[0001] 本发明涉及细胞的培养方法、细胞的凝集体、细胞凝集控制剂以及培养基，详细而言，涉及控制细胞的凝集块的直径、以及能够获得大量细胞的细胞的培养方法、通过该方法而获得的细胞的凝集体、细胞凝集控制剂、以及含有该细胞凝集控制剂的培养基。

[0002] 通常，人类的肝脏由约2500亿个细胞构成。使用多能干细胞使肝脏组织化时，在认为需要原来的肝脏的1成左右的情况下，以细胞数计需要约250亿个细胞。另外，由于在药物试验中也必须以均一的质量(以下也称为“均质”，homogeneous)的细胞进行试验，因此，均质且大量地培养多能干细胞的技术是对于产业上的应用发展来说不可缺少的工艺。基于这种背景，为了稳定地大量供给多能干细胞，从能够进行简便且高密度的培养出发，提出了悬浮培养法。该培养方法是被期待为可以获得能够应用于再生医疗等的细胞数的培养方法之一，特别是在设备方面和成本方面是有利的。

[0003] 然而，由于多能干细胞容易形成凝集体，因此，会形成巨大凝集体、或所得凝集体的直径不均一等，从而形成各种凝集体。另外，这种凝集体有传代时的细胞生存率低等的问题。因此，为了防止培养容器中的细胞及细胞块的沉淀，提出了：伴随使用了旋转瓶等的搅拌操作的三维悬浮培养法(参照非专利文献1及非专利文献2)。然而，由于多能干细胞对于因搅拌操作而产生的力学性应力敏感，因此，在如下方面存在问题：在培养中有可能会对细胞产生损伤，从而产生由应力引起的质量降低。

[0004] 因此，最近提出了：在培养袋中含有培养液、甲基纤维素及结冷胶，并在其中培养多能干细胞；在传代时使用尼龙网过滤器而使多能干细胞球体分解(参照非专利文献3)。然而，该方法中，在所得细胞的数量的方面无法令人满意。进而存在如下问题：为了利用结冷胶防止细胞及细胞块的沉淀而使培养液的粘度上升，因此无法进行充分的搅拌以供给对细胞增殖而言最低限度所需的营养和氧，所以在形成较大的细胞块时，内侧的细胞无法生存，从而细胞的质量降低。另外，在要使所得细胞块的全部细胞生存而未使细胞块生长成较大的情况下，有所得细胞数减少的问题。由此，通过该培养方法获得的干细胞无法同时满足细胞的质量及所得的细胞数这两者。

[0005] 现有技术文献

[0006] 非专利文献

[0007] 非专利文献1：BIOTECHNOLOGY AND BIOENGINEERING，Vol.92，NO.7，920～933，DECEMBER 30，2005

[0008] 非专利文献2：TISSUE ENGINEERING：Part C Vol.18，NO.10，1～13，2012[0009] 非专利文献3：Stem Cell Reports，Vol.2，734～745，May 6，2014

[0010] 发明要解决的问题

[0011] 因此，本发明的目的在于，提供能够控制细胞的凝集块的直径并且获得大量细胞的细胞的培养方法；通过该方法而获得的细胞的凝集体、细胞凝集控制剂、以及含有该细胞凝集控制剂的培养基。

[0012] 用于解决问题的方案

[0013] 本发明人等进行了深入研究，结果发现：通过在培养基中含有阻碍细胞粘附分子的物质，能够控制与凝集体的形成相关的细胞粘附分子的功能、以及由此在悬浮培养中控制凝集体的直径，因此能够解决上述课题，从而完成了本发明。

[0014] 即，本发明涉及细胞的培养方法、细胞的凝集体、细胞凝集控制剂以及培养基，为以下的[1]～[11]。

[0015] [1]一种培养方法，其特征在于，其为基于悬浮培养的细胞的培养方法，其包括凝集控制工序：将阻碍前述细胞的细胞粘附分子的物质添加至培养基中，从而控制前述细胞的细胞凝集。

[0016] [2]根据前述[1]所述的培养方法，其特征在于，在前述凝集控制工序中，以含有10～50μg/ml的浓度的方式在前述培养基中添加阻碍前述细胞粘附分子的物质。

[0017] [3]根据前述[1]或[2]所述的培养方法，其中，阻碍前述细胞粘附分子的物质为选自细胞粘附分子、由细胞粘附分子的部分区域构成的蛋白质、包含细胞粘附分子的全部或部分区域的融合蛋白质、细胞粘附分子的中和抗体、与细胞粘附分子结合的肽、以及它们的衍生物中的至少1种。

[0018] [4]根据前述[1]～[3]中任一项所述的培养方法，其特征在于，阻碍前述细胞粘附分子的物质含有选自E-钙黏着蛋白、由E-钙黏着蛋白的部分区域构成的蛋白质、包含E-钙黏着蛋白的全部或部分区域的融合蛋白质、E-钙黏着蛋白的中和抗体、与E-钙黏着蛋白结合的肽、以及它们的衍生物中的至少1种。

[0019] [5]根据前述[1]～[4]中任一项所述的培养方法，其中，前述细胞为干细胞或上皮细胞。

[0020] [6]一种凝集体，其特征在于，其为通过前述[1]～[5]中任一项所述的培养方法而获得的前述细胞的凝集体，且具有均一的凝集直径。

[0021] [7]根据前述[6]所述的凝集体，其特征在于，在悬浮培养48小时后的凝集体的直径为20μm以上且低于1mm。

[0022] [8]一种细胞凝集控制剂，其特征在于，含有阻碍细胞粘附分子的物质。

[0023] [9]根据前述[8]所述的细胞凝集控制剂，其中，作为阻碍前述细胞粘附分子的物质，含有选自E-钙黏着蛋白、由E-钙黏着蛋白的部分区域构成的蛋白质、包含E-钙黏着蛋白的全部或部分区域的融合蛋白质、E-钙黏着蛋白的中和抗体、与E-钙黏着蛋白结合的肽、以及它们的衍生物中的至少1种。

[0024] [10]根据前述[9]所述的细胞凝集控制剂，其特征在于，前述与E-钙黏着蛋白结合的肽为由序列号3所示的氨基酸序列构成的肽。

[0025] [11]一种培养基，其特征在于，其含有前述[8]～[10]中任一项所述的细胞凝集控制剂。

[0026] 发明的效果

[0027] 根据本发明，可以提供能够控制细胞的凝集块的直径，且获得大量细胞的细胞的培养方法、通过该方法而获得的细胞的凝集体、细胞凝集控制剂、以及含有该细胞凝集控制剂的培养基。附图说明

[0028] 图1为示出本发明的培养方法的一个实施方式的说明图。

[0029] 图2为对实施例1-1～1-5及比较例1-1中获得的凝集体的形状利用相位差显微镜进行拍摄而得到的照片图((A)～(F))，该凝集体是在E-钙黏着蛋白-Fc的用量分别为0、5、10、20、50及100μg/ml的范围内对人类iPS细胞进行处理、并对人类iPS细胞进行旋转悬浮培养(rotation suspension culture)5天时的凝集体。比例尺表示500μm。

[0030] 图3为示出由实施例1-1～1-5及比较例1-1中使用的培养基测定的细胞的葡萄糖消耗量的图表。

[0031] 图4为示出在实施例1-1～1-5及比较例1-1中培养5天并回收的细胞的每1ml培养基的密度的图表。

[0032] 图5为对实施例2-1～2-3及比较例2-1中获得的凝集体的形状利用相差显微镜拍摄而得到的照片图((A)～(D))，该凝集体是分别利用重组E-钙黏着蛋白(10μg/ml)、E-钙黏着蛋白抗体(16μg/ml)和E-钙黏着蛋白-Fc(10μg/ml)对人类iPS细胞进行处理然后对人类iPS细胞进行旋转悬浮培养1天时的凝集体；以及未添加阻碍细胞粘附分子的物质而进行处理，然后对人类iPS细胞进行旋转悬浮培养1天时的凝集体。比例尺表示500μm。

[0033] 图6为将实施例3-1、3-2及比较例3-1中获得的凝集体的形状利用相差显微镜拍摄而得到的照片图((A)～(C))，该凝集体是使E-钙黏着蛋白-Fc的用量分别在0、50及100μg/ml的范围内进行处理，并将人类iPS细胞进行旋转悬浮培养2天时的凝集体。比例尺表示500μm。

[0034] 图7为将实施例3-1、3-2及比较例3-1中获得的凝集体的形状利用相差显微镜拍摄而得到的照片图((A)～(C))，该凝集体是使E-钙黏着蛋白-Fc的用量分别在0、50及100μg/ml的范围内进行处理，并将人类iPS细胞进行旋转悬浮培养5天时的凝集体。比例尺表示500μm。可以认为，图7的(C)的凝集体的形态是在移液时变形而得到的。

[0035] 图8为示出由实施例3-1、3-2及比较例3-1中使用的培养基测定的细胞的葡萄糖消耗量的图。

[0036] 图9为示出在实施例3-1、3-2及比较例3-1中培养5天而回收的细胞的每1ml培养基的密度的图。

[0037] 本发明的培养方法的特征在于，其为基于悬浮培养的细胞的培养方法，其包括如下凝集控制工序：将阻碍前述细胞的细胞粘附分子的物质添加至培养基中，从而控制前述细胞的细胞凝集。另外，根据本发明的培养方法，也能够通过均一地控制凝集体的直径而大量培养均一质量的细胞。

[0038] 如下述详细说明，对于获得悬浮培养中使用的细胞的方法没有特别的限制。另外，细胞优选为具有E-钙黏着蛋白的细胞，更优选为干细胞或上皮细胞。

[0039] 作为阻碍前述细胞的细胞粘附分子的物质，优选为选自细胞粘附分子、由细胞粘附分子的部分区域构成的蛋白质、包含细胞粘附分子的全部或部分区域的融合蛋白质、细胞粘附分子的中和抗体、与细胞粘附分子结合的肽以及它们的衍生物中的至少1种。前述细胞粘附分子更优选为属于钙黏着蛋白·家族的分子。优选的是，前述属于钙黏着蛋白·家族的分子为E-钙黏着蛋白、或者为与该分子在结构上具有类似性的分子且包含E-钙黏着蛋白的EC1区域、EC2区域、EC3区域、EC4区域以及EC5区域中的1个以上区域，且与前述多能干细胞具有同种亲和性的结合能力的分子。

[0040] 另外，作为阻碍前述细胞的细胞粘附分子的物质，更优选为选自E-钙黏着蛋白、由E-钙黏着蛋白的部分区域构成的蛋白质、包含E-钙黏着蛋白的全部或部分区域的融合蛋白质、E-钙黏着蛋白的中和抗体、与E-钙黏着蛋白结合的肽、以及它们的衍生物中的至少1种。

[0041] 另外，也可以在前述凝集控制工序之后，将所得细胞的凝集体在不含有阻碍前述细胞粘附分子的物质的培养基中进行悬浮培养。这是因为，在前述凝集控制工序中若将初始的凝集体的直径控制为均一，则在其后的培养中即使在不含有阻碍前述细胞粘附分子的物质的培养基中进行悬浮培养，也可以将凝集体的尺寸控制为均一。如此，从增加细胞数的观点出发，优选其后在不含有阻碍前述细胞粘附分子的物质的培养基中进行悬浮培养。

[0042] 作为本发明的细胞的培养方法的具体一个实施方式，一边参照图1一边对使用人类iPS细胞的一例进行说明，但本发明并不限定于此。首先，为了获得用于悬浮培养的细胞，通过酶处理将粘接在作为通常培养基材料的基质胶上的人类iPS细胞进行剥离(图1的(A))并回收(图1的(B))。作为前述凝集控制工序，将回收的iPS细胞、与作为阻碍iPS细胞的细胞粘附分子的物质的E-钙黏着蛋白-Fc融合蛋白质混合，并进行悬浮培养，由此进行细胞彼此的粘接阻碍处理(图1的(C))。E-钙黏着蛋白为承担人类iPS细胞的细胞间粘接的膜蛋白，E-钙黏着蛋白-Fc融合蛋白质为对E-钙黏着蛋白的粘接区域赋予抗体的Fc标签而成的重组蛋白，通过使E-钙黏着蛋白-Fc融合蛋白质与人类iPS细胞上的E-钙黏着蛋白粘接区域粘接，可以阻碍细胞彼此使用E-钙黏着蛋白的粘接。作为其他E-钙黏着蛋白阻碍物质，例如可举出：重组E-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白抗体、E-钙黏着蛋白抑制肽等。该处理时间为1天至2天左右，在该期间使用搅拌器进行旋转培养。前述处理后，更换为通常的培养液，然后每天进行培养基更换(图1的(D))。

[0043] 以下，对用于实施本发明的形态进行详细说明。需要说明的是，本说明书中使用时，术语“多能干细胞”是指，通过体外培养而保持未分化状态，能够进行几乎永久或长期的细胞增殖，呈现正常的核(染色体)型，且具有在适当的条件下分化为三胚叶(外胚叶、中胚叶、以及内胚叶)全部的系谱的细胞的能力的细胞。“多能干细胞”为自初期胚分离的ES细胞、iPS细胞及其类似细胞，包含自胎儿期的原始生殖细胞分离的EG细胞，但并不限定于此。本说明书中，记为“ES细胞”的情况下，有时也包含“EG细胞”。

[0044] 在本说明书中使用时，术语“未分化性”是指在多能干细胞中，可以通过至少1个以上的未分化标记物、例如ALP活性、Oct-3/4基因(产物)的表达、或者各种抗原分子的表达而确认的呈现未分化状态的性质。多能干细胞中的未分化状态是指，多能干细胞能够进行几乎永久或长期的细胞增殖，呈现正常的核(染色体)型，且具有在适当的条件下分化为三胚叶全部的系谱的细胞的能力的状态。

[0045] 在本说明书中使用时，术语“分化多能性”是指，分化为各种细胞的能力。作为分化细胞，只要为通常可以自多能干细胞分化诱导的种类的细胞，则对其没有特别的限制。具体而言，可举出：外胚叶细胞或源自外胚叶的细胞、中胚叶细胞或源自中胚叶的细胞、内胚叶细胞或源自内胚叶的细胞等。

[0046] 在本说明书中使用时，术语“培养基”是指，包括全部将多能干细胞进行传代培养的以往的方法能够使用的液体培养基。

[0047] 对于获得在本发明的悬浮培养中使用的细胞的方法没有特别的限制，可以使用一直以来进行的培养方法。以下，针对多官能性干细胞的培养方法进行说明。

[0048] 作为多官能性干细胞的培养方法，可以使用下述多能干细胞的培养中使用的方法中的任一种：使用培养皿(dish)、96孔、48孔等微孔板、平板等容器的平面培养法；使用烧瓶、袋、反应器等的悬浮培养法等。

[0049] 在进行前述平面培养时，必须在培养皿、平板等容器表面设置细胞粘接基材。作为这种细胞粘接基材，可举出：琼脂、明胶、基质胶、层粘连蛋白、玻璃粘连蛋白、E-钙黏着蛋白等。它们的用量只要为培养多能干细胞时使用的浓度，则没有特别的限制，作为固定于容器时的水溶液浓度，为2～50μg/ml左右。

[0050] 作为将前述粘接基材固定或涂布于前述容器的固相表面的方法，可以应用吸附等物理学方法、共价键合等化学方法，但从操作的容易性出发，优选基于吸附的方法。吸附是指，可以通过使含有粘接基材的溶液与基材表面接触一定时间、优选为几分钟～一天、更优选为20分钟～12小时而实现。另外，也可以提前人为地使抗原性分子与粘接性分子进行加成/融合，利用该抗原性分子的与特异抗体的结合。

[0051] 如上所述制作的培养容器可以直接用于多能干细胞的通常的培养法。即，只要使适当数量的多能干细胞悬浊于通常使用的液体培养基或细胞培养液中，将其添加至该培养基材料中即可。其后的液体培养基的更换、传代也可以与以往方法同样地进行。

[0052] 通过利用前述材料培养多能干细胞，可以获得在悬浮培养中所需的数量的多能干细胞。细胞基材与细胞的分离及细胞的回收通常通过酶处理进行。作为此时使用的酶，可举出：胰蛋白酶、胶原酶、透明质酸酶、弹性蛋白酶、链霉蛋白酶等。

[0053] [阻碍细胞粘附分子的物质]

[0054] 本发明的培养方法中使用的阻碍细胞粘附分子的物质为与细胞的凝集性相关的能够阻碍细胞粘附分子的物质，如上所述，优选细胞粘附分子、其衍生物等，更优选选自E-钙黏着蛋白、由E-钙黏着蛋白的部分区域构成的蛋白质、包含E-钙黏着蛋白的全部或部分区域的融合蛋白质、E-钙黏着蛋白的中和抗体、与E-钙黏着蛋白结合的肽、以及它们的衍生物中的至少1种。

[0055] 钙黏着蛋白是指，与成为粘接结合或黏着连接(adherens junction)的Ca2+依赖性的细胞间粘接/结合相关的粘附分子，作为代表例，已知有E(上皮)型、N(神经)型、P(胎盘)型3种。这些钙黏着蛋白分子为由700～750个氨基酸残基构成的膜结合型糖蛋白分子，在其细胞外区域存在5个由约110个氨基酸残基构成的重复结构、被称为所谓的细胞外钙黏着蛋白(Extracellular Cadherin(EC))区域的区域。例如，在为人类E-钙黏着蛋白(将其氨基酸序列示于序列号1)的情况下，EC1、EC2、EC3、EC4、EC5的各区域分别相当于157～262、265～375、378～486、487～595、596～700(数值为序列号1中示出的氨基酸序列内的残基的编号)。另外，在为小鼠E-钙黏着蛋白(将其氨基酸序列示于序列号2)的情况下，EC1、EC2、EC3、EC4、EC5的各区域分别相当于159～264、267～377、380～488、489～597、598～702(数值为序列号2中示出的氨基酸序列内的残基的编号)。这些EC区域在不同的钙黏着蛋白分子种类之间具有同源性，特别是位于N末端侧的区域(EC1、EC2)的同源性高。作为呈现这种类似的结构的钙黏着蛋白分子，目前已知有50种以上，将这些分子统称为钙黏着蛋白·家族。以上，作为与钙黏着蛋白相关的总说，参照Takeichi，Curr.Opin.Cell Biol.7：619，1995；
Marrs&Nelson，Int.Rev.Cytol.165：159，1996；Yap et al.，Annu.Rev.Cell Dev.Biol.13：
119，1997；Yagi&Takeichi，Genes Dev.14：1169，2000；Gumbiner，J.Cell Biol.148：399，
2000等。

[0056] 另外，已知E-钙黏着蛋白(别名钙黏着蛋白-1)广泛地表达于肝脏、肾脏、肺等内脏脏器的实质细胞、角化细胞等上皮细胞，且为承担其细胞间粘接的重要的粘附分子(作为总说，参照Mareel et al.，Int.J.Dev.Biol.37：227，1993；Mays et al.，Cord Spring Harb.Symp.Quant.Biol.60：763，1995；El-Bahrawy&Pignatelli，Microsc.Res.Tech.43：224，1998；Nollet et al.，Mol.Cell.Biol.Res.Commun.2：77，1999等)。

[0057] 对于制作属于E-钙黏着蛋白的蛋白质的方法没有特别的限制，理想的是，使用分子生物学的方法对重组蛋白质进行制作/精制并使用该重组蛋白。除此以外，只要为示出同样效果的方法，则也可以使用任意者，例如也能够将多能干细胞的属于E-钙黏着蛋白的蛋白质自生物组织/细胞提取、精制而使用、或者以化学方式将该肽合成而使用。

[0058] 例如E-钙黏着蛋白基因已经在人类(序列号1)、小鼠(序列号2)、大鼠等动物中分离/鉴定，其碱基序列能够在NCBI等官方的DNA数据库中利用(访问编号：(人类)NM_004360；(小鼠)NM_009864；(大鼠)NM_031334)。因此，若是本领域技术人员，则可以通过对E-钙黏着蛋白基因设计特异的引物或探针，并使用通常的分子生物学的方法，从而取得并使用E-钙黏着蛋白基因的cDNA。另外，E-钙黏着蛋白基因的cDNA也可以从理化学研究所基因库(日本筑波)、American Type Culture Collection(ATCC)、Invitrogen Corporation/ResGen等购买。作为使用的编码属于钙黏着蛋白家族的蛋白质的基因，优选源自与多能干细胞所源自的种类同类的动物，例如在使用小鼠ES细胞实施本发明的情况下，理想的是使用小鼠的E-钙黏着蛋白cDNA。然而，也可以使用源自不同种类的动物、即源自人类、猴、牛、马、猪、羊、或鸟类(例如鸡等)、或两栖类(例如非洲爪蟾等)的E-钙黏着蛋白cDNA。

[0059] 用于制作属于E-钙黏着蛋白的蛋白质的重组蛋白质的适宜方法的一例的特征在于，将编码该分子的基因导入至COS细胞、293细胞、CHO细胞等哺乳动物细胞中而使其表达。优选的是，该基因与广泛的哺乳动物细胞中的能够进行基因的转录和表达的核酸序列、即启动子序列以能够在该启动子的控制下转录、表达的形式连结。另外，理想的是，使转录、表达的基因进一步与polyA加成信号连结。作为适宜的启动子，可举出：源自猿猴病毒(Simian Virus)40病毒、巨细胞病毒(Cytomegaro Virus；CMV)、劳氏肉瘤病毒(Rous sarcoma virus)等病毒的启动子、β-肌动蛋白启动子、EF(Elongation Factor)1α启动子等。

[0060] 用于制作上述重组蛋白质的基因无需包含编码该分子的基因的全长区域，即使为部分基因序列，该部分序列所编码的蛋白质或肽分子只要为具有与本来的该分子相同程度、或其以上粘接活性即可。例如，在本发明的适宜的事例中使用的E-钙黏着蛋白得情况下，可以使用编码细胞外区域的、包含自N末端侧起690～710个氨基酸残基的部分序列而制作的重组蛋白质即包含EC1～EC5区域的蛋白质。另外，由于通常在钙黏着蛋白分子中，位于最接近N末端侧的区域(EC1)规定该分子的结合特异性、即同类亲和性(Nose et al.，Cell 61：147，1990)，因此，也可以制作至少包含EC1且去除了其以外的1个或几个区域而成的蛋白质分子来使用。进而，也可以使用与上述蛋白质分子在氨基酸水平方面显示出80％以上、优选为85％以上、进一步优选为90％以上、最优选为95％以上的同源性且具有粘接活性的蛋白质。

[0061] 另外，上述重组蛋白质也能够以与其他蛋白质、肽的融合蛋白质的形式制作。例如，以免疫球蛋白的Fc区域、谷胱甘肽S转移酶(Glutathione-S-Transferase)蛋白质、甘露糖集合蛋白(Mannnose-Binding Protein)、抗生物素蛋白质、与His(低聚·组氨酸)标签、血细胞凝集素(Hem Agglutinin)标签、Myc标签、囊状病毒糖蛋白(Vesicular Stromatitis Virus Glycoprotein)标签等的融合蛋白质的形式制作，并使用蛋白A/G管柱、特异性抗体管柱等，由此可以容易且高效地进行重组蛋白质的精制。特别是Fc融合蛋白质由于形成二聚体，因此作为蛋白质的活性稳定，故在本发明的实施中适宜。

[0062] 编码免疫球蛋白的Fc区域的基因已经在以人类为代表的哺乳动物中大量分离并进行了鉴定。也大量报告有其碱基序列例如包含人类IgG1、IgG2、IgG3、以及IgG4的Fc区域的碱基序列的序列信息能够在NCBI等官方DNA数据库中利用，分别以访问编号：AJ294730、AJ294731、AJ294732、以及AJ294733的形式进行登录。因此，若为本领域技术人员，则能够通过对Fc区域设计特异的引物或探针，并使用通常的分子生物学的方法，从而取得并使用编码Fc区域部分的cDNA。此时，作为使用的编码Fc区域的基因，对于动物种类、子类型没有特别限制，优选的是，与蛋白A/G的结合性强的人类IgG1、IgG2、或小鼠IgG2a、IgG2b等编码Fc区域的基因。另外，也已知有通过向Fc区域导入变异而提高与蛋白A的结合性的方法(Nagaoka et al.，Protein Eng.16：243，2003参照)，也可以使用通过该法施加基因改变而成的Fc蛋白质。

[0063] 需要说明的是，在为用于实施本发明的可适宜使用的E-钙黏着蛋白的情况下，报告了该重组蛋白质的制作法的一例(参照Nagaoka et al.，Biotechnol.Lett.24：1857，2002；Protein Eng.16：243，2003)。

[0064] 另外，市售有将使编码人类IgG的Fc区域部分的序列及His标签序列的cDNA、与编码小鼠或人类的E-钙黏着蛋白的细胞外区域的cDNA连结而成的融合基因导入至小鼠细胞中并使其表达而制成的精制重组·蛋白质(Recombinant Human/Mouse E-cadherin-Fc Chimera；R&D Systems Company，Genzyme Techne Corporation)，也可以用作源自小鼠或人类的E-钙黏着蛋白/蛋白质(E-Cad-Fc蛋白质)。

[0065] 另外，对于制作与E-钙黏着蛋白等细胞粘附分子结合的肽的方法没有特别的限制，例如，只要将E-钙黏着蛋白等细胞粘附分子作为靶分子，使用一直以来进行的噬菌体展示等亲和选择法(affinity selection)进行筛选即可(例如，Devemy E，Blaschuk O.Identification of a novel N-cadherin antagonist.Peptides 2008；29：1853-61)。作为具体方法的一例，首先，将选自多肽库的肽加入至预先在平板的孔中涂布有E-钙黏着蛋白-Fc融合蛋白质的孔中而进行培养。接着，为了自孔去除未结合噬菌体而进行清洗。结合的噬菌体在2阶段溶出。在第一溶出工序中使用含有2mM EDTA的TBS进行，在第2溶出工序中利用0.2M的甘氨酸HCl(pH2.2)溶出。对pH2.2的溶出液使用1M的Tris-HCl(pH9.1)进行中和。通过使ER2738细胞感染而使溶出的噬菌体的各组分扩增，并通过聚乙二醇沉淀而进行精制。自EDTA组分扩增的噬菌体用于第二次的生物淘选操作，仅EDTA溶出液用于第三次的生物淘选操作。另外，自酸组分扩增的噬菌体可用于第二次的生物淘选操作，仅酸溶出液进行扩增，从而用于最终生物淘选操作。在筛选的最后，播种噬菌体，随机采集分离的克隆并进行扩增。提取各噬菌体克隆的单链DNA，通过DNA测序推定氨基酸序列。作为与E-钙黏着蛋白结合的肽，例如可举出：序列号3的氨基酸序列中示出的SWELYYPLRANL、序列号4～30的氨基酸序列中示出的肽等。这些肽可以在不失去与靶分子的结合的范围内进行公知惯用的修饰(例如PEG化、C末端的酰胺化等)。这些肽可以单独使用，也可以组合2种以上使用。

[0066] 另外，对于制作E-钙黏着蛋白等细胞粘附分子的中和抗体的方法没有特别的限制，可以使用一直以来进行的公知的方法。也可以将与前述E-钙黏着蛋白等细胞粘附分子结合的肽抗体化而使用。例如，可举出：将细胞粘附分子、与细胞粘附分子结合的肽作为抗原，使动物免疫而制作的方法；向动物导入引入至表达载体的目标蛋白质的基因，并使其在动物的体内表达，将该目标蛋白质作为抗原而制作、回收抗体的方法(DNA免疫法)等。

[0067] 本说明书中，由细胞粘附分子、E-钙黏着蛋白的部分区域构成的蛋白质是指，与细胞粘附分子、E-钙黏着蛋白的母体分子相比，缺损1个以上分子的蛋白质，且具有细胞粘接性。

[0068] 另外，本说明书中，衍生物是指，与母体分子相比，其序列呈现1个以上差异的分子且具有细胞粘接性。例如可举出：细胞粘附分子、E-钙黏着蛋白的全部或部分、与其他化学物质或低分子量的聚合物成分或者低聚物成分的反应产物。前述衍生物与母体分子的同源性优选为75％以上，更优选为85％以上，进一步优选为90％以上。

[0069] [凝集控制工序]

[0070] 本发明的培养方法中的凝集控制工序为如下工序：将培养的细胞的阻碍细胞粘附分子的物质添加至培养基中，从而控制前述细胞的细胞凝集。凝集控制工序只要在容器内放入所需的培养基，使其中含有细胞和阻碍细胞粘附分子的物质，一边进行静置或搅拌等一边进行悬浮培养即可。由此，能够使阻碍细胞粘附分子的物质作用于细胞表面，以成为所需的凝集体的尺寸的方式控制细胞间粘接性。

[0071] 此时的阻碍细胞粘附分子的物质的添加量根据细胞的量、培养基成分而适宜选择，特别是添加阻碍细胞粘附分子的物质而开始悬浮培养起经过48小时后的凝集体的尺寸(直径)成为20μm以上且低于1mm的方式进行适宜选择，例如优选的是，在使用属于E-钙黏着蛋白的蛋白质、中和抗体时，成为5～100μg/ml的浓度的方式添加，另外，在使用与E-钙黏着蛋白等细胞粘附分子结合的肽时，以成为0.01～1000μM的浓度的方式添加。若添加量少于上述范围，则有时所得凝集体的尺寸变得过大，因此，有时凝集体的内侧的细胞变得无法生存、或为干细胞时失去未分化性。另外，若超过上述范围，则有时凝集体的尺寸变得明显不均一、或较小的凝集体覆盖较大的凝集体的表面，由此，内侧的较大的凝集体的细胞变得无法生存。另外，从大量获得均质的细胞的观点出发，使用属于E-钙黏着蛋白的蛋白质、中和抗体时的浓度优选为7～80μg/ml，更优选为8～65μg/ml的范围，进一步优选为10～50μg/ml的范围，使用与E-钙黏着蛋白等细胞粘附分子结合的肽时的浓度优选为0.1～900μM，更优选为0.5～800μM的范围，进一步优选为1～600μM的范围。若为上述范围，则可以将经过48小时后的凝集体的尺寸控制为20μm以上且低于1mm的范围。通过将凝集体控制为该尺寸，可以使最终获得的凝集体的尺寸均质，结果使细胞生存率及细胞数增加。可以认为这是由于，与以往那样的使细胞彼此难以简单粘接的方法不同，在本发明中，阻碍细胞粘附分子的物质直接作用于粘接因子，并利用细胞水平控制细胞彼此的粘接量。

[0072] 进而，对于使用了属于E-钙黏着蛋白的蛋白质、中和抗体的阻碍细胞粘附分子的物质的添加量，若考虑由培养基中的蛋白质含量引起的蛋白质吸附性，则在使用蛋白质含量少的培养基(例如蛋白质含量为1mg/ml以下)时，优选的是25～100μg/ml，30～100μg/ml，优选为40～100μg/ml，进一步优选为50～100μg/ml的范围，在使用蛋白质含量多的培养基(例如10mg/ml以上)时，优选的是7～80μg/ml，更优选为8～65μg/ml，进一步优选为10～50μg/ml的范围。通过以这样的量添加阻碍细胞粘附分子的物质，阻碍细胞粘附分子的物质可以在封端目标的细胞膜钙黏着蛋白之前吸附于其他细胞膜、培养基材料，从而可靠地封端细胞膜钙黏着蛋白。

[0073] 另外，添加阻碍细胞粘附分子的物质时的对细胞的处理时间可以根据凝集体的尺寸而适宜确定，通常为24～48小时。若短于该期间，则有时难以形成凝集体，另外，若超过该范围，则凝集体难以增大，因此有时所得细胞数减少。

[0074] 本发明的培养方法中，从增加细胞数的观点出发，优选的是，如上所述，使在凝集控制工序中获得的细胞的凝集体在通常的悬浮培养、即不含有阻碍前述细胞粘附分子的物质的培养基中进行悬浮培养。此时，培养结束的标准为如下时机：全部凝集体的尺寸成为250μm以上且低于1mm、优选为250～950μm、更优选为300～750μm、进一步优选为300～600μm左右的范围。

[0075] 本发明中，悬浮培养方法只要为在袋、烧瓶、反应器等容器内将细胞进行悬浮培养的方法，就没有特别的限制。若为悬浮培养，则也可以为静置培养，从对细胞的营养成分赋予性及氧赋予性的方面出发，优选在可以赋予这些的条件例如伴随有搅拌、流动等的条件下进行培养。

[0076] 作为进行搅拌时的条件，例如优选进行20～150rpm左右的搅拌。作为除搅拌以外赋予营养成分、氧的方法，可举出：使培养液中含有气体的发泡方法、培养液回流的方法等。另外，作为赋予氧的方法，除了前述方法以外，可举出：使培养液中含有血红蛋白而有效地供给氧的方法等。

[0077] 对于本发明的悬浮培养中使用的培养基没有特别的限制，可以根据细胞的种类而使用培养细胞时所使用的培养基。以下，针对用于培养多能干细胞的培养基进行详细说明。作为用于培养多能干细胞的液体培养基，只要为了用于将多能干细胞进行传代培养的以往的方法，就没有特别的限制。作为其具体例，可举出：Dulbecco’s Modified Eagle’s Medium(DMEM)、Glasgow Minimum Essential Medium(GMEM)、RPMI1640培养基等，通常添加
2mM左右的谷氨酰胺和/或100μM左右的2-巯基乙醇而使用。另外，作为ES细胞培养用培养基，也可以使用市售的KnockOut DMEM(Invitrogen Corporation)、ES cell-qualified DMEM(Cell&MolecularTechnologies Inc.)、TX-WES(Thromb-X Co.,Ltd.)等。优选向这些培养基中添加5～25％左右的FBS，也可以进行无血清培养，例如替换15～20％的KnockOut Serum Replacement(Invitrogen Corporation)。另外，可以使用添加有MEF细胞的培养上清、bFGF/FGF-2，SCF等的培养基，其详细的方法为公知(Xu et al.，Nature Biotech.19：
971,2001；国际公开编号第01/51616号；国际公开编号第03/020920号；Amit et al.，Biol.Reprod.，70：837，2004)。作为多能干细胞的培养中使用的液体培养基，除上述以外，可以使用杜尔贝科改良伊格尔培养基(Dulbecco’s Modified Eagles’s Medium；DMEM)、DMEM/F12培养基、麦考伊5A培养基(McCoy’s 5A medium)、哈姆F12培养基(Ham’s Nutrient Mixture F12)、MEM培养基(Minimum Essential Medium)、αMEM培养基(alpha Modified Eagles’s Minimum Essential Medium；αMEM)、伊格尔MEM培养基(Eagles’s Minimum Essential Medium；EMEM)、RPMI1640培养基、IPL41培养基、伊思考夫改良杜尔贝可培养基(Iscove’s Modified Dulbecco’s Medium；IMDM)、威廉姆斯培养基E、MCDB131培养基、Fischer’s培养基、StemPro34(Invitrogen Corporation制)、StemProhESCSFM(Invitrogen Corporation制)、Sf-900II(Invitrogen Corporation制)、Opti-Pro(Invitrogen Corporation制)、X-VIVO 10(Cambrex Corp.制)、X-VIVO 15(Cambrex Corp.制)、HPGM(Cambrex Corp.制)、StemSpan H3000(Stem Cell Technology,Inc.制)、StemSpanSFEM(Stem Cell Technology,Inc.制)、mTeSR1或2培养基(Stem Cell Technology,Inc.制)、StemlineII(Sigma-Aldrich Corporation制)、QBSF-60(Quality biological,Inc.制)、Essential8培养基(GIBCO,Inc.制)、MesenPRO RS培养基(GIBCO,Inc.制)、Repro FF或Repro FF2(ReproCELL Inc.制)、PSGro hESC/iPSC培养基(System Biosciences,Inc.制)、NutriStem培养基(Biological Industries Ltd.制)、CSTI-7培养基(Cell Science&Technology Institute,Inc.制)、MF-Medium间叶系干细胞增殖培养基(东洋纺株式会社制)等公知常用的培养基。

[0078] 在使用大量包含以白蛋白为代表的蛋白质的培养基(例如蛋白质含量为10mg/ml以上)作为培养基时，显示出通过培养基中的蛋白质而抑制蛋白质对细胞膜表面、培养基材料等吸附的倾向，若使用蛋白质含量少的培养基(例如1mg/ml以下)，则显示出与大量包含蛋白质的培养基相比，产生蛋白质对细胞膜表面、培养基材料等吸附的可能性增高的倾向。

[0079] 另外，也可以根据目的在培养基中添加在培养多能干细胞时通常使用的成分例如钠、钾、钙、镁、磷、氯、各种氨基酸、各种维生素、抗生素、血清、脂肪酸、糖等。在培养源自动物的细胞和/或组织时，也可以根据目的将其他化学成分或活体成分组合一种以上而添加。

[0080] 作为前述添加至源自动物的细胞和/或组织的培养基中的成分，例如可举出：胎牛血清、人类血清、马血清、胰岛素、载铁蛋白、乳铁蛋白、胆固醇、乙醇胺、牛血清白蛋白、亚硒酸钠、1-硫代甘油、2-巯基乙醇、聚乙二醇、丙酮酸钠、各种维生素、各种氨基酸、琼脂、琼脂糖、胶原、甲基纤维素、各种细胞因子、各种激素、各种增殖因子、各种细胞外基质、各种细胞粘附分子等。

[0081] 作为前述细胞因子，例如可举出：白细胞介素-1(IL-1)、白细胞介素-2(IL-2)、白细胞介素-3(IL-3)、白细胞介素-4(IL-4)、白细胞介素-5(IL-5)、白细胞介素-6(IL-6)、白细胞介素-7(IL-7)、白细胞介素-8(IL-8)、白细胞介素-9(IL-9)、白细胞介素-10(IL-10)、白细胞介素-11(IL-11)、白细胞介素-12(IL-12)、白细胞介素-13(IL-13)、白细胞介素-14(IL-14)、白细胞介素-15(IL-15)、白细胞介素-18(IL-18)、白细胞介素-21(IL-21)、干扰素-α(IFN-α)、干扰素-β(IFN-β)、干扰素-γ(IFN-γ)、颗粒球集落刺激因子(G-CSF)、单球集落刺激因子(M-CSF)、颗粒球-巨噬菌体集落刺激因子(GM-CSF)、干细胞因子(SCF)、白血病细胞抑制因子(LIF)、flk2/flt3配体(FL)、制瘤素M(OM)、红细胞生成素(EPO)、血小板生成素(TPO)等。

[0082] 作为前述激素，例如可举出：褪黑素、血清素、甲状腺素、三碘甲腺原氨酸、肾上腺素、去甲肾上腺素、多巴胺、脂联素、抗米勒管激素、副肾皮质刺激激素、血管紧张肽原、血管紧缩素、抗利尿激素、心房钠尿肽、降血钙素、胆囊收缩素、促肾上腺皮质激素释放激素、红细胞生成素、促卵泡激素、促胃液素、胃饥饿素、胰高血糖素、促性腺激素释放激素、生长激素释放激素、人绒毛膜促性腺激素、人胎盘催乳激素、生长激素、胰岛素、胰岛素样生长因子、抑制素、瘦素、黄体形成激素、黑色素细胞刺激激素、副甲状腺激素、甲状腺刺激激素、促甲状腺激素释放激素、催产素、胰泌素、生长激素抑制素、血小板生成素、催乳素、皮质醇、醛固酮、睾酮、脱氢表雄酮、雄烯二酮、二氢睾酮、雌二醇、雌酮、雌三醇、孕酮、骨化三醇、骨化二醇、前列腺素、前列环素、白三烯、血栓素、催乳素释放激素、促脂解素、脑钠利尿肽、神经肽Y、组胺、内皮素、胰多肽、肾素、脑啡肽等。

[0083] 作为前述增殖因子，例如可举出：转化生长因子-α(TGF-α)、转化生长因子-β(TGF-β)、巨噬细胞炎症蛋白质-1α(MIP-1α)、上皮细胞增殖因子(EGF)、纤维芽细胞增殖因子-1、2、3、4、5、6、7、8或9(FGF-1、2、3、4、5、6、7、8、9)、神经细胞增殖因子(NGF)、白血病抑制因子(LIF)、肝细胞增殖因子(HGF)、血小板源生长因子(PDGF)、蛋白酶连接素I、蛋白酶连接素II、胆碱能分化因子(CDF)、趋化因子、Notch配体(Delta1等)、Wnt蛋白质、血管新生蛋白因子样蛋白质2、3、5或7(Angpt2、3、5、7)、胰岛素样生长因子(IGF)、胰岛素样生长因子结合蛋白质(IGFBP)、多效生长因子(Pleiotrophin)等，但并不限定于这些。

[0084] 通过基因重组技术人为地对前述细胞因子、增殖因子的氨基酸序列进行改良而成的物质也可以添加至培养基中。作为其例，可举出：IL-6/可溶性IL-6受体复合体或者Hyper IL-6(IL-6与可溶性IL-6受体的融合蛋白质)等。

[0085] 作为前述细胞外基质、细胞粘附分子，例如可举出：胶原I～XIX、纤连蛋白、玻璃粘连蛋白、层粘连蛋白-1～12、巢蛋白、生腱蛋白、血小板反应蛋白、血管性血友病(von Willebrand)因子、骨桥蛋白、纤维蛋白原、各种弹性蛋白、各种蛋白多糖、各种钙黏着蛋白、各种整联蛋白、桥粒胶蛋白、桥粒芯糖蛋白、E-选择蛋白、P-选择蛋白、L-选择蛋白、免疫球蛋白超家族、聚-D-赖氨酸、聚-L-赖氨酸、甲克质、壳聚糖、琼脂糖凝胶、透明质酸、基质胶、海藻酸凝胶、各种水凝胶等，也可以为它们的切断片段等。

[0086] 作为前述抗生素，例如可举出：磺胺制剂、青霉素、氨苄青霉素、苯氧乙基青霉素、甲氧西林、乙氧萘青霉素、苯唑西林、氯唑西林、双氯唑西林、氟氯唑西林、阿莫西林、环己西林、羧苄青霉素、替卡西林、哌拉西林、阿洛西林、美洛西林、阿姆地诺西林、美西林、头孢菌素及其衍生物、恶喹酸、氨氟沙星、替马沙星、萘啶酮酸、吡咯酸、吡哌酸、克拉维酸、β-溴代青霉烷酸、β-氯代青霉烷酸、6-乙酰亚甲基青霉烷酸、环丙沙星、西诺沙星、诺氟沙星、培氟沙星、罗沙沙星(Rosaxacin)、氟氧沙星、依诺沙星、舒巴坦、头孢恶唑、沙乌坦西林(Sultampicillin)、阿迪诺西林(Adinocillin)及舒巴坦的甲醛/水合物酯(formaldehyde-hydrate  ester)、他佐巴坦、氨曲南、沙法宰辛(Sulfazethin)、异沙法宰辛(IsoSulfazethin)、诺卡地辛(norcardicin)、间羧基苯基、苯基乙酰胺膦酸甲酯、氯四环素、氧四环素、四环素、地美环素、多西环素、美他环素、二甲胺四环素等。

[0087] 本发明的凝集体的特征在于，其为通过本发明的培养方法而获得的细胞的凝集体且具有均一的凝集直径。由本发明的凝集体获得大量的细胞且所获得的细胞均维持未分化性、分化多能性。从细胞的增殖性及分化多能性的观点出发，悬浮培养48小时后的全部凝集体的直径为20μm以上且低于1mm的范围，优选为20～950μm的范围，更优选为20～750μm的范围，进一步优选为50～500μm的范围，特别优选为100～300μm的范围。

[0088] 另外，本发明的细胞凝集控制剂的特征在于，其含有阻碍细胞粘附分子的物质。本发明的细胞凝集控制剂优选用于在细胞的悬浮培养中控制凝集体的粒径。对于阻碍细胞粘附分子的物质没有特别的限制，但优选选自E-钙黏着蛋白、由E-钙黏着蛋白的部分区域构成的蛋白质、包含E-钙黏着蛋白的全部或部分区域的融合蛋白质、E-钙黏着蛋白的中和抗体、与E-钙黏着蛋白结合的肽、以及它们的衍生物中的至少1种。

[0089] 本发明的培养方法作为能够以均一的质量且大量获得细胞、特别是iPS细胞、ES细胞等多能干细胞的干细胞的培养方法是极其有用的。另外，本发明的培养、细胞的凝集体、细胞凝集控制剂、细胞凝集控制剂以及培养基在再生医疗、药物开发领域中是极其有用的。

[0090] 实施例

[0091] 以下，通过实施例进一步对本发明进行详细说明，但本发明并不受这些实施例的任何限制。

[0092] <多能干细胞的准备>

[0093] 将基质胶水溶液(利用DMEM稀释50倍)以1mL/孔的量加入至未处理的组织培养6孔平板(IWAKI CO.,LTD.制)中，在37℃下培养2小时。然后，去除涂布剂，制备人类iPS细胞培养平板。

[0094] 使用hiPS细胞(TkDN4-M，东京大学干细胞库)作为多能干细胞。在准备该细胞的前述培养平板中以100000～400000个/孔的密度播种细胞，培养4天。培养液中使用mTeSR1(STEMCELL Technologies Inc.制)，并以2mL/孔的培养基量进行培养。此期间，除了播种1天后，每天进行培养基更换。

[0095] 细胞的剥离/回收中使用作为胰蛋白酶样酶的TrypLE  select(Life Technologies Corporation制)。去除培养液后，以成为1mL/孔的方式添加TrypLE select，并在37℃下培养2～5分钟。然后，去除TrypLE select，以2mL/孔加入包含10μM的作为ROCK抑制剂的Y-27632的mTeSR1，利用1000μL微量移液器进行移液，由此将细胞剥离。使该回收的细胞悬浊液透过40μm的细胞滤网(BD)，将细胞以单一细胞或微小凝集体的形式回收，得到向悬浮培养的导入用细胞。

[0096]

[0097] 依据Nagaoka M，Akaike T.，ProteinEng.2003；16：243-245.进行E-钙黏着蛋白-Fc融合蛋白质的表达和精制。本实施例中，将由小鼠的E-钙黏着蛋白总长(理研BRC DNA库，编码1184)获得的细胞外区域cDNA与导入有变异的IgG1-Fc区域cDNA(T252M/T254S)连接，使E-cad-Fc融合蛋白质表达。

[0098] <细胞的凝集体的直径的测定>

[0099] 在下述实施例及比较例中，对于培养期间中的细胞的凝集体的形态及尺寸，使用相差显微镜(制品名：DM IRB，LEICA COMPANY制)进行观察及测定。

[0100] <实施例1>

[0101] [实施例1-1]

[0102] 在实施了低细胞粘接处理的12孔平板中添加1mL/ml的mTeSR1，向其中同时加入预5
先准备的hiPS细胞(2×10个细胞/ml)和作为阻碍hiPS细胞的细胞粘附分子的物质的E-钙黏着蛋白-Fc(5μg/ml)，以90～120rpm的速度旋转培养48小时。利用E-钙黏着蛋白-Fc进行处理后经过48小时时的凝集体的尺寸为300～700μm的范围。接着，除了进行培养基更换而未添加E-钙黏着蛋白-Fc以外，在与前述相同条件下培养3天而获得凝集体。该凝集体的尺寸为500～1000μm的范围。

[0103] [实施例1-2]

[0104] 将实施例1-1中的E-钙黏着蛋白-Fc的浓度设为10μg/ml，除此以外，均与实施例1进行同样地操作，从而获得凝集体。利用E-钙黏着蛋白-Fc进行处理后经过48小时时的凝集体的尺寸为200～400μm的范围，在进行培养基更换而未添加E-钙黏着蛋白-Fc的情况下培养3天，此时凝集体的尺寸为300～1000μm的范围。

[0105] [实施例1-3]

[0106] 将实施例1-1中的E-钙黏着蛋白-Fc的浓度设为20μg/ml，除此以外，均与实施例1进行同样地操作，从而为获得凝集体。利用E-钙黏着蛋白-Fc进行处理后经过48小时时的凝集体的尺寸为100～500μm的范围，在进行培养基更换而未添加E-钙黏着蛋白-Fc的情况下培养3天，此时凝集体的尺寸为300～600μm的范围。

[0107] [实施例1-4]

[0108] 将实施例1-1中的E-钙黏着蛋白-Fc的浓度设为50μg/ml，除此以外，均与实施例1进行同样的操作，从而获得凝集体。利用E-钙黏着蛋白-Fc进行处理后经过48小时时的凝集体的尺寸为100～300μm的范围，在进行培养基更换而未添加E-钙黏着蛋白-Fc的情况下培养3天，此时凝集体的尺寸为300～600μm的范围。

[0109] [实施例1-5]

[0110] 将实施例1-1中的E-钙黏着蛋白-Fc的浓度设为100μg/ml，除此以外，均与实施例1进行同样的操作，从而获得凝集体。利用E-钙黏着蛋白-Fc进行处理后经过48小时时的凝集体的尺寸为150～700μm的范围，在进行培养基更换而未添加E-钙黏着蛋白-Fc的情况下培养3天，此时凝集体的尺寸为300～1000μm的范围。

[0111] [比较例1-1]

[0112] 没有使用实施例1-1中的E-钙黏着蛋白-Fc，除此以外，均与实施例1进行同样的操作，从而获得凝集体。利用E-钙黏着蛋白-Fc进行处理后经过48小时时的凝集体的尺寸为1000～3000μm的范围，培养3天时的凝集体的尺寸还在1000～3000μm的范围。

[0113] <细胞的凝集体的观察>

[0114] 实施例1-1～1-5及比较例1-1中，使用相差显微镜(制品名：DM IRB，LEICA COMPANY制)观察培养2天(利用E-钙黏着蛋白-Fc处理48小时)的细胞的凝集体的形态。将所得显微镜照片示于图2的(A)～(F)。根据图2的(A)～(F)可知，与比较例1-1(E-钙黏着蛋白-Fc浓度＝0μg/ml)中获得的凝集体相比，实施例1-1～1-5(分别为E-钙黏着蛋白-Fc浓度＝5、10、20、50、100μg/ml)中获得的凝集体的尺寸得到控制。特别是将E-钙黏着蛋白-Fc的浓度设为10～50μg/ml的范围的样品的过度凝集得到抑制，即使为单纯旋转培养也可以获得实现形成均一的凝集体的效果。

[0115] <葡萄糖消耗量的测定>

[0116] 总培养期间中，在培养基更换时采集培养液300μL，使用酶电极式生物分析仪(YSI2950)分析葡萄糖浓度，求出葡萄糖消耗量变化。将其结果示于图3。

[0117] <细胞数的测定>

[0118] 培养结束后，细胞在使用TrypLE select分散为单一细胞后，使用台盼蓝(Life Technologies Corporation制)和嗜酸性粒细胞计数器(TATAI Corporation制)对生细胞数进行计数。将其结果示于图4。

[0119] 根据图3、4中示出的图，可以将葡萄糖消耗量作为生存的细胞数的指标。根据图3、4中示出的结果可知，与比较例1-1(E-钙黏着蛋白-Fc浓度＝0μg/ml)中获得的凝集体相比，实施例1-1～1-5(分别为E-钙黏着蛋白-Fc浓度＝5、10、20、50、100μg/ml)中获得的凝集体的葡萄糖消耗量及细胞数量中的任一者均发挥出优异的效果。特别是对于培养第5天的葡萄糖消耗量，实施例1-1与比较例1-1相比增加至约2倍，细胞数增加至1.5～1.75倍左右。该倾向在实施例1-2～1-5中更强，葡萄糖消耗量在实施例1-2及1-5中达到2倍，在实施例1-3及1-4中达到2.5倍，关于细胞数，大致在实施例1-2中增加至1.8倍，在实施例1-3中增加至
2.5倍，在实施例1-4中增加至3倍，在实施例1-5中增加至2.3倍，因此可知：能够获得大量多能干细胞。另外，如图2所示，凝集体的直径被控制得更均一的实施例1-2～1-4为优异的结果，因此可知：通过抑制过量的细胞的凝集，更多地形成适当的粒径的凝集体，能够提高增殖效率。由此可知：所得细胞为维持未分化性及分化多能性的干细胞。通常若考虑细胞凝集体会因营养基质、氧的扩散而存在能够生长的极限的尺寸，则推测凝集体的直径的控制大大有助于人类iPS细胞的大量培养工艺的简易化。

[0120] <实施例2>

[0121] [实施例2-1]

[0122] 在实施了低细胞粘接处理的12孔平板中加入1mL的mTeSR1，向其中同时加入预先准备的hiPS细胞(TkDN4-M，东京大学干细胞库)(5×105个细胞/ml)和作为阻碍hiPS细胞的细胞粘附分子的物质的重组E-钙黏着蛋白(LD Biopharma,Inc.制hRP-0339)(10μg/ml)，以90rpm的速度进行旋转培养1天。

[0123] [实施例2-2]

[0124] 将实施例2-1中的阻碍hiPS细胞的细胞粘附分子的物质变更为E-钙黏着蛋白的中和抗体(Millipore Corporation制的E-钙黏着蛋白抗体，MAB3199Z)(16μg/ml)，除此以外，均与实施例2-1进行同样操作，从而获得凝集体。

[0125] [实施例2-3]

[0126] 将实施例2-1中的阻碍hiPS细胞的细胞粘附分子的物质变更为E-钙黏着蛋白-Fc(10μg/ml)，除此以外，均与实施例2-1进行同样的操作，从而获得凝集体。

[0127] [比较例2-1]

[0128] 没有使用实施例2-1中的重组E-钙黏着蛋白，除此以外，均与实施例2-1进行同样的操作，从而获得凝集体。

[0129] <细胞的凝集体的观察>

[0130] 实施例2-1～2-3及比较例2-1中，使用相差显微镜(制品名：DM IRB，LEICA COMPANY制)观察细胞的凝集体的形态。将所得显微镜照片示于图5的(A)～(D)。根据图5的(A)～(D)可知，与比较例2-1(没有添加阻碍细胞粘附分子的物质)获得的凝集体相比，重组E-钙黏着蛋白、E-钙黏着蛋白的中和抗体以及E-钙黏着蛋白-Fc均可以将凝集体的直径调整为均一。另外，E-钙黏着蛋白-Fc与重组E-钙黏着蛋白以及E-钙黏着蛋白的中和抗体相比，凝集体较大且其形状均一，因此，推测与重组E-钙黏着蛋白以及E-钙黏着蛋白的中和抗体相比，可以在20μm以上且低于1mm的范围内增大48小时后的全部凝集体的直径，可以获得大量细胞。

[0131] <实施例3>

[0132] [实施例3-1]

[0133] 在实施了低细胞粘接处理的12孔平板中加入1mL的Essential8，向其中同时加入预先准备的hiPS细胞(TkDN4-M，东京大学干细胞库)(2×105个细胞/ml)和作为阻碍hiPS细胞的细胞粘附分子的物质的E-钙黏着蛋白-Fc(50μg/ml)，以100rpm的速度进行旋转培养5天。需要说明的是，培养第2天以后(自培养开始起经过48小时后)，利用未添加E-钙黏着蛋白-Fc的培养基每天进行培养基更换。

[0134] [实施例3-2]

[0135] 将实施例3-1中的E-钙黏着蛋白-Fc的浓度设为100μg/ml，除此以外，均与实施例3-1进行同样的操作，从而获得凝集体。

[0136] [比较例3-1]

[0137] 没有使用实施例3-1中的E-钙黏着蛋白-Fc，除此以外，均与实施例3-1进行同样的操作，从而获得凝集体。

[0138] <细胞的凝集体的观察>

[0139] 实施例3-1、3-2及比较例3-1中，使用相差显微镜(制品名：DM IRB，LEICA COMPANY制)观察培养第2天以及第5天的细胞的凝集体的形态。将所得显微镜照片示于图6、7。根据图6、7所示的结果，可知：使用Essential8作为培养基时可以控制凝集体的尺寸。添加E-钙黏着蛋白-Fc时，培养第5天的凝集体尺寸与培养第2天相比，发生生长，其直径被控制为500μm左右。

[0140] 在此，若考虑使用mTeSR1作为培养基的实施例1-1～1-5(图2)，则可知在使用蛋白质含量多的mTeSR1(蛋白质含量约18mg/ml)作为培养基时，与使用作为蛋白质含量少的培养基的Essential8(蛋白质含量约9μg/ml)的情况相比，即使阻碍细胞粘附分子的物质的量少也可以获得同等的效果。推测出：使用蛋白质含量少的培养基时，阻碍细胞粘附分子的物质在封端目标的细胞膜钙黏着蛋白之前已吸附其他细胞膜、培养基材料。

[0141] <葡萄糖消耗量及细胞数的测定>

[0142] 针对实施例3-1、3-2及比较例3-1，与上述同样地测定葡萄糖消耗量及细胞数(图8及图9)，结果确认到：通过E-cad-Fc的添加，葡萄糖消耗量及细胞数中的任一者均显示出优异的效果。