技术领域
[0001] 本
发明涉及农药残留检测技术领域，具体涉及一种基于SERS的玉米中杀螟硫磷农药残留的检测方法。
背景技术
[0002] 杀螟硫磷具有较好的触杀与胃毒作用，可防治半翅目、鞘翅目等
害虫，常用于玉米、
水稻、大豆及蔬菜上的害虫防治。过量与不合理的施用会引起杀螟硫磷在作物上的残留积累。这些残留对人体、牲畜具有毒害作用，易引起神经系统中的胆
碱积累，具体表现为恶心、呕吐、腹痛、腹泻、昏迷等，急性中毒还可危及生命。对
农作物中残留的准确检测是避免其损害的重要技术方法。
[0003] 目前，常规的杀螟硫磷检测方法有气相色谱-质谱法(Gas chromatography-mass spectrometer,GC-MS)、高效液相色谱法(High performance liquid chromatography,HP-LC)，这些方法准确性虽好，但存在需大型仪器与专业人员介入、
试剂消耗大、样品前处理复杂以及检测速度慢等缺点。面对广泛存在的农药残留问题时，上述方法显得捉襟见肘。因此，通过简单的样品前处理，准确检测出杀螟硫磷残留对农产品安全和人体健康具有重要的意义。
发明内容
[0004] 本发明的目的在于提供一种基于SERS的玉米中杀螟硫磷农药残留的检测方法，该方法结合SERS
光谱和化学计量学方法，实现了玉米中杀螟硫磷农药残留的简单、快速、准确的检测。
[0005] 为实现上述目的，本发明采用了以下技术方案：
[0006] 一种基于SERS的玉米中杀螟硫磷农药残留的检测方法，该方法包括以下步骤：
[0007] (1)将玉米污染样品
粉碎，利用
乙醇溶液对该样品中残留的杀螟硫磷进行两次提取，每次获取的提取液经离心获得上清液，将上清液合并混匀，在水浴中
蒸发浓缩，得到残留提取液，对各浓度残留提取液中的残留参考值进行测定。
[0008] (2)测量各浓度残留提取液的表面增强拉曼光谱，得到杀螟硫磷残留光谱。表面增强拉曼光谱(SERS)法具有分析速度快、检测灵敏度高和特异性好等优点。
[0009] (3)采用多项式拟合
算法将杀螟硫磷残留光谱中的基线去除，并采用卷积平滑算法和
小波变换算法对杀螟硫磷残留光谱进行预处理。采用卷积平滑算法和小波变换算法对杀螟硫磷残留光谱进行预处理，能够减弱
荧光背景和干扰噪声对回归模型的干扰。
[0010] (4)采用主成分分析法提取杀螟硫磷残留光谱的主体信息，判断表面增强拉曼光谱对玉米中杀螟硫磷残留的
检测限。
[0011] (5)构建SVR回归模型，对玉米中杀螟硫磷残留进行定量分析。
[0012] 进一步的，步骤(1)中所述的“将玉米污染样品粉碎，利用乙醇溶液对该样品中残留的杀螟硫磷进行两次提取，每次获取的提取液经离心获得上清液，将上清液合并混匀，在水浴中蒸发浓缩，得到残留提取液，对各浓度残留提取液中的残留参考值进行测定；”，具体包括以下步骤：
[0013] (11)称取玉米污染样品5g并粉碎，置于15mL离心管中，加入10mL 50％乙醇，经超声均质器混匀后，以4000r/min的速度离心10min，取上清液。
[0014] (12)向初次提取上清液的玉米污染样品残渣中再次加入10mL 50％乙醇，重复混匀、离心获取上清液。
[0015] (13)将两次上清液合并，在60℃水浴中蒸发浓缩至5mL，得到残留提取液，残留提取液用于采集SERS光谱。
[0016] (14)采用气质联用仪对提取液中杀螟硫磷残留的参考值进行测定。
[0017] 进一步的，步骤(2)中所述的“测量各浓度残留提取液的表面增强拉曼光谱，得到杀螟硫磷残留光谱；”，具体包括以下步骤：
[0018] (21)采用两步
种子生长法合成金
纳米棒溶胶溶液，将金纳米溶胶溶液离心浓缩后，取2μL滴加在
硅片上形成金膜作为增强基底。
[0019] (22)取2μL残留提取液滴加在增强基底上，待溶液蒸发后，采用便携式拉曼光谱仪采集残留提取液中的杀螟硫磷残留光谱。
[0020] 进一步的，步骤(3)中所述的“采用多项式拟合算法将杀螟硫磷残留光谱中的基线去除，并采用卷积平滑算法和小波变换算法对杀螟硫磷残留光谱进行预处理；”，具体包括以下步骤：
[0021] (31)对采集到的原始的杀螟硫磷残留光谱，先采用6阶多项式将其中含有线性趋势的
信号进行拟合，将基线拟合出来，再用原始信号减去拟合信号，得到去除基线的信号，实现对杀螟硫磷残留光谱的校正。
[0022] (32)采用7点3阶卷积平滑法对去除基线后的光谱进行平滑去噪，拉曼位移k处经平滑后光谱强度的平均值为：
[0023]
[0024] 其中，xk,smooth和 均表示拉曼位移k处经平滑后的光谱强度的加权平均值，hi为拉曼位移i处的平滑系数，H为归一化因子，且 为平滑系数之和；ω为起始及终止位移距位移k的距离；每一光谱值乘以平滑系数hi的目的是尽可能减小平滑对有用信息的影响。
[0025] (33)采用db3小波包对去除基线校正后的光谱进行3层分解，分解后获取小波包树，并提取小波包系数，然后对小波包树采用软
阈值处理，同时保存其低频信号，对信号进行降噪。
[0026] 进一步的，步骤(4)中所述的“采用主成分分析法提取杀螟硫磷残留光谱的主体信息，判断表面增强拉曼光谱对玉米中杀螟硫磷残留的检测限；”，具体包括以下步骤：
[0027] (41)根据扣除基线的杀螟硫磷残留光谱数据的均值和标准差，将含不同浓度杀螟硫磷残留的光谱数据矩阵标准化。
[0028] (42)采用主成分分析函数对标准化后的光谱数据矩阵进行解析，将高维的光谱数据映射到低维空间，获得与原始的光谱数据矩阵一一对应的主成分得分矩阵。
[0029] (43)提取主成分得分矩阵中每一浓度的光谱的第一主成分和第二主成分，通过判断第一主成分和第二主成分的二维
坐标系中不同浓度的光谱聚类图是否重叠，来判断表面增强拉曼光谱对玉米中杀螟硫磷残留的检测限。
[0030] 进一步的，步骤(1)中的玉米污染样品的获得方法为：将高浓度杀螟硫磷溶液用乙醇溶液稀释，获得不同浓度的杀螟硫磷溶液，并向玉米样品中添加不同浓度的杀螟硫磷溶液，获得具有不同浓度残留的玉米污染样品。
[0031] 由以上技术方案可知，本发明结合SERS光谱和化学计量学方法，实现了玉米中杀螟硫磷农药残留的简单、快速、准确的检测。
附图说明
[0033] 图2是金棒(a)、乙醇溶液(b)、20mg/L杀螟硫磷乙醇溶液(c)的SERS光谱图；
[0034] 图3是20μg/mL杀螟硫磷乙醇溶液(a)、空白玉米提取液(b)、含18.95μg/mL杀螟硫磷残留玉米提取液(c)的SERS光谱图；
[0035] 图4是受杀螟硫磷污染玉米提取液的SERS光谱，(a)-(j)为提取液中含有0、0.37、0.48、0.97、1.96、4.80、7.76、9.67、14.25和18.95μg/mL杀螟硫磷残留；
[0036] 图5是受污染玉米样品提取液SERS光谱的PCA散点图；
[0037] 图6是含14.25μg/mL杀螟硫磷玉米提取液在650，830，1344cm-1处特征峰强度变化图；
[0038] 图7是最优SVR模型对不同浓度残留的预测误差图；
[0039] 图8是不同回归模型对玉米中杀螟硫磷残留的分析结果图；
[0040] 图9是玉米中杀螟硫磷残留的预测回收率图。
具体实施方式
[0041] 下面结合附图对本发明做进一步说明：
[0042] 如图1所示的一种基于SERS的玉米中杀螟硫磷农药残留的检测方法，该方法包括以下步骤：
[0043] S1、玉米污染样品的获取
[0044] 将高浓度杀螟硫磷溶液用50％乙醇溶液稀释，获得浓度为20、15、10、8、5、2、1、0.5和0.4mg/L杀螟硫磷溶液，避光保存备用；称取5g玉米样品，向其中添加不同浓度的杀螟硫磷溶液，获得加标残留为20、15、10、8、5、2、1、0.5和0.4μg/g的玉米污染样品。
[0045] S2、杀螟硫磷残留提取
[0046] S21、将玉米污染样品粉碎，置于15mL离心管中，加入10mL 50％乙醇，经超声均质器混匀后，以4000r/min的速度离心10min，取上清液。
[0047] S22、向初次提取上清液的玉米污染样品残渣中再次加入10mL50％乙醇，重复混匀、离心获取上清液。
[0048] S23、将两次上清液合并，在60℃水浴中蒸发浓缩至5mL，得到残留提取液，残留提取液用于采集SERS光谱。每个浓度的杀螟硫磷残留提取液制备50个样本。
[0049] S24、采用气质联用仪(GC-MS)对提取液中杀螟硫磷残留的参考值进行测定。其中，GC-MS对加标残留为20、15、10、8、5、2、1、0.5和0.4μg/g污染玉米样品提取液的检测均值为18.95、14.25、9.67、7.76、4.80、1.96、0.97、0.48和0.37μg/mL。本发明采用的气质联用仪为岛津GC-MS-QP2010SE。
[0050] S3、SERS光谱测量
[0051] 测量各浓度残留提取液的600～1800cm-1范围内的表面增强拉曼光谱，得到杀螟硫磷残留光谱，具体包括以下步骤：
[0052] S31、采用两步种子生长法合成金纳米棒溶胶溶液，将金纳米棒溶胶溶液离心浓缩后，取2μL滴加在
硅片上形成金膜作为增强基底。
[0053] S32、取2μL残留提取液滴加在增强基底上，待溶液蒸发后，采用便携式拉曼光谱仪采集残留提取液中的杀螟硫磷残留光谱。本发明采用便携式拉曼光谱仪(必达泰克i-Raman785Plus，美国)测量SERS光谱，该光谱仪的具体参数如下：785nm激发
波长、激光功率为200mW、拉曼位移
分辨率为2.2cm-1，光谱采集范围为600cm-1到1800cm-1，积分时间为6000ms，积分1次。随机选取样本点采集光谱，取5条光谱的均值作为一条分析光谱，每个样品采集2条分析光谱。
[0054] SERS光谱具有指纹特性是应用于物质检测与分析的
基础，其特征峰反映了被测物分子的化学键振动与转动信息。为确定杀螟硫磷的特征峰，本发明分别测量杀螟硫磷乙醇-1 -1溶液(20mg/L)、乙醇溶液和金棒的SERS光谱。由图2可知，金棒的光谱在758cm 和1443cm
位置出现两个特征峰，这是由金棒中残留的CTAB引起的，且在20mg/L杀螟硫磷溶液和乙醇溶液的光谱中依然明显，也表明乙醇无SERS特征峰。同时，杀螟硫磷的特征峰分别出现在
650、830、1082、1241、1344和1581cm-1处。根据杀螟硫磷分子结构与拉曼峰位归属可知，在
1581cm-1处的谱峰为苯环C＝C伸缩振动，在1344cm-1和1241cm-1可归属为NO2对称和非对称伸缩振动，1082cm-1处谱峰反映了苯环C-N伸缩振动，830cm-1为苯环-硝基剪式摇摆振动，
650cm-1则为C-C弯曲振动。因此，在650、830、1082、1241、1344和1581cm-1处的特征峰可作为SERS光谱检测杀螟硫磷的判别依据。
[0055] 复杂体系中被测物分子的SERS光谱会受到体系中其他成份的干扰，出现一些变化，如光谱峰位的增加、消失、重叠以及减弱。为确定玉米提取液中杀螟硫磷的SERS光谱特征，本发明对比了如图3所示的20μg/mL杀螟硫磷乙醇溶液、空白提取液和含18.95μg/mL残留提取液的光谱。空白提取液和污染样品提取液均在711cm-1出现新的特征峰，这是由玉米中
淀粉所导致，但并未干扰到杀螟硫磷特征峰的出现。污染样品提取液中杀螟硫磷在1241和1581cm-1处的特征峰变弱却依然可见，而在650、830和1344cm-1处的特征峰依然明显。上述实验结果表明SERS光谱可应用于玉米中杀螟硫磷残留的检测。
[0056] 污染玉米样品经提取后，测量了其对应提取液的光谱，如图4所示。由图4可知，在1082、1241和1581cm-1处的特征峰强度随着提取液中残留浓度的减弱而迅速变弱直至消失，-1
而650、830和1344cm 处特征峰直至残留浓度为0.48μg/mL依然可以识别。当残留浓度低至
0.37μg/mL，所得光谱与空白提取液光谱相似，杀螟硫磷对应的特征峰未在光谱中出现。
[0057] S4、SERS光谱分析
[0058] S41、采用多项式拟合算法将杀螟硫磷残留光谱中的基线去除：对采集到的原始的杀螟硫磷残留光谱，先采用6阶多项式将其中含有线性趋势的信号进行拟合，将基线拟合出来，再用原始信号减去拟合信号，得到去除基线的信号，实现对杀螟硫磷残留光谱的校正。
[0059] S42、采用卷积平滑Savitzky-Golay(S-G)算法对杀螟硫磷残留光谱进行预处理：采用7点3阶卷积平滑法对去除基线后的光谱进行平滑去噪，拉曼位移k处经平滑后光谱强度的平均值为：
[0060]
[0061] 其中，xk,smooth和 均表示拉曼位移k处经平滑后的光谱强度的加权平均值，hi为拉曼位移i处的平滑系数，H为归一化因子，且 为平滑系数之和；ω为起始及终止位移距位移k的距离；每一光谱值乘以平滑系数hi的目的是尽可能减小平滑对有用信息的影响。hk(拉曼位移k处的平滑系数)可基于最小二乘原理，用多项式拟合求得。
[0062] S43、采用小波变换(Wavelet transform,WT)算法对杀螟硫磷残留光谱进行预处理：采用db3小波包对去除基线校正后的光谱进行3层分解，分解后获取小波包树，并提取小波包系数，然后对小波包树采用软阈值处理，同时保存其低频信号，对信号进行降噪。
[0063] S5、SERS光谱主成分分析
[0064] 采用主成分分析(Principal component analysis,PCA)法提取杀螟硫磷残留光谱的主体信息，判断表面增强拉曼光谱对玉米中杀螟硫磷残留的检测限，具体包括以下步骤：
[0065] S51、根据去除基线后的杀螟硫磷残留光谱数据的均值和标准差，将含不同浓度杀螟硫磷残留的光谱数据矩阵标准化。
[0066] S52、采用主成分分析函数对标准化后的光谱数据矩阵进行解析，将高维的光谱数据映射到低维空间，获得与原始的光谱数据矩阵一一对应的主成分得分矩阵。
[0067] S53、提取主成分得分矩阵中每一浓度的光谱的第一主成分和第二主成分，通过判断第一主成分和第二主成分的二维坐标系中不同浓度的光谱聚类图是否重叠，来判断表面增强拉曼光谱对玉米中杀螟硫磷残留的检测限。
[0068] 为了进一步确定SERS技术对玉米中杀螟硫磷残留的检测限，将所获得的光谱进行PCA处理，所得的主成分得分见图5。由图5可知，含0.37μg/mL残留提取液的光谱与空白提取液光谱的主成分得分重叠在一起，而其他浓度对应的主成分得分分布在整个散点图的不同位置。上述现象表明本次实验对玉米中杀螟硫磷残留的检测限可达到0.5μg/mL(提取液残留为0.48μg/mL)，低于国家规定的杀螟硫磷在农作物中的最大残留值(5μg/g)。
[0069] S6、构建SVR回归模型，对玉米中杀螟硫磷残留进行定量分析。
[0070] 为了实现基于SERS光谱对玉米中杀螟硫磷残留的量化分析，本发明采用
支持向量机回归(Support vector machine regression,SVR)算法用于回归模型的建立。具体地说，回归模型中校正集、预测集均采用预处理函数进行归一化处理。预处理后的校正集用于支持向量机回归模型的训练。在训练模型之前，SVR模型类型设置为一类(one-class)SVR，核函数类型设置为径向基(RBF)核函数:exp(-gamma*|u-v|^2)。利用网格参数寻优函数寻找最佳参数c和g(c:惩罚系数，g：核函数的宽度)。SVR回归模型训练后，将预测集数据用于回归模型的预测，从而实现对不同浓度的农药残留光谱的浓度值预测。
[0071] 采用Kennard-Stone(KS)算法对校正数据集与测试数据集进行选择，具体地说，将每种浓度的光谱以校正集：预测集＝4:1划分，即校正集为40个样本，预测集为10个样本。采用Kennard-Stone(KS)算法优先挑选具有代表性的样本作为校正集，即将同一浓度的农药残留光谱中差异较大的光谱作为校正集，光谱值较为接近的样本作为预测集。KS算法基于光谱矢量之间的相对欧氏距离，以保证数据空间的均匀取样，克服校正集样本的不均匀分布。
[0072] 采用校正均方根误差(Root mean square error of correction,RMSEC)、校正集相关系数(correlation coefficient of correction,Rc)、预测均方根误差(Root mean square error of prediction,RMSEP)和预测集相关系数(correlation coefficient of prediction,Rp)对所建SVR回归模型的预测性能进行量化评估。
[0073] 本发明中涉及的所有光谱
数据处理及算法均在MATLAB 2013a(Mathworks Inc.,Natick,MA,USA)上实现。
[0074] 基于SERS光谱的定量分析中，光谱的重复性决定着量化分析的优劣。图6展示了含14.25μg/mL杀螟硫磷残留的不同玉米样本提取液光谱在650、830和1344cm-1处特征峰强度变化情况。由50个不同样本获取的光谱特征峰呈现了较好的重复性，相对标准偏差(Relative standard deviation,RSD)仅为3.12％。
[0075] 为了实现基于SERS对玉米中杀螟硫磷残留的定量分析，本发明采用SVR算法构建回归模型。由于所采集光谱除了被测物自身信息外，还存在由外界杂散光和荧光背景所引起的干扰，S-G卷积平滑和WT用于减弱或者消除非目标因素对光谱的影响，进而提高模型的
稳定性和预测能
力。实验结果如图8所示，SVR所构建的模型对提取液中的杀螟硫磷残留具有较好的预测准确度(RMSEC＝0.1308μg/mL, RMSEP＝0.1614μg/mL,)。值得注意的是，经过WT处理去除干扰的光谱所构建SVR模型分析误差更小，达到了RMSEC＝0.1032μg/mL, RMSEP＝0.1341μg/-mL， 此外，最
优模型对各浓度残留样本的预测结果见图7。不同浓度样本的预测结果较好，均呈现出较小的误差。图9为玉米中杀螟硫磷残留的预测回收率。由图9知，本发明所述的检测方法与GC-MS方法的检测结果基本一致，且预测回收率为95.31％～100.66％。因此，利用SERS光谱结合SVR和WT可以很好地实现对玉米中杀螟硫磷残留的准确检测，为农产品中残留检测提供了一条新的分析途径。
[0076] 综上所述，本发明利用SERS技术结合化学计量学方法实现玉米中杀螟硫磷残留的准确检测。首先，采用一种简单预处理方法提取玉米中杀螟硫磷残留，通过GC-MS检测结果可知，其处理回收率高于92.5％。接着，不同浓度残留的提取液的光谱被测量，对玉米中杀螟硫磷检测限可达0.5μg/g，远低于国家规定的农作物最大残留限，体现了本发明所述的检测方法的高灵敏性。在本发明中，杀螟硫磷残留的量化分析通过结合SVR、S-G卷积平滑和WT来实现，最优模型的分析误差达到RMSEP＝0.1341μg/mL，同时，预测回收率为95.31％～100.66％。由此可知，本发明所述的检测方法通过SERS结合化学计量学方法，可以很好地实现玉米中杀螟硫磷残留的准确检测，而且该方法可以进一步扩展到其他农作物中各种农药残留的定量分析中，为农产品安全检测提供可靠的技术手段。
[0077] 以上所述的
实施例仅仅是对本发明的优选实施方式进行描述，并非对本发明的范围进行限定，在不脱离本发明设计精神的前提下，本领域普通技术人员对本发明的技术方案作出的各种
变形和改进，均应落入本发明
权利要求书确定的保护范围内。
