一种PRV gB单克隆抗体及其应用 |
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| 申请号 | CN201710671265.8 | 申请日 | 2017-08-08 | 公开(公告)号 | CN107459574A | 公开(公告)日 | 2017-12-12 |
| 申请人 | 河南省动物疫病预防控制中心; | 发明人 | 闫若潜; 班付国; 吴志明; 马震原; 王淑娟; 谢彩华; 王华俊; 王东方; 赵雪丽; 曹伟伟; 方先珍; 赵明军; 刘梅芬; 赵国然; 张淼洁; 孙淑芳; 于辉; 杨海波; 李秀梅; 陈兴安; | ||||
| 摘要 | 本 发明 属于免疫 生物 学技术领域，具体涉及一种猪伪狂犬病病毒（PRV）gB单克隆 抗体 及其应用的 专利 申请 。该抗体利用杂交瘤细胞对猪伪狂犬病毒变异毒株HeNZK-2014和PRVgB蛋白筛选获得。通过筛选获得稳定分泌PRVgB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，进而获得了高效价的针对gB蛋白的单克隆抗体，并利用该抗体制备了成品化的 试剂 盒 及建立了配套的一步法竞争ELISA检测方法。通过一系列的特异性、灵敏性、重复性验证，结果表明，本申请中所提供的PRVgB抗体及所建立的一步法竞争ELISA检测方法，具有较为准确和较为稳定的检测结果，可较好地用于猪伪狂犬病gB抗体的检测评估，并为猪伪狂犬病的防控奠定 基础 。 | ||||||
| 权利要求 | 1.一种PRV gB单克隆抗体，其特征在于，通过如下步骤制备而成： |
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| 说明书全文 | 一种PRV gB单克隆抗体及其应用技术领域背景技术[0002] 猪伪狂犬病(Porcine Pseudorabies，PR)，是一种由猪疱疹病毒 1 型(Pseudorabies virus，PRV)引起的以发热、流产、死胎等为主要临床症状的高度接触性、急性传染病。猪感染 PRV 后，因不同的年龄段和不同的毒株毒力而表现出不同的症状，妊娠母猪主要症状为流产、产弱仔、死胎以及木乃伊胎等；新生仔猪多呈现急性致死性经过，典型的神经症状、麻痹、死亡率近 100%；成年猪大多是隐性感染状态。PRV 在世界范围内已广泛流行，给养猪业带来巨大的经济损失，是影响养猪业健康发展的重大传染病之一。 [0003] 就PR的预防而言，注射疫苗进行免疫仍是最主要的技术手段。在我国，从匈牙利引进的Bartha-K61 gE基因缺失弱毒活疫苗是主要的疫苗之一，对于我国PR疫情的控制发挥了重要的作用。但自2011年以来，PR又在我国许多地区包括河南、河北、山东、山西等在内的多个猪场中呈暴发式流行。诸多研究学者认为此次暴发可能是因为PRV某些氨基酸位点发生突变，致使变异株毒力增强，而现有Bartha-K61疫苗不能提供足够的免疫保护力。 [0004] 现有研究表明，PRV 病毒能够编码相当数量的糖蛋白在其复制的各个阶段发挥作用；这些糖蛋白是宿主产生免疫应答的主要靶标。作为α-疱疹病毒亚科的成员，PRV 编码 11 个囊膜糖蛋白，并根据它们在 I 型单纯疱疹病毒（HSV-1）上的同源物被命名为 gB、gC、gD、gE、gG、gH、gI、gK、gL、gM 和 gN。gB 糖蛋白是病毒主要的免疫原，因而有针对性的制备gB 抗体对于检测PRV 感染具有十分重要的意义。 [0005] 现有技术中，针对PRV 抗体的血清学诊断方法如琼脂扩散试验、间接ELISA、乳胶凝集试验、血凝抑制试验及微量中和试验等，对抗原的纯度要求过高，因此无法避免临床检验过程中经常出现的非特异性反应，进而造成假阳性结果的判定，因而也极有必要加以进一步改进；目前虽然国外有基于单抗检测PRV gB的阻断ELISA方法和试剂，但价格昂贵，操作时长，难以适应基层当前疫病检测的需求。 [0007] 因此，有针对性地对现有PRV变异毒株进行分离、研究及对基于单抗的PRV病毒检测方法进行有效改进，对于PR的预防和防治具有十分重要的应用意义。 发明内容[0008] 本申请目的在于通过利用一株致病力较高（TCID50高达10-9.77/0.1 mL）的猪伪狂犬病变异毒株HeNZK-2014制备了PRVgB的单克隆抗体，并利用该抗体制备了成品化的检测试剂盒及构建了一种一步竞争法的检测方法，从而为PR的检测判定及治疗奠定基础。 [0009] 本申请的技术方案详述如下。 [0010] 一种PRVgB单克隆抗体，该抗体以猪伪狂犬病变异毒株HeNZK-2014为基础制备而成，具体通过如下步骤制备而成：一、猪伪狂犬病毒（免疫抗原）的制备 将分离鉴定的猪伪狂犬病毒变异毒株HeNZK-2014扩大培养、浓缩并纯化后，备用； 二、制备猪伪狂犬病毒PRV gB重组蛋白（抗原） 利用基因工程技术制备获得PRV gB重组蛋白，其主要过程为，克隆获得gB 基因，并与原核表达载体pQE30连接后，转化BL-21 宿主菌，IPTG诱导表达并提纯获得PRV gB蛋白； 所述gB 基因的碱基序列如SEQ ID NO.1所示； 克隆gB 基因时，引物序列设计如下： 引物 P1 的序列为：5’- AATAGGATCCGCGCACGTGAACGACATGCTGA -3’； 引物 P2 的序列为：5’-CGGAAGCTTAATGTCGTAGAACTTGAGCGTGTG -3’； 三、制备和鉴定获得针对PRVgB蛋白的单克隆抗体 针对PRVgB蛋白单克隆抗体的获得首先需要对动物注射病毒（抗原）进行免疫，使其产生特异性抗体，细胞融合后筛选获得特异性的针对gB蛋白的抗体，主要步骤如下： 1、动物免疫 将步骤一中所获得浓缩纯化后猪伪狂犬病毒（变异毒株HeNZK-2014）用灭菌PBS调整到 1.5 mg/mL，免疫小鼠； 2、细胞融合 将脾细胞与骨髓瘤细胞进行融合，培养出有存活的（优选可稳定传代）的杂交瘤细胞； 3、阳性杂交瘤细胞的筛选 在含有（包被有）猪伪狂犬病毒和PRV gB蛋白的酶标板上对步骤2中所培养杂交瘤细胞进行筛选，并进一步筛选获得可被PRV免疫猪血清阻断的单抗细胞株； 对杂交瘤细胞进行初步筛选时，利用羊抗鼠 IgG-HRP指示单抗结合量，显色后测定OD450值，以骨髓瘤细胞培养上清为阴性对照，当OD450值不小于2.1 倍于阴性对照时，判为阳性，即为筛选所得目标细胞株； 筛选可被PRV免疫猪血清阻断的单抗细胞株时，在包被有猪伪狂犬病毒和PRV gB蛋白的酶标板上分别加入PRV免疫猪血清和SPF猪血清，利用羊抗鼠 IgG-HRP指示单抗结合量，显色后测定OD450值，以PRV免疫猪血清孔的 OD450值低于加入SPF猪血清孔OD 值一半作为筛选标准。 [0011] 、单克隆抗体腹水的制备将步骤3中筛选所得细胞株注射小鼠腹腔并进行培养，培养结束后，从小鼠腹部抽出腹水并提纯获得单克隆抗体； 本申请中所得单克隆抗体亚型为IgG-2a，效价为1:20 40万左右； ~ 对单克隆抗体进行纯化时，具体可采用辛酸--饱和硫酸铵沉淀法进行操作； 进一步优选操作中，对于所制备单克隆抗体采用HRP进行酶标，以便进一步应用于检测试剂盒制备应用。 [0012] 所述PRVgB单克隆抗体的制备方法。 [0013] 利用所述PRV gB单克隆抗体所制备的检测试剂盒，该试剂盒用于检测PRVgB蛋白抗体，具体包括：96孔ELISA检测板1块，酶标抗伪狂犬病毒单克隆抗体1瓶(10mL/瓶)，阴、阳性对照各2管(1.5mL/管)， 20倍浓缩洗涤液1瓶(30mL/瓶)，TMB显色液、终止液各1瓶(10mL/瓶)； 所述96孔ELISA检测板为抗原包被板，其包被有PRVgB重组蛋白； 所述酶标抗伪狂犬病毒单克隆抗体，为HRP酶标后单克隆抗体，实际使用时，单克隆抗体效价约为1:1000，所用稀释液为含有质量分数为1% BSA的Tris-cl缓冲液； 所述阴性对照为经稀释的SPF猪血清或血浆，阳性对照为经稀释的含有猪伪狂犬 gB 抗体的猪血清或血浆，阳性对照OD值约为0.20，阴性对照OD值约为1.30； 所述20倍浓缩洗涤液为含有1%Tween-20的20倍PBS缓冲液； 所述TMB显色液中TMB质量浓度为 0.3g/L； 所述终止液为：浓度为 2M 的 H2SO4溶液。 [0014] 利用所述检测试剂盒所构建的一种一步法竞争ELISA检测方法，具体包括如下操作步骤：（1）将试剂盒组分恢复至室温，然后取出96孔ELISA检测板，并进行标记； （2）在ELISA检测板上加入阴性对照血清、阳性对照血清和待检血清； （3）加入酶标抗伪狂犬病毒单克隆抗体，孵育（具体如：37℃条件下温育30分钟）； （4）孵育结束后，用工作浓度的洗涤液洗涤（工作浓度为含有0.05%Tween-20的PBS缓冲液）； （5）加入TMB 显色液，孵育显色； （6）显色结束后，加入终止液终止反应； （7）分光光度计测定OD450值； 首先，计算阴性对照平均值NC 和阳性对照平均值PC ，当PC ＜0.30，且NC ＞0.80时，本次检测有效，否则需要重新检测； 阴性对照平均值NC =( NC1+NC2 )/2， 阳性对照平均值（PC ）=( PC1+PC2 )/2； 其次，计算S/N值，计算公式为： S/N=（NC -S）/( NC -PC )； 如果S/N值≥0.4，样品判定为抗体阳性，即样品中含有PRV； 如果S/N值＜0.4，样品应判定为抗体阴性，即样品中不含PRV。 [0015] 总体而言，发明人通过对PRVgB基因的详细分析，设计了特异性引物对，并对该基因进行蛋白表达及纯化，进而利用新获得的具有较强致病力的猪伪狂犬病毒变异毒株HeNZK-2014为抗原基础，对BALB/c 小鼠进行了免疫，并用免疫小鼠脾细胞与SP2/0 骨髓瘤细胞融合并筛选获得了稳定分泌PRVgB蛋白单克隆抗体的杂交瘤细胞，进而获得了高效价的针对gB蛋白的单克隆抗体，并利用该抗体制备了成品化的试剂盒及建立了配套的一步法竞争ELISA检测方法。通过一系列的特异性、灵敏性、重复性验证，结果表明，本申请中所提供的PRVgB抗体及所建立的一步法竞争ELISA检测方法，具有较为准确和较为稳定的检测结果，可较好地用于猪伪狂犬病gB抗体的检测评估，并为猪伪狂犬病的防控奠定基础。附图说明 [0016] 图1为对克隆载体的双酶切鉴定结果，其中M: DNA Marker；1：pGEM-T-gB；图2为对表达载体双酶切鉴定结果，其中M: DNA Marker；1：pQE30空载体；2：pQE30-gB； 图3为纯化后的蛋白的检测结果，其中M：蛋白Marker；1：BL-21对照；2、3：重组表达的pQE30-gB蛋白；4、5：纯化后的pQE30-gB重组蛋白； 图4为纯化后单克隆抗体的SDS-PAGE鉴定，其中M: 蛋白质分子质量标准； 1: 纯化后单克隆抗体。 具体实施方式[0017] 下面结合实施例对本发明做进一步解释说明，在介绍具体实施例前，对本发明中所涉及部分物料情况简要介绍说明如下。 [0018] 主要生物材料：抗原：采用自行分离获得的河南省猪伪狂犬病毒变异毒株HeNZK-2014，具体使用高度浓缩纯化后的猪伪狂犬病毒（关于该毒株具体信息可参考《中国畜牧兽医》2017年度第7期发表的《猪伪狂犬病病毒变异毒株HeNZK-2014的分离及鉴定》中详细介绍，目前该毒株属于可公开获得毒株）； 细胞系：SP2/0株骨髓瘤细胞购自武汉博士德生物工程有限公司； 实验动物：6周龄雌性Balb/c小鼠（清洁级），购自河南省实验动物中心； 质粒载体：原核表达载体 pQE30购自QIAGEN 细胞：BL21(DE3)感受态细胞购自北京索莱宝科技有限公司； 主要试剂： 弗氏完全佐剂、弗氏不完全佐剂、聚乙二醇2000 (PEG2000)、聚乙二醇6000 (PEG6000) 、8-氮鸟嘌呤、50×HAT、50×HT 等购自Sigma 公司； 辣根过氧化物酶标记山羊抗小鼠（IgG-HRP）购自中衫金桥公司； 高糖DMEM培养液、胎牛血清(FBS)，购自GIBCO 公司； 酶标底物TMB、二甲基亚砜(DMSO)、双抗购自promega 公司； 小鼠单抗亚型鉴定试剂盒，购自洛阳佰奥通实验材料中心； 伪狂犬病病毒gB抗体检测试剂盒、伪狂犬病病毒gPI抗体检测试剂盒，购自IDEXX公司； 主要溶液及培养基有： DMEM完全培养基(含8-氮鸟嘌呤)：15%（体积比）胎牛血清，青霉素-链霉素混合溶液（100U/mL），1×8-氮鸟嘌呤溶液（20μg/mL）； 50% PEG2000溶液：称取10g PEG2000，121℃高压30min灭菌，冷却至50℃～60℃时加 10mL灭菌后不完全培养基DMEM，混匀，分装于高压灭菌后的1.50mL规格的Eppendorf管中，每管1mL，-20℃保存备用； HAT 选择培养液：1×HAT溶液（50×HAT稀释50倍），20%（体积比）胎牛血清，青霉素-链霉素混合溶液（100U/mL），混合均匀，4℃保存备用； HT 培养液：1×HT溶液（50×HAT稀释50倍），20%（体积比）胎牛血清，青霉素-链霉素混合溶液（100U/mL），混合均匀，4℃保存备用； 细胞冻存液：90%（体积比）胎牛血清，10%（体积比）二甲亚枫(DMSO)，混合均匀，4℃保存备用。 [0019] 实施例1本实施例就针对PRVgB单克隆抗体的制备鉴定过程简要介绍如下。 [0020] 一、猪伪狂犬病毒（免疫抗原）的制备对猪伪狂犬病毒（抗原）的制备主要是病毒的扩大培养、浓缩和纯化，相关步骤简要介绍如下。 [0021] 1、将自行分离的河南省猪伪狂犬病毒变异毒株HeNZK-2014在PK-15细胞上传代培养；根据Reed-Muench法，以PK-15细胞的细胞病变（CPE，cytopathic effect）为结果，对该毒株的初步研究结果表明，其TCID50可达10-9.77/0.1 mL； 扩大培养结束后将含有病毒的培养液反复冻融3次，然后于37℃条件下用0.1%甲醛溶液将培养液灭活18h（即灭活病毒）； 2、取500mL灭活后培养， 4℃、2000rpm离心10min，取上清； 3、向上清液中加入终浓度为 0.5mol/L 的 NaCl（有助于病毒的沉淀），再加入终浓度 10%（质量体积比）PEG6000，加入时，边加边轻轻搅拌混匀，4℃溶解过夜（确保 PEG6000充分溶解）； 4、对步骤3的沉淀后溶液，4℃、8500rpm 离心30min，弃上清，留取沉淀； 5、对所获得的沉淀用 1.5mL 无菌的 PBS 重悬，转入透析袋中，置于 2L预冷的 PBS 中进行透析；每 4h 更换一次透析液，至第 3 次时透析过夜； 6、透析结束后，用蔗糖进行浓缩，然后按500μL/支分装到 EP 管中，-80℃保存；并利用紫外分光光度计和 BCA 进行蛋白定量，蛋白定量结果为1.5mg/mL。 [0022] 二、制备猪伪狂犬病毒PRV gB蛋白（抗原）猪伪狂犬病毒PRV gB蛋白（抗原）通过基因工程技术制备获得，即首先通过克隆gB 基因，然后与适当载体连接后，再转化合适宿主进行翻译表达后，提取并进一步纯化后即可获得高纯度的gB蛋白（抗原），具体过程简要说明如下： 第一，仍以河南省猪伪狂犬病毒变异毒株HeNZK-2014为例，提取猪伪狂犬病毒DNA，以此为模板，利用如下引物序列进行PCR，获得gB 主要抗原表位区基因（基因序列如SEQ ID NO.1所示）； 引物 P1 的序列为：5’- AATAGGATCCGCGCACGTGAACGACATGCTGA -3’；（其中GGATCC部分序列为BamHⅠ酶切位点） 引物 P2 的序列为：5’-CGGAAGCTTAATGTCGTAGAACTTGAGCGTGTG -3’；（其中AAGCTT部分序列为HindШ酶切位点） 第二，利用HindШ酶和BamHⅠ酶分别对连接目的基因的克隆载体（酶切鉴定结果如图1所示）和原核表达载体pQE30进行双酶切，然后将酶切产物进行连接，构建重组后原核表达载体pQE30-gB621（酶切鉴定结果如图2所示）； 第三，将所构建的原核表达载体pQE30-gB621转化BL-21 宿主菌，IPTG诱导表达，蛋白大小约为27KDa，与预期大小一致； 第四，诱导表达结束后，提取并纯化获得gB蛋白（抗原）（鉴定结果如图3所示）。 [0023] 三、制备和鉴定针对PRVgB蛋白的单克隆抗体针对PRVgB蛋白的获得首先需要对动物注射病毒（抗原）进行免疫，使其产生抗体，然后筛选获得特异性的针对gB蛋白的抗体，相关步骤简述如下。 [0024] 、动物免疫（1）将步骤一中所获得浓缩纯化后猪伪狂犬病毒（变异毒株HeNZK-2014）用灭菌PBS调整到1.5 mg/mL，取一定量（例如100μL）病毒溶液与等体积量的弗氏完全佐剂充分混匀乳化； （2）选取健康小鼠4 只，待其适应环境后，在每只小鼠背部皮下分点注射200μL 步骤（1）中乳化后的病毒与弗氏佐剂混合液； （3）在首次免疫后第15、30 天分别再用弗氏不完全佐剂乳化等量病毒再免疫两次（病毒用量相对于首次免疫用量减半），免疫部位为腹腔注射与皮下分点注射交替进行； （4）第三次免疫后一周尾静脉采血，分离血清，利用商品化伪狂犬病毒gB抗体检测成品试剂盒确定每只小鼠体内的抗体水平； 根据测定的抗体水平结果，对免疫效果较好（选择抗体效价最高且大于1:200000）的小鼠在后续实验（细胞融合实验）前三天再次加强免疫一次，加强免疫时可用腹腔注射100μL不加佐剂的病毒溶液；而对免疫效果不理想的小鼠可以进行四免、五免，免疫方法及部位同上所述。 [0025] 、细胞融合（1）复苏与培养骨髓瘤细胞：在细胞融合前两周左右，开始复苏和培养骨髓瘤细胞SP2/ 0，具体过程简要介绍如下： A、将超净台用酒精棉球擦拭干净，用紫外灯将超净台照射至少30min，打开超净台风机； B、从液氮罐中取出冻存的SP2/0 细胞冻存管，迅速放入37℃水浴锅中，轻轻摇动冻存管，使冻存管内液体完全融化； C、取出冻存管，1000r/min 离心5min，用吸管轻轻吸取上清弃去； D、加入约1mL DMEM完全培养基，轻轻悬起细胞，移入准备好的细胞瓶内，再补充5mL DMEM完全培养基； E、轻轻摇动细胞培养瓶，使细胞分布均匀，置37℃，含5% CO2 细胞培养箱内培养，24h 后观察，待细胞贴壁后更换细胞培养液继续培养； F、细胞融合前1周更换为含有20μg/mL8-氮鸟嘌呤的DMEM完全培养基（以保持HGPRT 缺陷型）； G、在融合当天，将处于对数生长期，生长良好的SP2/0 细胞吹打起来，移至灭菌离心管中，1000r/min 离心10min，弃去上层培养基，收集细胞，加入20mL 不完全RPMI-1640 培养液洗涤一次，离心后将细胞重新悬浮，用台盼兰染色，计数板计数活细胞，备用。 [0026] （2）制备饲养细胞（巨噬细胞）取8 10 周龄健康BALB/c 小鼠一只，眼球采血，分离阴性血清，待小鼠失血死亡后，浸~ 泡于75%酒精中消毒5min，固定于超净台内塑料板上； 用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，用剪刀剪开腹部皮肤（注意不要剪破腹膜），将腹部皮肤拉开固定在塑料板上，使腹膜充分暴露； 用无菌的一次性注射器吸取8～10mL预冷的 HAT 选择培养液注射到小鼠腹腔内，保持注射器不动，用灭菌的小镊子轻揉腹部1 min，再用注射器吸出腹腔内的培养液，此时培养液内含有的巨噬细胞等可作为饲养细胞； 调整培养基中饲养细胞的浓度，使其在1×105个/mL 左右，将调整好浓度的培养基放在灭菌后的平皿内，备用。 [0027] （3）制备脾细胞取免疫好的BALB/c 小鼠（步骤1中免疫后小鼠，实验前3 天加强免疫），眼球采血，分离血清作为阳性对照； 将小鼠颈椎脱臼处死，浸泡于75%酒精中消毒5min，固定于超净台内塑料板上； 用消毒后的小镊子提起腹部皮肤，用剪刀剪开腹部皮肤和腹膜，找到脾脏，用无菌小镊子将其取下； 将取下的脾脏放入盛有不完全DMEM培养液的无菌平皿中稍作清冼，剥离表面脂肪和结缔组织； 然后放在高压灭菌过的200 目铜网上剪碎，用高压灭菌过的注射器芯研磨脾脏，边研磨边滴加不完全DMEM 培养液，直至脾脏完全磨碎，再用不完全DMEM培养液冲洗筛网，使脾细胞完全通过筛网进入烧杯中； 最后，将所收集的含有脾细胞的培养液1000r/m 离心10min 收集脾细胞备用。 [0028] （4）细胞融合将步骤（3）制备的脾细胞与步骤（1）制备的骨髓瘤细胞SP2/0 ，按细胞数量1：5 ～10的比例混合均匀，然后1000r/m 离心10min，倒掉上清，轻弹管底使其疏松； 在一干净的烧杯中加入37℃蒸馏水，将含有混合细胞的离心管置于水浴中，在1min内逐滴加入1 mL、37℃预热的PEG2000，边滴加边旋转离心管，加完后温浴90 s； 然后在1min 内逐滴加入1 mL、37℃预热的不完全DMEM培养液；再在1min 内逐滴加入2 mL、37℃预热的不完全DMEM培养液；再在1min 内逐滴加入4 mL、37℃预热的不完全DMEM培养液；最后用 37℃预热的不完全DMEM培养液补加至20 mL； 最后1000r/min 离心5 min，倒掉上清； 将所收集的细胞沉淀重悬于含20%胎牛血清的HAT 选择培养液中，混合均匀；同时将制备好的饲养细胞按相同体积加入，再次混合均匀； 用多道移液器转移至96 孔细胞培养板中，每孔200μL，饱和湿度、5%CO2、37℃培养。 [0029] 、阳性杂交瘤细胞的筛选和亚克隆（1）阳性杂交瘤细胞的筛选 将步骤2中融合后的细胞每隔2～4 天更换一次培养基，更换的时候采用半换液方式，即弃去100μL 培养基，再加入100μL 新的HAT 选择培养液； 融合后7～8d 时，开始观察细胞，在细胞培养板上标出可稳定传代的杂交瘤细胞的板孔； 待杂交瘤细胞长满孔底1/10 以上时，在包被有猪伪狂犬病毒抗原（步骤一制备）和gB蛋白（步骤二制备）的酶标板上分别加入相应含有杂交瘤细胞培养板上的细胞上清，37℃温育 1 小时； 洗涤液洗涤五次，加入 1∶4000 稀释的羊抗鼠 IgG-HRP，37℃反应 60min； 再洗涤五次后，加入显色液显色15min，2M浓硫酸终止反应之后，用酶标仪测每孔OD450读值； 同时设SP2/0细胞的培养上清作为阴性对照；当OD450值大于2.1 倍于阴性对照时，判为阳性； 选取生长旺盛，形态良好的阳性细胞孔用有限稀释法进行克隆； 将筛选出来的阳性克隆孔上清分别用PCV2、PPV、O型FMDV、CSFV和PRRSV检测试剂盒检测其交叉反应性，将与这5种病毒均无交叉反应性的培养板上的杂交瘤细胞作为备选细胞株（共筛选获得38株杂交瘤细胞株）。 [0030] （2）阳性杂交瘤细胞的亚克隆将步骤（1）中的培养板中的备选细胞株进行间接ELISA 检测，将检测阳性的的杂交瘤细胞吹起，并移入24孔细胞培养板中，待其长满后，重新吹起混匀并细胞计数； 计数后，用含20%胎牛血清的HT 培养液将其稀释到10个细胞/mL，将此浓度的细胞悬液按照100μL/ 孔加入预先铺有饲养细胞的96 孔细胞培养板中培养。 [0031] 重复上述筛选步骤，同时要将每次克隆化后的剩余细胞扩大培养后冻存，以免丢失。 [0032] 经过5次亚克隆（筛选）后，所有克隆化细胞孔内的上清经检测都呈阳性时，可以确定已经获得分泌单克隆抗体的细胞株，其最终筛选结果如下所示：对上述筛选所得细胞株进一步扩大培养，备用。 [0033] （3）单克隆抗体的特异性鉴定采用间接ELISA法，利用所获得的6株单克隆抗体（上述步骤（2）筛选所得细胞株所分泌抗体）与PRV gE、PCV-2、PPV、CSFV、PRRSV抗原及大肠杆菌菌体蛋白反应检测特异性，以P/N≥2.1判为阳性，检测同时设空白、阳性、阴性对照进行分析： 。 [0034] （4）可被gB抗体阳性血清阻断单抗的筛选鉴定在包被好抗原（分别为步骤一的PRV病毒抗原和步骤二的gB蛋白）的酶标板上加 100μL稀释好的PRV免疫猪血清和SPF猪血清，37℃温育 60min； 洗涤五次后，加入步骤（2）中筛选所获得细胞株的对应培养板的上清液100μL，37℃反应60min； 洗涤五次，加入1:4000稀释的羊抗鼠 IgG-HRP，反应30min； 再洗板五次，加入显色液，10分钟后用酶标仪测每孔 OD450读值。 [0035] 当加入PRV免疫猪血清孔的 OD450值低于加入SPF猪血清孔OD 值一半左右时，此单抗即为可被gB抗体阳性血清阻断的单抗（即筛选所获得细胞株上清液中含有对应抗体）。 [0036] 将获得的两株能够分泌与gB抗体阳性血清有相同结合位点的单抗细胞命名为：PRV-gB-6E9和PRV-gB-10G4。 [0037] （5）细胞冻存将形态良好、生长旺盛的杂交瘤细胞（即步骤（3）中筛选所获得的细胞PRV-gB-6E9和PRV-gB-10G4吹打均匀，1000r/min 离心5min，收集细胞； 用1mL 细胞冻存液将细胞悬起，加入到细胞冻存管中，同时做好标记，将冻存管放于冻存盒中置-70℃低温冰箱中过夜，最后投入液氮容器中，并做好记录。 [0038]4、单克隆抗体腹水的制备 在接种阳性杂交瘤细胞株（即上述步骤（5）中所冻存细胞）前一周，给每只8-12周龄雌性BALB/c 小鼠腹腔注射0.5mL 弗氏不完全佐剂；在此期间，对阳性单克隆杂交瘤细胞株进行扩大培养； 一周后，将扩大培养的细胞从细胞瓶中吹下，用无血清无双抗的DMEM培养液重悬，洗涤两次遍，1000r/min 离心5min，台盼蓝染色计数，将细胞密度调至1×106～2×106个/mL，每只小鼠腹腔注射0.5mL 细胞悬液； 接种细胞后每天观察小鼠腹部，待小鼠腹部明显膨大，行动困难时（大概需要5 7天），~ 将小鼠颈椎脱臼处死，用无菌注射器从小鼠腹部吸出暗红色的液体，8000r/min 离心 10min，取清亮的上清分装、标记，-20℃保存备用。 [0039] 、单克隆抗体特性的鉴定（1）抗体亚类的测定： 用小鼠单抗亚型鉴定试剂盒对单抗进行亚型鉴定，具体过程为： 吸取腹水上清200μL，加入已包被PRV病毒的ELISA板上，37℃，孵育60min； PBST溶液洗板5次，并拍干；加入1:2000倍稀释的亚型二抗，37℃，孵育30min； PBST溶液洗板5次，并拍干； 最后加入TMB底物，37℃孵育10~15min，加入终止液，OD450读数，最终确定两株单克隆抗体亚型为IgG-2a。 [0040] （2）单克隆抗体腹水的浓缩纯化与效价测定按1:2的体积比，在步骤4中所制备的腹水中加入0.06mol/L醋酸缓冲液，磁力搅拌器上缓慢混匀； 按终浓度33µL/mL的比例边搅拌边缓慢加入辛酸，30min内加完；4℃，静置2h，12000r/min离心30min，弃沉淀，上清经尼龙网过滤； 加入1/10体积的0.01mol/L的PBS，用1mol/L的NaOH将pH调至7.4，4℃边搅拌边缓慢加入饱和（NH4)2SO4(ph=7.4)使（NH4)2SO4浓度达到45%，静置30min； 4℃、12000r/min离心30min，弃上清；0.01M/L PBS 重悬沉淀；0.01M/L PBS透析除盐，最终即可获得浓缩纯化后腹水。 [0041] 为测定腹水中单克隆抗体效价，将浓缩纯化后小鼠腹水作2倍梯度稀释，从1：800～1：1638400倍，用包被有猪伪狂犬病毒抗原（步骤一制备）和gB蛋白（步骤二制备）的酶标板检测腹水效价；同时用SP2/0 细胞上清、正常小鼠腹水作阴性对照，病毒阳性血清做阳性对照；具体判定标准为：S/N ＞ 2.1 时的腹水最大稀释倍数为腹水的ELISA 效价。 [0042] 测定结果表明，PRV-gB-6E9和PRV-gB-10G4的效价分别为1:40万和1:20万。 [0043] （3）杂交瘤细胞的稳定性鉴定A、杂交瘤细胞体外传代试验 将上述2株杂交瘤细胞株经5次克隆化培养后，转入24孔板培养，连续传代2个月，每间隔5代即收集一次细胞培养上清，采用间接ELISA法测定杂交瘤细胞培养上清的抗体效价，对比传代前后效价变化情况以分析该细胞株的稳定性，实验结果如下表所示： 杂交瘤细胞体外传代实验结果： 上述结果表明，2株杂交瘤细胞株均可在体外稳定传代。 [0044] 、杂交瘤细胞连续冻存复苏试验将上述2株杂交瘤细胞冻存一个月后复苏，观察细胞生长状况，待其培养传代稳定后用ELISA间接法测定其培养上清的抗体效价，随后再冻存，1个月后取出复苏，如此连续冻存复苏3次。对杂交瘤细胞培养上清的抗体效价测定值进行比较分析，结果如下表所示： 杂交瘤细胞复苏实验结果： 。 [0045] 上述结果表明，2株杂交瘤细胞株均可在复苏15次内生长良好。 [0046] C、腹水连续传代试验将2株杂交瘤细胞采用体内诱生腹水法生产腹水，收集腹水后，采集腹水细胞并计数，按1×106～5×106个接种于小鼠腹腔中，连续传4代，测定小鼠各代腹水的效价，并将结果进行比较，结果如下表所示： 单克隆抗体各代腹水效价： 。 [0047] 上述结果表明，2株杂交瘤细胞株在连续4代腹水传代过程中均生长良好。 [0048] 、单克隆抗体的纯化由于含单克隆抗体的腹水中往往含有来自小鼠体内的非特异性IgG分子和其他无关蛋白成分，故一般均需进一步分离、提纯，以备实验使用。本次实验采用辛酸--饱和硫酸铵沉淀方法，对含有单克隆抗体的腹水进行纯化。具体操作步骤如下： （1）腹水的预处理：将采集的腹水在2～8℃条件下，以8000r/min离心30分钟，除去细胞残渣以及小颗粒物质。 [0049] （2）向1份预处理过的腹水中加2份乙酸缓冲液（0.06mol/L，pH值5.0），用0.1mol/L的HCl调pH值至4.5。 [0050] （3）于室温搅拌下在30分钟内逐滴加入辛酸，按每毫升稀释前的腹水加33μl，在2～8℃静置2小时，以8000r/min离心30分钟，弃沉淀。 [0051] （4）上清经砂芯漏斗过滤，加入1/l0体积的PBS（0.1mol/L，pH值7.4），用lmol/L的NaOH调pH值至7.4。 [0052] （5）在2～8℃冰浴下静置30分钟，加入0.277g/mL的硫酸铵，45％的饱和度，静置1小时以上，以8000r/min离心30分钟，弃上清。 [0053] （6）沉淀溶于1/3腹水体积的PBS中，2～8℃条件下置于50～100倍体积的上述PBS液中透析12小时，在2～8℃条件下，以8000r/min离心30分钟，除去不溶性沉淀。 [0054] 对6E9H7细胞株纯化后的单克隆抗体进行SDS-PAEG电泳，染色并记录结果，结果如图4所示。 [0055] 、单克隆抗体的酶标对6E9H7细胞株分泌单克隆抗体纯化后采用HRP进行酶标，具体过程为： （1）称取5mg HRP溶解于1mL蒸馏水中，加入0.2mL新配的0.1mol/LNaIO4溶液，室温下避光搅拌20分钟；将溶液装入透析袋中，使用1mmol/L的醋酸钠缓冲液（pH值4.4）透析，2℃ 8~ ℃过夜； （2）加入0.2mol/L碳酸盐缓冲液（pH值9.5）20µL，使以上醛化HRP的pH值升高到9.0～ 9.5，然后立即加入10mg纯化的单克隆抗体，在1mL碳酸盐缓冲液中（0.01mol/L），室温避光轻轻搅拌2小时； （3）加新配的NaBH4溶液（4mg/mL）0.1mL，混匀，置2℃ 8℃下2小时，然后于PBS缓冲液~ （0.01mol/L，pH值7.2）透析，2℃ 8℃过夜； ~ （4）称取100g硫酸铵，加入90mL水加热溶解，然后放在室温冷却，等待硫酸铵结晶析出稳定后，加氨水调pH值至7.6；然后在透析后的辣根过氧化物和抗体反应液（即步骤（3）透析后反应液）中，边搅拌边逐滴加入等体积饱和硫酸铵，2℃ 8℃静置3小时； ~ （5）8000r/min离心30分钟，弃上清；沉淀物用1mLPBS缓冲液（0.01mol/L，pH值7.2）溶解，最后边摇晃边逐滴加入0.5mL饱和硫酸铵，使其终浓度达到33%， 2℃ 8℃静置3小时； ~ （6）8000r/min离心30分钟，弃上清，沉淀用1mL PBS（0.01mol/L，pH值7.2）溶解； （7）用PBS缓冲液（0.01mol/L，pH值7.2）透析，去除铵离子后（用萘氏试剂检测），以 8000r/min离心30分钟去除沉淀，上清液即为酶标单克隆抗体，分装后，-20℃保存备用。 [0056] 实施例2利用实施例1所制备的单克隆抗体（以6E9H7细胞株分泌单克隆抗体为例）可以用于制备典型的检测猪伪狂犬病毒gB抗体用一步法竞争ELISA试剂盒，该试剂盒包括ELISA检测板、酶标抗伪狂犬病毒单克隆抗体、TMB显色液、终止液等，简要介绍如下。 [0057] 检测猪伪狂犬病毒gB抗体用一步法竞争ELISA试剂盒，包括：96孔ELISA检测板1块，酶标抗伪狂犬病毒单克隆抗体1瓶(10mL/瓶)，阴、阳性对照各2管(1.5mL/管)， 20倍浓缩洗涤液1瓶(30mL/瓶)，TMB显色液、终止液各1瓶(10mL/瓶)；所述96孔ELISA检测板为抗原包被板，具体按如下步骤制备而成：将纯化的gB蛋白抗原（实施例1）用碳酸盐缓冲液（pH9.6）以包被浓度0.5µg/mL、按100μL/孔量加于聚苯乙烯微孔板（96孔ELISA检测板）中，4℃放置过夜，洗一次；按150μL/孔量加入封闭液（含有质量分数 0.5% 酪蛋白的磷酸盐缓冲液（pH 7.4±0.1，浓度0.2mol/L）），4℃放置过夜；甩干并置干燥室干燥，优选装入含干燥剂的包装中密封保存备用； 所述酶标抗伪狂犬病毒单克隆抗体，为实施例1所制备的酶标后单克隆抗体，实际使用时，常需根据每批酶标单抗的效价进行适当稀释，稀释后效价大约为1:1000，稀释时所用稀释液为含有质量分数为1% BSA的Tris-cl缓冲液； 所述阴性对照为经稀释的SPF猪血清或血浆，阳性对照为经稀释的含有猪伪狂犬 gB 抗体的猪血清或血浆，阳性对照OD值约为0.20，阴性对照OD值约为1.30； 所述20倍浓缩洗涤液为含有1%Tween-20的20倍PBS缓冲液；； 所述TMB显色液中TMB质量浓度为 0.3g/L； 所述终止液为：浓度为 2M 的 H2SO4溶液。 [0059] (1)取出PRV 抗原包被板，在记录纸（表）上或包被板上标注并记录样品位置；(2)加25μL阴性对照血清至A1、B1 孔，25μL阳性对照血清至C1、D1 孔，25μL待检样品至相应的孔； 以96孔ELISA检测板为例，具体布置方式如下： ； (3) 每孔加入50 μL酶标抗伪狂犬病毒单克隆抗体，37℃条件下温育30分钟（±1分钟）； (4) 孵育结束后，每孔用大约300 μL 1:20倍稀释的浓缩洗涤液洗涤微孔3 5 次；每次~ 洗涤后，甩掉孔内的液体，在最后一次甩干后，在吸水材料上轻扣抗原包被板，彻底去掉剩余的液体； (5)每孔加100 μL TMB 显色液；室温（18 23℃）孵育15 分钟； ~ (6)每孔加入50 μL 终止液终止反应； (7)以空气作为空白对照对酶标仪进行空白设定，450nm条件下测量和记录样品和所有对照的吸光值OD值（OD450nm），根据下述公式计算各样品S/N值； 阴性对照平均值（NC ）NC =( NC1+NC2 )/2； 阳性对照平均值（PC ）PC =( PC1+PC2 )/2； 试验成立判断标准：PC ＜0.30；NC ＞0.80。如果试验无效，试验中的操作值得怀疑，应按照操作说明书重做一次试验。 [0060] S/N值的计算： S/N=（NC -S）/( NC -PC )；（括号中S指待检样本的OD值）如果S/N值≥0.4，样品应判定为抗体阳性；如果S/N值＜0.4，样品应判定为抗体阴性。 [0061] 实施例3为验证实施例2所提供的试剂盒的应用效果，对其进行了敏感性、特异性、准确性、重复性等检测，相关试验简要介绍如下。 [0062] 敏感性检测将70头未免疫健康猪分为7组，对免疫猪伪狂犬疫苗后不同时期猪群的PRV gB抗体进行监测，用本试剂盒对采集的血清样本进行检测，检测结果如下表所示。 [0063] 敏感性验证：。 [0064] 从上表数据可以看出，当免疫14天的大部分血清被检测为阳性，21天后样本全部被检测为阳性，说明试剂盒的灵敏度较好。 [0066] 特异性验证：。 [0067] 从上表数据可以看出，除PRV标准阳性血清的的S/N值≥0.4外，其余血清S/N值在0.12～0.23之间，均判定为阴性，表明该试剂盒特异性良好，与其它病原抗体阳性血清无交叉反应。 [0068] 准确性对比检验用IDEXX gB 抗体阻断法抗体检测试剂盒与本发明的试剂盒同时检测来自28个不同地市养猪场的临床猪血清样品1025份，其中保育猪297份，育肥猪563份，成年母猪165份，计算出各自S/N值，检测本方法的特异性和敏感性。检测结果如下表所示： 与商品化试剂盒的符合性验证： 。 [0069] 从上表可以看出，两种试剂盒检测样品的阳性符合率为98.5%，阴性样品的符合率为100%，总符合率为98.9%。 [0070] 重复性试验用试制的猪伪狂犬病毒gB竞争ELISA抗体检测试剂盒分别检测已知背景猪血清30份，其中低值样本10份，中值样本10份，高值样本10份。用3批试剂盒，每批用5个试剂盒，对以上 30份血清样品进行5次重复检测，计算5次重复平均值，得出变异系数： 。 [0071] 结果显示，批内变异系数均在3.8% 12.8%之间，批间变异系数在9.7% 14.0%之~ ~间，符合要求。 |
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