在腰椎运动中起到支撑旋转，降低
摩擦系数的作用。腰椎间盘突出症是较为常见的运动系统损伤，其发病率有逐年上升趋势。病因主要是腰椎间盘发生一定程度的退行性改变后，在外
力诱发下纤维环破裂，髓核组织压迫椎管内组织，导致相邻脊神经根遭受刺激或压迫，从而产生腰部
疼痛，一侧下肢或双下肢麻木、疼痛等。
[0003] 目前对腰椎间盘突出的
治疗分为非手术治疗和手术治疗两大类，非手术治疗主要包括药物治疗、牵引治疗、理疗、封闭治疗等，此类方法主要为缓解症状，疗效持续时间较短，无法根治。手术治疗包括常规开放手术，
微创手术，经皮穿刺切吸，人工椎间盘置换等。其中，人工椎间盘置换可以保留椎节之间的
活动度。目前临床使用的人工椎间盘主要为金属材料制成。组织工程技术为临床人工椎间盘的制备提供了一种理想、符合生理特点的方法。用组织工程技术，即在体外培养少量的
种子细胞，在扩增后和生物
支架结合成复合物，将其植入病变部位后，
细胞增殖、分化、分泌基质，最终使得该结构符合生理特点。该复合物在组织工程中起到支撑作用，同时为细胞提供寄宿、成长、分化和增殖的场所。生物支架与种子细胞共同对受损组织的再生进行引导和对再生组织的结构进行控制，是临床治疗的关键。
[0004] 针对相关技术中的问题，目前尚未提出有效的解决方案。
发明内容
[0005] 针对相关技术中的问题，本发明提出一种液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的方法，以克服现有相关技术所存在的上述技术问题。
[0006] 为此，本发明采用的具体技术方案如下：
[0007] 一种液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的方法，该液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的液体支撑介质由以下
质量份数的原料制成：
[0008] 壳聚糖5-50、海藻酸5-50、环糊精5-50、
淀粉5-50、
白蛋白5-50、明胶5-50、
溶剂5-50。
[0009] 该液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的方法，包括以下步骤：
[0010] 种子细胞的培养：以含10％胎
牛血清的F12培养基培养于37℃、5％CO2孵箱中，以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF 25ng/ml、
抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于37℃、5％CO2孵箱中。
[0011] 支撑溶剂的制备：量取适量的壳聚糖、海藻酸、环糊精、淀粉、白蛋白和明胶，溶解于溶剂中并调整至所需
密度。
[0012] 人工椎间盘打印模型的建立：使用三维打印
软件建立打印模型，外层为多层环形，内层为多层螺旋形，终板软骨为多层长方形，保存，等待下一步骤。
[0013] 人工椎间盘打印材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2、A3、A4并灭菌。量取适量的天然材料B1、B2、B3、B4并灭菌，与种子细胞混合，得到含细胞凝胶，等待下一步骤。
[0014] 人工椎间盘打印设备的准备：调校生物三维打印设备的工艺参数，打印头直径为150-400μm，打印
温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，打印结构由打印路径控制。
[0015] 人工椎间盘的打印：将步骤二的高分子材料A1和含细胞凝胶B1分别置入两料筒，启动设备，于S2支撑溶剂中进行三维打印，交替打印高分子材料与细胞凝胶，支撑溶剂中含交联剂，或打印完毕后使用适当方法对含细胞凝胶B1进行交联；当底层终板版软骨制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2，对髓核进行打印；完毕后将料筒内的材料更换为A3、B3，对纤维环进行打印；完毕后将料筒内的材料更换为A4、B4，对顶层终板软骨进行打印，每步打印完成后均进行交联，方法同上。
[0016] 三维打印人工椎间盘的培养：量取适量的培养基，浸没S3所得的人工椎间盘后放入二
氧化
碳培养箱中持续培养。
[0017] 进一步的，生物高分子材料A1、A2、A3、A4是由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚对二氧环己
酮中的一种或几种构成。
[0018] 进一步的，天然材料B1、B2、B3、B4是由明胶、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖、
胶原蛋白中的一种或几种构成。
[0019] 进一步的，种子细胞是由骨髓干细胞、软骨细胞中的一种或几种构成。
[0020] 进一步的，交联剂为紫外光、氯化
钙溶液中的一种或几种。
[0021] 进一步的，在人工椎间盘打印完成后，随后使用含海藻酸裂解酶的溶液去除海藻酸盐支撑介质。
[0022] 本发明的有益效果为：该方法使用液体支撑介质内生物三维打印技术，可以精确的控制打印路径，极大地提高打印结构的
稳定性；而使用含种子细胞的打印液，可使我们获得含有大量细胞的椎间盘生物支架，根据需要，设计打印路径参数，打印获得人工仿生椎间盘生物支架，该方法所获得的椎间盘生物支架具有终板软骨-纤维环-髓核结构，结构的
精度高，同时携带大量种子细胞进行增殖修复，利于快速建立椎间盘周围微环境，重建椎间盘结构及功能。
附图说明
[0023] 为了更清楚地说明本发明
实施例或
现有技术中的技术方案，下面将对实施例中所需要使用的附图作简单地介绍，显而易见地，下面描述中的附图仅仅是本发明的一些实施例，对于本领域普通技术人员来讲，在不付出创造性劳动的前提下，还可以根据这些附图获得其他的附图。
[0024] 图1是根据本发明实施例的一种液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的方法的
流程图；
[0025] 图2是根据本发明实施例的一种液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的方法的髓核区和纤维环区域的吸光值对照图；
[0026] 图3是根据本发明实施例的一种液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的方法的髓核区和纤维环区域的相关产物变化图；
[0027] 图4是根据本发明实施例的一种液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的方法的髓核区和纤维环区域力学性能结果图。
具体实施方式
[0028] 为进一步说明各实施例，本发明提供有附图，这些附图为本发明揭露内容的一部分，其主要用以说明实施例，并可配合
说明书的相关描述来解释实施例的运作原理，配合参考这些内容，本领域普通技术人员应能理解其他可能的实施方式以及本发明的优点，图中的组件并未按比例绘制，而类似的组件符号通常用来表示类似的组件。
[0029] 根据本发明的实施例，提供了一种液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的方法。
[0030] 该液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的液体支撑介质由以下质量份数的原料制成：
[0031] 壳聚糖5-50、海藻酸5-50、环糊精5-50、淀粉5-50、白蛋白5-50、明胶5-50、溶剂5-50。
[0032] 实施例一：
[0033] 该液体支撑介质内生物三维打印椎间盘的方法，包括以下步骤：
[0034] 步骤S101，种子细胞的培养：以含10％胎牛血清的F12培养基培养于37℃、5％CO2孵箱中，以含10％胎牛血清、结缔组织生长因子CTGF25ng/ml、抗坏血酸25uM的α-MEM培养基培养于37℃、5％CO2孵箱中。
[0035] 步骤S103，支撑溶剂的制备：量取适量的壳聚糖、海藻酸、环糊精、淀粉、白蛋白和明胶，溶解于溶剂中并调整至所需密度。
[0036] 步骤S105，人工椎间盘打印模型的建立：使用三维打印软件建立打印模型，外层为多层环形，内层为多层螺旋形，终板软骨为多层长方形，保存，等待下一步骤。
[0037] 步骤S107，人工椎间盘打印材料的制备：量取适量的生物高分子材料A1、A2、A3、A4并灭菌。量取适量的天然材料B1、B2、B3、B4并灭菌，与种子细胞混合，得到含细胞凝胶，等待下一步骤。
[0038] 步骤S109，人工椎间盘打印设备的准备：调校生物三维打印设备的工艺参数，打印头直径为150-400μm，打印温度根据材料的热属性进行调整，打印过程中料筒气压为600-1000KPa，打印结构由打印路径控制。
[0039] 步骤S111，人工椎间盘的打印：将步骤二的高分子材料A1和含细胞凝胶B1分别置入两料筒，启动设备，于S2支撑溶剂中进行三维打印，交替打印高分子材料与细胞凝胶，支撑溶剂中含交联剂，或打印完毕后使用适当方法对含细胞凝胶B1进行交联；当底层终板版软骨制备完毕后，将料筒内的材料更换为A2、B2，对髓核进行打印；完毕后将料筒内的材料更换为A3、B3，对纤维环进行打印；完毕后将料筒内的材料更换为A4、B4，对顶层终板软骨进行打印，每步打印完成后均进行交联，方法同上。
[0040] 步骤S113，三维打印人工椎间盘的培养：量取适量的培养基，浸没S3所得的人工椎间盘后放入二氧化碳培养箱中持续培养。
[0041] 实施例二：
[0042] 生物高分子材料A1、A2、A3、A4是由聚乳酸、聚己内酯、聚乳酸-羟基乙酸共聚物、聚乳酸-己内酯共聚物、聚对二氧环己酮中的一种或几种构成，进一步的，天然材料B1、B2、B3、B4是由明胶、透明质酸、海藻酸钠、壳聚糖、胶原蛋白中的一种或几种构成，种子细胞是由骨髓干细胞、软骨细胞中的一种或几种构成，交联剂为紫外光、
氯化钙溶液中的一种或几种，在人工椎间盘打印完成后，随后使用含海藻酸裂解酶的溶液去除海藻酸盐支撑介质。
[0043] 实施例三：
[0044] (1)使用三维打印软件建立打印模型，外层为多层环形状，内层为多层螺旋形，髓核区、纤维环区路径间隙不同，保存，等待下一步骤；
[0045] (2)量取适量的海藻酸盐、黄原胶、碳酸钙，溶解于D-(+)
葡萄糖酸δ内酯与双蒸
水中，并调整至所需密度；
[0046] (3)量取适量的聚己内酯并灭菌。量取适量的明胶并灭菌，与骨髓干细胞混合均匀，得到含骨髓干细胞明胶凝胶，等待下一步骤；
[0047] (4)设备的准备：调校生物三维打印设备的工艺参数：打印头直径为100μm，聚己内酯打印温度为120℃，含细胞凝胶打印温度18-37℃打印过程中料筒气压为600-1000KPa，打印结构由打印路径控制。将高分子材料聚己内酯和含细胞凝胶分别置入两料筒，启动设备，于支撑溶剂中进行三维打印，交替打印高分子材料与细胞凝胶，支撑溶剂中已含交联剂钙离子，可在打印同时对含细胞凝胶进行交联。当髓核区制备完毕后，
修改打印头直径为200μm，对纤维环进行打印，得到人工仿生椎间盘。随后使用含海藻酸裂解酶的溶液去除海藻酸盐支撑液。
[0048] 实施例四：
[0049] 将上述实施例3中得到的人工仿生椎间盘进行
生物相容性表征。将所得人工仿生椎间盘放入培养箱中培养。以不含细胞凝胶打印得到的椎间盘，种植软骨为对照组。分别培养1，3，5，7天后，利用MTT法检测椎间盘的细胞活力。结果图如2所示，显示带有细胞的人工仿生椎间盘上的细胞具有良好的增殖行为，细胞活力较好，且较对照组增殖行为更加显著。
[0050] 实施例五：
[0051] 将上述实施例3中利用液体支撑介质内生物三维打印得到的人工仿生椎间盘进行qRT-PCR检测。以不含细胞凝胶打印得到的椎间盘，种植软骨为对照组作对比。分别培养7天后，进行qRT-PCR检测。结果图如3所示，显示实验组软骨区软骨相关产物(SOX9、Aggrecan、COL II)表达明显较多。
[0052] 实施例六：
[0053] 将上述实施例3中得到的人工椎间盘置于万能测试机上进行力学压缩测试，分别测试髓核区和纤维环区域力学性能。测得结果如表格1所示，结果显示人工椎间盘力学性能较好。
[0054] 综上所述，借助于本发明的上述技术方案，该方法使用液体支撑介质内生物三维打印技术，可以精确的控制打印路径，极大地提高打印结构的稳定性；而使用含种子细胞的打印液，可使我们获得含有大量细胞的椎间盘生物支架，根据需要，设计打印路径参数，打印获得人工仿生椎间盘生物支架，该方法所获得的椎间盘生物支架具有终板软骨-纤维环-髓核结构，结构的精度高，同时携带大量种子细胞进行增殖修复，利于快速建立椎间盘周围微环境，重建椎间盘结构及功能。
[0055] 在本发明中，除非另有明确的规定和限定，术语“安装”、“设置”、“连接”、“固定”、“旋接”等术语应做广义理解，例如，可以是固定连接，也可以是可拆卸连接，或成一体；可以是机械连接，也可以是电连接；可以是直接相连，也可以通过中间媒介间接相连，可以是两个元件内部的连通或两个元件的相互作用关系，除非另有明确的限定，对于本领域的普通技术人员而言，可以根据具体情况理解上述术语在本发明中的具体含义。
[0056] 以上所述仅为本发明的较佳实施例而已，并不用以限制本发明，凡在本发明的精神和原则之内，所作的任何修改、等同替换、改进等，均应包含在本发明的保护范围之内。
